Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

जांच-आधारित वास्तविक समय पीसीआर microRNAs के मात्रात्मक मापन के लिए दृष्टिकोण

doi: 10.3791/52586 Published: April 14, 2015

Summary

परिसंचारी microRNAs हाल ही में विभिन्न प्रकार के कैंसर और अन्य बीमारियों के लिए होनहार और उपन्यास बायोमार्कर के रूप में उभरा है। इस लेख का लक्ष्य तीन अलग अलग जांच आधारित वास्तविक समय पीसीआर प्लेटफार्मों और यों और microRNAs परिसंचारी की बहुतायत निर्धारित करने के लिए उपलब्ध हैं कि तरीकों पर चर्चा करने के लिए है।

Abstract

यह एक सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विश्लेषण प्रदान करता है कि सबसे ज्यादा संवेदनशील तरीकों का पता लगाने में से एक है, क्योंकि जांच के आधार पर मात्रात्मक पीसीआर (qPCR), प्रतिलेख बहुतायत को मापने के लिए एक इष्ट विधि है। जांच-आधारित रसायन शास्त्र अन्य (डाई-आधारित) chemistries की तुलना में कम से कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति प्रदान करता है। वर्तमान में, प्रतिलेख बहुतायत quantitate करने के लिए उपयोग की जांच-आधारित रसायन शास्त्र उपलब्ध कई प्लेटफार्मों रहे हैं। एक 96 अच्छी तरह से थाली में qPCR हालांकि 96 नमूने या miRNAs की केवल एक अधिकतम एक भी रन में परीक्षण किया जा सकता है सबसे नियमित तौर पर इस्तेमाल किया विधि है। नमूनों की एक बड़ी संख्या / miRNAs विश्लेषण किया जा करने के लिए कर रहे हैं तो यह समय लेने वाली और थकाऊ है। ऐसे में microfluidics (जैसे TaqMan ऐरे कार्ड) और nanofluidics सरणियों (जैसे OpenArray) की पेशकश आसानी के रूप में उच्च throughput जांच-आधारित प्लेटफॉर्म reproducibly और कुशलता से एक कम समय में नमूनों की एक बड़ी संख्या में कई microRNAs की बहुतायत का पता लगाने के लिए। यहाँ, हम प्रयोगात्मक सेटअप एक का प्रदर्शनएन डी throughput के बढ़ते स्तर की पेशकश जांच आधारित रसायन शास्त्र और तीन अलग अलग प्लेटफार्मों (96 अच्छी तरह से थाली, microfluidics और nanofluidics सरणियों) का उपयोग सीरम या प्लाज्मा EDTA के नमूने से miRNA के quantitation के लिए प्रोटोकॉल।

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) जीन अभिव्यक्ति 1-3 के नियामकों के रूप में कार्य, ~ 22 न्यूक्लियोटाइड गैर-कोडिंग (नेकां) RNAs हैं। पशुओं में ज्यादातर miRNAs जीन अभिव्यक्ति 2-4 की नकारात्मक विनियमन की ओर जाता है, जो 3 'UTR से, लक्षित कर, एक mRNA के साथ दृश्य-विशिष्ट आधार बाँधना के माध्यम से कार्य करते हैं। यह आमतौर पर mRNA के अनुवाद के निषेध के माध्यम से या राइबोसोमल ड्रॉप बंद से उत्पन्न होती है। संचलन में miRNAs जैसे मधुमेह 5-7, डिम्बग्रंथि 8, प्रोस्टेट 9 और स्तन कैंसर 10,11, हेपेटाइटिस बी 12 और अन्य autoimmune रोग के रूप में 13 रोगों की एक किस्म के लिए अनुसंधान और नैदानिक ​​क्षेत्रों में उपन्यास बायोमार्कर होना दिखाया गया है। रिसर्च और अधिक सुलभ और 9,11-15 कम आक्रामक है जो मानव प्लाज्मा और सीरम नमूनों से प्रचलन में है, साथ ही विभिन्न कोशिकाओं या ऊतकों में प्रचुर मात्रा में miRNAs की पहचान करने के लिए आयोजित किया गया है।

MiRNA मात्रा का ठहराव के विभिन्न तरीकों ई गया हैइस तरह के मानक 96 अच्छी तरह से थाली मंच 4,12,16-18, microfluidics कार्ड मंच 12,18-23 और nanofluidics सरणी मंच 17,24 के रूप में कई प्लेटफार्मों का उपयोग करते हुए stablished। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR) एकाधिक (dye- या जांच-आधारित) chemistries का उपयोग कर टेप के रिश्तेदार या निरपेक्ष संख्या को मापने की क्षमता प्रदान करता है। जांच के आधार पर वास्तविक समय पीसीआर रसायन शास्त्र एक एकल प्रतिलिपि प्रतिलिपि पता लगाने के लिए कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और उच्च संवेदनशीलता के लाभ प्रदान करता है। यह अपेक्षाकृत बढ़ाता और miRNA अभिव्यक्ति 25 का निर्धारण करने के लिए यह एक इष्ट विधि है, जिससे, प्रभावी उपयोग करने के लिए सरल और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य खर्च कर रहा है। प्रतिलेखन (आरटी) और qPCR 4,26,27 रिवर्स: जांच आधारित qPCR के विधि आम तौर पर दो कदम शामिल है। स्टेम पाश आरटी प्राइमर एक परिपक्व या प्राथमिक miRNA के अणु को संकरित और पूरक (ग) डीएनए में बदल जाती है जहां आरटी है। सीडीएनए उत्पाद की मात्रा तो miRNA के विशिष्ट पीसीआर प्राइमरों का उपयोग किया जाता है26-28। जांच के आधार पर qPCR के सिद्धांत fluorescently टैग जांच की hydrolysis शामिल है जो वास्तविक समय में पूरक किनारा विस्तार, का पता लगाने पर आधारित है। ये जांच एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और झल्लाहट (प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण) की अनुमति के लिए सिर्फ अलग कर रहे हैं कि एक पेय शामिल करने के लिए तैयार कर रहे हैं। प्रतिदीप्ति रिपोर्टर (emitter) से उत्सर्जन की जांच पेय अणु के करीब निकटता से छिपा हुआ है। Taq पोलीमरेज़ (पीओएल) अपस्ट्रीम प्राइमर से फैली और एक कांटा (जांच के 5 'अंत) तक पहुँच जाता है, Taq पीओएल exonuclease गतिविधि पेय से फ्लोरोसेंट emitter के एक भौतिक हदबंदी / जुदाई के लिए अग्रणी, जांच hydrolyses। प्रतिदीप्ति emitter के एक अणु का यह रिलीज डिटेक्टर द्वारा दर्ज की गई और कहा कि अच्छी तरह से / प्रतिक्रिया से प्रतिदीप्ति संकेत में एक वृद्धिशील वृद्धि के रूप में प्रस्तुत किया है। प्रतिदीप्ति में वृद्धि के लिए एक सटीक qu के लिए अनुमति देता है, उत्पन्न पीसीआर उत्पाद की राशि के लिए आनुपातिक हैप्रवर्धित लक्ष्य 26,28 के antification।

MiRNA मात्रा का ठहराव में बढ़ती मांग के साथ, उच्च throughput प्रौद्योगिकियों के लिए मध्यम नमूनों की एक बड़ी संख्या के समय की एक छोटी राशि में संसाधित करने की अनुमति देने के लिए विकसित किया गया है। TaqMan कम घनत्व सरणी (TLDA) एक प्लेट पर विश्लेषण miRNAs की संख्या में वृद्धि की पेशकश की जांच के आधार पर qPCR के रसायन विज्ञान पर आधारित एक मध्यम throughput के अभिनव microfluidic डिजाइन है। TLDA सीडीएनए synthesize करने के लिए उपयोग किया जाता है कि आर टी-प्राइमरों के एक पूर्वनिर्धारित पूल का उपयोग शामिल है। ये cDNAs तो qPCR के 22,26,29 के प्रयोग से कई miRNAs की अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए एक स्वनिर्धारित 384 अच्छी तरह से सूक्ष्म fluidic कार्ड में काता जाता है। कार्ड के प्रत्येक अच्छी तरह इसलिए एकल TLDA कार्ड 26 में संसाधित किया जा सकता 384 प्रतिक्रियाओं अप करने के लिए, विशिष्ट miRNA (ओं) को बढ़ाना प्राइमरों और जांच सूख शामिल हैं।

nanofluidics सरणी जीन टेप का पता लगाने के लिए किया जाता है कि एक उच्च throughput मंच है 24 पर 3072 की एक सरणी में 33 nanoliter प्रतिक्रिया मिश्रण की आसान लोड हो रहा है की सुविधा के लिए हाइड्रोफोबिक-हाइड्रोफिलिक बातचीत की पेशकश की एक मालिकाना मैट्रिक्स का इस्तेमाल करता। यह लेख सीरम / प्लाज्मा में miRNAs बढ़ाता के लिए इन तरीकों का प्रदर्शन किया और प्रदर्शन करने और इस तरह के डेटा की व्याख्या जब विचार किया जाना चाहिए कि महत्वपूर्ण कारक हैं कैसे प्रदर्शन पर केंद्रित है। खाते में ले लिया है, अपने व्यक्तिगत लाभ और सीमाएं इस लेख में चर्चा की जाएगी।

