Abstract
Fordi proteinvarianter spille kritiske roller i mange sygdomme, herunder TDP-43 i amyotrofisk lateral sklerose (ALS), alfa-synuclein i Parkinsons sygdom og beta-amyloid og tau i Alzheimers sygdom, er det afgørende vigtigt at udvikle morfologi specifikke reagenser, som selektivt kan målrette disse sygdomsspecifikke protein varianter at undersøge den rolle, disse varianter i sygdomspatologi og potentielle diagnostiske og terapeutiske anvendelser. Vi har udviklet nye atomic force mikroskopi (AFM) baseret biopanning teknikker, der muliggør isolering af reagenser, som selektivt genkender sygdomsspecifikke proteinvarianter. Der er to centrale faser involveret i processen, de negative og positive panorering faser. Under den negative panorering fase, fager som er reaktive til off-målantigener elimineres gennem flere runder af subtraktiv panning udnytte en række nøje udvalgte off-target antigener. Et centralt element i den negativepanorering fase er at udnytte AFM billeddannelse at overvåge processen og bekræfte, at alle uønskede fagpartikler fjernes. For positive panorering fase er målantigen af interesse fastgjort på en glimmer overflade og bundne fager elueres og screenes for at identificere fager, som selektivt binder målantigenet. Målproteinet variant behøver ikke at være oprenset tilvejebringe de passende negative panorering kontroller er blevet anvendt. Selv målprotein varianter, der kun er til stede i meget lave koncentrationer i komplekse biologiske materiale kan anvendes i den positive panorering trin. Ved anvendelse af denne teknologi, vi købte antistoffer mod protein varianter af TDP-43, som er selektivt findes i humant ALS hjernevæv. Vi forventer, at denne protokol skal gælde for generere reagenser, som selektivt binder proteinvarianter stede i en lang række forskellige biologiske processer og sygdomme.
Introduction
Tilstedeværelsen af protein-varianter er blevet impliceret som en faktor i udviklingen af mange sygdomme, herunder neurodegenerative sygdomme, såsom Alzheimers, Parkinsons, ALS og frontotemporal demens (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11. Oligomere former af proteinerne beta-amyloid og a-synuclein menes at være de toksiske arter, der er ansvarlige for Alzheimers og Parkinsons henholdsvis 2,3,4,5. Aggregater af TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) har været knyttet til ALS og FTD 12,13,14. Derfor reagenser, såsom antistoffer, der selektivt kan målrette de forskellige proteinvarianter kan blive stærke redskaber til at tjene som diagnostiske markører og potentielle lægemidler. I denne undersøgelse har vi fokuseret på at udvikle reagenser, der selektivt binder varianter af TDP-43 protein impliceret i ALS, men teknikken er skitseret i grønbogen bør gælde for isolering af reagenser mod en bred vifte af protEin varianter.
Cytoplasmatisk sammenlægning af TDP-43 er blevet identificeret som en patologisk funktion i ALS 15,16,17,18,19. Typisk TDP-43 findes i kernen af alle celler fra et normalt individ, selvom det har en tendens til at bevæge sig mellem cytosolen og kernen 15,17. Men i ALS aggregerede former af TDP-43 er fundet i cytoplasmaet af udvalgte neuroner og glia med lavere koncentrationer fundet i kernen tyder bevægelse TDP-43 fra kernen til cytoplasmaet i sygdomsprogression 16,20. Mens sammenlægning af TDP-43 findes i de fleste ALS tilfælde betyder det ikke højde for alle tilfælde siden 1% -2% af de samlede ALS tilfælde (eller 15% -20% af familiære ALS tilfælde) er knyttet til mutationer i superoxiddismutase 1 (SOD1) -gen 15,17. På grund af den vigtige rolle, TDP-43 i langt de fleste ALS tilfælde her har vi fokus på at udvikle antistof reagenser, som selektivt kan binde til TDP-43 varianter, der ertil stede i humant ALS hjernevæv udnytte vores hidtil ukendte AFM baseret biopanning teknikker.
