Summary
En ny ex vivo förberedelse för avbildning musen ryggmärgen. Detta protokoll möjliggör två-foton-avbildning av levande cellulära interaktioner hela ryggmärgen.
Introduction
Musmodeller av demyelinisering, inklusive experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) och intrakraniell infektion med neuroadapted mus hepatitvirus (MHV), är utmärkta verktyg för att studera molekylära vägar och cellulära interaktioner förknippade med sjukdomen. De har lett till och stött effektivitet FDA godkända läkemedelsbehandlingar, främst inriktade upphörande av autoimmunitet och inflammation 1. Men när endogen remyelinisering har misslyckats, de närvarande godkända behandlingar inte effektivt reparera demyelinerade lesioner i det centrala nervsystemet. Därför reparationsfokuserade terapier i detta skede av sjukdomen är kritiska för lindring av kroniska symptom och förbättring av livskvaliteten. Nyligen har neurala prekursorceller (NPC) kommit i förgrunden som en potentiell regenerativ terapeutisk modalitet att rikta områden av inflammation och demyelinisering. Flera studier har visat på förmågan hos NPCs att inducera endogenooss remyelinisering och delta direkt i remyelinisering 2-8. Eftersom NPCs är involverade i direkt remyelinisering, är det absolut nödvändigt att förstå deras kinetik och interaktioner med endogena celler efter transplantation. Efter transplantation, NPCs migrera ventralt till områden av vit substans skada, sedan rostrally och kaudalt i förhållande till transplantation platsen 5,9. Kinetiken för migrationen skiljer som svar på miljösignaler; NPC transplanteras in i en icke-skadad ryggmärg har större hastigheter än NPC transplanteras till en skadad ryggmärg 6. Efter en vandrande period, överfört NPCs föröka i stor utsträckning, i högre takt i en skadad ryggmärg relativt en intakt ryggmärgen 6. Slutligen, majoriteten av NPC differentierar till oligodendrocyter och initiera direkt remyelinisering 4,6,9.
Den demyelinerad lesionen är komplex och kan innehålla en skiftande population av celler i olika skeden av enctivation. Till exempel kan en aktiv multipel skleros (MS) lesion omfattar en betydande population av aktiverade T-celler, M1 mikroglia och M1 makrofager, men en kronisk tyst MS lesionen kan bestå primärt av reaktiva astrocyter med få inflammatoriska celler 10-13. På grund av mångfalden av effektorceller, är två-foton (2P) avbildning i musmodeller av demyelinisering ett mycket användbart verktyg för att förstå lokala cellulära interaktioner inom lesionen. Vid MS och många utsträckning används MS forskningsmodeller, är majoriteten av lesioner som ligger på den ventrala sidan av ryggmärgen, en region oåtkomlig för intravital 2P avbildning på grund av skada djup och den höga fetthalten i ryggmärgen. För att kringgå dessa problem och studie cell-cell interaktioner inom lesioner längs den ventrala ryggmärgen har vi utvecklat en enkel ex vivo 2P avbildning förberedelse 6.
Denna studie följer upp en tidigare metoder publikation, vilket visadeförfarandet för omplantering förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) uttryckande NPC in i ryggmärgen av möss efter JHMV stam av MHV-inducerad demyelinisering 14. Fem veckor gamla möss infekterade med JHMV och transplanteras med eGFP-NPCs på thorax nivå 9 på dag 14 efter infektion. Protokollet presenteras här ger detaljerade steg för hur du extrahera ryggmärgen, gör en ex vivo -ig förberedelser, och bild transplanterade eGFP-NPC interaktioner med förstärkt gula fluorescerande protein (EYFP) uttryckande axoner. Möss som uttrycker EYFP under neuronala specifika Thy1 promotor användes i detta förfarande 15. Endast en del av de axoner uttrycka EYFP, vilket gör den användbar för avbildning enskilda axoner. Här visar vi ryggmärg avlägsnades vid 7 dagar efter transplantation; emellertid kan ryggmärg utvinnas vid någon tidpunkt efter transplantation. Medan vi visar interaktioner av NPCs med skadade axoner, kan våra protokoll användas i kombination med genetiska fluorescerande markörerav andra celltyper för att undersöka en mängd cellulära interaktioner inträffar hela musen ryggmärgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Etik Uttalande: Protokollet för djurhantering godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of California, Irvine, protokoll # 2010-2943.
