Abstract
Parce que les variantes de protéines jouent un rôle essentiel dans de nombreuses maladies, y compris TDP-43 dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA), l'alpha-synucléine dans la maladie de et bêta-amyloïde et tau dans la maladie d'Alzheimer, il est extrêmement important de développer des réactifs spécifiques de morphologie qui peuvent cibler sélectivement Parkinson ces protéine spécifique de la maladie variantes d'étudier le rôle de ces variants dans la pathologie de la maladie et pour des applications diagnostiques et thérapeutiques potentielles. Nous avons mis au point de nouveaux microscopie à force atomique (AFM) sur la base des techniques de biopanning qui permettent l'isolement des réactifs qui reconnaissent sélectivement variants protéiques spécifiques à une maladie. Il ya deux phases clés impliqués dans le processus, les phases positives et négatives panoramiques. Pendant la phase de balayage panoramique négatif, les phages qui sont réactifs aux antigènes hors-cible sont éliminés par de multiples cycles de criblage soustractive utilisant une série d'antigènes soigneusement sélectionnés hors-cible. Un élément clé dans la négativephase de panoramique est en utilisant l'imagerie par AFM pour surveiller le processus et de confirmer que toutes les particules de phages indésirables sont enlevés. Pour la phase de balayage panoramique positif, l'antigène cible d'intérêt est fixé sur une surface de mica et les phages liés sont élues et criblée pour identifier les phages qui se lient sélectivement l'antigène cible. La variante de la protéine cible n'a pas besoin d'être purifié fournir les commandes de panoramique négatifs appropriés ont été utilisés. Même cibler des variants de protéines qui sont seulement présentes à de très faibles concentrations en matière biologique complexe peut être utilisé dans l'étape de panning positive. Grâce à l'application de cette technologie, nous avons acquis des anticorps à des variantes de protéines de TDP-43 que l'on retrouve de manière sélective dans le tissu cérébral SLA humaine. Nous nous attendons à ce que ce protocole doit pouvoir se appliquer à des réactifs qui se lient de manière sélective générant variants protéiques présents dans une grande variété de différents procédés biologiques et de maladies.
Introduction
La présence de variants de protéine a été impliqué comme un facteur dans la progression de nombreuses maladies, dont les maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la SLA et la démence frontotemporale (DFT) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11. Formes oligomères de la protéines bêta-amyloïde et l'alpha-synucléine sont pensés pour être les espèces toxiques responsables de la maladie d'Alzheimer et de Parkinson, respectivement 2,3,4,5. Agrégats de la TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) ont été associés à la SLA et la DFT 12,13,14. Par conséquent réactifs tels que des anticorps qui peuvent cibler sélectivement les différentes variantes de protéines peuvent être des outils puissants pour servir de marqueurs diagnostiques et thérapeutiques potentiels. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur le développement de réactifs qui se lient sélectivement variants de la protéine TDP-43 impliqué dans la SLA, mais la technique décrite dans ce document devrait être applicable à l'isolement des réactifs contre un large éventail de protVariantes ein.
Agrégation cytoplasmique de TDP-43 a été identifiée comme une caractéristique pathologique de la SLA 15,16,17,18,19. Typiquement TDP-43 se trouve dans le noyau de toutes les cellules d'un individu normal, même si elle a tendance à se déplacer entre le cytosol et le noyau 15,17. Toutefois les formes, dans la SLA agrégées de TDP-43 sont détectés dans le cytoplasme des neurones et cellules gliales de sélection avec de plus faibles concentrations trouvées dans le noyau suggérant le mouvement de TDP-43 du noyau vers le cytoplasme au cours de la progression de la maladie 16,20. Bien que l'agrégation de TDP-43 se trouve dans la majorité des cas de SLA, elle ne tient pas compte de tous les cas étant donné que 1% à 2% des cas de SLA ou total (15% -20% des cas de SLA familiale) sont liées à des mutations dans le superoxyde dismutase 1 (SOD1) de 15,17 génique. En raison de l'importance du rôle du TDP-43 dans la grande majorité des cas de SLA, ici nous nous concentrons sur le développement de réactifs à base d'anticorps qui peuvent se lier sélectivement à TDP-43 variantes qui sontprésent dans le tissu cérébral humain SLA utilisant nos techniques de base biopanning roman AFM.
