Abstract
タンパク質変異体は、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、パーキンソン病におけるα-シヌクレインおよびアルツハイマー病におけるβアミロイドおよびタウにおけるTDP-43を含む多くの疾患において重要な役割を果たしているので、選択的に標的とすることができる形態学的試薬を開発することが非常に重要であるこれらの疾患特異的タンパク質が疾患の病状および潜在的な診断および治療用途のためにこれらの変異体の役割を研究する変異体である。我々は、選択的に、疾患特異的タンパク質の変異体を認識する試薬の単離を可能にする新規の原子間力顕微鏡（AFM）ベースのバイオパニング技術を開発した。プロセスに関与する2つの主要な相、負および正のパニング段階がある。負のパン·フェーズでは、オフターゲット抗原に反応性のあるファージは、厳選されたオフターゲット抗原の一連を利用し、サブトラクティブパニングの複数ラウンドを排除している。負の重要な機能パニング段階プロセスを監視し、すべての望ましくないファージ粒子が除去されていることを確認するために、AFMイメージングを利用している。正のパニング段階のために、関心対象の標的抗原は、雲母表面上に固定され、結合したファージを溶出させ、選択的に標的抗原に結合するファージを同定するためにスクリーニングされる。標的タンパク質の変異体は、適切な負のパンコントロールが使用されている提供精製する必要はない。複雑な生物学的物質に非常に低い濃度でのみ存在するタンパク質変異体は、正のパニング段階で利用することができるターゲット。この技術を適用することにより、我々は選択的に、人間のALSの脳組織に見られるTDP-43のタンパク質変異体に対する抗体を獲得した。我々は、このプロトコルは、選択的に異なる生物学的プロセスおよび疾患の多種多様に存在するタンパク質の変異体に結合する試薬を生成することに適用可能であるべきであることを期待する。
Introduction
タンパク質変異体の存在は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ALSおよび前頭側頭型認知症（FTD）1,2,3,4,5,6,7,8,9などの神経変性疾患を含む多くの疾患の進行の要因として関与している、10,11。タンパク質βアミロイドおよびα-シヌクレインのオリゴマー形態は、それぞれ2,3,4,5、アルツハイマー病及びパーキンソン病の原因で有毒種であると考えられている。 TAR DNA結合タンパク質43（TDP-43）の凝集体は、ALSとFTD 12,13,14にリンクされている。したがってそのような選択的に異なるタンパク質変異体は、診断マーカーおよび潜在的な治療薬として機能するための強力なツールであることができるターゲットにすることができる抗体などの試薬。本研究では、しかし、本論文で概説技術はprotの広い範囲に対して、試薬の分離に適用可能であるべきである、選択的にALSに関与TDP-43タンパク質の変異体を結合した試薬の開発に注力EIN変種。
TDP-43の細胞質の凝集は、ALS 15,16,17,18,19における病理学的特徴として同定されている。これは、サイトゾルおよび核15,17間を移動する傾向があるが、典型的にTDP-43は、正常な個体からのすべての細胞の核内に見出される。しかし、ALSにTDP-43の形態は、疾患の進行16,20の間に核から細胞質へのTDP-43の動きを示唆して核内に見つかったより低い濃度で選択したニューロンとグリアの細胞質で検出された集約。 TDP-43の凝集がALS症例の大多数において見出されているが、1％-2合計ALS症例の％（または家族性ALS症例の15％-20％）の変異にリンクされているので、すべての場合を考慮していないスーパーオキシドジスムターゼ1（SOD1）遺伝子15,17。そのためALS症例の大多数においてTDP-43の重要な役割のために、ここでは選択的にTDP-43変異体にも結合することができる抗体ベースの試薬の開発に注力私たちの小説AFMベースのバイオパニング技術を利用して、人間のALSの脳組織に存在する。
当初我々は、抗体結合ドメインの多様なレパートリーを必要としています。我々は、3つの異なるファージディスプレイ単鎖可変ドメイン抗体フラグメント（scFvの）ライブラリ（トムリンソンIとJとシートライブラリ21）を合わせた。パニングプロセスは、負および正のパニング段階に分けられる。ライブラリーからのファージを、最初に、複数のオフターゲット抗原が排除されるに反応するファージその間ネガティブパニングプロセスに供される。各オフターゲット抗原に対するネガティブパニングの各ラウンドが終了した後、プロセスは、オフターゲット抗原に結合する全てのファージが除去されたことを確認するためにAFMイメージングによってモニターされる。のみすべての反応性のファージを除去したAFMイメージングによって確認した後、我々は次の目標に進んでください。 ALSに関与TDP-43の変種に対する試薬を分離するために、我々は以下の負のパンニングの抗原を利用：タンパク質に弱く又は非特異的に結合するファージを除去するための1）BSA。凝集したタンパク質のジェネリック構造要素に結合するファージを除去するための2）凝集したα-シヌクレイン。 