Oprindeligt vi har brug for en mangfoldig repertoire af antistof bindende domæner. Vi kombinerede tre biblioteker forskellige fag-display enkelt kæde variable domæne antistof fragment (scFv'er) (Tomlinson I og J og ark biblioteker 21). Den panorering processen er opdelt i negative og positive panorering faser. Fager fra bibliotekerne først underkastes den negative panorering proces, hvorunder fager reaktiv til flere off-målantigener er udelukket. Efter afslutningen af hver runde af negativ panning for hver off-target antigen, er processen overvåges af AFM imaging at sikre, at alle fag binding off-målantigener er blevet fjernet. Først efter at have kontrolleret af AFM imaging, at alle reaktive fager fjernes vi videre til det næste mål. For at isolere reagenter mod TDP-43 varianter impliceret i ALS vi udnyttet følgende negative panning antigener: 1) BSA for at fjerne fager, som binder svagt eller ikke-specifikt til proteiner; 2) den samlede alfa-synuclein at fjerne fag, der binder til generiske strukturelle elementer af aggregerede proteiner; 3) menneskelige hjerne vævshomogenater at fjerne fager, der binder til eventuelle proteiner eller andre komponenter i obduktionsprøver af sundt humant hjernevæv; 4) immunpræcipiteret TDP-43 fra sundt menneskelige hjerne for at fjerne fager, som binder til alle TDP-43 former er forbundet med sund human hjerne; og 5) immunopræcipiterede TDP-43 isoleret fra FTD hjernehomogenater at fjerne fag, der binder TDP-43 varianter, der er forbundet med ikke-ALS patologi. Efter fjernelse af alle fag reaktiv til alle off-målantigener, derefter fortsatte vi til den positive panorering fase, hvorunder antistoffragmenter, der binder antigenet af interesse isoleres, i dette tilfælde TDP-43 immunopræcipiteret fra humant ALS hjernevæv. Disse isolerede antistoffer kan være reaktiv til aggregerede eller modificerede former af TDP-43.
"> Konventionel fag biopanning fokuserer primært på de positive panorering fase 22,23. Normalt målet af interesse immobiliseres, fagbiblioteket tilføjet og bundne fager elueres. Fagerne derefter forstærkes og sættes til målet igen. Denne forstærkning og udrugningen sædvanligvis gentages flere gange for at øge andelen af positiv binding fagen. Mens variationer af denne proces er blevet anvendt i udstrakt grad at isolere antistofreagenser mod en bred vifte af målantigener, kræver de generelt store mængder af oprenset målantigen 24,25,26, 27, mens vores proces kræver kun spormængder af målantigenet. Den her beskrevne protokol kan anvendes til at isolere reagenser, som selektivt binder målantigener der er til stede i meget lave koncentrationer, uden behov for rensning og panorering kan udføres direkte mod antigen til stede i komplekse vævsprøver. Anvendelsen af udtømmende negative panning protokoller som verificeretved AFM sikrer, at kloner isoleret mod den positive antigen selektivt skal binde målet selv når de ikke renset eller beriget.Kasturirangan og kolleger (2003) har gennemført en tilsvarende negativ og positiv biopanning proces at isolere antistoffer, der reagerer på oligomert beta-amyloid hjælp nanogram koncentration af målet 5. Her udvide denne proces for at muliggøre dannelsen af reagenser, som selektivt binder sygdomsspecifikke protein varianter direkte fra humane vævsprøver. I fremtidige studier vil vi for yderligere at undersøge ikke blot den diagnostiske værdi af reagenserne isolerede her, men også vurdere deres terapeutiske relevans for behandling af ALS.
Samlet set skal vores roman AFM baserede biopanning teknologi anvendelse på isolering af nogen sygdom-specifikt protein variant i ethvert biologisk materiale, uden behov for proteinoprensning eller ændring, selv når målantigenet concentrations er ekstremt lave.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fagproduktionen
- Udfør alle fag produktions- og biopanning processer i et biosikkerhed kabinet. Fremstil fager partikler fra de forskellige biblioteker (Tomlinson I og J biblioteker og ark Bibliotek 21) til biopanning proces ved at følge producentens anvisninger (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
BEMÆRK: Vi bruger flere biblioteker i vores panorering proces at øge mangfoldigheden af antistofferne til rådighed. - Kort fortalt, kultur bakterier lagre af de tre biblioteker i 200 ml 2xYT indeholdende 1% glucose og 100 ug / ml ampicillin på en ryster ved 37 ° C, indtil OD600 er 0,4.
- Tilføj 8 x 10 11 KM13 hjælperfag til 200 ml af Tomlinson I og J biblioteker og 8 x 10 11 VCSM13 hjælperfag til 200 ml af arkene biblioteket. Inkuber Bibliotek prøver med hjælperfag i 30 minutter ved 37 ° C uden omrystning.
- Centrifugerkulturer ved 3.000 xg i 10 minutter og resuspender cellepelleten i 200 ml 2xYT med 0,1% glucose, 100 ug / ml ampicillin og 50 ug / ml kanamycin.
- Inkuberes kulturerne O / N ved 30 ° C med omrystning, og derefter spinde i 30 minutter ved 3.300 xg den følgende dag.
- Der tilsættes 50 ml polyethylenglycol (PEG) 8000 i 2,5 M NaCl til 200 ml af supernatanten fra hvert af bibliotekerne, og der inkuberes på is i 1 time. Efter PEG præcipitation dreje løsninger igen i 30 minutter ved 3.300 x g.
- Tilføj 1-2 ml phosphatpufret saltvand (PBS) til cellepelleten (afhængigt af størrelsen af pellet) og overførsel til mikrocentrifugerør.
- Inkuber fagpartikler på is i 1 time ved 37 ° C med lejlighedsvis blanding før centrifugering i 10 minutter ved 11.600 x g. Opsaml supernatanten og opbevares ved -80 ° C.