Protocol

कुल शाही सेना हमारी प्रयोगशाला में 30 या अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करने में स्थापित एक प्रोटोकॉल का उपयोग सीरम से अलग किया जा सकता है।

नोट: प्रत्येक प्रयोग में प्रतिक्रिया संस्करणों की गणना के लिए पूरक इंटरैक्टिव स्प्रेडशीट (5% अतिरिक्त मात्रा के साथ pipetting के लिए हिसाब शामिल है) प्रदान की जाती हैं।

1. जांच-आधारित वास्तविक समय qPCR के एक मानक 96 अच्छी तरह से थाली मंच का उपयोग

  1. miRNA के लिए सीरम / प्लाज्मा शाही सेना के नमूने पर सीडीएनए संश्लेषण (रिवर्स प्रतिलेखन)
    1. गणना और प्रत्येक सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया के लिए शाही सेना के 10 एनजी बाहर ले। (एक 5 μl प्रतिक्रिया के लिए) 1.67 μl के लिए 10 एनजी शाही सेना की अंतिम मात्रा लाने के लिए Nuclease मुक्त पानी जोड़ें। बर्फ पर नमूने रखें।
    2. MiRNA का चयन करें और उनके आरटी प्राइमरों पिघलना।
    3. आरटी बफर (10X), dNTPs (100 मिमी), RNase अवरोध करनेवाला (20 यू / μl): आरटी अभिकर्मक मिश्रण घटकों गला लें। जगह एंजाइम रखना कभी नहीं (पुनः संयोजक Moloney murine ल्यूकेमिया वायरस(RMoMuLV)) (recombinanat Moloney murine ल्यूकेमिया वायरस (rMoMuLV) बर्फ पर रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (50 यू / μl)। जब तक की जरूरत है या एक फ्रीजर ब्लॉक में -20 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान।
    4. तालिका 1 ए में वर्णित के रूप में बर्फ पर आरटी अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें। यह कम से कम 5% pipetting त्रुटि के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए अतिरिक्त मात्रा तैयार करने के लिए सिफारिश की है।
    5. एक 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब / थाली में आरटी अभिकर्मक मिश्रण प्रत्येक के 2.33 μl जोड़ें।
    6. भंवर आरटी प्राइमर ट्यूबों 10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर फिर अपकेंद्रित्र संक्षेप में, मिश्रण करने के लिए। उनके संबंधित पीसीआर ट्यूब या प्लेट को miRNA के विशिष्ट आरटी प्राइमर की एक μl जोड़ें। थाली में उनके संबंधित पीसीआर ट्यूब या वेल्स को पतला शाही सेना की 1.67 μl जोड़ें। बर्फ पर सभी परिवर्धन प्रदर्शन करते हैं।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1950 XG पर प्रतिक्रिया ट्यूब या थाली अपकेंद्रित्र।
    8. 30 मिनट, 85 डिग्री के लिए 30 मिनट के लिए 16 डिग्री सेल्सियस, 42 डिग्री सेल्सियस: निम्न सेटिंग शर्तों के साथ थर्मल cycler पर miRNA सीडीएनए संश्लेषण प्रोग्राम सेट करें5 मिनट और पकड़ पर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सी।
    9. 10 μl के लिए सेट प्रतिक्रिया मात्रा। थर्मल cycler में प्रतिक्रिया ट्यूब या प्लेट लोड करें। आरटी रन प्रारंभ करें। वास्तविक समय पीसीआर प्रवर्धन तुरंत कार्यवाही की नहीं है, -20 डिग्री सेल्सियस पर सीडीएनए (आरटी) प्रतिक्रियाओं स्टोर।
  2. परिपक्व miRNAs का पता लगाने के लिए वास्तविक समय qPCR जांच आधारित
    1. संबंधित आरटी उत्पाद के लिए चयनित जांच आधारित qPCR assays के (20X) पिघलना।
    2. बोतल घूमता द्वारा वास्तविक समय पीसीआर (qPCR अभिकर्मक मिश्रण) के औचित्य एकमात्र समाधान मिलाएं।
    3. प्रत्येक miRNA विश्लेषण किया जा करने के लिए qPCR के अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें। QPCR के प्रत्येक miRNA के नमूने के लिए एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब प्राप्त करने और टेबल 1 बी में वर्णित के रूप में प्रत्येक ट्यूब में घटकों को जोड़ने को तैयार करने के लिए। यह कम से कम 5% pipetting त्रुटि के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए अतिरिक्त मात्रा तैयार करने के लिए सिफारिश की है।
    4. एक ऑप्टिकल 96 अच्छी तरह से थाली (या ट्यूब) के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए संबंधित qPCR के अभिकर्मक मिश्रण की 4.2 μl जोड़ें। 0.8 μl जोड़ेंसंबंधित सीडीएनए प्रतिक्रिया के संबंधित अच्छी तरह से करने के लिए (प्रत्येक miRNAs के लिए 1.1 चरण में संश्लेषित)।
    5. उपयुक्त ऑप्टिकल कवर के साथ थाली सील। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1950 XG पर प्लेट (या ट्यूब) अपकेंद्रित्र
    6. कंप्यूटर, 96 अच्छी तरह से थाली / microfluidics सरणी पाठक को चालू करें और अंत में सॉफ्टवेयर लांच। मशीनों को सही ढंग से जुड़ा हुआ है और सही ब्लॉक और (तेजी से 96 अच्छी तरह से थाली के लिए) गर्म ढक्कन जगह में कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें।
    7. चयन करें प्रयोग के रूप में 96 अच्छी तरह से तेजी से ब्लॉक (0.1 मिलीलीटर), मानक वक्र, TaqMan अभिकर्मकों और तेजी से मोड। 20 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 50 चक्र (1 सेकंड, 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस): निम्न कार्यक्रम साइकिल चालन की स्थिति का उपयोग कर रीयल टाइम पीसीआर सिस्टम पर qPCR के सेट करें।
    8. 10 μl के लिए सेट प्रतिक्रिया मात्रा। साधन में प्रतिक्रिया ट्यूब या प्लेट लोड करें। प्रेस "रन शुरू करें"। इस कार्यक्रम को पूरा करने के लिए लगभग एक घंटा लग जाएगा।

2. जांच आधारित Microfluidics ऐरे कार्ड (सीएआरडी ए और बी)

नोट: जांच आधारित miRNA के पैनल में दो 384 अच्छी तरह से microfluidic कार्ड (ऐरे कार्ड एक और सरणी कार्ड बी) के एक सेट के रूप में आता है। प्रत्येक कार्ड अप करने के लिए 380 miRNAs और नियंत्रण के लिए सूखे प्राइमरों और जांच में शामिल है। (के साथ या पूर्व प्रवर्धन के बिना) कार्ड एक या कार्ड बी करने के लिए विशिष्ट सीडीएनए उत्पाद वास्तविक समय पीसीआर के लिए संबंधित सरणी पर भरी हुई है।

