Summary
循環マイクロRNAは、最近様々な癌および他の疾患のための有望で新規なバイオマーカーとして浮上している。この記事の目的は、マイクロRNAの循環の豊富さを定量化し、決定するために利用可能である三つの異なるプローブベースのリアルタイムPCRプラットフォームと方法を議論することです。
Abstract
プローブベースの定量的PCR（qPCRに）それが正確で再現性のある分析を提供する最も高感度な検出方法の一つであるので、転写産物量を測定するための好まれる方法である。プローブベースの化学は、他の（染料系）の化学的性質と比較して、少なくともバックグラウンド蛍光を提供しています。現在、転写産物量を定量するためにプローブベースの化学を使用して利用可能ないくつかのプラットフォームがあります。 96ウェルプレート中のqPCRしかし96サンプルまたはmiRNAの最大値のみが単一のランで試験することができる最も日常的に使用される方法である。多数のサンプル/ miRNAが分析される場合、これは時間がかかり、面倒である。そのようなマイクロフルイディクス（ 例のTaqManアレイカード）などの高スループットプローブベースのプラットフォームとナノ流体工学アレイ（ 例えば OpenArray）を提供し、再現性と効率的に短時間で多数の試料内の複数のマイクロRNAの存在量を検出することが容易になります。ここでは、実験aを実証血清または血漿、EDTA試料からのmiRNAの定量のため番目プロトコル、スループットの増加レベルを提供するプローブベースの化学3つの異なるプラットフォーム（96ウェルプレート、マイクロ流体及びナノ流体アレイ）を使用。
Introduction
マイクロRNA（miRNA）は、遺伝子発現1-3の調節因子として機能する、約22ヌクレオチドの非コード（ncの）RNAである。動物におけるほとんどのmiRNAは、遺伝子発現2-4の負の調節をもたらす3 'UTRを標的とする、mRNAとの配列特異的塩基対形成を介して機能する。これは通常、mRNAの翻訳の阻害を介してまたはリボソームドロップオフによって起こる。循環中のmiRNAは、糖尿病5-7、卵巣8、9前立腺および乳癌10,11、B型肝炎12及び他の自己免疫疾患13として種々の疾患の研究および臨床分野における新規バイオマーカーであることが示されている。研究は、よりアクセス可能と9,11-15低侵襲であり、ヒト血漿および血清試料から異なる細胞または組織における、ならびに循環中の豊富なmiRNAを同定するために行われている。
のmiRNA定量化するさまざまな方法は、電子てきたそのような標準的な96ウェルプレートプラットホーム4,12,16-18、マイクロ流体カードプラットフォーム12,18-23とナノ流体工学アレイプラットフォーム17,24などの複数のプラットフォームを使用して、定評。定量的リアルタイムPCR（定量PCR）は、複数の（色素増またはプローブベース）の化学を用いて転写物の相対または絶対数を測定する能力を提供しています。プローブベースのリアルタイムPCR化学は、単一の転写コピーを検出するために、低バックグラウンド蛍光と高感度の利点を提供しています。これは、比較的それmiRNA発現25を定量化し、決定するための好まれる方法作る、効果的な使い方が簡単かつ再現性の高いコストです。プローブベースの定量PCR法は、一般的に2つのステップを含む：転写（RT）および定量PCR 4,26,27を逆転。ステム - ループRTプライマーは、成熟またはプライマリmiRNA分子にハイブリダイズし、相補的な（c）のDNAに変換されるRTある。 cDNA産物の定量は、その後miRNA特異的PCRプライマーを用いて行われる26-28。プローブベースの定量PCRの原理は、蛍光タグ化プローブの加水分解を伴うリアルタイムで相補鎖伸長の検出に基づいている。これらのプローブは、蛍光レポーターおよびFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）できるようにするだけ離れている消光剤を含むように設計されている。蛍光レポーター（エミッタ）からの発光の検出は、クエンチャー分子に近接によってマスクされます。 Taqポリメラーゼ（polの）を上流プライマーから延びており、フォーク（プローブの5 '末端）に達すると、Taqポリメラーゼのpolエキソヌクレアーゼ活性は、消光剤からの蛍光発光の物理的な解離/分離をもたらす、プローブを加水分解する。蛍光発光体の単一分子のこのリリースでは、検出器によって記録され、そのほか/反応からの蛍光シグナルの増加分として提示されている。蛍光の増加は、正確なquのを可能にする、生成されたPCR産物の量に比例する増幅された標的26,28のantification。
miRNAの定量における需要の増加とともに、ハイスループット技術の媒体は、多くのサンプルを短時間で処理することができるように開発されてきた。のTaqMan低密度アレイ（TLDA）は一方のプレート上で分析したmiRNAの数の増加を提供するプローブベースの定量PCR化学に基づく培地スループット革新的なマイクロ流体設計である。 TLDAは、cDNAを合成するために使用されるRT-プライマーの事前定義されたプールの使用を含む。これらのcDNAは、その後のqPCR 22,26,29を使用して、複数のmiRNAの発現を決定するために、カスタマイズされた384ウェルマイクロ流体カードに紡糸される。カードの各ウェルは、したがって、最大384の反応は、単一のTLDAカード26で処理することができ、特定のmiRNA（単数または複数）を増幅するために乾燥されたプライマーおよびプローブを含んでいる。
ナノ流体アレイは、遺伝子転写物の検出のために使用されるハイスループットプラットフォームである
Protocol
トータルRNAは、我々の研究室30または他の市販のキットを使用して確立されたプロトコルを用いて血清から単離することができる。
注：各実験で反応体積を計算するための補足インタラクティブスプレッドシート（5％過剰体積のピペッティングを占めて含まれる）が提供される。
1.プローブベースのリアルタイム定量PCR標準的な96ウェルプレートプラットフォームを使用して
- miRNAのための血清/血漿RNA試料に対するcDNAの合成（逆転写）
- 計算し、各cDNA合成反応のためのRNAの10 ngのを取る。 （5μlの反応用）1.67μlに10 ngのRNAの最終容量をもたらすために、ヌクレアーゼフリー水を追加します。サンプルを氷上に保管してください。
- miRNAのを選択し、それらのRTプライマーを解凍。