Au départ, nous devons un répertoire varié de domaines de liaison d'anticorps. Nous avons combiné trois phage display chaîne unique domaine variable fragments d'anticorps différents (scFv), les bibliothèques (Tomlinson I et J et draps bibliothèques 21). Le processus de panoramique est divisé en phases positives et négatives panoramiques. Les phages provenant des bibliothèques sont d'abord soumis à la procédure de panning négatif au cours de laquelle phages réactif de multiples antigènes hors cibles sont exclus. Après la fin de chaque cycle de lavage négative contre chaque antigène hors cible, le processus est surveillé par imagerie AFM se assurer que tous les antigènes hors cibles contraignantes phage ont été supprimés. Seulement après vérification par l'AFM imagerie que tous les phages réactifs sont retirés ne nous procédons à la prochaine cible. Pour isoler réactifs contre TDP-43 variantes impliqués dans la SLA, nous avons utilisé les antigènes panoramique négatifs suivants: 1) BSA pour éliminer les phages qui se lient faiblement ou de manière non spécifique à des protéines; 2) agrégé alpha-synucléine pour supprimer phage qui se lient à des éléments structurels génériques de protéines agrégées; 3) des homogénats de tissu cérébral humain pour éliminer les phages qui se lient à des protéines ou d'autres composants présents dans les échantillons post-mortem de tissu cérébral humain sain; 4) immunoprécipité TDP-43 à partir de cerveau humain sain pour enlever phage qui se lient à tous TDP-43 formes associées avec le cerveau humain sain; et 5) immunoprécipité TDP-43 isolé de FTD homogénats de cerveau pour enlever phage qui se lient TDP-43 variantes associés à la non-ALS pathologie. Après élimination de tous phage réactif à tous les antigènes hors cible, nous avons ensuite procédé à la phase de balayage panoramique positif au cours de laquelle des fragments d'anticorps qui se lient à l'antigène d'intérêt sont isolés, dans ce cas, TDP-43 immunoprécipitée à partir de tissu cérébral ALS humain. Ces anticorps isolés peuvent être réactif à des formes agrégées ou modifiées de TDP-43.
"> Conventionnelle phage biopanning se concentre principalement sur la phase de balayage panoramique positif 22,23. Habituellement, la cible d'intérêt est immobilisé, la banque de phages ajoutés et phages liés éluée. Les phages sont ensuite amplifiés et ajoutés à la cible à nouveau. Ce processus d'amplification et incubation est généralement répété plusieurs fois pour augmenter le pourcentage de liaison de phage positif. Bien que des variations de ce procédé ont été largement utilisées pour isoler des anticorps réactifs contre une large gamme d'antigènes cibles, ils nécessitent généralement de grandes quantités d'antigène cible purifiée 24,25,26, 27, alors que notre procédé ne nécessite que des traces de l'antigène cible. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour isoler des réactifs qui antigènes cibles se lient sélectivement qui sont présents à de très faibles concentrations, sans la nécessité d'une purification et le panoramique peut être effectuée directement contre antigène présent dans des échantillons de tissus complexes. L'utilisation de protocoles de panoramique négatifs exhaustives tel que vérifiépar l'AFM assure que clones isolés contre l'antigène positif devraient lier sélectivement la cible, même lorsqu'il ne est pas purifié ou enrichi.Kasturirangan et ses collègues (2003) ont effectué un processus de biopanning négative et positive similaire visant à isoler des anticorps réagissant à la bêta-amyloïde oligomères en utilisant une concentration de l'ordre du nanogramme de la cible 5. Ici, nous développons sur ce processus pour permettre la génération de réactifs qui se lient sélectivement la protéine spécifique de la maladie variantes directement à partir des échantillons de tissus humains. Dans les études futures nous avons l'intention d'approfondir non seulement la valeur diagnostique des réactifs isolés ici, mais aussi évaluer leur pertinence thérapeutique pour le traitement de la SLA.
Dans l'ensemble, notre nouvelle technologie à base de bioadhérence AFM devrait être applicable à l'isolement de ne importe quel variant de protéine spécifique de la maladie dans tout matériel biologique sans la nécessité d'une purification ou la modification de protéines, même lorsque l'antigène cible Concentrations sont extrêmement faibles.
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Protocol
1. Phage production
- Effectuer tous les processus de production de phages et biopanning dans une enceinte de sécurité biologique. Produire phages particules des différentes bibliothèques (bibliothèques Tomlinson I et J et fiches bibliothèque 21) pour le processus de biopanning utilisant les instructions du fabricant (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
NOTE: Nous utilisons plusieurs bibliothèques dans notre processus de panoramique à accroître la diversité des anticorps disponibles. - En bref, les bactéries de la culture stocks des trois bibliothèques dans 200 ml de 2 x YT contenant 1% de glucose et 100 pg / ml d'ampicilline sur un agitateur à 37 ° C jusqu'à ce que la DO 600 est de 0,4.
- Ajouter 8 x 10 11 de phage auxiliaire KM13 à 200 ml de bibliothèques Tomlinson I et J et 8 x 10 11 de phage auxiliaire VCSM13 à 200 ml de la bibliothèque de feuilles. Incuber échantillons bibliothèque avec le phage auxiliaire pendant 30 min à 37 ° C sans agitation.
- Centrifugeuse lacultures à 3000 xg pendant 10 min et remettre en suspension le culot cellulaire dans 200 ml de 2 x YT avec 0,1% de glucose, 100 pg / ml d'ampicilline et 50 ug / ml de kanamycine.
- Incuber les cultures O / N à 30 ° C avec agitation et ensuite tourner pendant 30 min à 3300 xg le lendemain.