- Før frysning overføre et lille volumen af fagpartiklerne fra de tre biblioteker til en anden mikrocentrifugerør og titrere hvert bibliotekindividuelt ved hjælp TG1 celler for at bestemme koncentrationen. Nedenfor er en beskrivelse af titer fremgangsmåde til ét bibliotek.
- Grow TG1 celler til OD600 på 0,4. Tilføj 990 pi PBS i 6 mikrocentrifugerør.
- Til det første rør tilsættes 10 pi af fagpartiklerne. Efter blanding fjernes 10 pi fra røret én og tilføje til røret 2. Gentag dette trin for de resterende 4 rør.
- Tilsæt 200 pi TG1 celler til 6 rør og tilsættes 10 pi af hver af de seks fag fortyndinger på disse rør. Lad fagpartikler at inficere i 30 minutter med ingen omrystning ved 37 ° C.
- Plate 100 pi af cellerne til Luria-Bertani agarplader med 100 ug / ml ampicillin (LBA). Inkuber O / N ved 37 ° C og derefter bestemme pfu / ml ved hjælp af antallet af synlige kolonier.
2. Negativ Biopanning Process
BEMÆRK: Undgå for mange fryse tø af fager hele biopanning processen. Ideally, er det bedst at udføre så mange af de negative panorering trin som muligt på en dag. Efter afslutningen af de runder af negativ eller positiv panorering mod hvert mål er det vigtigt at gemme nogle af de fag i tilfælde af forurening på ethvert trin.
- 12 runder af negativ panorering mod bovint serumalbumin (BSA)
- Tilsæt 4 ml 1 mg / ml BSA-opløsning i PBS til 12 immunorør og inkuberes O / N ved 4 ° C.
- Kombinér 1 x 10 12 fag-partikler fra hver af de tre biblioteker (afsat en lille mængde af denne fag blanding til fremtidig kontrol af den negative panorering processen).
- Kassér BSA-opløsningen fra det første rør og vaske røret 2-3 gange med PBS for at fjerne eventuelt ubundet BSA.
- Tilsæt de samlede fagbiblioteker denne første rør, inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur på rotator og indsamle de ubundne fager.
- Gentag trin 2.1.3 med den anden immunrør og tilsæt fag indsamlet fra trin 2.1.4 til dette jegmmunotube. Gentag trin 2.1.4.
- Gentag trin 2.1.3-2.1.4 med de resterende 10 rør af BSA-opløsning og ubundet fag opsamlet efter hver inkubation.
- For at verificere fjernelse af alle BSA fag bindemidler bruger AFM. Tilsættes 10 ul af fag fra trin 2.1.2 og 10 pi af det resterende fag efter trin 2.1.7 separat til 10 ug / ml BSA bundet til spaltet glimmer. En kort udgave af AFM er skitseret i afsnit 8.
- Det er vigtigt at gemme en lille mængde fag efter efterbehandling de mange runder af negativ panning mod hvert mål at verificere succes panorering proces.
- 10 runder af Negativ panorering mod forskellige former af alfa-synuclein
BEMÆRK: I dette projekt ønsker vi at fjerne fag, der kunne binde andre aggregerede former for proteiner, såsom alfa-synuclein (monomer, dimer, trimer, etc.) og så vil vi fjerne nogen af disse fager (målet er at fjerne så mange krydsreaktive fager som muligt). Tillad renset alpha-synuclein at aggregere i mindst 7 dage, så både monomere og oligomere former er til stede for negative panorering.- Forbered 4 immunorør med 500 ug / ml aggregeret alfa-synuclein i PBS og 4 immunorør med 100 ug / ml aggregeret alfa-synuclein og inkuberes O / N ved 4 ° C.
- Kassér opløsning fra et af rørene med 500 ug / ml aggregeret alfa-synuclein, vaskes med PBS og tilsæt fagbibliotek opsamlet efter 12 runder af negativ panning med BSA.
- Inkubér røret i 30 minutter ved stuetemperatur på rotator og indsamle de ubundne fager.
- Gentag trin 2.2.3 og 2.2.4 for de resterende rør med 500 ug / ml aggregeret alfa-synuclein og dernæst rør med 100 ug / ml aggregeret alfa-synuclein hjælp af ubundne fager opsamles hver gang efter trin 2.2.4.
- Gentag trin 2.1.8 ved hjælp af fagen efter den første negativ panning over 500 ug / ml aggregeret alphasynuclein og fagen efter ottende runde af negativ panning over 100 ug / ml af alfa-synuclein.
- For at fjerne alle negative bindemidler mod alfa-synuclein forberede to ekstra immunorør med 500 ug / ml aggregeret alfa-synuclein og gentag trin 2.2.2-2.2.4.
- 10 runder af Negativ panorering mod Sund menneskelige hjerne vævshomogenat
- Tilføj 1x STEN buffer (50 mM Tris (pH 7,6), 150 mM NaCI, 2 mM EDTA, 0,2% NP-40, 0,2% BSA, 20 mM PMSF og protease cocktail inhibitor) til humant hjernevæv 28. Homogeniser ved 24.000 rpm i 1 min, centrifugeres prøverne ved 3000 rpm og indsamle supernatanten.