- RTバッファー（10×）、dNTP類（100 mM）を、RNアーゼ阻害剤（20 U /μl）を：RT試薬混合コンポーネントを解凍する。場所酵素（組換えモロニーマウス白血病ウイルスを維持することはありません（rMoMuLV））（recombinanatのモロニーマウス白血病ウイルス（rMoMuLV）氷上で逆転写酵素（50 U /μl）を。必要になるまで、または冷凍庫ブロックで-20℃で保管してください。
- 表1Aに記載されているように氷上でのRT試薬ミックスを調製する。これは、ピペッティング誤差を補正するために、少なくとも5％の過剰ボリュームを準備することが推奨される。
- 0.2ミリリットルのPCRチューブ/プレートにRT試薬ミックスの2.33μlの各追加します。
- 渦RTプライマー管は10秒間万×gで、その後スピンダウン、混合する。それぞれのPCRチューブあるいはプレートにmiRNAの特異的RTプライマーの1を添加する。プレート内のそれぞれのPCRチューブあるいはウェルに希釈されたRNAの1.67を添加する。氷の上ですべての追加を行います。
- 遠心機で4℃で5分間1950×gで反応チューブまたはプレート。
- 30分、85℃で30分間、16℃、42℃以下の設定条件でサーマルサイクラー上のmiRNA cDNA合成プログラムを設定保留5分および4℃ためC。
- 10μlに反応容量を設定します。サーマルサイクラーに反応チューブまたはプレートをロードします。 RTの実行を開始します。リアルタイムPCR増幅はすぐに進んされていない場合は、-20℃でのcDNA（RT）反応を保管してください。
- 成熟miRNAを検出するためのプローブベースのリアルタイム定量PCR
- それぞれのRT産物のために選択されたプローブベースのqPCRアッセイ（20X）を解凍する。
- ボトルを回転させることによって、リアルタイムPCR（定量PCR試薬混合物）の可否唯一の解決策を混ぜる。
- 分析しようとする各miRNAのための定量PCR試薬ミックスを調製する。定量PCRは、各miRNAサンプルのための滅菌1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブを取得し、 表1Bに記載されているように各チューブにコンポーネントを追加する準備をするに。これは、ピペッティング誤差を補正するために、少なくとも5％の過剰ボリュームを準備することが推奨される。
- 光学96ウェルプレート（またはチューブ）の各ウェルにそれぞれの定量PCR試薬混合物の4.2を添加する。 0.8μLを追加それぞれのcDNA反応のそれぞれのウェルに（各miRNAのためのステップ1.1で合成された）。
- 適切な光学カバーでプレートをシール。 4℃で5分間1,950×gで遠心し、プレート（またはチューブ）
- コンピュータの電源を入れ、96ウェルプレート/マイクロ流体アレイリーダー、最後にソフトウェアを起動します。マシンが正しく接続され、正しいブロックと（高速96ウェルプレート用）加熱蓋が整備されているされていることを確認。
- 96ウェル速いブロック（0.1ミリリットル）、標準曲線、のTaqMan試薬および高速モードなどの実験を選択します。 20秒間95℃、50サイクル（1秒、30秒、60℃、95℃）：次のプログラムサイクル条件を使用してリアルタイムPCRシステム上で定量PCRをセットアップする。
- 10μlに反応容量を設定します。機器に反応チューブまたはプレートをロードします。プレス "実行を開始します」。プログラムが完了するまでに約1時間かかります。
2.プローブベースのマイクロフルイディクスアレイカード（CA番目のAとB）
注：プローブベースのmiRNAパネルは2 384ウェルマイクロ流体カード（アレイカードのAとアレイカードB）のセットとして付属しています。各カードには、最大380のmiRNAと対照乾燥プライマーおよびプローブが含まれています。 （または、前増幅なし）カードAまたはカードBに特異的なcDNA産物は、リアルタイムPCRのためのそれぞれの配列にロードされる。
- 逆転写（RT）
- 1〜1,000 ngの総RNAインプットのためにこのプロトコルを使用してください。入力は1から350 ngの間にある場合、事前に増幅（プリアンプ）の手順を実行します。 350 ngの上記の入力の場合、プリアンプなしで、アレイカードに直接のcDNAをロードします。
注：血清miRNAプロファイリングのために、全RNA 100ngの開始。完全なmiRNAプロファイルの場合は、サンプルあたりのRT反応（プールAとプールB）のRT-プライマーセットの2の定義済みのプールを実行します。 - 氷の上に以下の試薬を解凍する。 RTプライマー（10倍）：プールAとプールB、dTTPの（100 mM）を、RTバッファー（10倍）、 塩化マグネシウム（25 mM）を、RNアーゼ阻害剤（20 U /＆とのdNTP＃181; L）。氷上で酵素（組換えモロニーマウス白血病ウイルス（rMoMuLV））逆転写酵素（50 U /μl）を保管しないでください。必要になるまで-20℃で保管してください。
- 静かに酵素を除き、全ての試薬をボルテックスした後、簡単に10秒間万×gでチューブを遠心する。
- つのチューブに、 表2Aに記載のように、試薬を組み合わせる。プールA用のチューブ、他のプールBの各チューブは、それは、ピペッティング誤差を補正するために、少なくとも5％の過剰ボリュームを準備することが推奨されるプールAから、またはプールB.いずれかからRTプライマーセットの唯一の事前定義されたプールを含有するであろう。
- 混合する反転した後、10秒間万×gで短時間遠心。新しいチューブに各RNAサンプルのアリコート100 ngの、その後3μLの合計を作るためにヌクレアーゼフリー水の適切なボリュームを追加。
- それぞれのチューブに小分けし、適切なRTの試薬混合物4.5μlの。混合する反転した後、簡単に10秒間万×gで遠心する。氷上でインキュベート5分間。
- サーモサイクラー中に、以下の条件を用いてRTを開始する場所のサンプル：40サイクル（2分、16℃、1分間42℃、1秒間50℃）で、5分間、85℃で、4℃で保持するC.店舗cDNAは-15℃〜-25でRT-プライマーのこれらの定義済みのプールを使用することによって生成されたか、すぐに使用する。
- 1〜1,000 ngの総RNAインプットのためにこのプロトコルを使用してください。入力は1から350 ngの間にある場合、事前に増幅（プリアンプ）の手順を実行します。 350 ngの上記の入力の場合、プリアンプなしで、アレイカードに直接のcDNAをロードします。
- 事前増幅
- 氷上でプリアンププライマーの事前定義されたプールを解凍する。静かに渦プライマーは、その後、簡単に10秒間を10,000×gでそれらを遠心する。穏やかタップすることで、渦巻きのTaqMan PreAmpの試薬ミックス（2X）、混合する。