3）ヒト脳組織ホモジネートは、任意のタンパク質または健康なヒトの脳組織の死後のサンプル中に存在する他の成分に結合するファージを除去する。 4）健康なヒトの脳に関連するすべてのTDP-43のフォームに結合するファージを除去するために健康なヒトの脳からTDP-43を免疫沈降した。 5）非ALSの病態に関連TDP-43変異体を結合するファージを除去するためにFTD脳ホモジネートからTDP-43の単離された免疫沈降した。すべてのオフターゲット抗原に対する反応性のすべてのファージを除去した後、我々は、この場合には、TDP-43は、ヒトのALS脳組織から免疫沈降し、目的の抗原に結合する抗体断片が単離され、その間に正のパニング段階に進む。これらの単離された抗体は、TDP-43の集約または改変された形態への反応性であり得る。
">従来のファージパニングは正のパニング段階22,23に主に焦点を当てている。通常、目的の標的が固定化され、ファージライブラリーを添加し、結合したファージは、この増幅は、インキュベーション工程をファージを次に増幅される。溶出し、再びターゲットに追加このプロセスのバリエーションは、標的抗原の広い範囲に対する抗体試薬を単離するために広く使用されてきたが、通常は正の結合ファージの割合を増加させるために数回繰り返され、それらは一般的に精製された標的抗原24,25,26を大量に必要とし、本プロセスは、ターゲット抗原の微量必要一方、 図27は 、ここで説明するプロトコルは、精製およびパンを必要とせずに非常に低い濃度で存在している選択的に結合する標的抗原は、に対して直接行うことができる試薬を単離することができる複雑な組織サンプル中に存在する抗原。確認されるように徹底的なネガティブパニングプロトコルの使用AFMにより正の抗原に対する単離されたクローンを選択的に精製または濃縮なくても標的に結合する必要があることを保証します。Kasturiranganら（2003）は、ターゲット5ナノグラム濃度を用いてオリゴマーβ-アミロイドに対して反応性の抗体を単離するために類似の負及び正のバイオパニングプロセスを行った。ここでは、選択的に結合する疾患特異的タンパク質がヒト組織サンプルから直接改変試薬の生成を有効にするには、このプロセスに展開します。今後の研究では、我々はさらにだけでなく、ここで分離された試薬の診断価値を調査するだけでなく、ALSの治療のためにそれらの治療の関連性を評価していきます。
全体として、本発明の新規なAFMベースのバイオパニング技術は、タンパク質精製または修飾を必要とせずに、任意の生物学的材料の任意の疾患特異的タンパク質変異体の単離に適用可能であるべきである場合でも、標的抗原concentratioナノは極めて低い。
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Protocol
1.ファージ生産
- バイオセーフティキャビネット内のすべてのファージ生産とバイオパンニング処理を実行する。製造元の指示（http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf）を使用してバイオパニングプロセスの異なるライブラリーからのファージ粒子（トムリンソンI及びJライブラリとシートライブラリ21）を生成する。
注：我々は、利用可能な抗体の多様性を高めるために私たちのパニングプロセスで複数のライブラリを使用しています。 - OD 600が 0.4になるまで、1％グルコースおよび37℃でシェーカー上に100μg/ mlのアンピシリンを含む2×YT培地200ml中の3つのライブラリを簡単に説明すると、培養細菌株。
- トムリンソンI及びJライブラリ200ml及びシートライブラリを200mlのVCSM13ヘルパーファージの8×10 11にKM13ヘルパーファージの8×10 11を追加する。振盪せずに37℃で30分間、ヘルパーファージライブラリサンプルをインキュベートする。
- 遠心分離機10分間3000×gでの文化とは、0.1％グルコースとの2×YTの200ミリリットル、100μg/ mlのアンピシリン及びカナマイシン50μg/ mlの中で細胞ペレットを再懸濁します。
- 振とうしながら、30℃で培養物O / Nインキュベートした後、次の日XG 3300で30分間スピン。
- ライブラリーのそれぞれからの上清の200mlに2.5 M NaCl中のポリエチレングリコール（PEG）8000を50mlを加え、氷上で1時間インキュベートする。 PEG沈殿後、3300×gで30分間再度ソリューションをスピン。
- （ペレットのサイズに応じて）、細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）1-2 mlを添加し、マイクロ遠心チューブに移す。
- 11600×gで10分間遠心分離する前に、時々混合しながら37℃で1時間、氷上でファージ粒子をインキュベートする。 -80℃で上清とストアを収集します。
- 凍結前に、別のマイクロ遠心チューブに3つのライブラリーからのファージ粒子の小さな体積を転送し、各ライブラリを滴定個別に濃度を決定するために、TG1細胞を用いた。以下は1ライブラリの力価プロセスの記述がある。
- 0.4の600を ODまでTG1細胞を成長させる。 6マイクロ遠心チューブにPBSを990μlのを追加します。