1. Borttagning av ryggmärgs
- Placera pappershanddukar fuktade med ~ 100% flytande isofluran, USP i euthanizing kammaren och placera torra pappershanddukar ovanpå. Placera musen i kammaren på toppen av torra pappershanddukar så musen inte vidrör isofluran och se till kammaren är täckt. Vänta minst en minut efter avslutad andning för att se till att musen är avlivas.
- Utför en spinal transection av halsen för att säkerställa musen avlivas. Utför inte en halsdislokation då detta kan skada ryggmärgen.
- Spraya musen med 70% etanol för att väta håret.
- Använd vassa Fine sax för att ta bort hår och hud från baksidan av musen för att exponera ryggraden från ungefär livmoderhalscancer lamina 1 (C1) Till sakrala lamina 4 (S4).
- Med användning av en skalpell med ett # 10 blad, göra snitt till vänster och höger om ryggraden att separera den från muskler och fett. Detta kommer att göra avlägsnandet av ryggmärgen mycket lättare.
- tillval: en böjd Luer rongeurs kan användas för att skopa bort ytterligare kött.
- Håll upp på benknotorna med sågtandade Graefe pincett, sätt titan böjda Vannas sax med den böjda sidan uppåt i den exponerade ryggraden på C1, var noga med att inte röra ryggmärgen.
- Skjut titan böjda Vannas sax hela vägen till höger och gör ett litet snitt. En liten crunch ljudet ska höras och kände som sax klippa kotorna. Upprepa denna minskning längst till vänster sida av sladden. Var noga med att inte gå för fort eller göra för stor för en sänkning, eftersom detta riskerar att skada sladden med saxen.
- Den enda lamell ska kunna lyftas med tången när sidorna av kotorna skärs. REPEAT detta steg för varje lamell tills S4, vidmakthållande och dra tillbaka ryggmärgen kotorna.
OBS: kotorna ovanför transplantation webbplats kommer sannolikt lossna när det skärs ner till transplantationsstället. Fortsätt proceduren med början strax under transplantationen webbplatsen. - tillval: lägg kotorna ner för att se var transplantations webbplats är och mått och skär ~ 20 mm rostralt och kaudalt till transplantationsstället.
OBS: När transplantation NPCs mer inte kommer att behövas eftersom de transplanterade NPC allmänhet inte migrerar längre än 15 mm. Mängden ryggmärgen som behövs kommer att vara beroende av experimentet och migrationsegenskaper celltyp transplanteras. Göra rostralt och stjärtfenan nedskärningar som är lika långt till transplantation webbplatsen gör det möjligt för transplantation webbplatsen ska placeras lättare under avbildning. - Med hjälp av en skalpell med en # 11 blad skär försiktigt ganglierna till höger och vänster om den ventrala sidan av ryggmärgen börjar vid den rostrala änden. Denna wsjuk aktivera ryggmärgen avlägsnas från den ventrala kotor lättare.
OBS: Klar snabbt (stegen 1,7-1,11), kommer ryggmärgen inte torka ut. Emellertid kan 1 x PBS administreras till sladden för att hålla den fuktig. - Vänd musen och håll musen upp så ryggmärgen är vänd nedåt. Dra försiktigt ut ryggmärgen använder slutna sågtandade Graefe pincett. Utan nicking ryggmärgen, försiktigt klippa eventuella kvar ganglier att tillåta ryggmärgen lyftas ut i ett enda intakt stycke.
- Se till ryggmärgen är i RPMI-1640 och placera den på is för transport till 2P mikroskop.