- Ajouter 50 ml de polyéthylèneglycol (PEG) 8000 à 2,5 M de NaCl à 200 ml de surnageant provenant de chacune des bibliothèques et incuber sur de la glace pendant 1 heure. Après précipitation au PEG, tourner les solutions à nouveau pendant 30 min à 3300 x g.
- Ajouter 1-2 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) au culot de cellules (selon la taille de la pastille) et transférer dans des tubes de microcentrifugation.
- Incuber particules de phage sur de la glace pendant 1 heure à 37 ° C avec mélange occasionnel avant centrifugation pendant 10 min à 11 600 x g. Recueillir le surnageant et conserver à -80 ° C.
- Avant la congélation, transférer un faible volume des particules de phage à partir des trois bibliothèques dans un autre tube de microcentrifugation et titrer chaque bibliothèqueindividuellement en utilisant des cellules TG1 pour déterminer la concentration. Voici une description du processus de titre pour une bibliothèque.
- Cultiver les cellules TG1 à DO 600 de 0,4. Ajouter 990 pi de PBS à six microtubes.
- Pour ajouter le premier tube 10 ul de particules de phage. Après avoir mélangé, retirer 10 ul du tube d'une seule et ajouter au tube 2. Répétez cette étape pour les quatre tubes restants.
- Ajouter 200 ul de cellules TG1 à six tubes et ajouter 10 ul de chacune des dilutions à six phages ces tubes. Laisser les particules de phage pour infecter pendant 30 minutes sans agitation à 37 ° C.
- Planche 100 ul de cellules Unto Luria-Bertani plaques de gélose avec 100 ug / ml d'ampicilline (LBA). Incuber O / N à 37 ° C, puis déterminer la pfu / ml en utilisant le nombre de colonies visibles.
2. négative Processus biopanning
REMARQUE: Évitez de trop dégel gel des phages au long du processus de biopanning. Çaeally, il est préférable de réaliser le plus grand nombre des étapes panoramiques négatifs que possible dans une journée. Après l'achèvement des cycles de criblage négatif ou positif contre chaque cible, il est important d'économiser du phage en cas de contamination à chaque étape.
- 12 cycles de lavage négative contre sérum-albumine bovine (BSA)
- Ajouter 4 ml de 1 mg / ml de solution de BSA dans du PBS à 12 immunotubes et incuber O / N à 4 ° C.
- Combiné 1 x 10 12 particules de phage de chacun des trois bibliothèques (mettre de côté une petite quantité de ce mélange de phage pour la vérification avenir du processus de panoramique négative).
- Jeter la solution BSA du premier tube et laver le tube 2-3 fois avec du PBS pour éliminer toute BSA non lié.
- Ajouter les banques de phages associés à ce premier tube, incuber pendant 30 min à température ambiante sur le dispositif de rotation et de recueillir les phages non liés.
- Répétez l'étape 2.1.3 avec la deuxième immunotube et ajouter le phage collectées de l'étape 2.1.4 à cette immunotube. Répétez l'étape 2.1.4.
- Répétez les étapes 2.1.3-2.1.4 avec les 10 autres tubes de solution de BSA et le phage non lié recueilli après chaque incubation.
- Pour vérifier l'élimination de toutes les liants BSA de phages utiliser AFM. Ajouter 10 ul du phage de l'étape 2.1.2 et 10 ul de phage restant après l'étape 2.1.7 séparément à 10 pg / ml de BSA liés au mica clivé. Une version abrégée du processus de l'AFM est décrit à la section 8.
- Il est important pour sauver une petite quantité de phage après avoir terminé les nombreux cycles de criblage négative contre chaque cible de vérifier la réussite du processus de panoramique.
- 10 cycles de lavage négative contre diverses formes d'Alpha-synucléine
NOTE: Dans ce projet, nous voulons supprimer phage qui pourraient lier d'autres formes agrégées de protéines telles que l'alpha-synucléine (monomère, dimère, trimère, etc.) et donc nous allons éliminer l'un de ces phages (l'objectif est d'éliminer de nombreux phages cross-réactifs que possible). Laisser l'alpha-synucléine purifiée d'agréger pendant au moins 7 jours afin que les deux formes monomères et oligomères sont présents pour panoramique négative.- Préparer 4 immunotubes avec 500 pg / ml d'alpha-synucléine agrégée dans du PBS et 4 immunotubes avec 100 pg / ml d'alpha-synucléine agrégée et incuber O / N à 4 ° C.
- Jeter la solution de l'un des tubes avec 500 pg / ml d'alpha-synucléine agrégée, laver avec du PBS et ajouter la bibliothèque de phage recueillie après les 12 tours de négative panoramique avec de la BSA.
- Incuber le tube pendant 30 min à température ambiante sur le dispositif de rotation et de recueillir les phages non liés.
- Répétez les étapes 2.2.3 et 2.2.4 pour les tubes restants avec 500 pg / ml d'alpha-synucléine agrégée, puis les tubes avec 100 pg / ml d'alpha-synucléine agrégée en utilisant le phage non lié recueillies chaque fois après l'étape 2.2.4.