- 最初のチューブに、ファージ粒子の10μlを添加する。混合した後、チューブ1からの10μlを削除し、残りの4チューブ用2.繰り返しにチューブにこのステップを追加。
- 6チューブにTG1細胞200μlのを追加し、これらの管に6ファージ希釈液の各10μlのを追加します。ファージ粒子のない、37℃で振とうしながら30分間感染することができるようにします。
- プレートアンピシリン100μg/ mlの（LBA）を有するプレート寒天ルリア - ベルターニわたし細胞100μl。 37℃でO / Nインキュベートした後、目に見えるコロニーの数を使用して、PFU / mlで決定する。
2.負のバイオパニングプロセス
注：バイオパニングプロセスを通してファージのあまりに多くの凍結融解は避けてください。イドeally、それは一日に可能な限り負のパンニング工程の多くとして実施することが最善です。各対象に対して負または正のパニングのラウンドの完了後に、任意の段階での汚染の場合のファージの一部を保存することが重要である。
- ウシ血清アルブミンに対する負のパンの12ラウンド（BSA）
- 12イムノチューブをPBS中1mg / mlのBSA溶液4mlを加え、4℃でO / Nインキュベートする。
- （余談ネガティブパニングプロセスの将来の検証のために、このファージ混合物の少量を設定する）3つのライブラリのそれぞれから1×10 12ファージ粒子を組み合わせる。
- 最初のチューブからBSA溶液を捨て、すべての非結合BSAを除去するためにPBSでチューブを2〜3回洗浄する。
- 、この第一の管に合わせて、ファージライブラリーを追加しローテーター上で室温で30分間インキュベートし、非結合ファージを集める。
- 第二イムノチューブでステップ2.1.3を繰り返し、この私にステップ2.1.4から収集したファージを追加mmunotube。手順を繰り返し2.1.4。
- BSA溶液と各インキュベーション後に回収し、非結合ファージの残りの10管を有する手順を繰り返し2.1.3-2.1.4。
- すべてのBSAファージ結合剤の除去を確認するには、AFMを使用しています。切断された雲母に結合したBSA / mlの10μgのに別々にステップ2.1.7の後に残っているファージのステップ2.1.2および10μlのからのファージの10μlのを追加します。 AFMプロセスの簡単なバージョンは、セクション8に概説されている。
- それは、パニングプロセスの成功を確認するために、各ターゲットに対して負のパンニング数々のラウンドを終えた後、ファージの少量を保存することが重要です。
- α-シヌクレインのさまざまな形態に対する負のパンの10ラウンド
注：このプロジェクトでは、我々はそのようなα-シヌクレイン（モノマー、ダイマー、トリマー等 ）などのタンパク質の他の凝集形態を結合することができるファージを除去したいので、私たちはこれらのファージのいずれかを排除する（ゴールとして排除することですできるだけ多くの交差反応性のファージ）。両方のモノマーおよびオリゴマー形態が負のパンのために存在するように精製したα-シヌクレインは、少なくとも7日間の集計できるようにします。- PBS中の凝集α-シヌクレインの500μgの/ mlの4イムノ凝集α-シヌクレインの100μg/ mlの4イムノを準備し、4℃でO / Nインキュベートする。
- 、集約されたα-シヌクレインの500μgの/ mlのチューブの1から液を捨て、PBSで洗浄し、BSAでパンニング負の12ラウンド後に収集されたファージライブラリーを追加します。
- ローテーター上で室温で30分間チューブをインキュベートし、結合していないファージを集める。
- 繰り返します集約されたα-シヌクレインの500μgの/ mlの残りのチューブ用2.2.3と2.2.4を繰り返し、その後、非結合ファージを使用して集約されたα-シヌクレインのを100μg/ mlのチューブはステップ2.2.4後の各時間を集めた。
- 集約されたアルファの500 / mlのに対して負のパンニングの最初の後にファージを使用して手順を繰り返し2.1.8シヌクレインとα-シヌクレイン100μg/ mlのに対して負のパンニング8ラウンド後にファージ。
- に対するすべての否定的な結合剤除去するために、アルファ - シヌクレイン凝集したα-シヌクレインの500μgの/ mlの2余分なイムノを準備し、繰り返します2.2.2-2.2.4を繰り返します。
- 健康なヒトの脳組織ホモジネートに対する負のパンの10ラウンド
- 1×STEN緩衝液（50mMトリス（pH7.6）中、150mMのNaCl、2mMのEDTA、0.2％NP-40、0.2％BSA、20mMのPMSFおよびプロテアーゼカクテル阻害剤）は、ヒト脳組織28を追加。 3000 rpmで1分間24000 rpmで遠心分離サンプルを均質化し、上清を集める。
- PBS中のヒト脳組織の50μg/ mlの2 mlのヒト脳組織を、10μg/ mlの8イムノで2イムノチューブを準備し、4℃でO / Nインキュベートする。
- ヒトB10μg/ mlを含むものと、その後、人間の脳組織を50μg/ mlを含むチューブを最初2.2.3-2.2.5の手順を繰り返し、α-シヌクレインに対する負のパンニング後に回収し、非結合ファージを用いて、雨組織。