2. Beredning av ryggmärgs för Imaging
- Bädda ryggmärgen i agaros
- Håll den isolerade ryggmärgen i kyld RPMI-1640 på is före avbildning.
- Väg upp agaros (låg gelningstemperatur) och förbereda en 5% lösning i 5 ml 1 x PBS. Micro agaroslösningen 5% för 15 sek för att upplösa aguppstod och låt lösningen svalna till 37 ° C.
- Förbered ryggmärgen genom att placera den på ett ark Parafilm med den ventrala sidan uppåt.
- Pipettera ca 5 ml 5% -ig lösning under den ventrala sidan av ryggmärgen. Låt agarosen stelna genom kylning till rumstemperatur. Full stel tar ca 5 min.
- Applicera ett tunt lager av vävnad lim till en 22 mm fyrkant täckglas.
- Vänd inbäddade ryggmärgen, placera den ventrala sidan på Parafilm. Ryggsidan kommer nu att vända uppåt. Följ locket glida på ryggsidan, och dränka agarosen inbäddad ryggmärgen / täckglas beredning i RMPI stelna limmet. Ta bort överflödigt stelnade agarosen med hjälp av ett rakblad.
- Montering av ryggmärgen på mikroskop scenen
- Applicera vaselin till botten av locket halka. Detta kommer att stabilisera beredningen under perfusionen.
- Placera ryggmärgen beredning i enavbildning väl på mikroskop scenen med den ventrala sidan uppåt mot 25X doppa målet. Den specialbyggda avbildning väl är ungefär 20 mm djup, 50 mm lång, och 50 mm i diameter.
- Bild medan superfusing beredningen med uppvärmda (37 ° C), syresatt (95: 5 syre: koldioxid-carbogen) RPMI-1640 medium utan serum.
- Pre-varma media till 37 ° C i vattenbadet och anslut den till slangen pumpen genom att sätta in slangen i medieflaskan.
- Behåll temperaturen medier vid 37 ° C en värmeanordning vid anslutning av slangen till kammaren. Superfuse media genom väl vid 3 ml / min med användning av slang som är ansluten till slangen pumpen (Figur 1B).
3. 2P Imaging av ventrala ryggmärgs
- Mikroskopinställning
- Hämta bilder från Thy1-EYFP ryggmärg med en kameleont Ultra Ti: Sapphire laser inställd på 900 nm. Dämpa lasereffekt påexemplar till <5% för att säkerställa minimal fototoxicitet 16. Bibehåll temperaturen genom perfusion syre perfusion RPMI-1640 vid en konstant 37 ° C med användning av en enda inline lösning värmaren för att säkerställa stabil avbildning, och för att förhindra vävnads avdrift och cellulär skada.
- Att separera eGFP och EYFP fluorescerande signal, placera en 520 nm enda kant dikroisk och en 560 nm enda kant dikroisk stråldelare i serie för att separera 2P utsläpp i tre kanaler, avsikt dela den gröna utsläpp att öka synligheten.
OBS: Dessa kanal kallas blågröna (emission <520 nm), grön-gul (520-560 nm) och rött (emission> 560 nm). Fotomultiplikatorrör upptäcka utsända ljuset i varje kanal.
- Placering av avbildnings områden av intresse
- Använda okularet och en ljus fält ljuskälla, fokusera avbländande mål på den ventrala kanten av ryggmärgen att ställa in en referenspunkt.
- Se till omgivande ljuskällan är avstängd och swkliar till 2P excitation genom att öppna laser slutare.
- Om tillgängligt, när du söker vävnad för intresseområden, använd en lägre upplösning inställning, högre volym utan digital zoom, och högre skanningshastighet än vid förvärv slutliga bilderna. Typiska inställningar med detta system när du söker vävnad för ett område av intresse är: upplösning: 256 pixlar; volym: x = 600 nm, y = 600 nm, z = 0-300 nm.
