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Biology

프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

doi: 10.3791/52586 Published: April 14, 2015

Summary

순환 마이크로 RNA는 최근 각종 암 및 기타 질환에 대한 유망한 새로운 바이오 마커로 등장했다. 이 문서의 목적은 세 가지 다른 프로브 기반의 실시간 PCR 플랫폼 및 정량화 및 마이크로 RNA 순환의 풍요 로움을 결정하는 데 사용할 수있는 방법을 논의하는 것입니다.

Abstract

이 정확하고 재현성있는 분석을 제공 가장 민감한 검출 방법 중 하나이기 때문에 프로브 계 정량적 PCR (qPCR에)는, 전 사체 존재비를 측정하는 선호 방법이다. 프로브 기반 화학 다른 (염료 기반) 화학에 비해 최소한의 배경 형광을 제공합니다. 현재, 성적 증명서 풍부을 정량하는 그 사용 프로브 기반 화학 사용할 수있는 여러 가지 플랫폼이 있습니다. 96 웰 플레이트 (96) 그러나 qPCR에 샘플 또는 miRNA에 단지 최대 하나의 실행이 시험 될 수있는 가장 통상적으로 사용되는 방법이다. 샘플들의 다수 / miRNA가 분석되어야한다면 이는 시간 소모적이고 지루한 작업이다. 이러한 미세 유체 (예를 들면의 TaqMan 어레이 카드) 및 nanofluidics 배열 (예 : OpenArray) 제공 용이성 높은 처리량 프로브 기반 플랫폼은 재현하고 효율적으로 짧은 시간에 많은 수의 샘플에서 여러 마이크로 RNA의 풍요 로움을 감지한다. 여기서 우리는 실험 설정을 보여차 처리량의 증가 수준을 제공하는 프로브 기반 화학, 세 가지 서로 다른 플랫폼 (96 웰 플레이트, 미세 유체 및 nanofluidics 배열)를 사용하여 혈청 또는 혈장-EDTA 샘플에서 miRNA의 정량을위한 프로토콜입니다.

Introduction

마이크로 RNA (miRNA가)는 유전자 발현 1-3 조정기로서 기능 ~ 22 뉴클레오티드 비 코딩 (NC)의 RNA. 동물의 대부분의 miRNA는 유전자 발현 2-4의 부정적인 규제에 이르게 3 'UTR을 대상으로, mRNA의 DNA 서열의 특정 염기 쌍을 통해 작동합니다. 이것은 일반적으로 mRNA의 번역의 억제를 통해 또는 리보솜 드롭 오프에 의해 발생합니다. 순환의 miRNAs는 당뇨병 5-7, 8, 난소, 전립선 및 유방암 구 (10,11), (12) B 형 간염 및 다른자가 면역 질환과 같은 질병 (13)의 다양한 연구 및 임상 분야에서 새로운 바이오 마커 인 것으로 밝혀졌다. 연구는 더 접근하고 9,11-15 덜 침습적 인 인간 혈장 및 혈청에서 순환뿐만 아니라 다른 세포 또는 조직에서의 miRNA 풍부한를 식별하기 위해 실시되었다.

miRNA의 정량화의 다른 방법은 전자되었습니다이러한 표준 96 웰 플레이트 플랫폼 4,12,16-18, 마이크로 유체 카드 플랫폼 12,18-23과 nanofluidics 어레이 플랫폼 17,24 등 여러 플랫폼을 사용하여에 stablished. 정량 실시간 PCR (qPCR에)는 여러 (염료 - 또는 프로브 기반) 화학 물질을 사용하여 성적의 상대 또는 절대 숫자를 측정 할 수있는 기능을 제공합니다. 프로브 기반 실시간 PCR 화학은 단일 전 사체를 검출하기 위해 복사본 낮은 배경 형광 및 높은 감도의 장점을 제공한다. 그것은 상대적으로 정량화 된 miRNA 발현 (25)를 결정하는 그것을 선호하는 방법을, 효과적인 사용이 간단하고 재현성이 높은 비용이다. 전사 (RT) 및 qPCR에 4,26,27 역 : 프로브 기반 qPCR의 방법은 일반적으로 두 단계를 포함한다. 줄기 루프 RT 프라이머 성숙한 또는 기본 miRNA의 분자에 하이브리드 및 보완 (C) DNA로 변환되는 경우 RT이다. cDNA의 생성물의 정량은 miRNA에 특이 PCR 프라이머를 사용하여 수행26 ~ 28. 프로브 기반 qPCR에의 원리는 형광 표지 된 프로브의 가수 분해를 포함 실시간으로 보완 가닥 확장의 검출을 기반으로합니다. 이 프로브는 형광 기자와 FRET (형광 공명 에너지 전송)을 할 수 있도록 단지 떨어져있는 거​​제를 포함하도록 설계되었습니다. 형광 기자 (에미 터)에서 방출의 검출은 소광 분자의 근접에 의해 마스크 처리됩니다. 을 Taq 폴리머 라제 (POL)가 상류 프라이머로부터 연장 및 포크 (프로브의 5 '말단)에 도달 할 때의 Taq의 POL 엑소 뉴 클레아 제 활성은 소광에서 형광 방출의 물리적 분리 / 분리 선도, 프로브 가수 분해한다. 형광 터의 단일 분자의 릴리스는 검출기에 의해 기록이 아니라 / 반응에서 형광 신호의 증분 증가로 제시됩니다. 형광의 증가는 정확한 숨어 있도록, 생성 된 PCR 산물의 양에 비례증폭 된 대상 (26, 28)의 antification.

정량화 된 miRNA의 수요 증가, 높은 처리량에 기술 매체는 더 많은 샘플을 짧은 시간 안에 처리 할 수​​ 있도록 개발되었다. 저밀도의 TaqMan 어레이 (TLDA)은 하나의 플레이트에서 분석의 miRNA의 수의 증가를 제공하고 프로브 기반 qPCR의 화학에 기초하여 중간 처리량 마이크로 유체 혁신적인 디자인이다. TLDA는 cDNA의 합성에 사용되는 프라이머를 RT-소정 풀의 사용을 포함한다. 이러한 cDNA를 다음의 qPCR 22,26,29을 사용하여 여러 miRNAs의 발현을 결정하기 위해 사용자 정의 된 384 웰 미세 유체 카드에 방사된다. 카드의 각 웰 따라서 단일 TLDA 카드 (26)에서 처리 될 수있다 (384)의 반응까지, 특정의 miRNA (들)을 증폭하는 프라이머 및 프로브를 포함 건조.

nanofluidics 어레이 유전자 전 사체의 검출을 위해 사용되는 높은 처리량 플랫폼 (24)에 3,072의 배열로 33 나노 리터 반응 혼합물의 쉽게 로딩을 용이하게하기 위해 소수성 - 친수성 상호 작용을 제공하는 고유 행렬을 이용한다. 이 문서에서는 혈청 / 플라즈마에서의 miRNA를 정량화 이러한 방법이 수행하고 수행하고 이러한 데이터를 해석 할 때 고려해야 할 중요한 요소 방법을 시연에 초점을 맞추고 있습니다. 계정으로 연결, 개별 장점과 한계는이 문서에서 논의 될 것이다.