- Répétez l'étape 2.1.8 en utilisant le phage après le premier négatif de panning contre 500 pg / ml d'alpha agrégéesynucléine et le phage après le huitième cycle de lavage négative contre 100 pg / ml d'alpha-synucléine.
- Pour éliminer tous les liants négatives contre l'alpha-synucléine préparer deux immunotubes supplémentaires avec 500 pg / ml d'alpha-synucléine agrégée et répétez les étapes 2.2.2-2.2.4.
- 10 cycles de lavage négative contre homogénat de tissu sain Human Brain
- Ajouter 1x STEN tampon (50 mM de Tris (pH 7,6), NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 0,2% de NP-40, 0,2% de BSA, 20 mM de PMSF et cocktail inhibiteur de protease) de tissu cérébral humain 28. Homogénéiser à 24 000 rpm pendant 1 minute, centrifuger les échantillons à 3000 tours par minute et recueillir le surnageant.
- Préparer deux immunotubes avec 2 ml de 50 pg / ml de tissu cérébral humain dans du PBS et 8 immunotubes avec 10 ug / ml de tissu cérébral humain et incuber O / N à 4 ° C.
- Répéter les étapes 2.2.3-2.2.5 premier avec les tubes contenant 50 ug / ml de tissu cérébral humain, puis avec ceux contenant 10 ug / ml de b humainestissus de pluie en utilisant le phage non lié recueilli après le panoramique négative contre l'alpha-synucléine.
- Répétez l'étape 2.1.8 en utilisant le phage après le premier négatif de panning contre 50 pg / ml de tissu de cerveau humain et le phage après le dixième cycle de criblage négatif contre le tissu cérébral humain.
- 8 cycles de criblage négatif contre saine immunoprécipités TDP-43
- Immunoprécipiter saine protéine TDP-43 à partir de tissu cérébral humain en bonne santé en utilisant le protocole décrit dans l'article 9. En raison de la quantité plus faible de la protéine immunoprécipitée, effectuer ces cycles de criblage négatif en utilisant du mica.
- Cliver huit surfaces de mica.
- Pour la première mica ajouter ~ 100 pl de 5 pg / ml de la protéine immunoprécipitée et incuber pendant 5-10 min à température ambiante.
- Laver le mica 5 fois avec du PBS avec 0,1% de Tween 20 (PBST).
- Ajouter ~ 100 ul du phage après le panoramique négative contre le tissu cérébral sain et incuber pendant 5-10 min àRT.
- À mi-chemin incubation de l'étape 2.4.5, effectuer l'étape 2.4.3 en utilisant le deuxième mica.
- Recueillir le phage de l'étape 2.4.5 et laver le mica 5 fois avec 0,1% PBST.
- Laver le mica de l'étape 2.4.6 et ajouter le phage de 2.4.7.
- Répétez les étapes 2.4.4 à 2.4.9 jusqu'à ce que le phage est éreinté négativement contre les huit mica avec la protéine immunoprécipitée. Répétez l'étape 2.1.7 en utilisant le phage après la première et huit cycle de lavage négative.
- 2 cycles de lavage négative contre FTD immunoprécipités TDP-43
- Immunoprécipitat protéine TDP-43 dans les cerveaux des individus atteints de DFT.
- Cliver deux surfaces de mica.
- Ajouter 50 ul de 10 ug / ml de FTD TDP-43 à une mica. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Laver le mica 5 fois avec 0,1% PBST.
- Ajouter 50 ul du phage recueilli après panoramique négative contre saine TDP-43. Incuber pendant 5 min.
- Recueillir les phages non liés.
- Repeats étapes 2.5.3 à 2.5.6 avec la deuxième mica et le phage non lié recueillis dans 2.5.6.
3. positive Panoramique contre immunoprécipités TDP-43 de personnes atteintes de la SLA
- Immunoprécipitat protéine TDP-43 à partir de cerveaux de personnes atteintes de la SLA. Cliver trois surfaces de mica. Ajouter 50 ul de 10 ug / ml d'ALS TDP-43 à une mica. Incuber pendant 5 min à température ambiante. Laver le mica 5 fois avec 0,1% PBST.
- Ajouter 50 ul du phage recueilli après panoramique négative contre saine TDP-43 au mica. Incuber pendant 5 min.
- Recueillir les phages non liés. Également recueillir les phages liés à l'aide de trois méthodes d'élution. Il est important de garder tous les phages recueillies dans ces étapes panoramiques distincts.
- Tout d'abord, ajouter 50 pi de trypsine (1 mg / ml dans du PBS) pour chaque mica et incuber pendant pas plus de 10 min. Recueillir la solution et économisez. Ensuite, ajouter 50 pi de triéthylamine 100 mM (TEA) à chaque mica et incuber pendant pas plus de 10 min. Collect la solution, ajouter un volume égal de 1 M de tampon Tris-HCl pH 7,4 et sauvegarder.