- Beakta EYFP axoner nära den ventrala kanten av ryggmärgen. Andra harmoniska signalen från kollagen (blå) blir ljusast på ryggmärgsvävnad kant. Leta reda på EYFP axoner bara rygg till den andra harmoniska signalen från kollagen och EYFP signal visualiseras i grön-gula kanalen.
- Lokalisera transplantationen platsen i den längsgående centrum av ryggmärgen framställning 14. För möss 1 dagen efter eGFP-NPC transplantation, lokalisera transplantationen webbplatsen genom att fokusera strålgången i z-planet djupt in i vävnaden. Transplantationen site will varierar något mellan djur men vanligtvis ligger ~ 200 nm från ventrala kanten. Beakta kluster av EGFP-NPC i de vita substans, närmare de ventrala och laterala kanterna hos möss efter dag 1 efter transplantation.
- Förvärva slutliga bilderna
- Förvärva bildupplösning på 512 pixlar; volym: x = 270 nm, y = 212 nm, och z = 100 nm med hjälp Slidebook 6 programvara. Samman z-stackar genom att förvärva sekventiella fokalplan i steg om 2,5 | im.
- Utför en dubbelriktad skanning med ordentlig interlace offset för att säkerställa snabb beräkning av eventuella flytt föremål i ryggmärgen. Se till att den ideala förvärvsbildhastighet för att bestämma cellulär hastighet inom ryggmärgen är ungefär 1 bild / sek.
OBS: Imaging inställningar kan ändras till enskilda användarinställningar, såsom förvärvsbildhastighet, bildupplösning och bildvolymer. Större imaging volymerna kommer i allmänhet att ta längre tid att förvärva en givsv upplösning. - Analysera, gröda, smidig, och Pseudoslidebook bildfiler med bildanalys programvara såsom Bitplane Imaris 7.7. Producera slutgiltiga tidsförlopp videoklipp genom kamning avbildningsvolymer i följd med hjälp av en automatiserad process i Slidebook och Imaris.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medan den explanterade ryggmärgen avbildning protokoll kan användas för att visualisera något fluorescens inom ryggmärgen, våra representativa resultat visar EGFP-NPC interaktioner med EYFP-axoner. Först visar vi den inbäddade ventrala ryggmärgen förberedelser i figur 1A. Därefter visar vi 2P mikroskop setup och nyckelkomponenter i figur 1B. Figur 2 visar eGFP och EYFP fluorescens i en enda z-stack inom den ventrala ryggmärgen. Förvärv av z-stackar konsekutiva kan kompileras för att producera tidsförlopp filmer att analysera realtid cellulära dynamiken inom intakt vävnad. Med hjälp av en 520 nm enda kant dikroisk och en 560 nm enda kant dikroisk stråldelare, som noteras i protokollet, kan skilja eGFP och EYFP signal. Enskilda kanaler kan pseudocolored grönt och gult med hjälp bildbehandlingsprogram.