- 人間の脳組織と人間の脳組織に対する負のパンニング10ラウンド後にファージを50μg/ mlのに対して負のパンニング最初の後にファージを使用して手順を繰り返し2.1.8。
- 健康な免疫沈降TDP-43に対する負のパンの8ラウンド
- により免疫沈降したタンパク質のより低い量に項9に記載のプロトコルを用いて、健康なヒト脳組織から免疫沈降健康TDP-43タンパク質、マイカを使用して負のパンニングこれらのラウンドを行う。
- 8雲母表面を切断する。
- 最初のマイカに〜免疫沈降したタンパク質の5μg/ mlの100μlのを追加し、室温で5〜10分間インキュベートする。
- トゥイーン20（PBST）で、0.1％PBSでマイカを5回洗浄する。
- 健康な脳組織に対する負のパンニング後にファージの〜100μlを添加して、5〜10分でインキュベートRT。
- ステップ2.4.5の途中インキュベーションにおいて、第2マイカを使用してステップ2.4.3を実行する。
- ステップ2.4.5からのファージを収集し、0.1％PBSTでマイカを5回洗う。
- ステップ2.4.6から雲母を洗い、2.4.7からファージを追加します。
- ファージは負に免疫沈降したタンパク質を持つすべての8マイカに対してパンニングされるまで繰り返します2.4.9に2.4.4を繰り返します。負のパンニングの第一および第8ラウンド後のファージを使用して手順を繰り返し2.1.7。
- FTD免疫沈降TDP-43に対する負のパンの2ラウンド
- FTDを持つ個体の脳からの免疫沈降TDP-43タンパク質。
- 2雲母表面を切断する。
- FTDを10μg/ mlのTDP-43マイカ1への50μlのを追加。 RTで5分間インキュベートする。
- マイカの0.1％PBSTで5回洗浄する。
- 健全なTDP-43に対して負のパンニング後に回収したファージの50μlのを追加します。 5分間インキュベートする。
- 未結合のファージを収集します。
- REPEATSは第二マイカ、2.5.6に集め、非結合ファージを用いて2.5.6ために2.5.3を繰り返します。
ALSを有する個人から免疫TDP-43に対して3.ポジティブパン
- ALSとの個体の脳から免疫沈降TDP-43タンパク質。 3雲母表面を切断する。 1雲母にALS TDP-4310μg/ mlの50μlのを追加します。 RTで5分間インキュベートする。マイカの0.1％PBSTで5回洗浄する。
- マイカに健全なTDP-43に対して負のパンニング後に回収したファージの50μlのを追加します。 5分間インキュベートする。
- 未結合のファージを収集します。また、3溶出法を用いて、結合したファージを収集します。それは、独立したこれらのパンニングのステップで収集されたすべてのファージを維持することが重要である。
- まず、各雲母トリプシン50μlの（PBS中1mg / ml）を追加し、10分を超えないインキュベートする。ソリューションを収集し、保存します。次に、それぞれの雲母に100mMトリエチルアミン（TEA）の50μlを添加し、10分を超えないインキュベートする。共同溶液をllect、1 M Tris-HCl緩衝液（pH7.4）の等量を追加して保存。
- 第三に、直接マイカ0.4のOD 600でのTG1の50μLを加え、37℃で30分間インキュベートする。また、0.4のOD 600でのTG1の3.3.1から100μlの2つの溶出方法から収集したファージを追加し、37℃で30分間インキュベートする。
- 繰り返します第二マイカと3.1を繰り返します。
- 3.3.2に集め、非結合ファージを取る。 ALS TDP-43の最初のマイカを使用し、ALS TDP-43との第二雲母に追加します。 5分間インキュベートする。
- マイカのこれらの第二セットに対して3.3のすべてのステップを繰り返します。
- LBAプレート上で2 ALS TDP-43マイカ、プレートからトリプシンで溶出されたファージを感染させたTG1細胞を組み合わせる。 TEAのために同じプロセスを繰り返し、TG1は、3プレートの合計2 ALS TDP-43マイカからファージを溶出した。
注：ためALSとFTDの両方でTDP-43の関与の、で単離されたクローンの一部ALS TDP-43に対して陽性のパニングを2ラウンドは、この標的に特異的であってもよいが、いくつかはまた、FTDを結合することができる。より良い、ALS特定のクローンを単離する（負のパンニングこれら2ラウンドFTD TDP-43に反応性である任意のターゲットを削除したはずなので）FTD TDP-43に対する負のパンニングの2ラウンド後に収集され、非結合ファージを取ると、これらのファージを使用するには、雲母上ALS TDP-43抗原に対する陽性のパニングのもう一つのラウンド（3.3および3.4に記載のようALS TDP-43マイカを調製）。 - この第三のALSマイカと3.3のすべてのステップを繰り返し、37℃で3 LBAプレートO / Nに感染したTG1細胞をプレート。次の日は、潜在的なALSクローンで6 LBAプレート上のコロニーの数を数える。ポジティブパニングの2ラウンド後3 LBAプレートに比べて正のパンニング第三ラウンド後の電位ALSクローンを持つ3つのLBAプレート上で、より少ないコロニーがあるはずです。