Protocol

총 RNA는 30 실험실 또는 기타 시판되는 키트를 사용하여 확립 된 프로토콜을 사용하여 혈청으로부터 분리 될 수있다.

참고 : 각 실험에서 반응 볼륨을 계산하기위한 보충 대화 형 스프레드 시트 (5 % 초과 볼륨이 피펫 차지 포함)가 제공됩니다.

1. 프로브 기반 실시간 qPCR에 표준 96 웰 플레이트 플랫폼을 사용하여

  1. miRNA의 혈청 / 플라즈마 RNA 샘플에 cDNA 합성 (역전사)
    1. 계산하고 각 cDNA 합성 반응에 RNA 10ng의 인출. (5 ㎕의 반응에) 1.67 μL 10 겨 RNA의 최종 부피를 가지고 핵산 분해 효소가없는 물을 추가합니다. 얼음에 샘플을 유지합니다.
    2. miRNA의를 선택하고 자신의 RT 프라이머를 해동.
    3. RT 완충액 (10X)의 dNTPs (100 mM)을 된 RNase 억제제 (20 U / μL) : RT 시약 혼합 성분을 녹여. 장소 효소를 유지하지 마십시오 (재조합 몰 로니 쥐 백혈병 바이러스(rMoMuLV)) (recombinanat의 몰 로니 쥐 백혈병 바이러스 (rMoMuLV) 얼음에 역전사 효소 (50 U / μl를). 필요할 때까지 또는 냉동실 블록에 -20 ° C에서 보관하십시오.
    4. 표 1A에 설명 된대로 얼음 RT 시약 믹스를 준비합니다. 그것은 적어도 5 %를 피펫 미동 체적 과량을 제조 권장한다.
    5. 0.2 ㎖의 PCR 튜브 / 플레이트에 RT 시약 믹스 각각 2.33 μl를 추가합니다.
    6. 소용돌이 RT 프라이머 튜브는 10 초 동안 10,000 XG에서 다음 원심 분리기 간략하게 섞는다. 각각의 PCR 튜브 또는 판에 miRNA의 특정 RT 프라이머 1 μl를 추가합니다. 접시에 각각의 PCR 튜브 또는 우물에 희석 된 RNA의 1.67 μl를 추가합니다. 얼음에 모두 추가를 수행합니다.
    7. 4 ℃에서 5 분 동안 1,950 XG에서 반응 관 또는 판을 원심 분리기.
    8. 30 분, 85 ° 30 분 동안 16 ° C, 42 ° C : 다음 설정 조건에 열 자전거 타는 사람에 miRNA의 cDNA 합성 프로그램을 설정5 분 대기 4 ° C에 대한 C.
    9. 10 μL로 설정 반응 볼륨. 열 자전거 타는 사람에 반응 튜브 또는 플레이트를 넣습니다. RT 실행을 시작합니다. 실시간 PCR 증폭을 즉시 진행되지 않는 경우, -20 ° C에서의 cDNA (RT) 반응을 저장한다.
  2. 성숙의 miRNAs의 검출을위한 실시간 qPCR에 프로브 기반
    1. 각 제품에 대한 RT 선택된 프로브 기반의 qPCR 분석 (20X)를 해동.
    2. 병을 소용돌이로 실시간 PCR (qPCR에 시약 믹스)의 타당성 유일한 솔루션을 섞는다.
    3. 각각의 miRNA를 분석하는 qPCR에 시약 믹스를 준비합니다. qPCR에 각 miRNA의 샘플에 대한 멸균 1.5 ml의 microcentrifuge 관을 얻고 표 (1B)에 설명 된대로 각 튜브에 구성 요소를 추가 할 준비를합니다. 그것은 적어도 5 %를 피펫 미동 체적 과량을 제조 권장한다.
    4. 광학 96 웰 플레이트 (또는 튜브)의 각 웰에 각각의 qPCR에 시약 믹스의 4.2 μl를 추가합니다. 0.8 μl를 추가각각의 cDNA 반응의 각도에 (각 miRNA에 대한 단계 1.1에서 합성).
    5. 적절한 광학 커버 플레이트를 밀봉합니다. 4 ° C에서 5 분 동안 1,950 XG에서 판 (또는 튜브)를 원심 분리기
    6. 컴퓨터, 96 웰 플레이트 / 마이크로 유체 배열 리더를 켜고 마지막으로 소프트웨어를 실행합니다. 기계가 제대로 연결 및 올바른 블록 (빠른 96 웰 플레이트) 가열 뚜껑이 제자리에 있는지 확인합니다.
    7. 선택 실험으로 96 웰 고속 블록 (0.1 ml)에, 표준 곡선의 TaqMan 시약 및 고속 모드. 20 초 동안 95 ° C, 50 사이클 (1 초, 30 초, 60 ° C, 95 ° C) : 다음 프로그램 사이클링 조건을 사용하여 실시간 PCR 시스템에 qPCR에를 설정합니다.
    8. 10 μL로 설정 반응 볼륨. 악기에 반응 관 또는 플레이트를 넣습니다. 보도는 "실행을 시작합니다." 이 프로그램은 완료하는 데 약 1 시간이 소요됩니다.

2. 프로브 기반 미세 유체 어레이 카드 (칼슘RD 및 B)

참고 : 프로브 기반 miRNA의 패널은 두 개의 384 웰 미세 유체 카드 (배열 카드 및 배열 카드 B)의 집합으로 제공됩니다. 각 카드는 최대 380의 miRNAs과 컨트롤을 말린 프라이머 및 프로브가 포함되어 있습니다. (또는 프리 앰프없이) 카드 또는 카드 B에 해당하는 cDNA 제품은 실시간 PCR에 대한 각각의 배열에로드됩니다.