  1. रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी)
    1. 1-1,000 एनजी की कुल शाही सेना इनपुट के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करें। इनपुट 1-350 एनजी के बीच है, तो एक पूर्व प्रवर्धन (पूर्व एएमपी) कदम प्रदर्शन करते हैं। 350 एनजी से ऊपर आदानों के लिए, पूर्व amp बिना सरणी कार्ड पर सीधे सीडीएनए लोड।
      नोट: सीरम miRNA रूपरेखा के लिए, कुल शाही सेना के 100 एनजी के साथ शुरू करते हैं। एक पूरा miRNA के प्रोफाइल के लिए, नमूना प्रति आरटी प्रतिक्रियाओं (पूल ए और पूल बी) के आर टी-प्राइमर सेट के दो पूर्वनिर्धारित पूल चला रहे हैं।
    2. बर्फ पर निम्नलिखित अभिकर्मकों गला लें। आरटी प्राइमर (10x): पूल ए और पूल बी, dTTP (100 मिमी), आरटी बफर (10x), 2 MgCl (25 मिमी), RNase अवरोध करनेवाला (20 यू / और साथ dNTPs# 181; एल)। बर्फ पर एंजाइम (पुनः संयोजक Moloney murine ल्यूकेमिया वायरस (rMoMuLV)) रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (50 यू / μl) मत रखना। जब तक जरूरत -20 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान।
    3. धीरे एंजाइम को छोड़कर, सभी अभिकर्मकों भंवर, और फिर संक्षेप में 10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    4. दो ट्यूबों में, टेबल 2A में वर्णित के रूप में, अभिकर्मकों गठबंधन; पूल ए के लिए एक ट्यूब, पूल बी के लिए अन्य प्रत्येक ट्यूब यह pipetting त्रुटि के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए कम से कम 5% अतिरिक्त मात्रा को तैयार करने की सिफारिश की है पूल ए से या पूल बी से, या तो आरटी प्राइमर सेट का केवल एक पूर्वनिर्धारित पूल में शामिल होंगे ।
    5. मिश्रण को पलटना, और 10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर फिर अपकेंद्रित्र संक्षिप्त। विभाज्य 100 एक नया ट्यूब में प्रत्येक शाही सेना के नमूने की एनजी, तो 3 μl की कुल बनाने के लिए Nuclease मुक्त पानी का एक उचित मात्रा में जोड़ें।
    6. विभाज्य संबंधित ट्यूबों में उपयुक्त आरटी अभिकर्मक मिश्रण की 4.5 μl। मिश्रण को पलटना, और फिर संक्षेप में 10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र। बर्फ पर सेते5 मिनट के लिए।
    7. एक thermocycler में और निम्न शर्तों का उपयोग आरटी शुरू प्लेस के नमूने: 40 चक्र (2 मिनट के लिए 16 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस, 1 सेकंड के लिए 50 डिग्री सेल्सियस), 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री पर पकड़ सी. स्टोर सीडीएनए डिग्री सेल्सियस के लिए -25 -15 में आर टी-प्राइमरों के इन पूर्वनिर्धारित पूल का उपयोग करके उत्पन्न या तुरंत इस्तेमाल किया।
  2. पूर्व प्रवर्धन
    1. बर्फ पर पूर्व amp प्राइमरों की पूर्वनिर्धारित पूल गला लें। धीरे भंवर प्राइमरों, और फिर संक्षेप में 10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र। भंवर TaqMan preamp अभिकर्मक मिश्रण कोमल दोहन द्वारा (2x), मिश्रण करने के लिए।
    2. दो ट्यूबों में, टेबल 2 बी में वर्णित के रूप में, अभिकर्मकों गठबंधन; पूल ए के लिए एक ट्यूब, पूल बी के लिए अन्य
      नोट: ऊपर वर्णित के रूप में, पूल ए पूर्व amp प्राइमरों ट्यूब एक के लिए जाना जाएगा और पूल बी प्राइमरों यह कम से कम 5% pipetting त्रुटि के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए अतिरिक्त मात्रा को तैयार करने की सिफारिश की है ट्यूब बी के लिए जाना चाहिए।
    3. मिश्रण को पलटना, और फिर संक्षेप में 10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र।विभाज्य नए ट्यूबों में उपयुक्त preamp अभिकर्मक मिश्रण की 22.5 μl। विभाज्य संबंधित ट्यूब में (आर टी चरण में तैयार) सीडीएनए नमूना के 2.5 μl।
    4. मिश्रण को पलटना, और फिर संक्षेप में 10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र। 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। एक thermocycler में जगह नमूने और पूर्व amp चक्र शुरू करते हैं। साइकिल चालन की स्थिति: 10 मिनट, दो मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट, 12 चक्र (15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 4 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस), 10 मिनट के लिए 99.9 डिग्री सेल्सियस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, पकड़ 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    5. उलटें 10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर संक्षेप में अपकेंद्रित्र तो मिश्रण करने के लिए सीडीएनए पूर्व प्रवर्धित, और। (: 4 कमजोर पड़ने 1) 0.1x ते बफर (8.0 पीएच) के पूर्व प्रवर्धित सीडीएनए के 75 μl जोड़ें। मिश्रण करने के लिए पतला पूर्व amp नमूने पलटना, और फिर संक्षेप में 10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र। स्टोर करने के लिए एक सप्ताह के लिए -15 -25 डिग्री सेल्सियस पर सीडीएनए-पूर्व प्रवर्धित, या तुरंत इस्तेमाल पतला।
  3. Microfluidics कार्ड लोड हो रहा है और qPCR प्रदर्शन कर
    1. Microfluidics रखेंबाहर कम से कम आधे घंटे के लिए miRNA कार्ड कमरे के तापमान तक पहुँचने के लिए। बर्फ पर पतला पूर्व प्रवर्धित सीडीएनए पिघलना और संक्षिप्त स्पिन द्वारा पीछा ट्यूबों inverting द्वारा मिश्रण। बोतल घूमता द्वारा qPCR के अभिकर्मक मिश्रण मिलाएं।
    2. नया ट्यूब में पतला पूर्व प्रवर्धित सीडीएनए के 9 μl को qPCR के अभिकर्मक मिश्रण के 450 μl जोड़ें। कार्ड एक के लिए, पूर्व प्रवर्धित उत्पाद 900 μl अंतिम मात्रा को बनाने के लिए प्राइमर पूल ए nuclease मुफ्त पानी के 441 μl जोड़ें उपयोग कर तैयार उपयोग करें। मिश्रण करने के लिए ट्यूब पलटना, और फिर संक्षेप में 10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
    3. इसकी पैकेजिंग से TLDA कार्ड (यह पहुंचता है एक बार कमरे के तापमान) को हटाने और नीचे पन्नी पक्ष के साथ एक साफ क्षेत्र पर जगह है। कार्ड पर आठ भरने के बंदरगाहों में से प्रत्येक में पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण के 100 μl जोड़ें। जलाशय में से प्रत्येक पर दो बंदरगाहों (प्रत्येक कार्ड पर कुल 8 जलाशयों) कर रहे हैं।
      नोट: वेंट बंदरगाह छोटे छेद है जबकि भरने बंदरगाह, प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा जाता है जहां बड़ा छेद है। प्रत्येक miRNA TLDA कार्ड 8 जलाशय हैएस, प्रत्येक इस प्रकार एक ही पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ कार्ड में सभी 384 कुओं लोड हो रहा है, 48 कुओं (एक स्तंभ एक्स 2 कॉलम में 24 कुओं) के प्रमुख के लिए। कि पूल ए सुनिश्चित करने और प्रत्येक नमूने के पूल बी संबंधित TLDA कार्ड पर लोड कर रहे हैं। अपकेंद्रित्र में विशेष microfluidics सरणी कार्ड धारक बाल्टी में सरणी कार्ड रखें।
    4. Microfluidics सरणी कार्ड के लिए, और (जैसे कि "TaqMan ऐरे कार्ड" धारकों के रूप में) विशिष्ट बाल्टी (जैसे Heraeus Multifuge 3SR, 230V सेंट्रीफ्यूज के रूप में) एक उपयुक्त सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करें। प्रत्येक बाल्टी तीन कार्ड (लोड / खाली) को पकड़ कर सकते हैं। हमेशा एक बाल्टी के सभी 3 स्लॉट के कब्जे में हैं और बाल्टी सेंट्रीफ्यूज के विपरीत स्लॉट में इसी तरह की बाल्टी (इस बाल्टी भी खाली या पूर्ण या तो तीन कार्ड, को शामिल करना चाहिए) रखकर संतुलित है कि सुनिश्चित करते हैं। बाल्टी धारक में कार्ड रखने, जबकि आठ जलाशयों ऊपर की तरफ परियोजना और प्रतिक्रिया कुओं सेंट्रीफ्यूज की बाहरी दीवार का सामना करना सुनिश्चित करें।
      1. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 331 XG पर कार्ड स्पिन। के बादपहले स्पिन, अपकेंद्रित्र खोलने के लिए और नेत्रहीन प्रतिक्रिया मिश्रण 384 कुओं के माध्यम से तिरस्कृत किया गया है सुनिश्चित करते हैं। एक और अधिक समय के लिए एक ही सेटिंग्स पर स्पिन को दोहराएँ। बाल्टी से कार्ड निकालें और आठ जलाशयों में से प्रत्येक में प्रतिक्रिया मिश्रण का स्तर एक समान है कि सुनिश्चित करते हैं। जलाशयों में छोड़ दिया तरल खंडों में किसी भी विसंगतियों आगे उपयोग के लिए कार्ड अनुचित बनाते हैं।
    5. Microfluidics सरणी कार्ड एक सटीक लेखनी विधानसभा (गाड़ी) सरणी के तरल पदार्थ वितरण चैनलों को सील और समान रूप से (कुल प्रतिक्रिया मात्रा 1 μl / अच्छी तरह से) सभी कुओं में प्रतिक्रिया मिश्रण वितरित करने के लिए है कि एक विशेष मुहर की जरूरत है।
    6. शुरू करने की स्थिति गाड़ी ले आओ और पन्नी पक्ष के साथ मुहर में लोड कार्ड डालने और मुहर पर लेखनी पिन करने के लिए खड़े हैं। यह मुहर के अंत बिंदु तक पहुँच जाता है जब तक एक धीमी गति से, स्थिर और एकल वर्दी स्ट्रोक में, कार्ड भर में गाड़ी धक्का। सील सरणी कार्ड निकालें और फिर जलाशय काटकैंची का उपयोग कार्ड से एस।
    7. सही ब्लॉक, गर्म ढक्कन और नमूना वाहक microfluidics सरणी वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली / मशीन में स्थापित किया गया है कि यह सुनिश्चित करें।
    8. कंप्यूटर पर तो microfluidics सरणी प्रणाली की बारी है और अंत में सॉफ्टवेयर लांच। मशीनों को सही ढंग से जुड़े हुए हैं कि सुनिश्चित करें। सरणी कार्ड, मानक वक्र, TaqMan अभिकर्मकों और मानक मोड के रूप में चयन प्रयोग। कार्ड एक और कार्ड बी से किसी के लिए सेटअप फाइल आयात फ़ाइल सहेजें।
    9. साधन के सामने की ओर शीर्ष बाएं कोने और बारकोड में अच्छी तरह से A1 के साथ साधन ट्रे में सील कार्ड रखें। प्रेस "शुरू भागो"। इस कार्यक्रम को पूरा करने के लिए लगभग 2 घंटे का समय लगेगा।