- Troisièmement, ajouter 50 ul de TG1 à une DO 600 de 0,4 directement au mica et incuber pendant 30 min à 37 ° C. Ajoutez également les phages recueillies auprès des deux méthodes d'élution en 3.3.1 à 100 pi de TG1 à DO 600 de 0,4 et incuber pendant 30 min à 37 ° C.
- Répétez les étapes 3.1 avec un second mica.
- Prenez le phage non lié recueillies au point 3.3.2. en utilisant la première mica avec la SLA TDP-43 et l'ajouter à la deuxième mica avec la SLA TDP-43. Incuber pendant 5 min.
- Répéter toutes les étapes de 3,3 secondes pour ces ensembles de mica.
- Combiner les cellules TG1 infectées par les phages élues avec de la trypsine de la SLA deux TDP-43 mica et la plaque sur des plaques LBA. Répétez le même processus pour le thé et TG1 élue phages de la SLA deux TDP-43 mica pour un total de trois plaques.
NOTE: En raison de la participation de TDP-43 dans les deux SLA et la DFT, certains des clones isolés dans ledeux cycles de criblage positif contre la SLA TDP-43 peuvent être spécifiques à cet objectif, mais certains peuvent également se lier FTD. Pour mieux isoler SLA clones spécifiques, prendre la phages non liés recueilli après deux cycles de criblage négative contre FTD TDP-43 (puisque ces deux cycles de criblage négative auraient enlevé toute cible qui est réactif à FTD TDP-43) et utiliser ces phages une autre série de panoramique positif contre l'antigène SLA TDP-43 de mica (préparer la SLA TDP-43 mica comme décrit ci-dessus en 3.3 et 3.4). - Répéter toutes les étapes 3.3 avec cette troisième mica SLA et plaque les cellules TG1 infectées sur trois plaques LBA O / N à 37 ° C. Le lendemain, compter le nombre de colonies sur les six plaques LBA avec les clones potentiels SLA. Il devrait y avoir moins de colonies sur les trois plaques LBA avec les clones potentiels ALS après le troisième tour de panoramique positive par rapport aux trois plaques LBA après les deux cycles de criblage positif.
4. La culture et le phage produitions des clones positifs potentiels contre la SLA spécifique TDP-43
- Pousser chaque colonie des six plaques dans des plaques à 96 puits contenant 100 pi de 2 x YT avec 1% de glucose et 100 pg / ml d'ampicilline sur un agitateur à 37 ° CO / N.
- Le jour suivant transférer 10 ul des puits contenant les clones des plaques LBA 3 après le troisième cycle de lavage positive avec la protéine ALS TDP-43 à microtubes contenant 1 ml de 2xYT avec 1% de glucose et 100 pg / ml d'ampicilline .
- Ajouter glycérol à toutes les cultures dans les plaques à 96 puits à une concentration finale de 15% et congeler les plaques à -80 ° C. Permettre aux cultures de 1 ml de croître pendant 2-3 heures sous agitation à 37 ° C.
- Ajouter 10 9 de phage assistant KM13 et permettre au phage assistant pour infecter pendant 1 heure à 37 ° C avec agitation par secousses. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 3000 xg, jeter le surnageant et ajouter 1 ml de 2xYT avec 0,1% de glucose, 100 pg / ml d'ampicilline et 50 ug / ml de Kanamycin.
- Culture des cellules O / N à 30 ° C avec agitation. Centrifuger les tubes à 3300 g pendant 30 min, transférer le surnageant dans de nouveaux tubes à centrifuger et ajouter 250 ul PEG / NaCl à chaque tube.
- Incuber les tubes sur de la glace pendant 1 heure. Centrifuger les tubes à nouveau à 3300 g pendant 30 min, jeter le surnageant et ajouter 100 l de PBS dans chaque tube.
- Incuber les tubes sur de la glace pendant 1 heure. Faites tourner les tubes pendant 10 min à 11 600 xg et transférer le surnageant dans de nouveaux tubes. Conserver les phages à -80 ° C.
5. Le séquençage des clones potentiels SLA
- Répétez l'étape 4.2 et permet aux cultures de croître O / N à 37 ° C avec agitation. Le lendemain effectuer préparations d'ADN plasmidique des clones selon les instructions du fabricant. Séquencer les clones en utilisant le cas échéant amorces sens et antisens.
6. Le dépistage potentiels clones positifs contre la SLA spécifique TDP-43 Utilisation ELISA indirecte
- Ajouter 100 ul de 2,5 ug / ml de la SLA, DFT et les tissus sains du cerveau humain dans les puits d'une plaque ELISA de liaison élevée pour chaque clone potentiel SLA. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 1 heure avec une agitation lente.
- Laver les plaques trois fois avec 0,1% PBST. Ajouter 200 ul de 2% de lait en poudre dans du PBS pour le puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant 1 h avec une agitation lente.
- Répéter l'étape de lavage, puis ajouter 100 ul de chaque phage dilué au moins 1/100 en PBS dans les puits. Après l'incubation et laver étapes, ajouter 100 pi de 1 / 1,000 anti-M13 HRP dans chaque puits. Laver les plaques et de visualiser en utilisant le kit de substrat de chimioluminescence femto ELISA.