- Forbered 2 immunorør med 2 ml 50 ug / ml af humant hjernevæv i PBS og 8 immunorør med 10 ug / ml humant hjernevæv og inkuber O / N ved 4 ° C.
- Gentag trin 2.2.3-2.2.5 først med de rør, der indeholder 50 ug / ml humant hjernevæv og derefter med de, der indeholder 10 ug / ml human Bregn væv ved hjælp af ubundet fag opsamlet efter den negative panorering mod alpha-synuclein.
- Gentag trin 2.1.8 ved hjælp af fagen efter den første negativ panning over 50 ug / ml af humant hjernevæv og fagen efter den tiende runde af negativ panning mod humant hjernevæv.
- 8 runder af negativ panorering mod Sund immunfældet TDP-43
- Immunpræcipitere sund TDP-43 protein fra sunde hjernevæv under anvendelse af protokollen beskrevet i afsnit 9. På grund af lavere mængde immunopræcipiteret protein, udføre disse runder af negativ panorering hjælp glimmer.
- Spalte otte glimmer overflader.
- Til den første glimmer tilføje ~ 100 pi af 5 ug / ml af det immunopræcipiterede protein og inkuberes i 5-10 minutter ved stuetemperatur.
- Vask glimmer 5 gange med 0,1% PBS med Tween 20 (PBST).
- Tilføj ~ 100 pi af fagen efter negativ panning over sundt hjernevæv og inkuberes i 5-10 minutter vedRT.
- Ved midtvejs inkubation af trin 2.4.5, udføre trin 2.4.3 ved hjælp af den anden glimmer.
- Saml fagen fra trin 2.4.5 og vaske glimmer 5 gange med 0,1% PBST.
- Vask glimmer fra trin 2.4.6 og tilføje fag fra 2.4.7.
- Gentag trin 2.4.4 til 2.4.9 indtil fagen er negativt panoreres mod alle otte glimmer med immunopræcipiterede protein. Gentag trin 2.1.7 ved hjælp af fagen efter den første og otte runde af negativ panning.
- 2 runder af Negativ panorering mod FTD immunfældet TDP-43
- Immunopræcipitere TDP-43 protein fra hjerner af personer med FTD.
- Spalte 2 glimmer overflader.
- Der tilsættes 50 pi 10 ug / ml FTD TDP-43 til en glimmer. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Vask glimmer 5 gange med 0,1% PBST.
- Der tilsættes 50 pi af fagen opsamlet efter negativ panning mod sund TDP-43. Der inkuberes i 5 min.
- Saml de ubundne fager.
- RepeATS trin 2.5.3 til 2.5.6 med den anden glimmer og ubundne fag indsamlet i 2.5.6.
3. Positiv panorering mod immunfældet TDP-43 fra Personer med ALS
- Immunopræcipitere TDP-43 protein fra hjerner af personer med ALS. Spalte 3 glimmer overflader. Der tilsættes 50 pi 10 ug / ml ALS TDP-43 til en glimmer. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Vask glimmer 5 gange med 0,1% PBST.
- Der tilsættes 50 pi af fagen opsamlet efter negativ panning mod sund TDP-43 til glimmer. Der inkuberes i 5 min.
- Saml de ubundne fager. Også indsamle de bundne fager hjælp af tre elueringstider metoder. Det er vigtigt at holde alle indsamlede fager i disse panorering trin adskilte.
- Først tilsættes 50 pi trypsin (1 mg / ml i PBS) til hver glimmer og inkuberes i ikke mere end 10 min. Saml løsningen og gemme. Dernæst tilsættes 50 pi 100 mM triethylamin (TEA) til hver glimmer og inkuberes i ikke mere end 10 min. Collect opløsningen tilsættes lige så stort volumen 1 M Tris-HCI-buffer pH 7,4 og gem.
- For det tredje, tilsættes 50 pi TG1 ved OD 600 på 0,4 direkte til glimmer og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C. Også tilføje fager opsamlet fra de to elueringsbetingelser metoder 3.3.1 til 100 pi TG1 ved OD 600 på 0,4 og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C.
- Gentag trin 3.1 med et andet glimmer.
- Tag den ubundne fag indsamlet i 3.3.2. ved hjælp af den første glimmer med ALS TDP-43 og føje den til den anden glimmer med ALS TDP-43. Der inkuberes i 5 min.
- Gentag alle trin i 3,3 for disse andet sæt af glimmer.
- Kombiner de TG1 celler inficeret med fager elueret med trypsin fra to ALS TDP-43 glimmer og plade på LBA plader. Gentag den samme proces for TEA og TG1 eluerede fager fra de to ALS TDP-43 glimmer i alt tre plader.