4.培養し、ファージ製品ALSに対する潜在的な陽性クローンのイオン具体的なTDP-43
- 37℃CO / Nでシェーカー上で1％グルコースとの2×YT100μlのとアンピシリン100μg/ mlを含む96ウェルプレートで6プレートから各コロニーを育てる。
- 翌日転送1％グルコースとする2×YTの1ミリリットルとアンピシリン100μg/ mlを含む微量遠心チューブにALS TDP-43タンパク質とポジティブパニングの第三ラウンド後に3 LBAプレートからのクローンを含むウェルからの10μl 。
- 15％の最終濃度になるように96ウェルプレート中の全ての培養物にグリセロールを添加し、-80℃でプレートを凍結する。 1ミリリットル培養を37℃で振とう2-3時間、成長することを許可する。
- KM13ヘルパーファージの10 9を追加し、ヘルパーファージは、振とうしながら、37℃で1時間に感染することができます。遠心機3000×gで10分間、細胞、上清を廃棄し、0.1％グルコース、アンピシリン100μg/ mlのとkanamを50μg/ mlのする2×YTの1ミリリットルを追加ycin。
- 文化振とうしながら30℃での細胞のO / N。遠心し30分間3300×gでチューブ、新しいマイクロチューブに上清を転送し、各チューブに250μlのPEG / NaClを追加します。
- 1時間氷上でチューブをインキュベートします。 、30分間3300×gで再びチューブを遠心上清を廃棄し、各チューブに100μlのPBSを追加。
- 1時間氷上でチューブをインキュベートします。 11600×gで10分間チューブをスピンし、新しいチューブに上清を移す。 -80℃でファージを保管してください。
潜在的なALSクローンの5シーケンシング
- 手順を繰り返し4.2と振とうしながら、37℃でO / Nを成長させる培養に許可する。翌日、製造業者の説明書に従ってクローンのDNAプラスミドプレップを行う。フォワード適切なを使用してクローンを配列およびリバースプライマー。
6.間接ELISAを用いてALS具体的なTDP-43に対する潜在的な陽性クローンのスクリーニング
- 各潜在的なALSのクローンに対して高い結合ELISAプレートのウェルにALS、FTDと健康なヒトの脳組織の2.5 / mlの100μlのを追加します。ゆっくり振盪させながら1時間、37℃でプレートをインキュベートする。
- 0.1％PBSTでプレートを3回洗浄する。ウェルにPBS中の2％粉乳の200μlを加え、ゆっくりと振盪させながら1時間、37℃でプレートをインキュベート。
- 洗浄ステップを繰り返した後、ウェルにPBS中に少なくとも1/100に希釈各ファージの100μlを添加する。インキュベーション後と洗浄工程、各ウェルに抗M13 HRP 1 / 1,000の100μlを添加する。プレートを洗浄し、ELISAフェムト化学発光基質キットを用いて可視化する。
7. scFvの生産と間接ELISAを用いたスクリーニング
- 0.4の600を ODまでHB 2151細胞を増殖させる。 HB 2151細胞の20μlに異なるファージの5μlを添加する。ファージを30分振とうせずに37℃で感染することができるようにします。そのようにグリッドにLBAプレートを分割そのおよそ20クローンがそれぞれ上に播種することができる。
- プレートに各ファージに感染した細菌の5-10μlを加え、37℃でO / Nインキュベートする。翌日、0.1％グルコースおよびアンピシリン100μg/ mlの2×YT培地1mlに個々のコロニーを追加し、OD 600が 0.6になるまで3~4時間、37℃で振る。
- 各チューブに1 Mイソプロピルチオガラクトシド（IPTG）の1μLを加え、振とうしながら30℃でO / Nインキュベートする。 10分間11600×gでチューブをスピンし、ELISAテストのための上清を収穫。
- ELISA試験のために希釈されていないのscFvを追加除き、代わりにファージの6.5で、セクション6で同じ手順に従うと6.6のために1 / 1,000 9E10 HRP100μlのを追加します。
8. AFMプロセス
- 切断された雲母に標的抗原の10〜20μLを加え、5〜10分間インキュベートする。水でマイカを5回洗浄する。マイカにファージの10〜20μLを加え、5〜10分間インキュベートする。
- 5回は再びWIマイカを洗う水番目、空気乾燥さマイカを許可する。 AFM 1を使用して結合するファージを可視化。 RT 29で空気中のナノスコープIIIaのコントローラとAFMタッピングモードAFMを用いて撮像処理を実行する。シリコンAFMプローブは、300kHzの共振周波数および40 N / mのバネ定数を有している。 3.05 Hzから512サンプル/ラインのスキャン解像度のスキャンレートを使用してください。
- 全ての粒子サイズは、各画像内で同等であることを保証するために、背景の基本的な平坦化して画像を処理する。ファージ幅（長さではないが）が、他の粒子サイズと走査領域への画像からの画像に変えることができるが、それは、ファージは、抗原に結合するか否かの精度を損なうことはありません。
- 負のパンニングファージの各セットのためのAFM検証中雲母に表示されている場合は全くファージは負のパンニングの次のセットに進む前に検出されなくなるまで、追加のラウンドを行う。