7. Production scFv et préalable au moyen d'ELISA indirect
- Cultivez HB 2151 cellules à DO 600 de 0,4. Ajouter 5 ul des différents phages 20 pi des cellules HB 2151. Autoriser les phages 30 min pour infecter à 37 ° C sans agitation. Divisez plaques LBA dans les réseaux afinqu'environ 20 clones peuvent être étalées sur chaque.
- Ajouter 5-10 ul de chaque phages infectés bactéries de la plaque et incuber O / N à 37 ° C. Le jour suivant, ajouter des colonies individuelles de 1 ml de 2 x YT avec 0,1% de glucose et 100 pg / ml d'ampicilline et agiter à 37 ° C pendant 3-4 h jusqu'à ce que la DO 600 est de 0,6.
- Ajouter 1 pi de 1 M isopropylthiogalactoside (IPTG) à chaque tube et incuber O / N à 30 ° C avec agitation par secousses. Faites tourner les tubes à 11 600 g pendant 10 min et récolter le surnageant pour les tests ELISA.
- Pour le test ELISA suivre les mêmes procédures de la section 6, sauf qu'au lieu de phages dans 6,5 ajouter le scFv pur et à 6,6 ajouter 100 pi de 1/1000 9E10 HRP.
8. Processus AFM
- Ajouter 10 à 20 pi de l'antigène cible de mica clivé et incuber pendant 5-10 min. Laver le mica 5 fois avec de l'eau. Ajouter 10-20 ul des phages au mica et incuber pendant 5-10 min.
- Laver le mica 5 fois wi nouveaue l'eau et laisser le mica sécher à l'air. Visualisez phage liaison en utilisant une AFM. Exécutez le processus d'imagerie AFM en utilisant le mode tapant AFM avec un contrôleur Nanoscope IIIa dans l'air à température ambiante 29. Les sondes AFM de silicium ont une fréquence de résonance de 300 kHz et une constante de rappel de 40 N / m. Utilisez une vitesse de balayage de 3,05 Hz et une résolution de numérisation de 512 échantillons / ligne.
- Traiter les images en aplatissant de base de l'arrière-plan afin de se assurer que toutes les tailles de particules sont comparables à l'intérieur de chaque image. largeur de phages (pas de longueur) peut varier d'une image à cause d'autres tailles de particules et la zone de numérisation, mais il ne sera jamais compromettre l'exactitude ou non phage se lie à l'antigène.
- Si lors de la vérification AFM pour chaque ensemble de phages de panoramique négatifs sont visibles sur le mica, effectuer des tours d'addition jusqu'à ce qu'aucune phages sont détectés avant de passer à la prochaine série de panoramique négative.
9. Immunoprécipitation de la cible Antigène
- Pour Isolate l'antigène cible (TDP-43), ajouter 250 ug de tissu homogénéiser du cerveau (du cortex moteur), 100 pi d'une dilution de 1/100 de l'anti-TDP 43 anticorps polyclonaux et 1x STEN tampon pour 700 ul volume total à un Eppendorf tube 28.
- Incuber O / N à 4 ° C sur un agitateur. Lavage A / G billes d'agarose avec le tampon 1x STEN 2-3 fois et ajouter 25 ml au mélange des tissus. Incuber à 4 ° C pendant 1,5 heure sur un agitateur, puis centrifuger à 2,000-4,000 rpm pendant 1 min.
- Eliminer le surnageant et laver le culot une fois avec 1 x tampon STEN et 5 fois avec du PBS. Ajouter 40-60 pi de tampon 1x STEN au culot et faire bouillir pendant 5 min. Après les échantillons sont cool, centrifugeuse et recueillir le surnageant. Utilisez SDS-PAGE et Western blot pour vérifier le succès du processus de immunoprécipitation 30.
10. Dot Blot Analysis
- Couper le papier de nitrocellulose en petits rectangles pour chaque clone qui sera testé. Dot 2 ul de la SLA, FTD et des échantillons de tissus cérébraux humains sains Unto le papier de nitrocellulose et laissez sécher complètement.
- Ajouter 1-2 ml de 5% de lait en poudre dans du PBS et laisser agiter pendant une heure à température ambiante. Ajouter 1 ml de dilution de 1/100 de chaque phage et laisser secouer O / N à 4 ° C. Laver la membrane trois fois pendant 10 minutes chacune avec 0,5% du PBST.
- Ajouter 1 ml de 1 / 1,000 dilution des anti-M13 HRP et laisser agiter pendant une heure à température ambiante. Répétez la procédure de lavage et visualisées en utilisant une solution de chimioluminescence occidentale.