  1. 역전사 (RT)
    1. 1-1,000 NG의 총 RNA의 입력이 프로토콜을 사용한다. 입력 1-350 사이 NG이면, 프리 앰프 (프리 앰프) 단계를 수행한다. 350 NG 위의 입력의 경우, 프리 앰프없이 배열 카드에 직접 cDNA를로드합니다.
      참고 : 혈청 miRNA의 프로파일의 경우, 총 RNA 100 NG로 시작합니다. 전체 miRNA의 프로파일의 경우, 샘플 당 RT 반응 (풀과 풀 B)의 RT-프라이머 세트의 두 개의 미리 정의 된 풀을 실행합니다.
    2. 얼음에 다음과 같은 시약을 녹여. RT 프라이머 (10 배) : 수영장과 풀 B, dTTP (100 mM)을 RT 버퍼 (10 배)의 MgCl 2 (25 mM)을의 RNase 억제제 (20 U / &와의 dNTPs# 181; L). 얼음에 효소 (재조합 몰 로니 쥐 백혈병 바이러스 (rMoMuLV)) 역전사 효소 (50 U / μL)를 보관하지 마십시오. 필요할 때까지 -20 ° C에서 보관합니다.
    3. 조심스럽게 효소를 제외한 모든 시약 와동 후 잠시 10 초 동안 10,000 XG에서 튜브를 원심 분리기.
    4. 두 튜브에, 표 2A에 기재된 바와 같이, 결합 시약; 풀에 대해 하나의 튜브, 수영장 B의 다른 각 튜브 그것은 피펫 오류를 보상하기 위해 적어도 5 %를 초과 볼륨을 준비하는 것이 좋습니다 풀 또는 풀 B.에서 중, RT 프라이머 세트의 하나의 미리 정의 된 풀을 포함합니다 .
    5. 혼합 반전 및 10 초 동안 10,000 XG에 다음 원심 분리기 잠시. 분취 액 100 새 튜브에 각 RNA 샘플의 NG 후 3 μL의 합계를 만들기 위해 자유로운 클레아 물의 적절한 볼륨.
    6. 각각의 튜브에 나누어지는 적절한 RT 시약 믹스 4.5 μL. 혼합 반전 한 후 잠시 10 초 동안 10,000 XG에 원심 분리기. 얼음에 품어5 분.
    7. 열 순환기에 다음과 같은 조건을 사용하여 RT를 시작 장소 샘플 : 40주기 (2 분 16 ° C, 1 분 42 ° C, 1 초 동안 50 ° C), 5 분 동안 85 ° C는 4 °에서 개최 C. 저장 cDNA를 ° C ~ -25 -15 RT-프라이머의 미리 정의 된 풀을 사용하여 생성 즉시 사용.
  2. 사전 증폭
    1. 얼음 전치 증폭 프라이머의 풀을 미리 녹여. 부드럽게 소용돌이 프라이머는 다음 간단히 10 초 동안 10,000 XG에이를 원심 분리. 소용돌이의 TaqMan 프리 앰프 시약 믹스 부드러운 눌러 (2 배), 혼합합니다.
    2. 두 튜브에, 표 2b에 설명 된 바와 같이, 결합 시약; 풀에 대해 하나의 튜브, 풀 B의 다른
      주의 : 전술 한 바와 같이, 풀 전치 증폭 프라이머 튜브로 이동되며, 풀 B 프라이머 그것이 적어도 5 %를 피펫 미동 초과 부피를 제조 권장 튜브 B. 가야한다.
    3. 혼합 반전 한 후 잠시 10 초 동안 10,000 XG에 원심 분리기.나누어지는 새로운 튜브에 적합한 프리 앰프 시약 믹스의 22.5 μL. 분취 각 튜브에 (RT 단계에서 제조 됨)의 cDNA 샘플 2.5 μL.
    4. 혼합 반전 한 후 잠시 10 초 동안 10,000 XG에 원심 분리기. 5 분 동안 얼음에 품어. 열 순환기에 배치 샘플은 프리 앰프주기를 시작합니다. 사이클링 조건 : 10 분, 2 분 55 ° C, 2 분, 12주기 (15 초 95 ° C, 4 분 60 ° C), 10 분 동안 99.9 ° C, 72 ° C, 95 ° C, 보유 4 ° C에서.
    5. 반전은 10 초 동안 10,000 XG에서 간단히 원심 분리 한 후 혼합 된 cDNA를 미리 증폭. (: 4 희석 1) 0.1X TE 완충액 (pH 8.0)에 사전 증폭 된 cDNA의 75 μl를 추가합니다. 혼합 희석 된 전치 증폭 샘플을 전환 한 후 10 초 동안 간단히 만 XG 원심 분리기. 저장은 최대 일주일 동안 -15 -25 ° C에서의 cDNA를 미리 증폭, 또는 즉시 사용 희석시켰다.
  3. 미세 유체 카드를로드 및 qPCR에를 수행
    1. 미세 유체 유지외부 적어도 반 시간 동안 miRNA의 카드 실온에 도달한다. 얼음에 묽은 사전 증폭 된 cDNA를 해동하고이어서 짧은 스핀 반전 튜브에 의해 혼합한다. 병을 소용돌이에 의해 qPCR의 시약 믹스를 섞는다.
    2. 새로운 튜브에 희석 사전 증폭 된 cDNA의 9 μL에 qPCR의 시약 믹스 450 μl를 추가합니다. 카드의 경우, 사전 증폭 된 제품은 900 μL에 최종 볼륨을 만들기 위해 프라이머 풀 A.이 뉴 클레아 무료 물 441 μl를 추가하여 제조 사용합니다. 혼합 할 수있는 튜브를 반전 한 후 잠시 10 초 동안 10,000 XG에 원심 분리기.
    3. 포장에서 TLDA 카드 (이 도달하면 실내 온도)를 제거하고 아래 포일면이 깨끗한 지역에 놓습니다. 카드의 8 충전 포트에 각각 PCR 반응 혼합물의 100 μl를 추가합니다. 저수지의 각 포트 2 개 (각 카드에 총 8 저수지)가 있습니다.
      주 : 통기구가 작은 구멍 반면 충전 포트는, 반응 혼합물이 추가 큰 구멍이다. 각각의 miRNA의 TLDA 카드 8 저수지가의 각 따라서 동일한 PCR 반응 믹스 카드에있는 모든 384 우물을로드, 48 우물 (한 열 × 2 열 24 우물)에 이르는. 그 풀을 확인하고, 각 샘플의 풀 B는 각각 TLDA 카드에로드됩니다. 원심 분리기 전문 마이크로 유체 배열 카드 홀더 양동이에 배열 카드를 놓습니다.
    4. 마이크로 유체 어레이 카드의 경우 (예 : "의 TaqMan 배열 카드"소지자) 특정 버킷 (예 : 헤라우스 Multifuge 3SR, 230V 원심 분리기 등)에 적합한 원심 분리기를 사용합니다. 각 버킷은 3 카드 (로드 / 빈)까지 저장할 수 있습니다. 항상 양동이의 3 슬롯을 점유하고 버킷 원심 분리기의 반대 슬롯에 비슷한 버킷 (이 양동이는 빈 또는 전체 중 3 카드를 포함한다) 배치로 균형되어 있는지 확인합니다. 버킷 홀더에 카드를 배치하는 동안, 8 저수지 위쪽으로 돌출 반응 우물이 원심 분리기의 외부 벽에 직면해야합니다.
      1. 실온에서 1 분 동안 331 XG에 카드 스핀. 후제 1 스핀은, 원심 분리기를 열고 시각적 반응 혼합물은 384 웰을 통해 분배 된 보장. 1 시간을 더 동일한 설정에서 스핀을 반복합니다. 양동이에서 카드를 제거하고 8 저수지의 각각에 반응 혼합물의 수준이 균일 있는지 확인하십시오. 저수지에 남아있는 액체 볼륨의 모든 불일치는 더 사용할 카드가 부적절합니다.
    5. 마이크로 유체 어레이 카드 정밀 스타일러스 조립체 (캐리지) 어레이의 유체 유통 경로를 밀봉 동등 (총 반응 부피 1 μL / 웰)을 모든 웰에 첨가, 혼합을 배포를 갖는 특수한 시일이 필요하다.
    6. 시작 위치로 캐리지를 가져오고 포일면 실러에로드 된 카드를 삽입하고 봉인에 스타일러스 핀에 줄 지어. 이 시일의 종점에 도달 할 때까지 천천히 꾸준하고 균일 한 번의 스트로크로, 카드를 통해 캐리지를 밀어. 밀봉 배열 카드를 분리 한 다음 저장을 차단가위를 사용하여 카드에서의.
    7. 올바른 블록, 가열 뚜껑 및 샘플 캐리어는 마이크로 유체 배열 실시간 PCR 시스템 / 컴퓨터에 설치되어 있는지 확인하십시오.
    8. 컴퓨터에 다음의 마이크로 유체 어레이 시스템의 전원을 켜고 마지막으로 소프트웨어를 실행합니다. 기계가 제대로 연결되어 있는지 확인합니다. 배열 카드, 표준 곡선의 TaqMan 시약 및 표준 모드로 선택합니다 실험. 카드 및 카드 B. 중 하나의 설치 파일을 가져 오기하면 파일을 저장합니다.
    9. 악기의 앞쪽으로 왼쪽 상단 모서리 및 바코드에 잘 A1과기구 트레이에 봉인 카드를 놓습니다. 보도는 "시작 실행". 이 프로그램은 완료하는 데 약 2 시간이 소요됩니다.