ターゲット抗原の9免疫沈降
- isolatへ電子標的抗原（TDP-43）は、エッペンドルフに700μlの総容量、抗TDP 43ポリクローナル抗体および1×STENバッファの1/100希釈液100μlを（運動皮質から）ホモジナイズ脳組織の250μgのを追加チューブ28。
- ローテーター上、4℃でO / Nインキュベートします。 1X STENを洗浄A / Gアガロースビーズは、2〜3回をバッファリングし、組織の混合物に25ミリリットルを追加します。ローテーター上で1.5時間4℃でインキュベートした後、1分間2,000〜4,000 rpmで遠心する。
- 上清を除去し、PBSで1×STENバッファと5回で一回ペレットを洗浄。ペレットに1×STENバッファの40〜60μl加え、5分間沸騰させる。サンプルの後クール、遠心分離し、上清を収集します。免疫沈降法30の成功を検証するために、SDS-PAGEおよびウエスタンブロットを使用してください。
10.ドットブロット分析
- テストされる各クローンのための小さな長方形にニトロセルロース紙をカットします。 ALS、Fのドット2μLTDおよびニトロセルロース紙かれ健康ヒト脳組織サンプル、それは完全に乾燥させ。
- PBS中の5％粉乳1-2 mlを添加し、室温で1時間振盪させ。各ファージの1/100希釈の1ミリリットルを追加し、それを4℃でO / Nを振るましょう。 0.5％PBSTで10分間ずつ膜を3回洗浄する。
- 抗M13 HRPの1 / 1,000希釈の1ミリリットルを追加し、それを室温で1時間振とうしましょう。洗浄手順を繰り返し、西洋化学発光溶液を用いて可視化した。
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Representative Results
図1では、回路図は、我々はイムノを使用して私たちのライブラリからオフターゲット抗原に結合するファージを削除したことにより、負のパニングプロセスを示しています。これは一般的なブロッキング剤であり、このターゲットと非特異的に反応するすべてのファージは将来のイムノアッセイにおいて問題となるので、私たちは、最初にBSAで始めた。次に、凝集したタンパク質（ すなわち、凝集したα-シヌクレインに対する交差反応性であろう抗体は、TDP-43、アミロイドβ など ）の一般構造を有する反応性のファージを除去するために、凝集α-シヌクレインの結合剤を除去した。 AFMの結果は集約されたα-シヌクレインに対する負のパンニング1ラウンド（ 図2A）の後に結合およびno 8ラウンド（ 図2B）の後に結合ファージを示した。次に、負に健康なヒトの脳ホモジネートに存在する多くの抗原に結合するファージを除去するために、健康なヒト脳組織に対してパンニング。 図2C 図2D）の10ラウンド後に結合を左に示した。パニングのために利用可能な健康とFTD免疫沈降したTDP-43タンパク質の量はイムノチューブが少ないボリュームを活用し、したがって、総蛋白消費されます（ 図3）を下げではなくマイカを使用して、低いものであった。健康な免疫沈降TDP-43に対する負のパニングの8ラウンド後、ファージを分割した。ハーフファージはFTD TDP-43に対する負のパンニング2ラウンドで費やされた。目的は、潜在的なALS TDP-43特異的クローンを維持しながら、（これはFTDにおけるTDP-43の関与に）すべてのFTD TDP-43反応性クローンを排除することでした。
ポジティブパン部分（ 図4）については、我々はまた、材料の使用を最小限にする基質として雲母を使用した。私たちはいずれかを取得するためにALS TDP-43に対するFTD TDP-43陰性のパニングの後、未結合ファージを使用ALS特異的クローン。我々はまた、積極的に私たちはFTD TDP-43に対して負のパンから未結合ファージを使用した後、クローンを得られなかった場合に、TDP-43回ALSに対してパンニング。全体のパンニング工程の後、我々の3溶出法は（FTD TDP-から未結合のファージを用いて、45の潜在的ALS特異的クローン（ALSおよびFTDに反応性であり得るクローン）ALS TDP-43に対するつの正のパニングから154個のクローンが得られた43ネガティブパニング）。
さらに、45の潜在的ALS特異的クローンを低減するために、クローンを配列決定され、任意の停止コドンなしのクローンのみが二回現れた一つのクローンを除いて、さらに検討した。これは23の可能性ALS特異的クローンを私たちに残しました。これらのクローンをファージおよび可溶性scFvの両方を準備した後、それらはALS組織への特異性についての間接的ELISAで試験する。ほとんどのファージの全てが健康な組織（ 図5）上のALS組織に対する選択性を示した。同様の結果がOBTですFTD組織にALSに結合するファージ（ 図6）を比較するときained。今後の研究のためには、これらのクローンが機能的scFvの高収量を表現することが不可欠ですので、我々は、異なるscFvの小さなバッチを製造し、同じような間接的ELISAを行った。健康（ 図7）およびFTD組織（ 図8）の両方にALS組織へのscFv結合の比較は、再び、ほとんどすべてのクローンにおけるALS組織への選択的結合を示した。