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Representative Results
Dans la figure 1, le schéma montre le processus de panoramique négative par laquelle nous avons retiré antigènes hors objectif contraignant de notre bibliothèque à l'aide immunotubes phage. Nous avons commencé avec de la BSA puisque ce est un agent de blocage commun et toute phage qui réagit de manière non spécifique avec cet objectif serait problématique dans les immunoessais futures. Ensuite, nous avons supprimé les liants à agrégée alpha-synucléine pour éliminer phage qui sont réactifs avec des structures génériques de protéines agrégées (ce est à dire, un anticorps qui serait une réaction croisée avec agrégé alpha-synucléine, TDP-43, Abeta, etc.). les résultats de l'AFM ont montré obligatoire après une ronde de panoramique négative contre l'alpha-synucléine agrégée (figure 2A) et aucune liaison après 8 tours (figure 2B) phage. Nous avons ensuite batée négativement contre le tissu du cerveau humain sain de supprimer la liaison des antigènes présents dans de nombreux saine homogénat de cerveau humain phage. Figure 2C (Figure 2D). Puisque la quantité de santé et FTD immunoprécipitée protéine TDP-43 disponible pour panoramique était faible, en utilisant du mica plutôt que immunotubes utilisés moins de volume et donc abaissés protéine totale consommée (Figure 3). Après huit cycles de criblage négative contre saine TDP-43 immunoprécipitée, le phage a été divisé. La moitié du phage a été dépensé en deux cycles de criblage négative contre FTD TDP-43. L'objectif était d'éliminer toute FTD TDP-43 clones réactifs (en raison de la participation de TDP-43 dans la DFT), tout en conservant toute la SLA TDP-43 clones spécifiques potentiels.
Pour la partie panoramique positive (Figure 4), nous avons également eu recours à mica comme substrat pour minimiser l'utilisation de matériel. Nous avons utilisé le phage non lié après la FTD TDP-43 panoramique négative contre la SLA TDP-43 d'acquérir touteALS clones spécifiques. Nous avons également éreinté positivement contre la SLA TDP-43 deux fois dans le cas où nous ne avons pas obtenu clones après avoir utilisé le phage non lié du panoramique négative contre FTD TDP-43. Après le processus de panoramique ensemble, nos trois méthodes d'élution ont donné 154 clones des deux panoramique positif contre la SLA TDP-43 (clones qui peuvent être réactif à la SLA et la DFT) et 45 potentiels clones spécifiques SLA (en utilisant le phage non lié du FTD TDP 43 panoramique négative).
Pour réduire encore les 45 clones potentiels spécifiques de la SLA, les clones sont séquences et seuls les clones sans aucun codon de terminaison ont été considérées en outre, sauf pour un clone qui se est présenté deux fois. Cela nous a laissé 23 clones potentiels spécifiques SLA. Après avoir préparé la fois phage et scFv soluble avec ces clones, ils sont testés dans ELISA indirects pour la spécificité des tissus SLA. Presque tous les phages ont montré une préférence pour la SLA tissus sur le tissu sain (Figure 5). Des résultats similaires sont obtained lorsque l'on compare la liaison à la SLA au tissu FTD phage (figure 6). Pour les études futures, il est essentiel que ces clones expriment des rendements élevés de scFv fonctionnels, donc nous avons produit de petits lots de différents scFv et effectué des tests ELISA indirects similaires. La comparaison de la liaison de scFv tissu SLA à la fois sain (figure 7) et le tissu FTD (figure 8) de nouveau montré une liaison sélective au tissu ALS dans presque tous les clones.
Nous avons utilisé une autre immunologique (de transferts de points) de continuer à vérifier la liaison aux tissus SLA et aussi pour déterminer les clones sont réactifs immunologiques dans d'autres applications. Clone de liaison au tissu ALS 2A est représenté (figure 9). Tous ces clones ont montré des résultats prometteurs dans un ou les deux du phage scFv et ELISA. Ces résultats confirment que notre processus de biopanning sur la base de l'AFM est une technique très puissante qui peut être utilisé pour générer des réactifs qui se lient sélectivement protéine spécifique de la maladie varifourmis directement à partir de sources complexes.