- つのチューブに、 表2Bに記載されているように、試薬を組み合わせる。プールA、プールBの他のための1のチューブ
注：上記のように、プールプリアンププライマーは管Aに行くとプールBプライマーは、それがピペット操作誤差を補正するためには、少なくとも5％の過剰ボリュームを準備することが推奨され、チューブBに行く必要があります。 - 混合する反転した後、簡単に10秒間万×gで遠心する。新しいチューブに適切なプリアンプ試薬混合物のアリコート22.5μL。それぞれのチューブにアリコート（RT工程で調製）cDNAサンプル2.5μlのを。
- 混合する反転した後、簡単に10秒間万×gで遠心する。 5分間氷上でインキュベートする。場所サンプルサーモへとプリアンプサイクルを開始。サイクル条件：10分、2分、55℃、2分、12サイクル（15秒95℃、4分間、60℃）、10分間、99.9℃、72℃、95℃、保持4℃で。
- 混合する前増幅されたcDNAを反転してから、簡単に10秒間万×gで遠心する。 （：4希釈1）0.1×TE緩衝液（pH8.0）ことが事前に増幅されたcDNAの75を添加する。ミックスに希釈したプリアンプサンプルを反転してから、簡単に10秒間万×gで遠心する。ストアには、最大1週間-15〜-25℃でプレ増幅cDNAを希釈し、または直ちに使用する。
- マイクロフルイディクスカードをロードし、定量PCRを実施
- マイクロフルイディクスしてください室温に到達するために、少なくとも半時間外のmiRNAカード。氷上で希釈したプレ増幅cDNAを解凍し、短時間のスピンに続いて、チューブを転倒混和する。ボトルを回転させることによって定量PCR試薬混合物を混ぜる。
- 新しいチューブに希釈したプレ増幅cDNAの9μlに定量PCR試薬混合物450μlを添加する。カードAの場合は、事前に増幅産物は、プライマープールAには900μlに最終容量を補うためにヌクレアーゼフリー水441μl加え用いて調製使用しています。混合するチューブを反転してから、簡単に10秒間万×gで遠心する。
- （それが室温に達すると）パッケージから本件契約カードを取り外して、下に箔側できれいな部分の上に置きます。カード上の8注入口のそれぞれにPCR反応混合物の100μlのを追加します。貯水池の各2ポート（各カードの合計8貯水池）があります。
NOTE：通気口が小さい穴であるのに対し、充填ポートは、反応混合物が添加され、より大きな孔である。各miRNA TLDAカードは8リザーバを有するsは、それぞれ、したがって、同じPCR反応ミックスとカード内のすべての384ウェルのロード、48ウェル（1列×2列の24ウェル）につながる。各サンプルのプールAとプールBは、それぞれ本件契約カードにロードされていることを確認してください。遠心機に特化したマイクロ流体アレイカードホルダーバケットにアレイカードを置きます。 - マイクロ流体アレイカードの場合、（そのようなヘレウスMultifuge 3SR、230V遠心分離機など）を適当な遠心機と（例えば「のTaqManアレイカード」保有者など）は、特定のバケットを使用しています。各バケットは3カード（空/ロードされた）を保持できます。常にバケットのすべての3つのスロットが占有されていることを確認し、バケットは遠心機の反対スロットに（このバケットが空またはフルいずれか3枚のカードを、また含まれている必要があります）同じようなバケツを置くことでバランスされている。バケットホルダーにカードを配置しながら、8貯水池が上向きに突出して反応ウェルは遠心機の外壁に直面していることを確認してください。
- 室温で1分間331×gでのカードをスピン。後に最初のスピンは、遠心分離機を開いて、視覚的に反応ミックスが384井戸を通って分配されていることを確認。 1より多くの時間のために同じ設定でスピンを繰り返します。バケツからカードを取り出し、8貯水池の各反応混合物のレベルが均一であることを確認してください。貯水池に残った液体ボリューム内の任意の矛盾がさらに使いのカードが不適切にする。
- マイクロ流体アレイカードは、アレイの流体流通経路を密封し、等しく、全てのウェル内の反応混合物（総反応体積を1μl/ウェル）を配布するために精密スタイラスアセンブリ（キャリッジ）を有する特殊なシーラーを必要とする。
- 開始位置にキャリッジを持参し、箔側にシーラーにロードされたカードを挿入し、シーラー上のスタイラスピンに並んで。それはシーラーの終点に到達したまで、ゆっくり着実かつ一律脳卒中では、カード全体にキャリッジを押してください。密封されたアレイカードを外し、貯水池を遮断はさみを使用してカードからのS。
- 正しいブロック、加熱蓋およびサンプルキャリアはマイクロ流体アレイのリアルタイムPCRシステム/マシンにインストールされていることを確認してください。
- マイクロ流体アレイシステムその後、コンピュータの電源を入れ、最終的にソフトウェアを起動します。マシンが正しく接続されていることを確認。アレイカード、標準曲線、のTaqMan試薬および標準モードとして実験を選択します。カードAとカードBのいずれかのセットアップファイルをインポートすると、ファイルを保存します。
- 楽器の正面に向かって左上隅とバーコードでもA1と楽器トレイに封印されたカードを置きます。プレス "スタートファイル名を指定して実行」。プログラムが完了するのに約2時間かかります。
3.プローブベースのナノ流体工学のヒトmiRNAのパネル
- 逆転写（RT）
- しかし100 ngはほとんどのサンプルに最適です、50-200 ngの総RNAインプットのためにこのプロトコルを使用してください。完全なmiRNAプロファイルの場合は、2 predefiを実行サンプルあたりRT反応（プールAとプールB）のRT-プライマーセットNEDプール。
- のdTTP（100 mM）を、RTバッファー（10倍）、のMgCl 2、（25 mM）を、RNアーゼ阻害剤（20 U /μl）を用いたRTプライマーセット（10×）、dNTPの事前定義されたプール：氷の上の試薬 を解凍する。氷上で酵素（組換えモロニーマウス白血病ウイルス（rMoMuLV）逆転写酵素（50 U /μl）を保管しないでください。-20℃で保存し、必要になるまで。静かに酵素を除き、全ての試薬をボルテックスし、簡単に万でそれらを遠心10秒間XG。
- つのチューブに、 表3Aに記載のように、試薬を組み合わせる。プールA、各チューブはプールAからか、プールBのいずれかから、RT-プライマーセットの唯一の定義済みのプールが含まれていますプールBの他のための1管はこれをピペッティングを補うためには、少なくとも5％の過剰ボリュームを準備することをお勧めしますエラー。