3. जांच-आधारित Nanofluidics मानव miRNA के पैनल

  1. रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी)
    1. हालांकि 100 एनजी सबसे नमूने के लिए इष्टतम है, 50-200 एनजी की कुल शाही सेना इनपुट के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करें। एक पूरा miRNA के प्रोफाइल के लिए, दो predefi चलानेनमूना प्रति आरटी प्रतिक्रियाओं (पूल ए और पूल बी) के आर टी-प्राइमर सेट के नेड ताल।
    2. DTTP (100 मिमी), आरटी बफर (10x), 2 MgCl, (25 मिमी), RNase अवरोध करनेवाला (20 यू / μl) के साथ आरटी प्राइमर सेट (10X), dNTPs की पूर्वनिर्धारित पूल: बर्फ पर अभिकर्मकों गला लें। बर्फ पर एंजाइम (पुनः संयोजक Moloney murine ल्यूकेमिया वायरस (rMoMuLV) रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (50 यू / μl) मत रखना। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर यह जब तक जरूरत। धीरे एंजाइम को छोड़कर, सभी अभिकर्मकों भंवर, और संक्षेप में 10,000 पर उन्हें अपकेंद्रित्र 10 सेकंड के लिए XG।
    3. दो ट्यूबों में, टेबल 3 ए में वर्णित के रूप में, अभिकर्मकों गठबंधन; पूल ए के लिए एक ट्यूब, पूल बी के लिए अन्य प्रत्येक ट्यूब पूल ए से या पूल बी से, या तो आर टी-प्राइमर सेट का केवल एक पूर्वनिर्धारित पूल में शामिल होंगे यह कम से कम 5% pipetting के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए अतिरिक्त मात्रा को तैयार करने की सिफारिश की है त्रुटि।
    4. पिपेट मिश्रण और 10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर फिर अपकेंद्रित्र संक्षिप्त करने के लिए। विभाज्य 100 एक नया ट्यूब में प्रत्येक शाही सेना के नमूने की एनजी, तो एक उचित मात्रा में जोड़नेNuclease मुक्त पानी के 3 μl की कुल बनाने के लिए। विभाज्य संबंधित ट्यूब में उपयुक्त आरटी अभिकर्मक मिश्रण की 4.5 μl।
    5. मिश्रण को पलटना, और फिर संक्षेप में 10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र। 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। एक thermocycler में जगह नमूने और आरटी कार्यक्रम शुरू करते हैं। साइकिल चालन की स्थिति: 40 चक्र, 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस (2 मिनट, 1 मिनट, 1 सेकंड के लिए 50 डिग्री सेल्सियस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस के लिए 16 डिग्री सेल्सियस), 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़। स्टोर सीडीएनए -15 -25 डिग्री सेल्सियस पर सेट आर टी-प्राइमर के इन पूर्वनिर्धारित पूल का उपयोग कर या तुरंत उपयोग उत्पन्न।
  2. पूर्व प्रवर्धन (पूर्व एएमपी)
    1. बर्फ पर सेट पूर्व amp प्राइमर का पूर्वनिर्धारित पूल गला लें। धीरे भंवर प्राइमरों, तो संक्षेप में 10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र। भंवर TaqMan preamp अभिकर्मक मिश्रण (2x) मिश्रण करने के लिए।
    2. दो ट्यूबों में, टेबल 3 बी में वर्णित के रूप में, अभिकर्मकों गठबंधन; पूल ए के लिए एक ट्यूब, पूल बी के लिए अन्य प्रत्येक ट्यूब या तो FR, आर टी-प्राइमर सेट का केवल एक पूर्वनिर्धारित पूल में शामिल होंगेओम पूल ए या पूल बी से यह कम से कम 5% त्रुटि pipetting के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए अतिरिक्त मात्रा तैयार करने के लिए सिफारिश की है।
    3. पिपेट मिश्रण है, और फिर संक्षेप में 10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र करने के लिए। विभाज्य नए ट्यूबों में उपयुक्त preamp अभिकर्मक मिश्रण की 22.5 μl। विभाज्य संबंधित ट्यूब में सीडीएनए नमूना के 2.5 μl। मिश्रण को पलटना, और फिर संक्षेप में 10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
    4. जगह एक thermocycler में नमूनों और पूर्व amp चलाते हैं। 25 μl के लिए सेट प्रतिक्रिया मात्रा। साइकिल चालन की स्थिति: 10 मिनट, दो मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट, 12 चक्र (15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 4 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस), 10 मिनट के लिए 99.9 डिग्री सेल्सियस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, पकड़ 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    5. उलटें 10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर संक्षेप में अपकेंद्रित्र तो मिश्रण करने के लिए सीडीएनए पूर्व प्रवर्धित, और। नए ट्यूबों में 0.1x ते बफर 8.0 पीएच (01:40 कमजोर पड़ने) के 156 μl के लिए पूर्व प्रवर्धित सीडीएनए के 4 μl जोड़ें। पतला मिश्रण करने के लिए पूर्व amp नमूने, और उसके बाद संक्षिप्त सीई उलटें10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर ntrifuge। स्टोर पतला और अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए -15 -25 डिग्री सेल्सियस पर undiluted पूर्व प्रवर्धित सीडीएनए, या तुरंत का उपयोग करें।
  3. Nanofluidics सारणियों लोड हो रहा है और qPCR प्रदर्शन
    1. Nanofluidics सरणी स्लाइड सीरियल नंबर का उपयोग कर वेबसाइट 31 से प्रासंगिक थाली फ़ाइल (.tpf) को डाउनलोड करें। इस विशिष्ट nanofluidics सरणी स्लाइड के लिए रन जानकारी शामिल हैं।
    2. पिघलना पतला पूर्व प्रवर्धित सीडीएनए और TaqMan वास्तविक समय qPCR के अभिकर्मक मिश्रण बर्फ पर (पहली बार के लिए अगर) का उपयोग। बोतल घूमता द्वारा qPCR के अभिकर्मक मिश्रण मिलाएं। नए ट्यूबों में पतला पूर्व प्रवर्धित सीडीएनए की 22.5 μl को qPCR के अभिकर्मक मिश्रण की 22.5 μl जोड़ें। धीरे भंवर मिश्रण करने के लिए, और उसके बाद संक्षिप्त 10 सेकंड के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
    3. विभाज्य nanofluidics सरणी कार्यप्रवाह 384 अच्छी तरह से नमूना थाली के आठ कुओं में प्रत्येक नमूने के 5 μl (2 कॉलम, चार पंक्तियाँ)। प्रत्येक नमूने के पूल ए और पूल बी आसन्न 8 अच्छी तरह से ब्लॉक में कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करें (देखें Figurई 1 या पूरक) लेआउट के लिए एक्सेल शीट।
      1. प्रत्येक नमूना प्लेट नमूनों की कीमत आठ स्लाइड्स शामिल कर सकते हैं। हालांकि, nanofluidics सरणी के लिए प्रणाली केवल एक ही समय में चार nanofluidics सरणियों प्रक्रिया कर सकते हैं। नमूनों की कीमत चार से अधिक स्लाइड एक नमूना थाली पर लोड करने के लिए कर रहे हैं, शेष वर्गों सील कर रहे हैं सुनिश्चित करें। OpenArray नमूना थाली मुहर के साथ सील।
        नोट: यह सलाह दी जाती है आवश्यक वर्गों में मुहर पूर्व में कटौती, ताकि वर्गों वाष्पीकरण कम करने के लिए व्यक्तिगत रूप से unsealed / सील किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, थाली एक अक्षुण्ण मुहर के साथ सील किया जा सकता है, और लोड हो रहा है तो जब वर्गों को व्यक्तिगत रूप से बाहर काटा जा सकता है।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 490 XG पर अपकेंद्रित्र थाली। 1 घंटे के भीतर nanofluidics सरणी स्लाइड लोड। कारण स्लाइड सील करने के लिए अनुमति दी सीमित समय के लिए, एक बार में केवल एक स्लाइड लोड करें। फ्रीजर से nanofluidics सरणी स्लाइड निकालें और यह कमरे में अस्थायी करने के लिए आने की अनुमतिerature (~ 15 मिनट)।
    5. सही ब्लॉक, गर्म ढक्कन और नमूना वाहक nanofluidics सरणी प्रणाली में स्थापित किया गया है कि यह सुनिश्चित करें। कंप्यूटर, और वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली और लोडिंग सिस्टम चालू करें। संबंधित सॉफ्टवेयर और मशीनों से जुड़े हुए हैं कि सुनिश्चित करते हैं। पैकेजिंग से लोडिंग सिस्टम (उपभोग्य ऐरे स्लाइड ढक्कन, प्लग और विसर्जन तरल पदार्थ) निकालें।
    6. धीरे ढीला करने के लिए विसर्जन द्रव सिरिंज के सवार पर खींच। , टोपी निकालें सिरे से पर टिप और फ्लश हवा जगह है। मशीन के भीतर लोडिंग सिस्टम सुझावों प्लेस और ढक्कन हटा दें। पीसीआर प्रणाली के भीतर नमूना थाली रखें।
    7. पर दस्ताने डाल दिया। वे गलती से स्लाइड ढक्कन अंकन के जोखिम को कम करने के लिए कसकर फिटिंग कर रहे हैं सुनिश्चित करें। ध्यान से खुला स्लाइड पैकेजिंग। धीरे धीरे हाथ में स्लाइड टिप। स्लाइड के शीर्ष मत छुओ।
    8. बाईं तरफ बारकोड के साथ, पीसीआर प्रणाली में स्लाइड रखें। लोड हो रहा है के लिए इरादा नमूना थाली के हिस्से से मुहर निकालें। लोड हो रहा है प्रणाली का प्रयोग करेंसॉफ्टवेयर स्लाइड बारकोड दर्ज करने के लिए, स्थिति, नमूना स्थिति और टिप विन्यास स्लाइड।
    9. सभी प्रासंगिक चेक पूरा कर रहे हैं, प्रेस लोड स्लाइड। पीसीआर प्रणाली स्लाइड लोड हो रहा है, वहीं स्लाइड ढक्कन के नीचे से स्पष्ट और लाल प्लास्टिक को हटा दें। लोड हो रहा है जब समाप्त हो, ध्यान से हटाने के लिए और 90 सेकंड के भीतर स्लाइड सील।
      1. थाली दबाना भीतर स्लाइड रखें। स्लाइड पर स्लाइड ढक्कन रखें। 30 सेकंड के लिए दबाना। कि बारकोड को सही ढंग से प्रदर्शित किया जाता है ताकि ढक्कन तैनात है सुनिश्चित करें। थाली दबाना से विधानसभा निकालें।
      2. स्लाइड के भीतर की स्थिति विसर्जन द्रव सिरिंज टिप ढक्कन के खिलाफ दबाव डाल रहा है कि इतनी। धीरे धीरे ढक्कन के साथ तरल पदार्थ रन, यह सुनिश्चित करने के विसर्जन के तरल पदार्थ के साथ स्लाइड भरें। पूरा एक बार, हैंडल से टूट जाता है जब तक पेंच मोड़, प्लग के साथ स्लाइड सील।
      3. स्लाइड ढक्कन के शीर्ष पर प्लास्टिक कवर निकालें, और फिर ध्यान से वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली की स्लाइड वाहक में जगह है। सु नहीं है सुनिश्चित करेंयह अचानक नहीं छोड़ देता है, और स्लाइड के शीर्ष पर नहीं टिकते ताकि स्लाइड के तल पर pport यह उतारा जा रहा है। यह एक घंटा के भीतर qPCR के लिए कार्यक्रम स्लाइड / cassette.Initialize पीसीआर प्रणाली के पक्षों को छूने और शुरू करने के लिए ठीक है।
    10. पीसीआर सिस्टम सॉफ्टवेयर के भीतर "OpenArray" का चयन करें। प्रेस "स्लाइड आईडी खोजें"। यह कुछ मिनट लगेंगे। सॉफ्टवेयर थाली आईडी नहीं मिल सकता है यह मैन्युअल दर्ज किए जाने के लिए, यह पूछना होगा।
    11. प्रेस "प्लेट केन्द्रों की पुष्टि करें"। फिर, यह कुछ ही मिनट लगेंगे। लाल डॉट केंद्र के भीतर है कि और स्लाइड के शीर्ष पर कोई उंगलियों के निशान / निशान हैं कि जाँच करें। प्रत्येक स्लाइड के लिए संबंधित .tpf फाइल लोड और एक परिणाम फ़ाइल का नाम और स्थान निर्दिष्ट करें। प्रेस "शुरू भागो"। इस कार्यक्रम को पूरा करने के लिए लगभग 2 घंटे का समय लगेगा।