80 / 52580fig1.jpg "/>
Figur 1: Ryggmärgs och mikroskop setup. (A) En ryggmärg inbäddad i en 5% agarosgel (vänster) och monterade på ett täckglas efter avlägsnande av överskott av agaros (höger). (B) En bild av mikroskop setup med nyckelkomponenter märkta. 1. Vattenbad inställt vid 37 ° C. 2. förvärmda RPMI-1640. 3. C / L variabel hastighet slang Pump. 4. Single inline lösning värmare. 5. Doppa mål. 6. Digital termometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Exempel 2P bild erhållits i den ventrala ryggmärgen 3D rekonstruktioner av den ventrala sidan av en icke-infekterade, icke-skadad (A) och JHMV-infekterade, demyelinerad (B) ryggmärgen.från en Thy1-EYFP musen efter transplantation med eGFP-märkta NPCs. Fluorescerande-märkta axoner pseudocolored gult och NPC är pseudocolored grönt. Bildupplösning: 512 pixlar; bildvolym: (A) x = 239 | im, y = 259 um, z = 65 | im truerades med användning 26 z-stackar åtskilda 2,5 um från varandra och (B) x = 497 | im, y = 389 um, z = 127,5 um konstrueras med hjälp 51 z-stackar avstånd 2,5 pm från varandra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Realtids 2P avbildning av intakt vävnad krävs för att utreda NPC kinetik och interaktioner efter transplantation till demyelinerad musen ryggmärgen. Intravital 2P avbildning används ofta för att bestämma cellulära dynamiken på ryggsidan av ryggmärgen i levande möss, och har använts för att studera rygg demyelinisering i demyeliniserande sjukdom 17-19. Men eftersom transplanterade NPCs migrera till den ventrala vita substansen, som ligger för djupt för att bilden på plats med hjälp av 2P mikroskopi, är nödvändigt en ex vivo förberedelser. Denna metod har använts i vårt labb för att bestämma motilitet och remyelinisering kinetik NPCs transplanterade in i skadade och icke-skadade ryggmärgen 6. Ex vivo preparat möjliggör skanning av ryggmärgen inte bara på längden utan också på tvären från buksidan 6,20 . Detta möjliggör analys av skillnader i cellrörelse (hastighet och riktning) och interaktioner vid transplant plats, intill transplantation platsen, och på olika avstånd från transplantations site 6. Medan vi ursprungligen utarbetat detta preparat till bilden transplanterade eGFP-NPCs på den ventrala sidan av ryggmärgen, kan den användas för att bilden något fluorescerande eller färgade celler från ventrala, dorsala, eller laterala sidor genom att ändra orienteringen ryggmärgen är monterad. Fördelar med detta preparat under intravital avbildning inkluderar tillåter ventrala sidan avbildning och saknar behov av bedövning och överlevnad kirurgi, som fortfarande behövs med de nya intravital preparat med en "glasfönster" inställning som gör det möjligt för flera avbildning sessioner utan upprepade operationer 19,21 . Det bör noteras att en begränsning av detta förfarande jämfört med "glasfönster" tillvägagångssätt i kombination med intravital avbildning är oförmågan att få flera tidpunkter från en enda mus, eftersom ryggmärgen avlägsnas och musen avlivas.
2P avbildning är idealisk för att lösa dynamiken i enskilda celler i intakta vävnader 22,23. 2P excitation utnyttjar nära infraröda fotoner som möjliggör längre perioder av djup vävnad avbildning med minimal fototoxicitet. 2P excitation sker vid samtidig absorption av två fotoner med en fluorofor. Den höga koncentrationen av fotoner som är nödvändiga för 2P excite uppnås genom spatiotemporala kompression av 2P laserutmatningen vid en enda fokalplan. Detta begränsar fluorescerande excitation till brännpunkten, ytterligare minimera fototoxicitet i ryggmärgsregioner utanför fokalplanet. Nära-infraröda fotoner har också minskat spridning, vilket möjliggör avbildning upp till ungefär 300 | im från den ventrala sidan av ryggmärgen 16.