- 10秒間万×gで混合し、次いで遠心簡単にピペット。新しいチューブにアリコート各RNAサンプルを100ngを、適切なボリュームを追加3μLの合計を作るために、ヌクレアーゼフリー水。それぞれのチューブに小分けし、適切なRTの試薬混合物4.5μlの。
- 混合する反転した後、簡単に10秒間万×gで遠心する。氷上で5分間インキュベートします。サーモサイクラーにサンプルを置き、RTプログラムを起動します。サイクル条件：40サイクル、5分間85℃（2分、1分、1秒間50℃、42℃、16℃）、4℃で保持する。店舗cDNAは、-15〜-25℃に設定し、RT-プライマーのこれらの定義済みのプールを使用するか、すぐに使用を生成した。
- 前増幅（プリアンプ）
- 氷の上に設定され、プリアンププライマーの事前定義されたプールを解凍する。穏やかにボルテックスプライマーは、その後簡単に10秒間を10,000×gでそれらを遠心する。ミックスするスワールのTaqMan PreAmpの試薬ミックス（2X）。
- 表3Bに説明するように、2つのチューブに、試薬を組み合わせる。プールAの1のチューブは、プールBの他は、各チューブはどちらFR、RT-プライマーセットの唯一の定義済みのプールが含まれていますOMプールAまたはプールBからそれは、ピペッティング誤差を補正するためには、少なくとも5％の過剰ボリュームを準備することをお勧めします。
- ミックスした後、簡単に10秒間を10,000×gでそれらを遠心分離機にピペット。新しいチューブに適切なプリアンプ試薬混合物のアリコート22.5μL。アリコートそれぞれのチューブにcDNAサンプル2.5μlの。混合する反転した後、簡単に10秒間万×gでチューブを遠心する。氷上で5分間インキュベートします。
- 場所サンプルサーモへとプリアンプを実行します。 25μlに反応容量を設定します。サイクル条件：10分、2分、55℃、2分、12サイクル（15秒95℃、4分間、60℃）、10分間、99.9℃、72℃、95℃、保持4℃で。
- 混合する前増幅されたcDNAを反転してから、簡単に10秒間万×gで遠心する。新しいチューブに0.1×TEバッファーpHは8.0（1時40希釈）の156μlにプレ増幅cDNAの4μlを添加する。ミックスに希釈したプリアンプサンプルを反転してから、簡単にCEの10秒間万×gでntrifuge。ストアを希釈し、希釈されていないプレ増幅cDNA -15〜-25℃で最大1週間、またはすぐに使用しています。
- ナノ流体工学配列をロードし、定量PCRの実行
- ナノ流体工学アレイスライドシリアル番号を使用してWebサイト31から関連するプレートファイル（.tpf）をダウンロードします。これは、特定のナノ流体工学アレイスライドの実行情報が含まれています。
- 解凍希釈したプレ増幅cDNAおよびTaqManリアルタイム定量PCR試薬混合物を氷上に（初めて使用している場合）。ボトルを回転させることによって定量PCR試薬混合物を混ぜる。新しいチューブに希釈したプレ増幅cDNAの22.5μlに定量PCR試薬混合物の22.5μlを添加する。穏やかにボルテックス混合し、その後簡単に10秒間万×gで遠心する。
- アリコートナノ流体アレイワークフロー384ウェルサンプルプレートの8ウェルに各サンプルの5μlの（2列、4行）。各サンプルのプールAとプールBは、隣接する8ウェルブロックになっていることを確認してください（FIGURE 1またはレイアウトの補足Excelシート）。
- 各サンプルプレートはサンプルの価値は最大8つのスライドを含めることができます。しかし、ナノ流体工学アレイ用のシステムは、単一の実行で4ナノ流体工学アレイを処理することができます。サンプルの価値つ以上のスライドを1サンプルプレート上にロードされる場合、残りのセクションが封入されていることを確認してください。 OpenArrayサンプルプレートシーラーでシール。
注：それは必要なセクションに予めカットシーラーすることをお勧めしますので、セクションでは、蒸発を減らすために、個別に開封/密封されてもよい。あるいは、プレートは、無傷のシーラーで密閉することができ、ロード時に、その後のセクションでは、個別に切り出すことができる。
- 各サンプルプレートはサンプルの価値は最大8つのスライドを含めることができます。しかし、ナノ流体工学アレイ用のシステムは、単一の実行で4ナノ流体工学アレイを処理することができます。サンプルの価値つ以上のスライドを1サンプルプレート上にロードされる場合、残りのセクションが封入されていることを確認してください。 OpenArrayサンプルプレートシーラーでシール。
- 4℃で1分間490×gで遠心分離プレート。 1時間以内にナノ流体工学アレイスライドをロードします。によりスライドを密閉するために許可された限られた時間に、同時に複数のスライドをロードしてください。冷凍庫からナノ流体工学アレイスライドを削除し、それが室温に来ることを許可するerature（〜15分）。
- 正しいブロック、加熱蓋およびサンプルキャリアがナノ流体工学アレイシステムにインストールされていることを確認してください。コンピュータの電源を入れ、リアルタイムPCRシステムとローディングシステム。各ソフトウェアにアクセスし、マシンが接続されていることを確認してください。パッケージからローディングシステムの消耗品（配列のスライド蓋、プラグおよび浸漬液）を取り外します。
- 静かに緩めるために液浸流体シリンジのプランジャーを引っ張る。先端から、キャップを外しに先端を配置し、フラッシュ空気。マシン内のローディングシステムのヒントを置き、ふたを取り外します。 PCRシステム内のサンプルプレートを置きます。
- 手袋を上に置く。彼らは誤ってスライド蓋をマーキングするリスクを最小限にするためにしっかりとフィットしていることを確認してください。慎重にオープンスライド包装。ゆっくりと手にスライドを傾ける。スライドの上に手を触れないでください。
- 左のバーコードが、PCRシステムにスライドを置きます。読み込みのために意図サンプルプレートの部分からシーラーを削除します。ローディングシステムを使用して、スライドバーコードを入力するためのソフトウェアは、位置、サンプル位置とチップ構成をスライド。
- すべての関連するチェックが完了し、プレス荷重スライド。 PCRシステムは、スライドをロードしている間に、スライド蓋の底からはっきりと赤いプラスチックを取り外します。読み込みが終了したら、慎重に取り外し、90秒以内にスライドをシール。
- プレートクランプ内でスライドを置きます。スライド上にスライド蓋を置きます。 30秒間クランプ。バーコードが正しく表示されるように、蓋が配置されていることを確認してください。プレートクランプからアセンブリを取り外します。