3. 프로브 기반 Nanofluidics 인간의 miRNA 패널

  1. 역전사 (RT)
    1. 그러나 100 ng 등 대부분의 샘플에 최적입니다, 50-200 NG 총 RNA의 입력이 프로토콜을 사용합니다. 전체 miRNA의 프로파일의 경우, 두 predefi을 실행샘플 당 RT 반응 (풀과 풀 B)의 RT-프라이머 세트의 네드 풀.
    2. dTTP (100 mM)을 RT 버퍼 (10 배)의 MgCl 2, (25 mM)을의 RNase 억제제 (20 U / μL)와 RT 프라이머 세트 (10 배), dNTPs를 미리 정의 된 풀 : 얼음에 시약을 녹여. 얼음에 효소 (재조합 몰 로니 쥐 백혈병 바이러스 (rMoMuLV) 역전사 효소 (50 U / μL)를 보관하지 마십시오. -20 ° C에서 보관 필요할 때까지. 조심스럽게 효소를 제외한 모든 시약 와동, 짧게 만에 그들을 원심 분리 10 초 동안 XG.
    3. 두 튜브에, 표 3A에 기재된 바와 같이, 결합 시약; 풀에 대해 하나의 튜브, 수영장 B의 다른 각 튜브 풀 또는 풀 B.에서 중, RT-프라이머 세트의 한 미리 정의 된 풀을 포함이 5 % 이상을 피펫 팅을 보상하기 초과 볼륨을 준비하는 것이 좋습니다 오류가 발생했습니다.
    4. 피펫은 혼합하고 10 초 동안 10,000 XG에 다음 원심 분리기 짧게한다. 나누어지는 100 새로운 튜브에 각각의 RNA 샘플의 NG 후 적절한 볼륨을 추가핵산 분해 효소가없는 물 3 μL의 총 확인합니다. 분취 각 튜브에 적절한 RT 시약 믹스 4.5 μL.
    5. 혼합 반전 한 후 잠시 10 초 동안 10,000 XG에 원심 분리기. 5 분 동안 얼음에서 인큐베이션. 열 순환기에 배치 샘플은 RT 프로그램을 시작합니다. 사이클링 조건 : 40 회, 5 분 동안 85 ° C (2 분, 1 분, 1 초 동안 50 ° C 42 ° C 16 ° C)는, 4 ° C에서 개최. 저장 cDNA를 -15~-25 ℃로 설정 RT-프라이머의 미리 정의 된 풀을 사용하거나 즉시 사용을 생성합니다.
  2. 프리 앰프 (프리 앰프)
    1. 얼음에 설정 전치 증폭 프라이머의 풀을 미리 녹여. 부드럽게 소용돌이 프라이머는 다음 간단히 10 초 동안 10,000 XG에이를 원심 분리. 소용돌이의 TaqMan 프리 앰프 시약 믹스 (2X)를 혼합합니다.
    2. 두 튜브에, 표 3B에 기재된 바와 같이, 결합 시약; 풀에 대해 하나의 튜브, 수영장 B의 다른 각 튜브 중 하나 FR, RT-프라이머 세트의 한 미리 정의 된 풀을 포함합니다톰 수영장 또는이 풀 B.에서이 5 % 이상에게 오류를 피펫 팅을 보상하기 초과 볼륨을 준비하는 것이 좋습니다.
    3. 피펫 혼합 한 다음 잠깐 10 초 동안 10,000 XG에이를 원심 분리한다. 나누어지는 새로운 튜브에 적합한 프리 앰프 시약 믹스의 22.5 μL. 분취 각 튜브에의 cDNA 샘플 2.5 μL. 혼합 반전 한 후 잠시 10 초 동안 10,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 5 분 동안 얼음에서 인큐베이션.
    4. 장소 열 순환기에 샘플과는 프리 앰프를 실행합니다. 25 μL로 설정 반응 볼륨. 사이클링 조건 : 10 분, 2 분 55 ° C, 2 분, 12주기 (15 초 95 ° C, 4 분 60 ° C), 10 분 동안 99.9 ° C, 72 ° C, 95 ° C, 보유 4 ° C에서.
    5. 반전은 10 초 동안 10,000 XG에서 간단히 원심 분리 한 후 혼합 된 cDNA를 미리 증폭. 새로운 튜브에 0.1X TE 버퍼의 pH 8.0 (1시 40분 희석)의 156 μL에 사전 증폭 된 cDNA의 4 μl를 추가합니다. 희석 혼합하는 프리 앰프 샘플, 다음 간단히 가전 전환10 초 동안 10,000 XG에 ntrifuge. 스토어 희석 최대 1 주일 -15 -25 ° C에서 희석 사전 증폭 된 cDNA, 즉시 사용합니다.
  3. Nanofluidics 배열을로드 및 qPCR에 수행
    1. nanofluidics 어레이 슬라이드의 일련 번호를 사용하여 웹 사이트 (31)로부터 해당 파일 플레이트 (.tpf)을 다운로드. 이것은 특정 nanofluidics 배열 슬라이드의 실행 정보가 포함되어 있습니다.
    2. 해동 묽은 사전 증폭 된 cDNA와의 TaqMan 실시간 qPCR의 시약 믹스 얼음 (처음으로 사용하는 경우). 병을 소용돌이에 의해 qPCR의 시약 믹스를 섞는다. 새로운 튜브에 희석 사전 증폭 된 cDNA의 22.5 μL에 qPCR의 시약 믹스의 22.5 μl를 추가합니다. 부드럽게 소용돌이 혼합하고, 그 후 잠시 10 초 동안 10,000 XG에 원심 분리기.
    3. 나누어지는 nanofluidics 배열 워크 플로우 384 웰 샘플 플레이트의 8 우물에 각 시료의 5 μL (2 열, 4 행). 각 샘플의 수영장과 풀 B 인접한 8 웰 블록에 있는지 확인하십시오 (Figur전자 1 또는 보충은) 레이아웃 시트를 엑셀.