Representative Results

एक miRNA जांच आधारित परख qPCR प्रतिक्रिया के लिए सिफारिश की मात्रा 20 μl है। नोट: हम 5 μl की एक प्रतिक्रिया मात्रा 20 μl मात्रा 4,7,30 का प्रयोग कर प्राप्त उन लोगों के लिए इसी तरह के परिणाम का उत्पादन करने में सक्षम है कि इस बात की पुष्टि की है। 5 μl की प्रतिक्रिया की मात्रा कम करने के प्रति संवेदनशीलता में सराहनीय हानि के बिना अभिकर्मक लागत में 75% की कमी के लिए अनुमति देता है। चित्रा 2 में प्रस्तुत किया है, प्रतिक्रिया 20 μl की मात्रा और 5 μl अप (0.92 की आर 2, पी = 0.0002) के साथ 39 चक्र तक एक मजबूत सह-संबंध को दिखाते हैं।

Microfluidics सरणी पारंपरिक 96 अच्छी तरह से थाली PCRs की तुलना में कई नमूने का विश्लेषण करने के लिए एक अधिक कुशल तरीका है, जो (कार्ड एक और कार्ड बी के लिए) लगभग 5 घंटे में एक नमूने में व्यक्त 754 miRNAs पर डेटा प्राप्त करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। <बी एक नरम-Altman साजिश (पता चलता है - हम एक ही नमूने के लिए miRNA microfluidics सरणी कार्ड की तुलना में (नमूना एक और एक दोहराने नमूना) चित्रा 3 ए।मजबूत> 3 ए) और इन नमूनों के लिए परीक्षण सभी 754 miRNAs के लिए सहसंबंध साजिश (3 बी)। कार्ड (कार्ड ए और बी) कई स्थानों में दोनों पर बेतरतीब रखे 3 अलग नियंत्रण miRNAs (U6, RNU44 और RNU48) कर रहे हैं। U6 चक्र दहलीज (सीटी) मूल्यों दो रन के बीच तुलना कर रहे हैं, हम मूल्यों (तालिका 4) के बीच महत्वपूर्ण अंतर का पालन नहीं किया। यह U6 का मूल्यांकन नमूने में अधिक से अधिक बहुतायत (कम सीटी मूल्य) पर व्यक्त की है कि यहाँ भी ध्यान दें महत्वपूर्ण है। हम तो कुल मिलाकर एक गुणांक 98% का दृढ़ संकल्प के (चित्रा -3 सी-डी) के साथ miRNAs की इसी तरह की अभिव्यक्ति थी जो रन (एन = 150) दोनों में 0-19.99 के बीच सीटी मूल्यों है कि सभी miRNAs, की तुलना में। Betwee महत्वपूर्ण अंतर के साथ miRNAs की संख्या। - दोनों रन में 20 और 29.99 के बीच सीटी मूल्यों है कि सभी 277 miRNAs की, 16 Mirs मूल और दोहराने रन (एफ 3E चित्रा) के बीच काफी मतभेदसीटी मूल्यों दोनों रन (- एच चित्रा 3 जी) के लिए 30-40 के बीच चयन किया गया था जब एन रन (327 में से 89) की वृद्धि हुई।