- スライド内の位置液浸流体注射器先端は蓋に押し付けられるように。ゆっくりと蓋に沿って流体の実行を保証する、浸漬液でスライドを埋める。フルたら、ハンドルが途切れるまで、ネジを回して、プラグ付きスライドをシール。
- スライド蓋の上にプラスチック製のカバーを外し、慎重にリアルタイムPCRシステムのスライドキャリアに配置します。 SUがあることを確認それが急に低下しないように、低下している、とスライドの上に手を触れないでくださいように、スライドの底にPPORT。これは、PCRシステムスライド/ cassette.Initializeの側面に触れ、1時間以内に定量PCRのためのプログラムを起動するためにOKです。
- PCR-システムソフトウェア内「OpenArray」を選択します。プレス「スライドIDを検索する」。これには数分かかります。ソフトウェアは、プレートIDを見つけることができない場合は、手動で入力するために、それが要求されます。
- を押して、「プレートセンターを確認してください」。繰り返しますが、これには数分かかります。赤い点がセンター内にあることを、スライドの上には何の指紋/マークがないことを確認してください。各スライドのためのそれぞれの.tpfファイルをロードし、結果ファイルの名前と場所を指定します。プレス "スタートファイル名を指定して実行」。プログラムが完了するのに約2時間かかります。
Representative Results
miRNAプローブに基づくアッセイの定量PCR反応のための推奨される容量は20μlである。注：我々は、5μlの反応体積は20μl容量4,7,30を使用して達成されるものと同様の結果を生成することが可能であることを確認した。 5μlに反応容量を小さくすると感度がかなりの損失なしに、試薬コストの75％の減少を可能にする。 図2に示されたように、反応を20μlの体積および5μlをアップ（0.92のR 2、P = 0.0002で）39サイクルまで、強力な共同関係を示している。
マイクロ流体アレイは、従来の96ウェルプレートのPCRと比較して複数のサンプルを分析するより効率的な方法であり、（AカードとカードBの場合）約5時間で、サンプル中で発現されたmiRNA 754上のデータを取得するためのツールを提供する。私たちは（試料Aと繰り返しサンプル）同じサンプル用のmiRNAマイクロ流体アレイカードを比較した図3A - 。Bは、ブランド·アルトマンプロットを示している（<これらのサンプルのために試験されたすべての754のmiRNAのための強力な> 3A）および相関プロット（3B）。 3異なる制御のmiRNA（U6、RNU44とRNU48）が複数の場所にカード（カードAとB）の両方にランダムに配置されています。 U6サイクル閾値（Ct）値は2実行の間を比較すると、我々は、値（ 表4）の間に有意差は観察されなかった。これは、U6を評価サンプルにおいてより豊富（低いCt値）で発現されることをここで留意することも重要である。私たちは、その後の共同効率的な98パーセント（図3C-D）の決定に全体的なmiRNAの同様の発現を持っていたラン（N = 150）の両方で0から19.99の間のCt値を持つすべてのmiRNAを、比較した。 betwee有意差とのmiRNAの数。 -両方のランで20と29.99の間のCt値を持つすべての277のmiRNAの、16のmiRは、オリジナルを繰り返し実行する（F図3E）との間で有意に異なっCt値は、両方のラン（ - H図3G）のために30〜40の間で選択されたときのnランは（327の89）増加した。
ナノ流体アレイプラットフォームは、図4Aに示されるように、試験した各血清/血漿試料からの754のmiRNAのためのデータを提供する。なお、これらの増幅曲線を検討することが重要である-それは、すべてのqPCRであるように-結果が真の増幅の指標であることを保証する。 48サブアレイの各（ 図1）は、3最も人気のある「ハウスキーピング」のncRNAのアッセイが含まれています。U6は、RNU44とRNU48 図4Bは、U6の典型的なクラスタリングは、単一のサンプルから複製し示しています。これらの複製は、低い標準偏差（SD <0.5）を表示するので、信頼性の指標である。また、 図4Cは、第二の試料中のU6の複製物（SD> 0.5）の増加の変動を示しています。これは妥当Oを否定するものではない残りのアッセイF、それはより徹底的な批判を必要としませんが。 U6は、生物学的流体中で最も「ハウスキーピング」のmiRNAと同様に、変数式を持つことができます。これは、 図4Cに概説試料の一つは、 図4Bに示すものよりも4倍未満U6コンテンツを表示することに留意すべきである。 （c）に提示され、サンプル中のU6のレベルは、パネル4Bに提示され1よりで始まる75％未満であることから、より大きな技術的変動が小さいため反応容量17によって悪化する転写産物のポアソン分布に期待されている。
実行が完了すると別の有用なツールでは、輸出のために利用可能な品質管理（QC）の画像、である。これらの選択は、各貫通孔が正常（ 図5）にロードされたことを確認するために、ROX、定量PCR試薬混合物中に見出さ受動染料の蛍光を使用する。エンスルーホール、または実際にタイヤのサブアレイは、不十分な試料体積、蒸発、384ウェルサンプルプレート、完全Accufillシステムまたはそのチップ内のサンプルプレートシール、または欠陥を除去するための失敗のウェル中に存在する気泡によって読み込まれない場合があります。実際に検定がロードされなかったときに貫通孔アンロードはいずれも、「検出できない」として、標識miRNAを回避するために識別されなければならない。この問題が発生した場合、サンプル/マスターミックスの少なくとも5μlを384ウェルサンプルプレートの各ウェルにロードされていることを確認し、サンプルプレートが適切に装填する前に遠心分離し、ホイルシールが完全に除去され、そしてロードOpenArrayスライドを密封し、すべての連続したランの割り当てられた時間内に実行されます。負荷の問題がまだ解決しない場合は、これらは、より可能性が高い特定のバッチや配列または関連消耗品の多くは、さらなる支援に関連することができる製造業者を通じて求められるべきである。
「SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 52586 / 52586fig1.jpg" />