      1. 각 샘플 플레이트는 샘플의 가치가 최대 8 개의 슬라이드를 포함 할 수 있습니다. 그러나 nanofluidics 배열의 시스템은 단일 실행에 4 nanofluidics 배열을 처리 할 수​​ 있습니다. 샘플의 가치 개 이상의 슬라이드를 하나의 샘플 플레이트에로드 할 경우, 나머지 부분이 밀봉되어 있는지 확인하시기 바랍니다. OpenArray 샘플 플레이트 실러와 인감.
        참고 : 그것은하는 것이 좋습니다 필요한 섹션으로 봉인을 미리 절단, 그래서 섹션 증발을 줄이기 위해 개별적으로 개봉 / 밀봉 될 수있다. 대안 적으로, 플레이트를 그대로 시일 재로 밀봉 될 수 있으며,로드시 다음 섹션들은 개별적으로 절단 할 수있다.
    4. 4 ℃에서 1 분 동안 490 XG에 원심 분리기 판. 1 시간 이내에 nanofluidics 배열 슬라이드를로드합니다. 인해 슬라이드를 밀봉하도록 허용 제한된 시간에 한 번에 하나의 슬라이드를로드주세요. 냉동실에서 nanofluidics 배열 슬라이드를 제거하고 실내 온도에 올 수 있도록erature (~ 15 분).
    5. 올바른 블록, 가열 뚜껑 및 샘플 캐리어 nanofluidics 어레이 시스템에 설치되어 있는지 확인하십시오. 컴퓨터 및 실시간 PCR 시스템과 로딩 시스템을 켭니다. 각각의 소프트웨어에 액세스하고 컴퓨터가 연결되어 있는지 확인합니다. 포장 로딩 시스템의 소모품 (배열 슬라이드 덮개, 플러그 및 침지 유체)를 제거합니다.
    6. 조심스럽게 풉니 다 침지 유체 주사기의 플런저를 잡아 당깁니다. , 캡을 제거 끝에서의 팁과 플러시 공기를 배치합니다. 기계 내에서 로딩 시스템 팁을 놓고 뚜껑을 제거합니다. PCR 시스템 내에서 샘플 플레이트를 놓습니다.
    7. 에 장갑을 넣어. 이들이 실수로 슬라이드 덮개 마킹의 위험을 최소화하기 위해 밀착되도록. 조심스럽게 열고 슬라이드 포장. 천천히 손에 슬라이드 팁. 슬라이드의 상단을 만지지 마십시오.
    8. 왼쪽에있는 바코드, PCR 시스템에 슬라이드를 놓습니다. 로딩을위한 샘플 판의 부분에서 봉인을 제거합니다. 로딩 시스템을 사용하여소프트웨어는 슬라이드 바코드를 입력 할 위치, 샘플과 선단 위치 설정 슬라이드.
    9. 모든 관련 검사 완료를 눌러 부하 슬라이드. PCR 시스템 슬라이드 로딩하는 동안, 슬라이드 덮개의 바닥으로부터 명확하고 적색 플라스틱을 제거한다. 로드가 완료되면, 조심스럽게 제거하고 90 초 이내에 슬라이드를 봉인.
      1. 플레이트 클램프 내에서 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드에 슬라이드 덮개를 놓습니다. 30 초 동안 클램프. 그 바코드를 올바르게 표시되도록 뚜껑이 배치되어 있는지 확인합니다. 플레이트 클램프에서 조립품을 분리합니다.
      2. 슬라이드 위치 내의 침지 유체 주사기 팁 덮개 압압되도록. 천천히 뚜껑을 따라 유체 실행을 보장 침지​​ 유체와 슬라이드를 입력합니다. 전체되면 핸들이 끊기는 때까지 나사를 돌릴, 플러그 슬라이드를 봉인.
      3. 슬라이드 덮개의 상부에 플라스틱 커버를 제거하고 신중 실시간 PCR 시스템의 슬라이드 캐리어에 놓는다. SU가 있는지 확인갑자기 떨어 뜨리지 않고, 슬라이드의 상단을 만지지 않도록 슬라이드 하단에 DMA 장치는이 저하되고있다. 그것은 1 시간 내에 qPCR을위한 프로그램을 슬라이드 / cassette.Initialize PCR 시스템의 측면을 터치하고 시작하려면 확인합니다.
    10. PCR 시스템 소프트웨어 내에서 "OpenArray"를 선택합니다. 보도는 "슬라이드 ID를 찾기". 이 작업은 몇 분 소요됩니다. 소프트웨어가 판 ID를 찾을 수없는 경우가 수동으로 입력하는 것은 요청합니다.
    11. 보도는 "플레이트 센터 확인". 다시, 이것은 몇 분 소요됩니다. 빨간 점은 센터 내에 있는지와 슬라이드의 맨 위에 아무 지문 / 표시가 없는지 확인하십시오. 각 슬라이드에 대한 각각의 .tpf 파일을로드하고 결과 파일 이름과 위치를 지정합니다. 보도는 "시작 실행". 이 프로그램은 완료하는 데 약 2 시간이 소요됩니다.

Representative Results

miRNA의 프로브 기반 분석 qPCR의 반응에 권장되는 볼륨은 20 μL이다. 참고 : 5 μL의 반응 부피가 20 μL 부피 4,7,30을 사용하여 달성 된 것과 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 확인했다. 5 μL로 반응 부피를 낮추면 감도의 상당한 손실없이 시약 비용의 75 % 감소를 허용한다. 그림 2에 제시된 바와 같이, 반응 20 μL의 볼륨과 5 μL 최대 (0.92 R 2, P = 0.0002)와 39 회까지 강력한 협력 관계를 보여줍니다.