我々はさらに、ALS組織への結合を確認するために、また、他の免疫学的用途において反応性であるクローンを確認するために別の免疫測定法（ドットブロット）を使用した。 ALS組織に結合するクローン2A（ 図9）に示されている。これらのクローンはすべて、ファージおよびscFv ELISAのいずれかまたは両方において有望な結果を示した。これらの結果は、我々のAFMベースのバイオパニングプロセスは、選択的に、疾患特異的タンパク質バリに結合する試薬を生成するために用いることができる非常に強力な技術であることを確認直接複雑なソースからのアリ。
イムノを利用図1.負のバイオパニングプロセス。回路図負のバイオパニングプロセスを実証する。 BSAなど、集約されたα-シヌクレインと健康な脳組織のようなタンパク質に反応性であるファージをイムノチューブを用いて除去している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.負のパニング結果の確認。AFMイメージングは、全ての反応性のファージを除去することを確認するために、様々な標的に対する負のパンニング手順を監視するために使用される。ここでは、実証AFMの結果の一部を示している前と負のパンニング後に結合ファージのレベル。（A）は、ファージの結合が負のパンニングの最初のラウンドの後に集約されたαシヌクレイン粒子に検出することができますが、（B）なしファージネガティブパニングの8ラウンド後に表示されている。（C ）健康な組織ファージに対する負のパニングの最初のラウンドの結合後に明らかですが、（D）は結合は負のパンニングの10ラウンド後に検出されない。すべての画像は5μmである。 AFM像に大きな白い構造は、通常、ファージ生産中のPEG沈殿工程からバッファまたは残留PEG中に存在する塩によるものである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.負のBiopannマイカを利用るプロセス。マイカを使用して回路図実証追加の負のバイオパニング。制限により試料に雲母表面は最初健康へのバインダーを除去するために使用され、その後、FTDは、TDP-43を免疫沈降させた。 FTD TDP-43に対する負のパンニング2ラウンドに進む前に、ファージは（正のパニング段階中のALS TDP-43排他的なファージの不成功孤立した場合に）半分に分割されている。 拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。
図4. ALS正のバイオパニングプロセス。回路図ALS正のバイオパニングプロセスを実証する。 FTD TDP-43に対して負のパンニング後に、非結合ファージは、よりALSを溶出するためにALS TDP-43に対して陽性のパニングのラウンドで使用されているTDP-43特異的クローン。また、ALS TDP-43に対して陽性のパニングの2ラウンドは雲母表面と健康なこれらのファージは、健康なTDP-43結合してはならないので、TDP-43は、（結合したファージは、溶出される免疫沈降したが、一部に対して負のパニングの後、未結合のファージを用いて行われるALSとFTD）の両方と交差反応性であってもよい。三つの溶出方法は、すべての結合したファージが削除されるように（トリプシン、紅茶、TG1細胞）を使用されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
均質化された人間のALS、FTD、我々は異なるクローンから生成したファージを用いた間接ELISA法を実施し、健康な脳組織（HT）のサンプルを使用して、 潜在的なALSのクローン（HT対ALS）。図5.ファージELISAスクリーニング 。結果が表現されます健康な組織サンプルに対する割合として。結果は、いくつかのクローンは、ALS患者と健常のものに見られるTDP-43を区別することを示した。 ALS、FTDとHT組織は3人から脳サンプル（運動野）の混在である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6.潜在的なALSクローンのファージELISAスクリーニング（FTD対ALS）は。ここでは、FTD患者に対するALSのファージELISAの結果を示している。クローンのほとんどは、FTDオーバーALSの好みを持っている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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潜在的なALSクローンの図7.のscFv ELISAスクリーニング（HT対ALS）。私たちは、健康上のALS患者からのTDP-43のための好みを持っているクローンを観察することができ、各クローンから産生されるscFvを使用して。 拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。