nanofluidics सरणी मंच चित्रा -4 ए में प्रतिनिधित्व के रूप में परीक्षण प्रत्येक सीरम / प्लाज्मा नमूना से 754 miRNAs, के लिए डेटा प्रदान करता है यह इन प्रवर्धन घटता जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है -। यह सब qPCR के साथ है - परिणाम सच प्रवर्धन का संकेत है कि यह सुनिश्चित करने के लिए। 48 subarrays के प्रत्येक (चित्रा 1) भी तीन सबसे लोकप्रिय "गृह" ncRNAs के लिए एक परख में शामिल हैं:। U6, RNU44 और RNU48 4B चित्रा U6 का एक विशिष्ट क्लस्टरिंग एक भी नमूना से प्रतिकृति को दिखाता है। ये प्रतिकृति कम मानक विचलन (एसडी <0.5) को प्रदर्शित करने और इतनी विश्वसनीयता का सूचक हैं। वैकल्पिक रूप से, चित्रा 4C एक दूसरे नमूने में U6 प्रतिकृति (एसडी> 0.5) की वृद्धि की परिवर्तनशीलता को दर्शाता है। इस वैधता ओ नकारना नहीं हैशेष assays के एफ, हालांकि यह एक और अधिक गहन आलोचना की जरूरत नहीं है। U6, जैविक तरल पदार्थ में सबसे "गृह" miRNAs साथ के रूप में, एक चर अभिव्यक्ति हो सकती है। यह चित्रा 4C में उल्लिखित नमूने, के एक 4B चित्रा में प्रस्तुत किया कि कम से कम U6 सामग्री चार गुना प्रदर्शित करता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। 4C में प्रस्तुत नमूने में U6 के स्तर पर एक पैनल 4 बी में प्रस्तुत की तुलना के साथ शुरू करने के लिए 75% से भी कम है, इसलिए अधिक से अधिक तकनीकी परिवर्तनशीलता छोटे प्रतिक्रिया मात्रा 17 के द्वारा exacerbated है जो टेप के पॉसों वितरण, की वजह से उम्मीद की जाती है।

रन पूरा कर लिया है एक बार एक और उपयोगी उपकरण निर्यात के लिए उपलब्ध गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) छवियों है। इनमें से एक चयन प्रत्येक के माध्यम से छेद सही ढंग से (चित्रा 5) लोड किया गया है कि इस बात की पुष्टि करने के लिए Rox, qPCR के अभिकर्मक मिश्रण में पाया निष्क्रिय डाई, के प्रतिदीप्ति का उपयोग करता है। एन ए के माध्यम से छेद, या वास्तव में एक टायर subarray, अपर्याप्त नमूना मात्रा, वाष्पीकरण के लिए, 384 अच्छी तरह से नमूना थाली, पूरी तरह से Accufill प्रणाली या उसके सुझावों के भीतर नमूना थाली सील, या दोष को दूर करने के लिए विफलता के कुओं में मौजूद बुलबुले के कारण लोड नहीं हो सकता। छेद के माध्यम से वास्तविकता में परख लोड कभी नहीं किया गया था, जब "से undetectable" के रूप में लेबलिंग miRNAs से बचने के लिए पहचान की जानी चाहिए और कोई भी उतार दिया। इस समस्या का सामना कर रहा है, तो नमूना / mastermix का कम से कम 5 μl 384 अच्छी तरह से नमूना थाली के प्रत्येक कुएं में भरी हुई है कि इस बात की पुष्टि, नमूना प्लेट ठीक से लोड करने से पहले centrifuged है, पन्नी सील पूरी तरह से हटा दिया जाता है और लोड OpenArray स्लाइड सील और सभी लगातार रन के लिए आवंटित समय के भीतर चलाया जाता है। लोड हो रहा मुद्दों पर अभी भी जारी रहती है, तो ये अधिक होने की संभावना विशिष्ट बैच या सरणियों की बहुत या संबंधित उपभोग्य और आगे की सहायता से संबंधित हो सकता है निर्माता के माध्यम से मांग की जानी चाहिए।

"Src =" / फ़ाइलें / ftp_upload / 52,586 / 52586fig1.jpg "/>
चित्रा 1: Nanofluidics ऐरे कार्यप्रवाह के लिए नमूने के लेआउट: (ए) प्रत्येक 384 अच्छी तरह से नमूना थाली अप करने के लिए 8 nanofluidics सरणियों के लिए नमूने पकड़ कर सकते हैं। (बी) पतला, पूर्व प्रवर्धित सीडीएनए आसन्न 8 अच्छी तरह से समूहों में पूल ए और पूल बी के साथ, 8 कुओं (4 पंक्तियों से 2 कॉलम) में रखा गया है। प्रत्येक चक्र एक अच्छी तरह से प्रतिनिधित्व करता है। (सी) नमूना थाली के प्रत्येक अच्छी तरह nanofluidics सरणी में से एक subarray में लोड किया जाएगा। प्रत्येक छोटे से वर्ग एक subarray का प्रतिनिधित्व करता है।

चित्र 2
चित्रा 2: परम्परागत 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेटफार्मों के लिए सह-संबंध विश्लेषण: 20 μl और सीटी मूल्यों (39 चक्र) में एक मानक 96 अच्छी तरह से थाली मंच का उपयोग TaqMan वास्तविक समय qPCR पर 5 μl प्रतिक्रिया संस्करणों के बीच सह-संबंध। हम चार अलग microRNAs तुलना में (मीर 375, 4 विभिन्न मानव सीरम और प्लाज्मा नमूनों में मीर-30C, मीर-30D और मीर-7)। दूसरों से undetectable थे के बाद से ही 11 डेटा बिंदुओं प्लॉट किए जाते हैं। आर 2 = 0.92, पी = 0.0002।

चित्र तीन
। चित्रा 3: (- बी ए) microfluidics सरणी कार्ड का उपयोग कर miRNA रूपरेखा परिसंचारी दो microfluidics कार्ड (कार्ड-ए और कार्ड-बी) का उपयोग करना, 754 miRNAs की एक प्रोफाइल उत्पन्न होता है। यहाँ दिखाया गया है, हम दो microfluidics सरणी के लिए एक ही नमूना इस्तेमाल किया microfluidics कार्ड परिणामों के reproducibility जाँच करने के लिए चलाता है। हम 0-19.99 के बीच सीटी मूल्यों के साथ, कुल मिलाकर miRNAs की एक समान अभिव्यक्ति मनाया (सी - डी)। दोहराने रन के बीच 20-29.99 और महत्वपूर्ण मतभेद (- एफ ई) के बीच सीटी मूल्यों के साथ कुछ miRNAs (277 में से 16) शामिल हैं। 327 की नवासीउच्च सीटी मूल्यों के साथ microRNAs (30-40) दोनों रन (- एच जी) के बीच महत्वपूर्ण अंतर का प्रदर्शन किया।   डाटा बनती टी परीक्षण का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: पीसीआर उत्पाद प्रवर्धन घटता के प्रतिनिधि प्रोफाइल: एक मानव प्लाज्मा नमूना के लिए सभी miRNA लक्ष्य के संयुक्त (ए) प्रवर्धन घटता के एक प्रतिनिधि आंकड़ा है। U6 के लिए एक परख (एक आम नियंत्रण ncRNA) हर subarray में रखा गया है। (बी) में नमूना <(0.5 (सी) उच्च मानक विचलन एसडी) से पता चलता है, जबकि (0.5 कम परिवर्तनशीलता एसडी)> U6 प्रतिकृति भीतर दर्शाता है। दोनों नमूनों को tota हैंमानव प्लाज्मा से अलग एल आरएनए। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: Nanofluidics सारणियों की क्यूसी विश्लेषण: एक सही रूप से लोड nanofluidics सरणी (बाएं) और एक गलत तरीके से लोड nanofluidics सरणी (दाएं) के गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) छवियों। (qPCR के अभिकर्मक मिश्रण में वर्तमान) निष्क्रिय डाई, Rox, एक सही रूप से लोड के माध्यम से छेद से संकेत मिलता है fluoresces। सही पर सरणी के माध्यम से छेद qPCR के अभिकर्मक मिश्रण के साथ लोड नहीं कर रहे हैं और इन झूठी नकारात्मक पीसीआर प्रतिक्रियाओं के रूप में पहचान की जानी चाहिए कि कई subarrays / है।