마이크로 유체 어레이는 통상적 인 96 개의 웰 플레이트 PCR들에 비해 다수의 샘플을 분석하는 더 효율적인 방법이다 (카드, 카드 B의 경우) 약 5 시간에 시료에서 발현 754 miRNA에 대한 데이터를 획득하기위한 수단을 제공한다. <B는 개성 - 알트 플롯을 (표시 - 우리는 같은 샘플에 대한 miRNA의 마이크로 유체 배열 카드 비교 (샘플 및 반복 샘플)도 3a를.강한> 3A) 및 이들 샘플 테스트를 모든 754의 miRNA에 대한 상관 관계 플롯 (3B). 카드 (카드 A와 B) 여러 위치에서 모두 랜덤하게 배치 된 3 가지 제어 miRNA가 (U6, RNU44 및 RNU48)이 있습니다. U6주기 임계 값 (CT) 값이 2 실행 사이에 비교하면, 우리는 값 (표 4) 사이에 유의 한 차이가 관찰되지 않았다. 그것은 U6는 평가 샘플에서 더 풍부 (낮은 코네티컷 값)에서 표현되는 점에 유의하는 것이 중요하다. 우리는 전체 공동 효율 98 %의 결정 (그림 3C-D)와 miRNA가 유사한 표현했다 런 (N = 150) 모두에서 0-19.99 사이 코네티컷 값이 모두의 miRNA를 비교했다. betwee 상당한 차이가있는 miRNA의 수입니다. - 모두 실행 20과 29.99 사이에 코네티컷 값이있는 모든 277의 miRNAs 중 16 미르는 원래 반복 실행 (F 그림 3E) 사이에 크게 차이코네티컷 값이 모두 실행 (- H 그림 3G)에 대해 30 ~ 40 사이에서 선택했을 때 N 실행은 (327의 89) 증가했다.

nanofluidics 어레이 플랫폼은도 4a에 나타낸 바와 같이 테스트 각 혈청 / 혈장 샘플로부터 754 miRNA에 대한 데이터를 제공하며 이러한 증폭 곡선을 검토하는 것이 중요 -. 그것은 모든 qPCR에와 같이 - 결과가 참 증폭 나타내는되도록. (48) 서브 어레이의 각 (그림 1) 또한 세 가지 가장 인기있는 "가사"ncRNAs에 대한 분석이 포함되어 있습니다. U6는 RNU44 및 RNU48도 4b는 U6의 전형적인 클러스터링이 하나의 샘플에서 복제 보여줍니다. 이러한 복제물 낮은 표준 편차 (SD <0.5) 표시 등 안정성의 지표입니다. 대안 적으로,도 4C는 제 2 샘플에서 U6의 복제물 (SD> 0.5)의 변동성이 증가 보여준다. 이 유효성 O를 부정하지 않습니다나머지 분석 f를, 비록 그것은보다 철저한 비판을 필요로한다. U6는 생체 액에서 가장 "가사"의 miRNAs와 같은 변수 표현을 할 수 있습니다. 이것은도 4c에 설명 된 샘플 중 하나는도 4b에 제시된 것 이상 U6 콘텐츠를 4 배 표시 주목해야한다. 도 4c에 제시된 샘플 U6의 레벨이 하나의 패널 (b)에 제시된보다 처음부터 75 % 이하이기 때문에, 큰 기술적 변동은 작은 반응 부피 (17)에 의해 악화된다 사체의 푸 아송 분포로 인해 예상된다.

실행이 완료되면 또 다른 유용한 도구는 수출에 사용할 수있는 품질 관리 (QC) 이미지입니다. 이들의 선택은 각각의 관통 구멍이 올바르게 (도 5)로드되었는지 확인 ROX, qPCR에 시약 믹스 검색된 패시브 염료의 형광을 사용한다. EN 관통 구멍, 또는 실제로 타이어 부분 배열이 불충분 샘플 볼륨, 증발, 384 웰 샘플 플레이트, 완전히 Accufill 시스템 또는 끝에서 샘플 플레이트 씰, 또는 결함을 제거하기 위해 실패의 우물에 존재하는 거품 인해로드되지 않을 수 있습니다. 구멍을 통해 현실의 분석이로드되지 않을 때, "탐지"로 라벨의 miRNA를 방지하기 위해 확인해야하는 모든 언로드. 이런 문제가 발생하면, 샘플 / mastermix의 적어도 5 μL를 384- 웰 샘플 플레이트의 각 웰에로드되었는지 확인, 샘플 플레이트가 적절히 로딩 전에 원심 분리하여, 호일 시일을 완전히 제거하고,로드 OpenArray 슬라이드 밀​​봉 및 모든 연속적인 실행을 위해 할당 된 시간 내에서 실행됩니다. 로딩 문제가 여전히 지속되면, 이러한 가능성이 특정 배치 또는 배열의 많은 또는 관련 소모품 및 추가 지원에 관한 될 수있다 제조 업체를 찾아야한다.

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그림 1 : Nanofluidics 배열 워크 플로우 샘플의 레이아웃 : (A) 각 384 웰 샘플 플레이트는 최대 8 nanofluidics 배열에 대한 샘플을 보유 할 수 있습니다. (B) 희석은 사전 증폭 된 cDNA를 인접한 8 웰 그룹에 수영장과 풀 B로, 8 우물 (4 행으로 2 열)에 배치됩니다. 각 원은 잘 하나를 나타냅니다. (C) 샘플 플레이트의 각 웰은 nanofluidics 어레이의 하나의 부분 배열에로드한다. 각각의 작은 사각형은 하나의 부분 배열을 나타냅니다.

그림 2
그림 2 : 기존의 96 웰 PCR 플랫폼을위한 협력 관계 분석 : 20 μL와 CT 값 (39주기)의 표준 96 웰 플레이트 플랫폼을 사용의 TaqMan 실시간 qPCR에 5 μL 반응 볼륨 사이의 협력 관계. 우리는 4 개의 마이크로 RNA를 비교 (은 miR-375, 4 다른 인간의 혈청 및 혈장 샘플은 miR-30C 미르-30D 미르-7). 다른 사람들이 발견 할 때부터 만 11 데이터 포인트는 플롯됩니다. R 2 = 0.92, P = 0.0002.