BEMÆRK: På grund af TDP-43 engagement i både ALS og FTD, nogle af klonerne isoleret ito runder af positiv panorering mod ALS TDP-43 kan være specifik for dette mål, men nogle kan også binde FTD. For bedre at isolere ALS specifikke kloner, tage det ubundne fag opsamlet efter 2 runder af negativ panorering mod FTD TDP-43 (da disse to runder af negativ panorering skulle have fjernet ethvert mål, der er reaktiv til FTD TDP-43) og bruge disse fager i endnu en runde af positive panorering mod ALS TDP-43 antigenet på glimmer (forberede ALS TDP-43 glimmer som beskrevet ovenfor i 3.3 og 3.4). - Gentag alle trin i 3.3 med denne tredje ALS glimmer og plade de inficerede TG1 celler på tre LBA plader O / N ved 37 ° C. Den næste dag tælle antallet af kolonier på de 6 LBA plader med de potentielle ALS kloner. Der bør være færre kolonier på tre LBA plader med de potentielle ALS kloner efter den tredje runde af positiv panning i forhold til de tre LBA pladerne efter de to runder af positiv panning.
4. Dyrkning og Phage Produktion af potentielle positive kloner mod ALS Specifikke TDP-43
- Grow hver koloni fra 6 plader i 96-brønds plader indeholdende 100 pi 2 x YT med 1% glucose og 100 ug / ml ampicillin på en ryster ved 37 ° CO / N.
- Den næste dag overføres 10 pi fra brønde, der indeholder kloner fra 3 LBA pladerne efter den tredje runde af positiv panning med ALS TDP-43 protein til mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml 2 x YT med 1% glucose og 100 ug / ml ampicillin .
- Tilføj glycerol til alle kulturer i 96-brønds plader til en slutkoncentration på 15% og fryse pladerne ved -80 ° C. Lad 1 ml kulturer til at vokse i 2-3 timer under omrystning ved 37 ° C.
- Tilsæt 10 9 i KM13 hjælpefag og tillade hjælperfag til at inficere i 1 time ved 37 ° C med omrystning. Centrifuger cellerne i 10 minutter ved 3.000 xg, supernatanten fjernes, og der tilsættes 1 ml 2 x YT med 0,1% glucose, 100 ug / ml ampicillin og 50 ug / ml Kanamycin.
- Kultur cellerne O / N ved 30 ° C med omrystning. Centrifuger rørene ved 3.300 xg i 30 minutter, Supernatanten overføres til nye mikrocentrifugerør og tilsæt 250 pi PEG / NaCl til hvert rør.
- Inkuber rørene på is i 1 time. Centrifugeres rørene igen ved 3.300 xg i 30 min, supernatanten fjernes, og der tilsættes 100 pi PBS til hvert rør.
- Inkuber rørene på is i 1 time. Spin rørene i 10 minutter ved 11.600 xg og overføre supernatanten til nye rør. Opbevar fager ved -80 ° C.
5. Sekventering af potentielle ALS Clones
- Gentag trin 4.2 og lad kulturer vokse O / N ved 37 ° C med omrystning. Den næste dag udføre DNA-plasmid preps af klonerne ifølge producentens anvisninger. Sekventere kloner anvendelse af den passende forward og reverse primere.
6. Screening potentielle positive kloner mod ALS Specifik TDP-43 Brug Indirekte ELISA
- Tilsæt 100 pi af 2,5 pg / ml af ALS, FTD og sundt humant hjernevæv til brøndene i en høj bindende ELISA-plade for hver potentiel ALS klon. Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 1 time med langsom rystning.
- Vask pladerne 3 gange med 0,1% PBST. Tilsæt 200 pi 2% mælkepulver i PBS til brønd og inkuberes pladerne ved 37 ° C i 1 time med langsom rystning.
- Gentag vasketrin og derefter tilsættes 100 pi af hver fag fortyndet mindst 1/100 i PBS til brøndene. Efter inkubering og vask trin, tilsættes 100 pi af 1 / 1.000 anti-M13 HRP til hver brønd. Pladerne skylles, og visualisere ved hjælp af ELISA femto kemiluminescens-substrat kit.
7. scFv Produktion og screening ved indirekte ELISA
- Grow HB 2151 celler til OD600 på 0,4. Tilsæt 5 pi af de forskellige fager til 20 pi af HB 2151-celler. Lad fager 30 min at inficere ved 37 ° C uden omrystning. Opdel LBA-plader i net, såat ca. 20 kloner kan udpladet på hver.
- Tilsæt 5-10 pi hver fag inficeret bakterier til pladen og inkuber O / N ved 37 ° C. Den næste dag tilføje individuelle kolonier til 1 ml 2 x YT med 0,1% glucose og 100 ug / ml ampicillin og rystes ved 37 ° C i 3-4 timer, indtil OD600 er 0,6.
- Tilsæt 1 pi 1 M isopropylthiogalactosid (IPTG) til hvert rør og inkuberes O / N ved 30 ° C med omrystning. Spin rørene ved 11.600 xg i 10 minutter og høste supernatanten for ELISA.