図1：ナノ流体アレイワークフローのサンプルのレイアウト：（A）各384ウェルサンプルプレートは、最大8ナノ流体工学アレイのためのサンプルを保持することができる。 （B）で希釈し、事前に増幅されたcDNAは、隣接する8ウェルのグループにプールAとプールBで、8ウェル（4行による2列）に配置されます。各円は、1つのウェルを表す。 （C）サンプルプレートの各ウェルは、ナノ流体工学アレイの一サブアレイにロードされる。各小正方形は1部分配列を表す。
図2：従来の96ウェルPCRプラットフォームの共同関係の分析：20μLとCT値（39サイクル）における標準的な96ウェルプレートプラットフォームを使用したTaqManリアルタイム定量PCRに5μlの反応ボリューム間の共同関係。私たちは、4種類のマイクロRNAを比較した（のmiR-375、4種類のヒト血清および血漿試料におけるmiR-30C、のmiR-30DとのmiR-7）。他は検出できなかったので、唯一の11のデータ点がプロットされている。 R 2 = 0.92のp = 0.0002。
。図3：（ - B A）マイクロ流体アレイカードを使用してmiRNAプロファイリング循環 2マイクロ流体カード（カードAとカード-B）を使用して、754のmiRNAプロファイルが生成される。ここに示されているように、我々は、マイクロ流体カード結果の再現性を確認するために2マイクロ流体アレイを実行するために、同じサンプルを使用した。私たちは、0から19.99の間のCt値と、全体的なmiRNAの同様の発現を観察した（C - D）。繰り返し実行間20から29.99と有意差（ - F E）間のCt値を持つ少数のmiRNA（277の16）があります。 327の八十9より高いCt値を持つマイクロRNA（30〜40）は、両方のラン（ - H G）の間に有意差を示した。 データは、対応のあるt検定を用いて分析している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：PCR産物の増幅曲線の代表的なプロフィール：ヒト血漿サンプルのためのすべてのmiRNA標的の組み合わせ（A）の増幅曲線の代表図である。 U6のためのアッセイ（共通制御ncRNAの）は、すべての部分配列に配置されます。 <（0.5（C）は 、高い標準偏差SD）を示している（0.5（B）のサンプルは低い変動SD）を>示していU6内で複製されます。両サンプルを踏太ですヒト血漿から分離され、LのRNA。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：ナノ流体工学配列のQC分析：正しくロードされたナノ流体工学アレイ（左）と間違ってロードされたナノ流体工学アレイ（右）の品質管理（QC）の画像。 （定量PCR試薬混合物中に存在する）受動染料、ROXは、正しくセットされた貫通孔を示すために蛍光を発する。右側のアレイは、貫通孔定量PCR試薬混合物を装填していないと、これらは偽陰性PCR反応として特定されるべきいくつかのサブアレイ/持つ。
| コンポーネント | 5μlの反応あたり容量（μL） | RTバッファー（10倍） | 0.5 |
| のdNTP（100 mM）を | 0.05 | ||
| RNaseインヒビター | 0.6 | ||
| ヌクレアーゼフリー水 | 1.39 | ||
| 逆転写酵素 | 0.33 | ||
| 全容積 | 2.33 |
表1A：RT試薬混合物の成分のTaqManリアルタイム定量PCRのために、5μlのRT反応の調製における標準的な96ウェルプレートプラットホームを使用する。
| コンポーネント | 5μlの反応あたり容量（μL） | 20μlの反応あたり容量（μL） |
| ファストPCRマスターミックス（2×） | 2.5 | 10 |
| のTaqMan定量PCRアッセイ（20X）* | 0.25 | 1 |
| ヌクレアーゼフリー水 | 1.45 | 5.8 |
| 総容積： | 4.2 | 16.8 |
*テストし、選択したmiRNAに基づいたアッセイ成分。
表1B：標準的な96ウェルプレートプラットホームを用いたTaqManリアルタイム定量PCRのために5または20μlの定量PCR反応の調製における定量PCR試薬混合成分。
| コンポーネント | 反応あたり容量（μL） |
| メガプレックスRTプライマー（10倍） | 0.8 |
| のdTTP（100 mM）を持つのdNTP | 0.2 |
| Multiscribe逆転写酵素（50 U /μL） | 1.5 |
| 10X RTバッファー | 0.8 |
| のMgCl 2（25 mM）の | 0.9 |
| RNアーゼ阻害剤＆＃ 160。 （20 U /μL） | 0.1 |
| ヌクレアーゼフリー水 | 0.2 |
| 合計 | 4.5 |
表2A：本件契約のmiRNAパネルの5μlのRT反応の準備におけるRT試薬混合コンポーネント。
| コンポーネント | 反応あたり容量（μL） |
| のTaqMan PreAmpのマスターミックス（2×） | 12.5 |
| メガプレックスプリアンププライマー（10倍） | 2.5 |
| ヌクレアーゼフリー水 | 7.5 |
| 合計 | 22.5 |
表2B：本件契約のmiRNAパネル用の25μlのプレamplication反応準備プリアンプ試薬混合コンポーネント。
「CELLSPACING = "0">表3a：プローブベースのナノ流体工学のmiRNAのパネルの5μlのRT反応の準備におけるRT試薬混合コンポーネント。
| コンポーネントS | 反応あたり容量（μL） |
| のTaqMan PreAmpのマスターミックス（2×） | 12.5 |
| メガプレックスプリアンププライマー（10倍） | 2.5 |
| ヌクレアーゼフリー水 | 7.5 |
| 合計 | 22.5 |
表3B：プローブベースのナノ流体工学のmiRNAのパネル用の25μlのプレamplication反応準備プリアンプ試薬混合コンポーネントは、注：3つのプラットフォームのために提供インタラクティブな補助的なExcelスプレッドシートは、すでにペッティング誤差を補償するために5％の追加を占める。
| サンプルA | リピートサンプル |
| 15.535 | 16.156 |
| 15.471 | 15.652 |
| 15。623 | 16.063 |
| 15.963 | 15.889 |
| 14.006 | 13.993 |
| 14.502 | 14.623 |
| 14.907 | 14.384 |
| 13.732 | 14.946 |
表4：マイクロ流体アレイカードを使用してのmiRNA U6プロファイリングを循環。 2マイクロ流体アレイカード（AおよびB）を使用して。サンプルAからU6制御miRNAのCtの値（合計= 8）。ランの間で観察一貫したU6制御のmiRNA豊富。
Discussion