그림 3
. 그림 3 : (- B) 마이크로 유체 배열 카드를 사용하여 miRNA의 프로파일 링을 순환 2 미세 유체 카드 (카드 및 카드-B)를 사용하여, 754의 miRNA의 프로파일이 생성됩니다. 여기에 도시 된 바와 같이, 우리는 2 미세 유체 배열에 대해 동일한 샘플을 사용은 마이크로 유체 카드 결과의 재현성을 확인하기 위해 실행됩니다. 우리는 0-19.99 사이 코네티컷 값으로, 전체의 miRNAs의 유사한 표현을 관찰 (C - D). 반복 실행 사이의 20-29.99과 유의 한 차이 (- F E) 사이의 코네티컷 값을 몇 가지의 miRNA (277의 16)이있다. (327)의 여든 아홉높은 코네티컷 값이 마이크로 RNA (30 ~ 40)은 모두 실행 (- H G) 사이에 유의 한 차이를 나타냈다.   데이터가 짝 T 테스트를 사용하여 분석 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : PCR 제품 증폭 곡선의 대표 프로필 : 인간 혈장 샘플에 대한 모든 miRNA의 대상의 결합 (A) 증폭 곡선의 대표적인 그림입니다. U6에 대한 분석 (공통 제어 ncRNA)는 모든 부분 배열에 배치됩니다. (B)의 샘플은 <(0.5 (C)가 높은 표준 편차 SD)를 보여줍니다 동안 (0.5 낮은 변동성 SD)>을 U6는 복제 내을 보여줍니다. 두 샘플자는 tota 있습니다인간 혈장에서 분리 리터의 RNA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : Nanofluidics 배열의 QC 분석 : 올바르게로드 nanofluidics 배열 (왼쪽)와 잘못 넣었 nanofluidics 배열 (오른쪽)의 품질 관리 (QC) 이미지. (qPCR에 시약 믹스에 존재) 수동 염료, ROX는 올바르게로드 관통 구멍을 나타 내기 위해 형광. 오른쪽에 배열 통공 qPCR의 시약 믹스로드되지 이들은 위음성 PCR 반응으로 식별되어야 몇몇 하위 어레이 / 갖는다.

구성 요소들 5 μL 반응 당 볼륨 (μL) RT 완충액 (10 배) 0.5
의 dNTPs (100 mM의) 0.05
의 RNase 억제제 0.6
뉴 클레아없는 물 1.39
역전사 효소 0.33
총 볼륨 2.33

표 A : 표준 96 웰 플레이트 플랫폼을 사용의 TaqMan 실시간 qPCR에 대한 5 μL RT 반응 준비 RT 시약 믹스 구성 요소.

구성 요소들 5 μL 반응 당 볼륨 (μL) 20 μL 반응 당 볼륨 (μL)
고속 PCR의 mastermix (2 배) 2.5 (10)
의 TaqMan qPCR의 분석 (20 배) * 0.25 (1)
뉴 클레아 무료물 1.45 5.8
총 양 : 4.2 16.8

* 테스트 선택한 miRNA를 기반​​으로 분석 구성 요소입니다.

표 1B : 표준 96 웰 플레이트 플랫폼을 사용의 TaqMan 실시간 qPCR에 대한 5 또는 20 μL qPCR의 반응 준비 qPCR에 시약 믹스 구성 요소.

구성 요소들 반응 당 볼륨 (μL)
Megaplex의 RT 프라이머 (10 배) 0.8
dTTp (100 mM의)과의 dNTPs 0.2
Multiscribe 역전사 효소 (50 U / μL) 1.5
10 배 RT 버퍼 0.8
의 MgCl 2 (25 mM의) 0.9
의 RNase 억제제 & # (160); (20 U / μL) 0.1
클레아없는 물 0.2
합계 4.5

표 2A : TLDA miRNA의 패널 5 μL RT 반응 준비 RT 시약 믹스 구성 요소.

구성 요소들 반응 당 볼륨 (μL)
의 TaqMan 프리 앰프 Mastermix (2 배) 12.5
Megaplex의 프리 앰프 프라이머 (10 배) 2.5
뉴 클레아없는 물 7.5
합계 22.5

표 2B : TLDA miRNA의 패널 용 25 μL 사전 amplication 반응 준비 프리 앰프 시약 믹스의 구성 요소.

"cellspacing ="0 "> 구성 요소들 반응 당 볼륨 (μL) Megaplex의 RT 프라이머 (10 배) 0.75 dTTp (100 mM의)과의 dNTPs 0.15 Multiscribe 역전사 효소 (50 U / μL) 1.5 10 배 RT 버퍼 0.75 의 MgCl 2 (25 mM의) 0.9 의 RNase 억제제 (20 U / μL) 0.09 클레아없는 물 0.35 합계 4.5

표 3A : 프로브 기반 nanofluidics의 miRNA의 패널 5 μL RT 반응 준비 RT 시약 믹스의 구성 요소.

구성 요소에스 반응 당 볼륨 (μL)
의 TaqMan 프리 앰프 Mastermix (2 배) 12.5
Megaplex의 프리 앰프 프라이머 (10 배) 2.5
뉴 클레아없는 물 7.5
합계 22.5

표 3B :. 프로브 기반 nanofluidics의 miRNA의 패널 25 μL 예비 amplication 반응 제제의 프리 앰프 시약 믹스 성분 NOTE : 쌍방향 보충은, 세 가지 플랫폼이 제공 스프레드 시트 엑셀 이미 에러 피펫 팅을 보상하기 위해 5 %의 첨가를 차지한다.

샘플 반복 샘플
15.535 16.156
15.471 15.652
15.(623) 16.063
15.963 15.889
14.006 13.993
14.502 14.623
14.907 14.384
13.732 14.946

표 4 : 마이크로 유체 배열 카드를 사용의 miRNA U6 프로파일 링을 순환. 두 개의 마이크로 유체 어레이 카드 (AB)를 사용. 샘플로부터 U6 제어의 miRNA의 CT-값 (총 = 8). 실행 사이에 관찰 일관된 U6 제어 miRNA의 풍부.

Discussion

정확하고 재현성있는 결과를 얻기 위해 프로브 기반 qPCR의 프로토콜 내에서 중요한 단계는 RT-제품의 동일한 부피 및 농도는 각각 qPCR의 반응에로드되어) 있는지 일을한다, 2) 성분의 정확한 비율 및 볼륨에 필요한 qPCR의 반응은 제조 및 음, 3) 정확하고 일관된 볼륨 각각 qPCR의 반응에 첨가 혼합하고, 여전히 염두하면서 4) 각 샘플과 반응 혼합물의 제조 및 로딩, 가능한 한 짧은 시간에 완료된다 위의 중요한 단계는 앞에서 언급.

마이크로 유체 배열 카드는 적합한 원심 분리기 및 특정 버킷이 필요합니다. 각 버킷은 3 카드 (로드 / 빈)까지 저장할 수 있습니다. 항상 양동이의 3 슬롯을 점유하고 버킷 원심 분리기의 반대 슬롯에 비슷한 버킷 (이 양동이는 빈 또는 전체 중 3 카드를 포함한다) 배치로 균형되어 있는지 확인합니다. bucke에 카드를 배치하는 동안t 홀더, 8 저수지 위쪽으로 돌출 반응 우물이 원심 분리기의 외부 벽에 직면해야합니다. 실온에서 1 분 동안 331 XG에 카드 스핀. 제 1 스핀 후, 원심 분리기를 열고 시각적 반응 혼합물은 384 웰을 통해 분배 된 보장. 1 시간을 더 동일한 설정에서 스핀을 반복합니다. 양동이에서 카드를 제거하고 8 저수지의 각각에 반응 혼합물의 수준이 균일 있는지 확인하십시오. 저수지에 남아있는 액체 볼륨의 모든 불일치는 더 사용할 카드가 부적절합니다.