- For ELISA følger de samme procedurer i kapitel 6, undtagen i stedet for fag i 6,5 tilføje scFv ufortyndet og for 6,6 tilsættes 100 pi af 1 / 1.000 9E10 HRP.
8. AFM Process
- Tilføj 10-20 pi målantigenet til spaltet glimmer og inkuberes i 5-10 min. Vask glimmer 5 gange med vand. Tilføj 10-20 ul af fager til glimmer og inkuberes i 5-10 min.
- Vask glimmer 5 gange igen with vand og lade glimmer lufttørre. Visualiser fagbinding hjælp AFM 1. Udfør AFM imaging proces med AFM trykke tilstand med en Nanoscope IIIa controller i luft ved stuetemperatur 29. De silicium AFM prober har en resonansfrekvens på 300 kHz og en fjederkonstant på 40 N / m. Brug en scanningshastighed på 3,05 Hz og en scanningsopløsning på 512 prøver / line.
- Behandle billeder ved grundlæggende udfladning af baggrunden for at sikre, at alle partikelstørrelser er sammenlignelige inden hvert billede. Fag bredde (ikke længde) kan variere fra billede til billede på grund af andre partikelstørrelser og scanningsområdet, men det vil aldrig gå på kompromis rigtigheden af, hvorvidt fag binder til antigenet.
- Hvis der under AFM verifikation for hvert sæt af negative panorering fager er synlige på glimmer, udføre tilføjelse runder, indtil der ikke fager detekteres før man går videre til det næste sæt negativ panorering.
9. Immunopræcipitation af målantigen
- Til isolate målantigenet (TDP-43), der tilsættes 250 ug homogenisere hjernevæv (fra motor cortex), 100 pi 1/100 fortynding af anti-TDP 43 polyklonale antistof og 1x STEN buffer til 700 pi samlet volumen på en Eppendorf røret 28.
- Inkuber O / N ved 4 ° C på en rotator. Wash A / G agaroseperler med 1x STEN buffer 2-3 gange, og der tilsættes 25 ml til vævet blanding. Inkuber ved 4 ° C i 1,5 timer på en rotator, og derefter centrifugeres ved 2,000-4,000 rpm i 1 min.
- Fjern supernatanten og vask pellet én gang med 1x STEN buffer og 5 gange med PBS. Tilføj 40-60 pi 1x STEN buffer til pillen og koges i 5 min. Efter prøverne er cool, centrifuge og indsamle supernatanten. Brug SDS-PAGE og Western blotting for at kontrollere succes immunopræcipitation proces 30.
10. Dot-blot-analyse
- Skær nitrocellulosepapir i små rektangler for hver klon, som skal afprøves. Dot 2 pi ALS, FTD og raske hjerne vævsprøver Unto nitrocellulosepapiret og lad det tørre helt.
- Tilføj 1-2 ml 5% mælkepulver i PBS og lad det rystes i 1 time ved stuetemperatur. Tilsæt 1 ml 1/100 fortynding af hver fag og lad det ryste O / N ved 4 ° C. Vask membranen 3 gange i 10 minutter hver med 0,5% PBST.
- Der tilsættes 1 ml 1 / 1.000 fortynding af anti-M13 HRP og lad det rystes i 1 time ved stuetemperatur. Gentag vaskeproceduren og visualiseres ved hjælp af Western kemiluminescens opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1 skematisk viser den negative panorering proces, som vi fjernet fag aflukning-målantigener fra vores bibliotek ved hjælp immunorør. Vi oprindeligt startede med BSA, da dette er en fælles blokerende agent og enhver fag, der ville reagere ikke-specifikt med dette mål ville være problematisk i fremtidige tests. Dernæst vi fjernet bindemidler aggregerede alpha-synuclein at fjerne fager, der er reaktive med generiske strukturer af aggregerede proteiner (dvs. et antistof, der ville være krydsreaktiv aggregerede alfa-synuclein, TDP-43, Abeta, etc.). AFM Resultaterne viste fag bindende efter 1. runde af negativ panorering mod den aggregerede alfa-synuclein (figur 2A) og ingen binding efter 8 runder (figur 2B). Vi derefter negativt panoreres mod sundt humant hjernevæv for at fjerne fagbinding de mange antigener til stede på raske hjernehomogenat. Figur 2C (figur 2D). Da mængden af sunde og FTD immunpræcipiteret TDP-43-protein til rådighed for panning var lav, ved hjælp glimmer stedet immunorør udnyttes mindre volumen og derfor sænket totalprotein forbrugt (figur 3). Efter 8 runder af negativ panorering mod sund immunopræcipiterede TDP-43, blev fag delt. Halvdelen af fag blev brugt i to runder af negativ panorering mod FTD TDP-43. Formålet var at fjerne eventuelle FTD TDP-43 reaktive kloner (grundet TDP-43 involvering i FTD), og samtidig bevare eventuelle ALS TDP-43-specifikke kloner.