अवयव 5 μl प्रतिक्रिया प्रति वॉल्यूम (μl) आरटी बफर (10x) 0.5
dNTPs (100 मिमी) 0.05
RNase अवरोध करनेवाला 0.6
Nuclease मुक्त पानी 1.39
रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस 0.33
कुल मात्रा 2.33

तालिका 1 ए: एक मानक 96 अच्छी तरह से थाली मंच का उपयोग TaqMan वास्तविक समय qPCR के लिए एक 5 μl आरटी प्रतिक्रिया तैयारी में आरटी अभिकर्मक मिश्रण घटकों।

अवयव 5 μl प्रतिक्रिया प्रति वॉल्यूम (μl) 20 μl प्रतिक्रिया प्रति वॉल्यूम (μl)
फास्ट पीसीआर mastermix (2x) 2.5 10
TaqMan qPCR परख (20x) * 0.25 1
Nuclease मुक्तपानी 1.45 5.8
कुल मात्रा: 4.2 16.8

* परीक्षण किया चयनित miRNA के आधार पर परख घटक।

तालिका 1 बी: एक मानक 96 अच्छी तरह से थाली मंच का उपयोग TaqMan वास्तविक समय qPCR के लिए एक 5 या 20 μl qPCR प्रतिक्रिया तैयारी में qPCR के अभिकर्मक मिश्रण घटकों।

अवयव प्रतिक्रिया प्रति वॉल्यूम (μl)
Megaplex आरटी प्राइमर (10x) 0.8
dTTp (100 मिमी) के साथ dNTPs 0.2
Multiscribe रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (50 यू / μl) 1.5
10X आरटी बफर 0.8
2 MgCl (25 मिमी) 0.9
RNase अवरोध करनेवाला & # 160; (20 यू / μl) 0.1
Nuclease मुक्त पानी 0.2
संपूर्ण 4.5

टेबल 2A: TLDA miRNA के पैनल के लिए एक 5 μl आरटी प्रतिक्रिया तैयारी में आरटी अभिकर्मक मिश्रण घटकों।

अवयव प्रतिक्रिया प्रति वॉल्यूम (μl)
TaqMan preamp Mastermix (2x) 12.5
Megaplex preamp प्राइमर (10x) 2.5
Nuclease मुक्त पानी 7.5
संपूर्ण 22.5

तालिका 2 बी: TLDA miRNA के पैनल के लिए एक 25 μl पूर्व amplication प्रतिक्रिया तैयारी में preamp अभिकर्मक मिश्रण घटकों।

"Cellspacing =" 0 "> अवयव प्रतिक्रिया प्रति वॉल्यूम (μl) Megaplex आरटी प्राइमर (10x) 0.75 dTTp (100 मिमी) के साथ dNTPs 0.15 Multiscribe रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (50 यू / μl) 1.5 10X आरटी बफर 0.75 2 MgCl (25 मिमी) 0.9 RNase अवरोध करनेवाला (20 यू / μl) 0.09 Nuclease मुक्त पानी 0.35 संपूर्ण 4.5

तालिका 3 ए: जांच आधारित nanofluidics miRNA के पैनल के लिए एक 5 μl आरटी प्रतिक्रिया तैयारी में आरटी अभिकर्मक मिश्रण घटकों।

अवयवएस प्रतिक्रिया प्रति वॉल्यूम (μl)
TaqMan preamp Mastermix (2x) 12.5
Megaplex preamp प्राइमर (10x) 2.5
Nuclease मुक्त पानी 7.5
संपूर्ण 22.5

तालिका -3 बी:। जांच के आधार पर nanofluidics miRNA के पैनल के लिए एक 25 μl पूर्व amplication प्रतिक्रिया तैयारी में preamp अभिकर्मक मिश्रण घटकों नोट: इंटरैक्टिव अनुपूरक, तीन प्लेटफार्मों के लिए उपलब्ध कराई गई एक्सेल स्प्रेडशीट पहले से ही त्रुटि pipetting के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए 5% अतिरिक्त के लिए खातों।

नमूना एक एक दोहराने का नमूना
15.535 16.156
15.471 15.652
15।623 16.063
15.963 15.889
14.006 13.993
14.502 14.623
14.907 14.384
13.732 14.946

टेबल 4: microfluidics सरणी कार्ड का उपयोग कर miRNA U6 रूपरेखा परिसंचारी। दो microfluidics सरणी कार्ड (ए और बी) का उपयोग करना। नमूना एक से U6 नियंत्रण miRNA की सीटी-मूल्यों (कुल = 8)। रनों के बीच मनाया अनुरूप U6 नियंत्रण miRNA बहुतायत।

Discussion

सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए जांच-आधारित qPCR के प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम आरटी-उत्पाद का एक ही मात्रा और एकाग्रता प्रत्येक qPCR प्रतिक्रिया में भरी हुई है) यकीन है कि एक बनाने के लिए कर रहे हैं, 2) के घटकों का सही अनुपात और संस्करणों के लिए आवश्यक qPCR प्रतिक्रिया तैयार किया है और अच्छी तरह से, 3) सही और लगातार संस्करणों प्रत्येक qPCR प्रतिक्रिया के लिए जोड़ रहे मिलाया है, और अभी भी ध्यान में रखना है, जबकि 4) प्रत्येक नमूने और प्रतिक्रिया मिश्रण की तैयारी और लोड हो रहा है, संभव के रूप में समय कम से कम राशि में पूरा हो गया है कर रहे हैं ऊपर दिए गए महत्वपूर्ण कदम पहले उल्लेख किया है।

microfluidics सरणी कार्ड उपयुक्त सेंट्रीफ्यूज और विशिष्ट बाल्टी की जरूरत है। प्रत्येक बाल्टी तीन कार्ड (लोड / खाली) को पकड़ कर सकते हैं। हमेशा एक बाल्टी के सभी 3 स्लॉट के कब्जे में हैं और बाल्टी सेंट्रीफ्यूज के विपरीत स्लॉट में इसी तरह की बाल्टी (इस बाल्टी भी खाली या पूर्ण या तो तीन कार्ड, को शामिल करना चाहिए) रखकर संतुलित है कि सुनिश्चित करते हैं। Bucke में कार्ड देते हुएटी धारक, 8 जलाशयों ऊपर की तरफ परियोजना और प्रतिक्रिया कुओं सेंट्रीफ्यूज की बाहरी दीवार का सामना करना सुनिश्चित करें। कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 331 XG पर कार्ड स्पिन। पहले स्पिन के बाद, अपकेंद्रित्र खोलने के लिए और नेत्रहीन प्रतिक्रिया मिश्रण 384 कुओं के माध्यम से तिरस्कृत किया गया है सुनिश्चित करते हैं। एक और अधिक समय के लिए एक ही सेटिंग्स पर स्पिन को दोहराएँ। बाल्टी से कार्ड निकालें और आठ जलाशयों में से प्रत्येक में प्रतिक्रिया मिश्रण का स्तर एक समान है कि सुनिश्चित करते हैं। जलाशयों में छोड़ दिया तरल खंडों में किसी भी विसंगतियों आगे उपयोग के लिए कार्ड अनुचित बनाते हैं।

आर टी-उत्पाद का एक ही एकाग्रता है, शाही सेना के एक ही इनपुट एकाग्रता प्रत्येक आरटी प्रतिक्रिया में जोड़ा जाता है। कुल शाही सेना एकाग्रता एक माइक्रो volumespectrophotometer का उपयोग कर मापा जाता है। मनाया 260/280 अनुपात प्लाज्मा / सीरम से अलग शाही सेना के लिए 1.3 के रूप में के रूप में कम हो सकता है; नीचे की ओर qPCR संबंधी प्रक्रिया या डेटा 30 उत्पन्न पर इस एक प्रभाव है प्रकट नहीं होता है। इसी तरह, के 260/280 अनुपातइस के साथ साथ परीक्षण किया शाही सेना के नमूने मनाया qPCR में कोई असामान्य प्रभाव के साथ 1.3-1.7 के बीच थे।