RT-생성물의 동일한 농도가, 동일한 입력 RNA의 농도는 각각의 RT 반응에 첨가된다. 전체 RNA의 농도는 마이크로 volumespectrophotometer를 사용하여 측정된다. 260/280 비율이 관찰 혈장 / 혈청으로부터 분리 RNA 1.3 정도로 낮을 수있다; 다운 스트림 qPCR에 관련 프로세스 나 데이터 (30)를 생성에이 효과가 나타나지 않습니다. 마찬가지로, 260/280의 비율여기에 테스트 RNA 샘플을 관찰 qPCR에에서 더 이상 효과를 1.3 ~ 1.7 사이에 있었다.

이러한 biofluids시 그러한 낮은 함량 RNA 샘플을 사용할 때, 처리에 앞서 RNA을 정량화하기 어렵다. 우리는 RNA 분리에서 합성 스파이크에서의 사용뿐만 아니라, 역전사 단계가 추천. 우리의 경험, 애기 장대의 miRNA 후보 (ATH-은 miR-159A와 ATH-은 miR-172A)에서 우리의 경험에 더있을 수 있습니다 (예 : CEL-은 miR-39 또는 CEL-은 miR-54) 예쁜 꼬마 선충의 miRNA가 선호된다 A.에서보다 동성 장대. 이러한 특정 스테이지에서 스파이크의 사용은 서로 다른 시간에 복수의 샘플 분석 miRNA에 걸쳐 데이터의 정규화를 설명 할 수있다. cDNA 합성 반응에 고정 된 RNA의 양을 입력하여도 32, 33을 권장한다.

miRNA의 정량화를위한​​ 세 가지 프로브 기반 프로토콜은 여기에 설명 된 다양한 양을 필요로총 RNA 입력, 다른 워크 플로우 및 비용. 워크 플로우의 각 miRNA의 타겟의 수와 분석 할 샘플의 수에 따라 서로 다른 스루풋에 맞추도록 설계된다. 처리량이 증가 (384 RXN 3072 RXN RXN 96)을, 반응 당 비용은 단위 시간에 걸쳐 얻어진 데이터의 양이 증가함에 따라 감소한다. 이러한 플랫폼 모두의 TaqMan 화학을 이용하기 때문에, 얻어진 데이터의 품질이 유사 할 것으로 예상 할 수있다. 의 TaqMan qPCR에 혈청 / 혈장 9,11,27에서의 miRNA의 풍부를 식별하기위한 잘 확립 된 방법이다. 여기서 설명하는 세 가지 플랫폼이 동일한 화학을 공유하지만, 반응 부피의 감소는 전 사체의 동적 검출 범위의 감소 (파르 RJ 외., 미발표)로 이끈다. 96 웰 qPCR의 플랫폼은 낮은 처리량,하지만 고감도 플랫폼이며, 우리의 관점에서, 모든 프로브 기반 (또는 기반 염료) PCR 플랫폼의 "황금 표준". 그러나,이 월샘플의 수백 또는 수천 분석 및 여러 마이크로 RNA에 대한되는 경우 가장 경제적 또는 효율적인 플랫폼을 수 없습니다. 미세 유체 (TLDA)과 nanofluidics은 (OA) 플랫폼은 짧은 시간에 큰 데이터의 수집을 할 수 있도록 설계 높은 처리량 / 콘텐츠 플랫폼이다. 일괄 차이 TLDA 카드에서 관찰되었지만,이 같은 배치에서 TLDA 카드를 요청함으로써 최소화 될 수있다. 낮은 풍요의 miRNA를 TLDA 카드의 다른 배치에 동일한 샘플을 사용하여 테스트 할 때 - 우리는 TLDA 플랫폼 (그림 3) 중간의 17 %에 상당한 변화를 보여 주었다 관찰합니다. 따라서 우리는 TLDA 카드를 사용하여 분석을 위해 동일한 배치 번호를 사용하는 것이 좋습니다. 이 변화는 또한 잠재적 인로드 및 피펫 오류를 포함하여 기술 변화로 인해 수 있습니다. 그러나, 우리는 TLDA 카드의 동일한 배치를 요청 / 주문을 추천합니다. 유의 배치 변화는 OA 플랫폼에서 관찰되지 않았다. 그럼에도 불구하고,의 TaqMan experimen을 기반으로탈 qPCR의 혈장 / 혈청에서의 miRNA의 풍부를 측정하기 위해 제공 쉽게 접근한다. 여기서 설명 낮은, 중간 및 높은 처리량 접근법은 고도로 효율적이고 재현하고 깨끗한 (낮은 배경 잡음) 화학 제를 사용하여 샘​​플의 miRNAs의 범위를 분석 할 수있는 유연성을 제공한다.

Disclosures

제 처리 / 출판 비용은 출판이 원고의 수락 다음, Life 기술이 적용되었다.

Acknowledgments

모든 저자는 NHMRC CTC, 시드니, 청소년 당뇨병 연구 재단 (JDRF), 호주의 대학과 레베카 쿠퍼 재단, 호주에서 인프라 지원을 인정합니다. 이 연구는 WW, RJF을 아하기 위해 호주 연구 협의회 (FT110100254)와 JDRF, 호주 (CRN201314)에서 보조금을 통해 자금을 지원하고 MVJ 모든 젖은 실험실 실험을 실시, ASJ 데이터 분석을 수행 하였다. WW는 첫 번째 초안을 썼다. AAH는 연구를 계획하고 데이터를 분석했다. 모든 저자 읽고 게시를 위해 제출 된 원고, 그림 및 워크 시트의 최종 버전에 동의했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well-platform
For Reverse transcription
TaqMan MicroRNA Assays INV SM  Applied Biosystems
 
4427975 https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975
The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems
 
4366597 or 4366596 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596
The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.
For qPCR run on a 96-well platform
2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG  Applied Biosystems
 
4367846 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846
The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on  the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml  Applied Biosystems 4346907 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product
Microfluidics platform (TLDA)
For Reverse transcription
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems
 
4399966 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966
The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 Applied Biosystems
 
4444281 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281
The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
OR OR
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 Applied Biosystems
 
4444750 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750
The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
For Pre-amplification
TaqMan PreAmp Master Mix Applied Biosystems
 
4391128 or 4488593 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593
The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0  Applied Biosystems
 
4444303 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303
The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems
 
4399233 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233
The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
1x TE Buffer (100 ml) Invitrogen 12090-015 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product
The 1x TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0  Applied Biosystems 4444913 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913
Nanofluidics platform (OpenArray)
For Reverse transcription
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).
For Pre-amplification
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)
To load and run the slides
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) Applied Biosystems
 
4470187 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit  Applied Biosystems
 
4469576 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576
OpenArray 384-well Sample Plates   Applied Biosystems
 
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References

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프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법
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Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J. Vis. Exp. (98), e52586, doi:10.3791/52586 (2015).More

Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J. Vis. Exp. (98), e52586, doi:10.3791/52586 (2015).

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