For positive panorering del (figur 4), har vi også ansat glimmer som et substrat for at minimere anvendelse af materialer. Vi brugte det ubundne fag efter FTD TDP-43 negative panorering mod ALS TDP-43 at erhverveALS-specifikke kloner. Vi har også positivt panoreres mod ALS TDP-43 to gange i tilfælde af, at vi ikke opnåede kloner efter brug af ubundne fag fra den negative panorering mod FTD TDP-43. Efter hele panorering processen vores tre elueringsbetingelser metoder gav 154 kloner fra de to positive panorering mod ALS TDP-43 (kloner, der kan være reaktive til ALS og FTD) og 45 potentielle ALS specifikke kloner (ved hjælp af ubundet fag fra FTD TDP- 43 negativ panorering).
For yderligere at reducere de 45 potentielle ALS specifikke kloner, er klonerne sekventeret og kun de kloner uden nogen stopcodoner blev anset yderligere, bortset fra en klon, som dukkede op to gange. Dette efterlod os med 23 potentielle ALS specifikke kloner. Efter udarbejdelsen både fag og opløselig scFv med disse kloner, er de testet i indirekte ELISA-test til specificitet til ALS væv. Næsten alle de fager viste en præference for ALS væv i sundt væv (figur 5). Lignende resultater er OBTained når man sammenligner fag-binding til ALS til FTD væv (figur 6). For fremtidige undersøgelser er det vigtigt, at disse kloner udtrykker høje udbytter af funktionelle scFv'er, så vi fremstillet små partier af de forskellige scFv'er og udføres lignende indirekte ELISA. Sammenligning af scFv-binding til ALS væv til både sundt (figur 7) og FTD væv (figur 8) igen viste selektiv binding til ALS væv i næsten alle kloner.
Vi brugte en anden immunoassay (dot blots) for yderligere at verificere binding til ALS væv og også at fastlægge, hvilke kloner er reaktive i andre immunologiske applikationer. Klon 2A binding til ALS væv er vist (figur 9). Alle disse kloner viste lovende resultater i enten af fagen og scFv ELISA eller begge. Disse resultater bekræfter, at vores AFM baseret biopanning proces er en meget kraftfuld teknik, der kan anvendes til at generere reagenser, der selektivt binder sygdomsspecifikke protein Varimyrer direkte fra komplekse kilder.
Figur 1. Negativ Biopanning Process hjælp immunorør. Skematisk viser den negative biopanning proces. Fager, der er reaktive for proteiner såsom BSA, aggregeret alfa-synuclein og sundt hjernevæv fjernes ved hjælp immunorør. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Bekræftelse af Negative Panorering Virkninger. AFM billeddannelse anvendes til at overvåge de negative panorering skridt mod de forskellige mål for at sikre alle reaktive fager fjernes. Her viser vi nogle af AFM resultater demonstrererniveau fagbinding før og efter den negative panning. (A) fagbinding kan detekteres til aggregerede alpha-synuclein partikler efter den første runde af negativ panning, men (B) nr fag er synlige efter 8 runder af negativ panning. (C ) Efter den første runde af negativ panning mod sundt væv fagbinding er indlysende, men (D) ingen binding detekteres efter 10 runder af negativ panning. Alle billeder er 5 um. De store hvide strukturer på AFM billeder er normalt på grund af salte til stede i buffere eller resterende PEG fra PEG nedbør trin under fag produktion. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Negativ BiopannSkematisk demonstrerer yderligere negativ biopanning hjælp glimmer ing Process hjælp Mica.. På grund af begrænset prøve glimmer overflade anvendes til først at eliminere bindemidler til sunde og derefter FTD immunpræcipiterede TDP-43. Før vi går til de to runder af negativ panorering mod FTD TDP-43, er det fag delt i halve (i tilfælde af mislykket isolering af ALS TDP-43 eksklusive fager under den positive panorering fase). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. ALS Positive Biopanning Process. Skematisk demonstrerer ALS positive biopanning proces. De ubundne fager efter negativ panning over FTD TDP-43 anvendes i en runde af positiv panning over ALS TDP-43 til eluering mere ALSTDP-43-specifikke kloner. Ligeledes bliver to runder af positiv panning over ALS TDP-43 udføres under anvendelse af glimmer overflade og de ubundne fager efter negativ panning mod sund immunpræcipiteret TDP-43 (de bundne fager elueres da disse fager ikke bør binde sund TDP-43, men nogle kan være krydsreaktiv med både ALS og FTD). Tre eluering metoder anvendes (trypsin, te og TG1 celler) for at sikre alle bundne fager fjernes. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. fag-ELISA Screening af potentielle ALS kloner (ALS versus HT). Brug af homogeniseret human ALS, FTD og sundt hjernevæv (HT) prøver vi udførte indirekte ELISA under anvendelse af fag fremstillet af forskellige kloner. Resultaterne er vist som forholdet til raske vævsprøver. Resultaterne viste, at nogle kloner skelner mellem TDP-43 fundet i ALS-patienter og hos raske. ALS, FTD og HT væv er en blanding af hjerne prøver (motor cortex) fra tre personer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6. fag-ELISA Screening af potentielle ALS kloner (ALS versus FTD). Her viser vi de fag-ELISA resultater af ALS versus FTD patienter. De fleste af klonerne har en præference for ALS end FTD. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
_upload / 52584 / 52584fig7highres.jpg "/>
Figur 7. scFv ELISA Screening af potentielle ALS kloner (ALS versus HT). Brug af scFv'er fremstillet af hver klon, vi kan observere kloner, der har en præference for TDP-43 fra ALS-patienter end sund. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. scFv ELISA Screening af potentielle ALS kloner (ALS versus FTD). Succesen med vores panorering proces demonstreres yderligere, når man sammenligner ALS til FTD for de forskellige scFv'er i de indirekte ELISA'er. Klik her for at se en større udgave af dette tal .