正確で再現性のある結果を得るために、プローブベースの定量PCRプロトコル内の重要なステップはRT-製品の同じ体積および濃度は、それぞれのqPCR反応にロードされる）ことを確認1を作ることであり、2）成分の正しい比率とボリュームのために必要定量PCR反応を調製してよく混合し、3）正確かつ一貫性のあるボリュームは、各定量PCR反応に添加され、および、まだ心に留めながら、4）各サンプルと反応混合物の調製および負荷は、可能な限り最短の時間で完了している上記の重要なステップは、先に述べた。
マイクロ流体アレイカードは、適切な遠心分離し、特定のバケットが必要です。各バケットは3カード（空/ロードされた）を保持できます。常にバケットのすべての3つのスロットが占有されていることを確認し、バケットは遠心機の反対スロットに（このバケットが空またはフルいずれか3枚のカードを、また含まれている必要があります）同じようなバケツを置くことでバランスされている。 buckeにカードを配置しながらTホルダーは、8貯水池が上向きに突出して反応ウェルは遠心機の外壁に直面していることを確認してください。室温で1分間331×gでのカードをスピン。最初のスピンの後、遠心分離を開き、視覚的に、反応混合物を確保する384ウェルを介して分配されている。 1より多くの時間のために同じ設定でスピンを繰り返します。バケツからカードを取り出し、8貯水池の各反応混合物のレベルが均一であることを確認してください。貯水池に残った液体ボリューム内の任意の矛盾がさらに使いのカードが不適切にする。
RT-製品の同じ濃度を有するように、RNAの同一の入力濃度は、各RT反応に添加される。総RNA濃度は、マイクロvolumespectrophotometerを用いて測定される。観察260/280比は、血漿/血清から単離されたRNAは1.3と低くすることができる。これは、下流のqPCR関連プロセスに影響を与えるようには見えない、またはデータ30を生成した。同様に、の260/280比ここにテストされたRNAサンプルを観察し、定量PCRんの異常な効果を1.3から1.7の間であった。
そのような生体液からのもののような低RNA含有量のサンプルを使用する場合には、処理の前にRNAを定量することは困難である。私たちは、RNA単離での合成スパイクでの使用だけでなく、逆転写ステージをお勧めします。我々の経験では、 シロイヌナズナのmiRNA候補（ATH-のmiR-159AとATH-のmiR-172A）は、我々の経験では、より高いがある可能性があり（例えばCEL-のmiR-39またはCEL-のmiR-54のような） 線虫（Caenorhabditis elegans）の miRNAは、より好ましいAからのものよりも相同性シロイヌナズナ 。このような時期特異的スパイクインの使用は、異なる時点でアッセイし、複数の試料にわたってmiRNAのデータの正規化を考慮することができる。 cDNA合成反応のためのRNAの固定入力ボリュームを使用すると、32,33とが推奨される。
ここで説明したmiRNA定量化のための3つのプローブベースのプロトコルは、様々な量を必要とするトータルRNAインプット、異なるワークフローとコストの。ワークフローの各々は、miRNA標的の数と分析されるサンプルの数に基づいて、異なるスループットに対応するために設計されている。スループットを向上させる（384 rxnの3072 rxnは96 rxnが）で、反応あたりのコストは、単位時間にわたって得られたデータの量の増加に伴って減少する。これらのプラットフォームのすべてのTaqMan化学を利用するので、得られたデータの品質が類似していることが期待できる。のTaqMan qPCRに、血清/血漿試料9,11,27におけるmiRNAの存在量を同定するための十分に確立された方法である。ここで説明した3つのプラットフォームは、同じ化学的性質を共有するが、反応体積の減少は、転写産物の検出のダイナミックレンジの低下（ファーRJ ら 、未発表データ）につながる。 96ウェルのqPCRプラットフォームは低いスループットが、高感度·プラットフォームと我々の見解では、すべてのプローブベースのための「ゴールドスタンダード」（または系色素）をPCRプラットフォームです。しかし、これはよいサンプルの数百または数千のアッセイし、複数のマイクロRNAのためにされている場合、最も経済的または効率的なプラットフォームではない。マイクロフルイディクス（TLDA）およびナノ流体工学（OA）のプラットフォームは、より短い時間で大量のデータの取得を可能にするように設計された高スループット/コンテンツ·プラットフォームである。バッチ差がTLDAカードで観察されているが、これは、同じバッチからTLDAカードを要求することによって最小化することができる。本件契約カードの異なるバッチで同じサンプルを用いて試験した場合に低量miRNAは-私たちは、本件契約のプラットフォーム（ 図3）は半ばの17％の大幅な変動を示したことを観察。そこで、本件契約カードを使用して分析のための同じバッチ番号を使用することをお勧めします。この変化はまた、任意の潜在的なロードやペッティングエラーを含む技術的な変動に起因する可能性があります。しかし、我々は、本件契約カードの同じバッチを要求/ご注文をお勧めします。有意なバッチ変動はOAプラットフォーム上で観察されなかった。これにもかかわらず、TaqManに基づくexperimenTAL定量PCRは、血漿/血清サンプルにおけるmiRNAの豊かさを測定するためにオファーしやすさに近づく。ここで説明した低、中、高スループットのアプローチは非常に効率的で再現性のあるクリーンな（低バックグラウンドノイズ）化学を用いて試料およびmiRNAの範囲を分析するための柔軟性を提供する。
Disclosures
物品処理/出版費用は、出版物のために、この原稿の受け入れを、以下、Life Technologies社覆われていた。
Acknowledgments
すべての著者はNHMRC CTC、シドニー大学、若年性糖尿病研究財団（JDRF）、オーストラリア、レベッカクーパー財団、オーストラリアのインフラ支援を認める。本研究は、WWをAAH、オーストラリア研究会議（FT110100254）とJDRF、オーストラリア（CRN201314）からの補助金により資金を調達し、RJFとMVJは、すべての湿ったラボ実験を行った、ASJはデータ分析を行った。 WWは最初の草案を書いた。 AAHは、研究を計画し、データを分析した。すべての著者は、読んで、出版のために提出された原稿、図面およびワークシートの最終版に合意した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well-platform | |||