Figure 1. Processus de biopanning négatif Utilisant immunotubes. Schéma montrant le processus de biopanning négative. Phages qui sont réactifs aux protéines tels que BSA, agrégé alpha-synucléine et le tissu cérébral sain sont enlevés en utilisant immunotubes. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Confirmation de résultats négatifs de panoramique. Imagerie AFM est utilisé pour surveiller les étapes panoramiques négatives contre les différentes cibles pour assurer tous les phages réactifs sont retirés. Ici, nous montrons quelques-uns des résultats de l'AFM démontrant laniveau de liaison avant et après le panoramique négative phage. obligatoire (A) Phage peuvent être détectés à des particules alpha-synucléine agrégées après le premier cycle de criblage négatif, mais (B) ne phages sont visibles après 8 cycles de criblage négatif. (C ) Après le premier cycle de lavage négative contre phage tissus sains liaison est évident, mais (D) aucune liaison ne est détecté après 10 cycles de criblage négatif. Toutes les images sont 5 um. Les grandes structures blanches sur les images AFM sont généralement dues à des sels présents dans les tampons ou PEG résiduelle de l'étape de précipitation PEG pendant la production de phage. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. négatif Biopanning procédé utilisant Mica. démontrer schématique biopanning négatif supplémentaire en utilisant du mica. En raison de l'échantillon limité surface de mica est utilisé pour éliminer premier liants à une saine puis FTD immunoprécipité TDP-43. Avant de passer aux deux cycles de criblage négative contre FTD TDP-43, le phage est divisé en deux (dans le cas de l'isolement échec de la SLA TDP-43 phages exclusifs pendant la phase de panoramique positif). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Processus SLA positif biopanning. Schéma montrant le processus de biopanning positif SLA. Les phages non liés après le panoramique négative contre FTD TDP-43 sont utilisés dans un cycle de criblage positif contre la SLA TDP-43 pour éluer plus SLATDP-43 clones spécifiques. En outre, deux cycles de criblage positif contre la SLA TDP-43 sont réalisées en utilisant surface de mica et les phages non liés après panoramique négative contre cependant saine immunoprécipité TDP-43 (les phages liés sont élues depuis ces phages ne devraient pas lier saine TDP-43, certains peut être une réaction croisée avec deux SLA et la DFT). Trois méthodes d'élution sont utilisés (trypsine, du thé et des cellules TG1) pour assurer que tous les phages liés sont retirés. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Phage ELISA dépistage des clones potentiels SLA (SLA __gVirt_NP_NNS_NNPS<__ contre HT). Utilisation humaine homogénéisé SLA, FTD et le tissu cérébral sain (HT) des échantillons que nous avons effectués ELISA indirect en utilisant phage produite à partir de différents clones. Les résultats sont représentés comme le rapport à des échantillons de tissus sains. Les résultats ont montré que certains clones distinction entre TDP-43 trouvé chez les patients SLA et ceux en bonne santé. Les tissus de la SLA, FTD et HT sont un mélange d'échantillons de cerveau (cortex moteur) à partir de trois personnes. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Phage ELISA dépistage des potentiels Clones SLA (SLA contre FTD). Ici, nous montrons les phages résultats ELISA de la SLA par rapport patients FTD. La plupart des clones ont une préférence pour la SLA plus FTD. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 7. scFv ELISA dépistage des potentiels Clones SLA (SLA contre HT). En utilisant les scFv produits à partir de chaque clone, nous pouvons observer des clones qui ont une préférence pour le TDP-43 chez des patients atteints de SLA plus sain. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8. scFv criblage ELISA des clones potentiels SLA (SLA contre FTD). Le succès de notre processus de panoramique est en outre démontré lorsque l'on compare la SLA à FTD pour les différents scFv dans les tests ELISA indirects. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .
Figure 9. Dot Blot analyse du potentiel Clones SLA. Utilisation dot blot lieu de ELISA est une autre technique pour montrer la spécificité des clones pour la SLA plus FTD ou HT. Clone 2A se affiche. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Acknowledgments
Cette recherche a été financée par une subvention du NIH: R21AG042066. Nous tenons à remercier Philip Schulz pour ses contributions dans la création des vidéos de capture d'écran.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tomlinson I and J Libraries | MRC (Cambridge, England) | ||
| Sheets Library | MRC (Cambridge, England) | ||
| 2xYT | BD Sciences | 244020 | |
| Glucose | Amresco | 0188-2.5KG | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | Irritant |
| KM13 Helper Phage | MRC (Cambridge, England) | ||
| Kanamycin | OmniPur | 5880 | Irritant |
| Polyethylene Glycol 8000 | OmniPur | 6510 | Irritant |
| Sodium Chloride | Macron | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Amresco | 0404-1KG | Irritant |
| Potassium Chloride | EMD | PX1405-1 | Irritant |
| Potassium Phosphate Monobasic | Amresco | 0781-500G | Irritant |
| TG1 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Luria-Bertani Agar | EMD | 1.10283.0500 | |
| Bovine Serum Albumin | Amresco | 0332-100G | |
| STEN buffer | Crystalgen Inc. | 33429775 | |
| Immunotubes | Thermo Scientific | 470319 | |
| Mica | Spruce Pine Mica | 24365 | |
| Tween 20 | EMD | ||
| Trypsin | Sigma | T-0303 | Irritant |
| Triethylamine | Sigma | T-0886 | Flammable |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | Irritant |
| DNA Plasmid Prep Kit | qiagen | 27106 | Irritant |
| Non-Fat Milk Powder | Carnation | ||
| 96-Well High Binding ELISA Plate | Costar | 3590 | |
| Anti-M13 HRP | GE Healthcare Life Sciences | 27-9421-01 | |
| ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit | Thermo Scientific | 37074 | |
| Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody | ProteinTech | 10782-2-AP | |
| A/G Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| HB 2151 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Isopropylthiogalactoside | Teknova | 13325 | |
| 9e10 HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Nitrocellulose Membrane | Biorad | 162-0115 | Flammable |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall RC 6+ | |
| Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope | Veeco | ||
| AFM Probes | VistaProbes | T300R-10 |
References
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