Figur 9. Dot blot-analyse af potentielle ALS-kloner. Brug dot blot i stedet for ELISA er en anden teknik til at vise specificiteten af kloner for ALS end FTD eller HT. Klon 2A vises. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af en bevilling fra NIH: R21AG042066. Vi vil gerne takke Philip Schulz for hans bidrag i skabe skærm capture videoer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tomlinson I and J Libraries | MRC (Cambridge, England) | ||
| Sheets Library | MRC (Cambridge, England) | ||
| 2xYT | BD Sciences | 244020 | |
| Glucose | Amresco | 0188-2.5KG | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | Irritant |
| KM13 Helper Phage | MRC (Cambridge, England) | ||
| Kanamycin | OmniPur | 5880 | Irritant |
| Polyethylene Glycol 8000 | OmniPur | 6510 | Irritant |
| Sodium Chloride | Macron | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Amresco | 0404-1KG | Irritant |
| Potassium Chloride | EMD | PX1405-1 | Irritant |
| Potassium Phosphate Monobasic | Amresco | 0781-500G | Irritant |
| TG1 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Luria-Bertani Agar | EMD | 1.10283.0500 | |
| Bovine Serum Albumin | Amresco | 0332-100G | |
| STEN buffer | Crystalgen Inc. | 33429775 | |
| Immunotubes | Thermo Scientific | 470319 | |
| Mica | Spruce Pine Mica | 24365 | |
| Tween 20 | EMD | ||
| Trypsin | Sigma | T-0303 | Irritant |
| Triethylamine | Sigma | T-0886 | Flammable |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | Irritant |
| DNA Plasmid Prep Kit | qiagen | 27106 | Irritant |
| Non-Fat Milk Powder | Carnation | ||
| 96-Well High Binding ELISA Plate | Costar | 3590 | |
| Anti-M13 HRP | GE Healthcare Life Sciences | 27-9421-01 | |
| ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit | Thermo Scientific | 37074 | |
| Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody | ProteinTech | 10782-2-AP | |
| A/G Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| HB 2151 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Isopropylthiogalactoside | Teknova | 13325 | |
| 9e10 HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Nitrocellulose Membrane | Biorad | 162-0115 | Flammable |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall RC 6+ | |
| Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope | Veeco | ||
| AFM Probes | VistaProbes | T300R-10 |
References
- Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies. Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).
- Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity. Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).
- Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein. Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).
- Kasturirangan, S., et al. Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form. Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).
- Kasturirangan, S., et al. Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples. Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).
- Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. Anti-oligomeric Aβ Single-chain Variable Domain Antibody Blocks Aβ-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells. Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).
- Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. Inhibiting β-Secretase Activity in Alzheimer's Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP. Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).
- Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits β-Secretase and Promotes α-Secretase Processing of AβPP. Journal of Alzheimer's Disease. 28, 961-969 (2012).
- Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein. Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).
- Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis. Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).
- Akamatsu, M., et al. A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation. Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).
- Keage, H. A., et al. TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age. Journal of Alzheimer's Disease. 42, 641-650 (2014).
- Honda, D., et al. The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons. FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).
- Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).
- Ling, S. -C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).
- Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).
- Robertson, J., et al. Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS. Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).
- Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS. Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).
- Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons. Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).
- Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
- Sheets, M. D., et al. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).
- Hairul Bahara, N. H., et al. Phage display antibodies for diagnostic applications. Biologicals. 41, 209-216 (2013).
- Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Zhang, X., et al. Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt). Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).
- Liu, H., et al. Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library. Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).
- Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. I. Identification and characterization of a salivary-pellicle-binding peptide by phage display. Archives of Oral Biology. 59, 448-454 (2014).
- Adamson, C. S., et al. Novel single chain antibodies to the prion protein identified by phage display. Virology. 358, 166-177 (2007).
- Hebron, M. L., et al. Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6). Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).
- Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM. Langmuir. 25, 912-918 (2008).
- Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus. Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).
- Jończyk, E., Kłak, M., Międzybrodzki, R., Górski, A. The influence of external factors on bacteriophages—review. Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).
- Hammers, C. M., Stanley, J. R. Antibody Phage Display: Technique and Applications. J Invest Dermatol. 134, e17 (2014).