| For Reverse transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Assays INV SM | Applied Biosystems |
4427975 | https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer. |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems |
4366597 or 4366596 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray. |
| For qPCR run on a 96-well platform | |||
| 2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystems |
4367846 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml | Applied Biosystems | 4346907 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product |
| Microfluidics platform (TLDA) | |||
| For Reverse transcription | |||
| Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
| Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399966 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
| Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444281 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
| OR | OR | ||
| Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 | Applied Biosystems |
4444750 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
| For Pre-amplification | |||
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems |
4391128 or 4488593 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
| Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444303 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
| Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399233 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
| 1x TE Buffer (100 ml) | Invitrogen | 12090-015 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product The 1x TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
| To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card | |||
| TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913 |
| Nanofluidics platform (OpenArray) | |||
| For Reverse transcription | |||
| Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
| For Pre-amplification | |||
| Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above) | |||
| To load and run the slides | |||
| TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) | Applied Biosystems |
4470187 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187 |
| QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit | Applied Biosystems |
4469576 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576 |
| OpenArray 384-well Sample Plates | Applied Biosystems |
4406947 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947 |
| TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix | Applied Biosystems |
4462159 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159 |
| OpenArray AccuFill System Tips | Applied Biosystems |
4457246 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246 |
| Others | |||
| Nuclease-Free Water | Qiagen | 129117 | http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water |
References
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