潜在的なALSクローンの図8のscFv ELISAスクリーニング（FTD対ALS）間接ELISAにおいて異なるscFvのためのFTDにALSを比較するとき。私たちのパニングプロセスの成功をさらに実証されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図潜在ALSクローンの9ドットブロット分析。代わりにELISAのドットブロットを使用してはFTDまたはHT上のALSのクローンの特異性を示すために別の手法である。クローン2Aが示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Acknowledgments
R21AG042066：この研究は、NIHからの助成金によってサポートされていました。私たちは、画面キャプチャのビデオを作成する際の彼の貢献のためにフィリップ·シュルツに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tomlinson I and J Libraries | MRC (Cambridge, England) | ||
| Sheets Library | MRC (Cambridge, England) | ||
| 2xYT | BD Sciences | 244020 | |
| Glucose | Amresco | 0188-2.5KG | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | Irritant |
| KM13 Helper Phage | MRC (Cambridge, England) | ||
| Kanamycin | OmniPur | 5880 | Irritant |
| Polyethylene Glycol 8000 | OmniPur | 6510 | Irritant |
| Sodium Chloride | Macron | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Amresco | 0404-1KG | Irritant |
| Potassium Chloride | EMD | PX1405-1 | Irritant |
| Potassium Phosphate Monobasic | Amresco | 0781-500G | Irritant |
| TG1 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Luria-Bertani Agar | EMD | 1.10283.0500 | |
| Bovine Serum Albumin | Amresco | 0332-100G | |
| STEN buffer | Crystalgen Inc. | 33429775 | |
| Immunotubes | Thermo Scientific | 470319 | |
| Mica | Spruce Pine Mica | 24365 | |
| Tween 20 | EMD | ||
| Trypsin | Sigma | T-0303 | Irritant |
| Triethylamine | Sigma | T-0886 | Flammable |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | Irritant |
| DNA Plasmid Prep Kit | qiagen | 27106 | Irritant |
| Non-Fat Milk Powder | Carnation | ||
| 96-Well High Binding ELISA Plate | Costar | 3590 | |
| Anti-M13 HRP | GE Healthcare Life Sciences | 27-9421-01 | |
| ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit | Thermo Scientific | 37074 | |
| Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody | ProteinTech | 10782-2-AP | |
| A/G Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| HB 2151 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Isopropylthiogalactoside | Teknova | 13325 | |
| 9e10 HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Nitrocellulose Membrane | Biorad | 162-0115 | Flammable |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall RC 6+ | |
| Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope | Veeco | ||
| AFM Probes | VistaProbes | T300R-10 |
References
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