Som med alla ny teknik är emellertid 2P avbildning av den explanterade ryggmärgen har begränsningar som måste hållas i åtanke. Denna bildprotokoll använder en 520 nm Dichroic spegel som möjliggör separation av eGFP och EYFP fluorescens genom att avleda eGFP utsläpp i fluorescerande kanalen vanligtvis reserverad för blått ljus. Andra övertonen generationen skapats av kollagen i ryggmärgen visas också i den blå kanalen, men är lätt att skilja från eGFP-märkta celler som är betydligt ljusare i denna beredning, och har en del av sina utsläpp identifierbar i grön-gula kanalen som kollagen inte. Denna teknik för kanal blandning och separation av olika delar av ett emissionsspektra med specifika dikroiska är ofta användbart för visuell eller automatiserad identifiering av enskilda fluoroforer med nära eller nästan överlappemissionsspektra. Fototoxicitet är en annan begränsning av denna 2P avbildning protokoll. Celler inom en enda bildvolym är känsliga för fototoxicitet; Därför bör experimentalist vara lyhörda för tecken på fototoxicitet. Fototoxicitet är vanligtvis först tydlig i minskning eller brist på cellmotilitet, följt av fotoblekning och / eller morfologiska förändringar i lokala vävnader. Flera faktorer kan skada vävnaden leder till fototoxicitet eller göra det olämpligt för live-cell imaging. Det är kritiskt att övervaka lasereffekten och temperaturen och syresättningen av perfunderade RPMI-1640. Det är också viktigt att säkerställa korrekt avlägsnande av ryggmärg från musen utan överdriven sträckning eller komprimering av ryggmärgen och utan att skära ryggmärgen med bladen. Om den hanteras på rätt sätt, kommer den explanterade ryggmärgen förberedelser förbli lönsamt för upp till tio timmar, bestämd med robust cellulär motilitet inom den ventrala ryggmärgen utan minskning på tio timmar efter extraktion. En mängd extraherat vävnad brukar avbildas för långa längder av tid och anses livskraftig 23-26. Därför är det möjligt kvantifiering av cellulära dynamik i flera regioner inom en enda ryggmärgen. Slutligen bör det noteras att den stora majoriteten av celler that är inte fluorescerande kommer inte visualiseras genom denna beredning (om inte naturligt autofluorescerande), och det är viktigt att erkänna att märkta celler interagerar med en komplex miljö med andra omärkta, till synes osynliga endogena celler och strukturella element.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | sharp |
| scalpel blade #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Luer rongeurs | Fine Science Tools | 16001-15 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15615-08 | |
| scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
| agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-25G | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 1469SB | |
| 22 mm square cover slip | Fisher Scientific | 12-547 | |
| 25X dipping objective, 1.1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |
| 520 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF520-Di02-25x36 | Brightline |
| 560 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF560-FDi01-25x36 | Brightline |
| photomultiplier tubes | Hamamatsu | R928 | |
| C/L variable-speed tubing pump | Masterflex | 77122-22 | |
| digital thermometer | Comar Instruments | 3501 | |
| Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser | Coherent | N/A | |
| Slidebook 6 software | 3i | N/A | |
| Imaris 7.7 software | Bitplane | N/A |
References
- Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
- Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation. Neurosci Lett. 456 (3), 101-106 (2009).
- Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 212 (1-2), 74-81 (2009).
- Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187 (2), 254-265 (2004).
- Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination. J Neuroimmunol. 224 (1-2), 101-107 (2010).
- Greenberg, M. L., et al. Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (22), E2349-E2355 (2014).
- Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination. Exp Neurol. 235 (1), 380-387 (2012).
- Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).
- Weinger, J. G., et al. MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination. Stem Cells. 30 (11), 2584-2595 (2012).
- Vogel, D. Y., et al. Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status. J Neuroinflammation. 10, 35 (2013).
- Coyle, P. K. Ch. 3. Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. Rizvi, S. A., Coyle, P. K. 3, Springer. 43-70 (2011).
- McManus, C., et al. MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study. J Neuroimmunol. 86 (1), 20-29 (1998).
- Calderon, T. M., et al. A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein. J Neuroimmunol. 177 (1-2), 27-39 (2006).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J Vis Exp. 53, e2834 (2011).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging. Cell Calcium. 30 (6), 383-393 (2001).
- Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. 82, e50826 (2013).
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Pakan, J. M., McDermott, K. W. A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development. Front Neuroanat. 8, 22 (2014).
- Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J Physiol. 590 (Pt 16), 3665-3675 (2012).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336, 1676-1681 (2012).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (6089), 1869-1873 (2002).
- Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Curr Protoc Cytom. Chapter 12 (Unit12 26), (2012).
- Matheu, M. P., et al. Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), E1258-E1266 (2012).
- Matheu, M. P., et al. Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy. PLoS One. 8 (3), e58033 (2013).