ऐसे biofluids से उन के रूप में कम आरएनए सामग्री के नमूने, का उपयोग कर, यह प्रसंस्करण के लिए पूर्व शाही सेना अंदाजा लगाना मुश्किल हो सकता है। हम शाही सेना अलगाव में सिंथेटिक कील-इन का उपयोग करने के साथ ही रिवर्स प्रतिलेखन चरणों की सलाह देते हैं। हमारे अनुभव, Arabidopsis thaliana miRNA के उम्मीदवारों (ATH-मीर 159a और एथलीट-मीर 172a) में हमारे अनुभव में उच्च हो सकता है, जो (जैसे सेल-मीर 39 या सेल-मीर 54) के रूप में Caenorhabditis एलिगेंस miRNAs अधिक पसंद कर रहे हैं से उन लोगों की तुलना अनुरूपता thaliana। इस तरह के चरण-विशिष्ट कील-इन के उपयोग के अलग अलग समय पर assayed कई नमूने भर में miRNA के डेटा को सामान्य बनाने के लिए खाते में कर सकते हैं। सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया के लिए शाही सेना की एक निश्चित इनपुट मात्रा का प्रयोग भी 32,33 सिफारिश की है।

miRNA मात्रा का ठहराव के लिए तीन जांच आधारित प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित अलग मात्रा की आवश्यकता होती हैकुल शाही सेना इनपुट, अलग workflows और लागत की। वर्कफ़्लोज़ के प्रत्येक miRNA लक्ष्य की संख्या और विश्लेषण किया जा करने के लिए नमूनों की संख्या के आधार पर अलग-अलग throughputs के लिए पूरा करने के लिए तैयार कर रहे हैं। बढ़ रही है throughput (384 rxn 3072 rxn 96 rxn) के साथ, प्रतिक्रिया प्रति लागत के समय की एक इकाई पर प्राप्त डेटा की मात्रा में वृद्धि के साथ कम हो जाती है। इन प्लेटफार्मों के सभी TaqMan रसायन शास्त्र उपयोग के बाद से, प्राप्त आंकड़ों की गुणवत्ता के समान होने की उम्मीद की जा सकती। TaqMan qPCR के सीरम / प्लाज्मा नमूने 9,11,27 में miRNAs की बहुतायत की पहचान के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है। यहाँ पर चर्चा की तीन प्लेटफार्मों वही रसायन शास्त्र का हिस्सा है, प्रतिक्रिया मात्रा में कमी प्रतिलेख का पता लगाने के गतिशील रेंज में कमी (फार आरजे एट अल।, अप्रकाशित डेटा) की ओर जाता है। 96 अच्छी तरह से qPCR के प्लेटफार्म एक कम throughput, लेकिन उच्च संवेदनशीलता मंच है और हमारे विचार में, सभी की जांच के आधार पर (या आधारित डाई) पीसीआर प्लेटफार्मों के लिए "सोने के मानक '। हालांकि, इस साल मईनमूने के कई सौ या हजारों assayed और कई microRNAs के लिए किया जा रहा है अगर सबसे किफायती या कुशल मंच नहीं हो। Microfluidics (TLDA) और nanofluidics (OA) की प्लेटफार्मों एक कम समय में बड़े डेटा के अधिग्रहण की अनुमति देने के लिए बनाया गया उच्च throughput / सामग्री प्लेटफार्मों रहे हैं। बैच मतभेद TLDA कार्ड में मनाया गया है, इस एक ही बैच से TLDA कार्ड का अनुरोध द्वारा कम किया जा सकता है। कम बहुतायत miRNAs TLDA कार्ड के विभिन्न बैचों पर ही नमूना परीक्षण का उपयोग कर - जब हम TLDA मंच (चित्रा 3) के मध्य का 17% में महत्वपूर्ण भिन्नता से पता चला है कि निरीक्षण करते हैं। इसलिए हम TLDA कार्ड का उपयोग कर विश्लेषण के लिए एक ही बैच नंबर का उपयोग की सलाह देते हैं। इस बदलाव भी किसी भी संभावित लोड हो रहा है और pipetting त्रुटियों सहित तकनीकी परिवर्तनशीलता के कारण हो सकता है। हालांकि, हम TLDA ताश के पत्तों की एक ही बैच का अनुरोध / आदेश देने की सलाह देते हैं। कोई महत्वपूर्ण बैच भिन्नता OA के मंच पर मनाया गया। इस के बावजूद, TaqMan experimen आधारितताल qPCR प्लाज्मा / सीरम नमूनों में miRNAs की बहुतायत को मापने के लिए प्रस्ताव आसानी दृष्टिकोण। यहाँ पर चर्चा कम, मध्यम और उच्च throughput दृष्टिकोण एक अत्यंत कुशल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और साफ (कम पृष्ठभूमि शोर) रसायन विज्ञान का उपयोग कर नमूने और miRNAs की एक सीमा का विश्लेषण करने के लिए लचीलापन प्रदान करते हैं।

Disclosures

अनुच्छेद प्रसंस्करण / प्रकाशन लागत प्रकाशन के लिए इस पांडुलिपि की स्वीकृति के बाद, जीवन टेक्नोलॉजीज द्वारा कवर किया गया।

Acknowledgments

सभी लेखकों NHMRC सीटीसी, सिडनी, किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन (JDRF), ऑस्ट्रेलिया के विश्वविद्यालय और रेबेका कूपर फाउंडेशन, ऑस्ट्रेलिया से बुनियादी सुविधाओं के समर्थन को स्वीकार करते हैं। इस शोध WW, RJF आह करने के लिए ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (FT110100254) और JDRF, ऑस्ट्रेलिया (CRN201314) से अनुदान के माध्यम से वित्त पोषित किया गया और एम वी जे सब गीला प्रयोगशाला प्रयोग किया जाता है, ASJ डेटा विश्लेषण किया जाता है। WW के पहले मसौदे में लिखा था। आह अध्ययन की योजना बनाई है और डेटा का विश्लेषण किया। सभी लेखकों को पढ़ा है और प्रकाशन के लिए प्रस्तुत पांडुलिपि, आंकड़े और कार्यपत्रकों के अंतिम संस्करण पर सहमत हुए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well-platform
For Reverse transcription
TaqMan MicroRNA Assays INV SM  Applied Biosystems
 
4427975 https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975
The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems
 
4366597 or 4366596 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596
The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.
For qPCR run on a 96-well platform
2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG  Applied Biosystems
 
4367846 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846
The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on  the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml  Applied Biosystems 4346907 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product
Microfluidics platform (TLDA)
For Reverse transcription
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems
 
4399966 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966
The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 Applied Biosystems
 
4444281 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281
The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
OR OR
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 Applied Biosystems
 
4444750 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750
The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
For Pre-amplification
TaqMan PreAmp Master Mix Applied Biosystems
 
4391128 or 4488593 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593
The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0  Applied Biosystems
 
4444303 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303
The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems
 
4399233 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233
The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
1x TE Buffer (100 ml) Invitrogen 12090-015 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product
The 1x TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0  Applied Biosystems 4444913 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913
Nanofluidics platform (OpenArray)
For Reverse transcription
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).
For Pre-amplification
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)
To load and run the slides
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) Applied Biosystems
 
4470187 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit  Applied Biosystems
 
4469576 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576
OpenArray 384-well Sample Plates   Applied Biosystems
 
4406947 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix Applied Biosystems
 
4462159 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159
OpenArray AccuFill System Tips  Applied Biosystems
 
4457246 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246
Others
Nuclease-Free Water Qiagen 129117 http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 431, 350-355 (2004).
  2. Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. MicroRNA functions in animal development and human disease. Development. 132, 4653-4662 (2005).
  3. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  4. Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell. Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478 (2010).
  5. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes. Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).
  6. Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes. Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).
  7. Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development. Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).
  8. Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA profiling in ovarian cancer. Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).
  9. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).
  10. Mattie, M. D., et al. Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies. Mol Cancer. 5, 24 (2006).
  11. Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects. BMC Res Notes. 2, 89 (2009).
  12. Zhu, H. T., et al. Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients. Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).
  13. Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases. Clin Endocrinol (Oxf). (2014).
  14. Liu, R., et al. Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer. Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).
  15. Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PLoS One. 3, e3148 (2008).
  16. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3. Dev Biol. 311, 603-612 (2007).
  17. Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR. J Am Heart Assoc. 3, e000792 (2014).
  18. Wu, C., et al. Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma. PLoS One. 9, e92292 (2014).
  19. McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media. J Vis Exp. e50294 (2013).
  20. Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
  21. Genda, Y., et al. microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study. Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).
  22. Wang, B., et al. Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array. PLoS One. 6, e17167 (2011).
  23. Cuk, K., et al. Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer. Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).
  24. Morrison, T., et al. Nanoliter high throughput quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 34, e123 (2006).
  25. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16, 991-1006 (2010).
  26. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50, 244-249 (2010).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
  28. Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44, 31-38 (2008).
  29. Kodani, M., et al. Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens. J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).
  30. Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta,, V, M., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Exp Diabetes Res. 2012, 168368 (2012).
  31. TPF & SPF File Download Options [Internet]. Available from: http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html (2014).
  32. Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).
  33. Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).
जांच-आधारित वास्तविक समय पीसीआर microRNAs के मात्रात्मक मापन के लिए दृष्टिकोण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J. Vis. Exp. (98), e52586, doi:10.3791/52586 (2015).More

Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J. Vis. Exp. (98), e52586, doi:10.3791/52586 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter