Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Probe-baserade Real-time PCR Approaches för kvantitativ mätning av mikroRNA

doi: 10.3791/52586 Published: April 14, 2015

Summary

Cirkulerande mikroRNA har nyligen dykt upp som lovande och nya biomarkörer för olika cancerformer och andra sjukdomar. Målet med denna artikel är att diskutera tre olika probbaserad realtids-PCR-plattformar och metoder som finns tillgängliga för att kvantifiera och avgöra överflödet av cirkulerande mikroRNA.

Abstract

Probe-baserade kvantitativ PCR (qPCR) är en gynnad metod för att mäta avskrift överflöd, eftersom det är en av de mest känsliga detektionsmetoder som ger en exakt och reproducerbar analys. Sond-baserad kemi ger det minsta bakgrundsfluorescens jämfört med andra (färgbaserat) kemier. För närvarande finns det flera plattformar tillgängliga att använda sondbaserad kemi för att kvantifiera transkriptet överflöd. qPCR i en 96 brunnar är det mest rutinmässigt använt metoden, men bara högst 96 prover eller miRNA kan testas i en enda körning. Detta är tidskrävande och tröttande, om ett stort antal prover / miRNA skall analyseras. Hög kapacitet sondbaserade plattformar som mikrofluidik (t.ex. TaqMan Array kort) och nanofluidik kedjor (t.ex. OpenArray) erbjudande lätthet att reproducerbart och effektivt upptäcka överflödet av flera mikroRNA i ett stort antal prover på kort tid. Här visar vi den experimentella uppställningen ennd protokoll för miRNA kvantifiering från serum eller plasma-EDTA prover, med hjälp av sond baserad kemi och tre olika plattformar (96 brunnar, mikrofluidik och nanofluidik arrayer) erbjuder ökande genomströmning.

Introduction

MicroRNAs (miRNA) är ~ 22 nukleotid icke-kodande (nc) RNA, som fungerar som regulatorer av genuttryck 1-3. De flesta miRNA hos djur fungerar genom sekvensspecifik basparning med ett mRNA, med inriktning på 3 'UTR, vilket leder till negativ reglering av genuttryck 2-4. Detta sker oftast via hämning av mRNA translation eller genom ribosomal drop-off. miRNA i omlopp har visat sig vara nya biomarkörer inom forskning och kliniska områden för en mängd olika sjukdomar, såsom diabetes 5-7, äggstocks 8, prostata 9 och bröstcancer 10,11, hepatit B 12 och andra autoimmuna sjukdomar 13. Forskning har utförts för att identifiera rikliga miRNA i olika celler eller vävnader, samt i omlopp från human plasma och serumprov, som är mer tillgänglig och mindre invasiv 9,11-15.

Olika metoder för miRNA kvantifiering har established använder flera plattformar, såsom standard 96-brunnar plattform 4,12,16-18, den mikrofluidik kortplattform 12,18-23 och nanofluidik arrayen plattformen 17,24. Kvantitativ realtids-PCR (qPCR) erbjuder möjligheten att mäta relativa eller absoluta antalet utskrifter med hjälp av multipel (dye- eller probbaserad) kemi. Sondbaserad realtids-PCR kemi erbjuder fördelen av låg bakgrundsfluorescens och hög känslighet för att detektera en enda transkript kopia. Det är relativt kostnadseffektivt, enkelt att använda och mycket reproducerbar, vilket gör det en gynnad metod för att kvantifiera och bestämma miRNA uttryck 25. Sondbaserad qPCR metod involverar i allmänhet två steg: omvänd transkription (RT) och qPCR 4,26,27. RT är där stammen loop RT primer hybridiseras till en mogen eller primär miRNA molekyl och omvandlas till kompletterande (c) DNA. Kvantifiering av cDNA-produkten genomförs sedan med användning av miRNA-specifika PCR-primrar26-28. Principen för sondbaserad qPCR är baserad på detektion av komplementär sträng förlängning i realtid, vilket innebär hydrolys av fluorescent-märkta proben. Dessa sönder är utformade för att innehålla en fluorescerande reporter och en utsläckare som är bara från varandra för att tillåta FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Detektion av emissionen från fluorescens reportern (emitter) är maskerat av närheten av släckningsmolekylen. När Taq-polymeras (pol) sträcker sig från den uppströms primern och når en gaffel (5'-änden av sonden), hydrolyserar Taq Pol-exonukleasaktivitet sonden, vilket leder till en fysisk dissociering / separation av den fluorescerande emittern från släckningsenheten. Denna frisättning av en enda molekyl av fluorescens emitter registreras av detektorn och presenteras som en inkrementell ökning av fluorescenssignal från det väl / reaktion. Ökningen i fluorescens är proportionell mot mängden av PCR-produkt som genererats, vilket möjliggör en noggrann quantification av den amplifierade mål 26,28.

Med ökande efterfrågan i miRNA kvantifiering, har medium till teknik med hög kapacitet utvecklats för att möjliggöra ett större antal prover som ska behandlas på kort tid. TaqMan Low Density Array (TLDA) är en medel genomströmning innovativ mikroflödes design baserad på sondbaserad qPCR kemi som erbjuder en ökning av antalet miRNA analyserade på en platta. TLDA involverar användningen av en fördefinierad pool av RT-primrar som används för att syntetisera cDNA. Dessa cDNA sedan spinns till en anpassad 384 väl mikrofluid kort för att bestämma uttrycket av flera miRNA använder qPCR 22,26,29. Varje brunn av kortet innehåller torkade primers och prober för att förstärka specifika miRNA (s), alltså upp till 384 reaktioner kan behandlas i singel TLDA kort 26.

Den nanofluidik array är en hög genomströmning plattform som används för detektion av gentranskript 24 rostfritt stål. Denna artikel fokuserar på att visa hur dessa metoder för att kvantifiera miRNA i serum / plasma utföras och de kritiska faktorer som måste beaktas när du utför och tolkning av sådana uppgifter. Taken till kontot, kommer deras individuella fördelar och begränsningar diskuteras i denna artikel.

Protocol

Total RNA kan isoleras från serum med hjälp av ett protokoll upprättas i vårt laboratorium 30 eller använda andra kommersiellt tillgängliga kit.

OBS: Kompletterande interaktiva kalkylblad för beräkning av reaktionsvolymerna i varje experiment (med 5% överskottsvolym svarade för pipettering ingår) tillhandahålls.

1. Sond baserade realtid qPCR användning av en standard 96-brunnar Plattform

  1. cDNA-syntes (omvänd transkription) på serum / plasma RNA-prover för miRNA
    1. Beräkna och ta ut 10 ng RNA för varje cDNA-syntesreaktionen. Lägg nukleasfritt vatten att den slutliga volymen på 10 ng RNA till 1,67 l (för en 5 pl reaktion). Håll prover på is.
    2. Välj miRNA och tina sina RT primers.
    3. Tina RT reagens mix komponenter: RT Buffer (10X), dNTP (100 mM), RNas Inhibitor (20 U / l). Aldrig hålla plats enzym (rekombinant Moloney musleukemivirus(RMoMuLV)) (recombinanat Moloney murint leukemivirus (rMoMuLV) omvänt transkriptas (50 U / ^) på is. Förvara den vid -20 ° C tills det behövs eller i en frys-block.
    4. Förbered RT reagensblandning på is som beskrivs i tabell 1A. Det rekommenderas att förbereda minst 5% överskottsvolym för att kompensera för pipettering fel.
    5. Lägg 2.33 il av RT reagensblandning vardera i en 0,2 ml PCR-rör / platta.
    6. Vortex RT primer rören att blanda, sedan centrifugera kort på 10.000 xg under 10 sek. Tillsätt 1 pl av miRNA specifika RT primer till sina respektive PCR-rör eller platta. Lägg 1,67 pl av den utspädda RNA till deras respektive PCR-rör eller brunnar i plattan. Utför alla tillägg på is.
    7. Centrifugera reaktionsröret eller plattan vid 1950 xg under 5 min vid 4 ° C.
    8. Ställ in miRNA cDNA-syntes program på termocyklern med följande inställningsförhållanden: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 min, 85 °C i 5 min och 4 ° C på is.
    9. Ställ reaktionsvolymen till 10 | il. Ladda reaktionsrören eller plattan i termocykeln. Starta RT körningen. Förvara cDNA (RT) reaktioner vid -20 ° C, om realtids PCR-amplifiering inte omedelbart fortsatte.
  2. Probe-baserade Realtids qPCR för detektion av mogna miRNA
    1. Tina de utvalda sondbaserad qPCR analyser (20X) för respektive RT produkten.
    2. Blanda anständighets enda lösningen för realtids-PCR (qPCR reagens mix) genom att snurra flaskan.
    3. Förbered qPCR reagensmixen för varje miRNA som skall analyseras. För att framställa den qPCR erhålla ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör för varje miRNA prov och tillsätt komponenterna i varje rör som beskrivs i tabell 1B. Det rekommenderas att förbereda minst 5% överskottsvolym för att kompensera för pipettering fel.
    4. Lägg 4,2 pl av respektive qPCR reagensblandning till varje brunn i en optisk 96-brunnsplatta (eller rör). Lägg 0,8 plav respektive cDNA-reaktion (syntetiserad i steg 1.1 för varje miRNA) till respektive brunn.
    5. Täta plattan med lämplig optisk lock. Centrifugera plattan (eller rör) vid 1950 xg under 5 min vid 4 ° C
    6. Slå på datorn, 96-brunnar / mikrofluidik array läsare och slutligen starta programmet. Se till att maskinerna är rätt anslutna och korrekt block och uppvärmda lock (för snabb 96 brunnar) är på plats.
    7. Välj experiment som 96-väl snabbt blocket (0,1 ml), standardkurva, TaqMan reagenser och snabbt läge. Ställ in qPCR på Real Time PCR-system med hjälp av följande program cykelförhållanden: 95 ° C i 20 sekunder, 50 cykler (95 ° C i 1 sek, 60 ° C under 30 sekunder).
    8. Ställ reaktionsvolymen till 10 | il. Ladda reaktionsröret eller platta i instrumentet. Tryck på "Starta run". Programmet tar ungefär 1 timme att slutföra.

2. Probe-baserade Mikrofluidik Array Card (Card A och B)

OBS: Probe-baserade miRNA panelen kommer som en uppsättning av två 384-väl microfluidic kort (Array-kort A och Array kort B). Varje kort innehåller torkade Primers och prober för upp till 380 miRNA och kontroller. cDNA produkt (med eller utan förut förstärkning) specifik för kort A eller kort B lastas på respektive array för realtids-PCR.

  1. Omvänd transkription (RT)
    1. Använd detta protokoll för en total RNA ingång 1-1000 ng. Om ingången är mellan 1-350 ng, utför ett steg i förväg förstärkning (pre-amp). För ingångar över 350 ng, ladda cDNA direkt på matris kort utan förförstärkare.
      OBS: För serum miRNA profilering, börja med 100 ng av totalt RNA. För en komplett miRNA profil, kör två fördefinierade pooler av RT-primer uppsättningar RT reaktioner (Pool A och pool B) per prov.
    2. Tina följande reagenser på is. RT Primers (10x): Pool A och pool B, dNTP med dTTP (100 mM), RT Buffer (10x), MgCl2 (25 mM), RNas Inhibitor (20 U / &# 181; l). Förvara inte enzymet (rekombinant Moloney murinleukemivirus (rMoMuLV)) omvänt transkriptas (50 U / l) på is. Förvara den vid -20 ° C tills det behövs.
    3. Vortexa försiktigt alla reagenser utom enzymet och centrifugera sedan kort rören vid 10.000 xg under 10 sek.
    4. Kombinera reagens, såsom beskrivs i Tabell 2A, i två rör; ett rör för Pool A, den andra för Pool B. Varje rör innehåller endast en fördefinierad pool av RT primer set, antingen från Pool A eller från Pool B. Det rekommenderas att förbereda minst 5% överskottsvolym för att kompensera för pipettering fel .
    5. Invertera att blanda, och centrifugera sedan kort vid 10.000 xg under 10 sek. Alikvotera 100 ng av varje RNA provet i ett nytt rör, lägg sedan till en lämplig volym av nukleasfritt vatten till totalt 3 pl.
    6. Alikvot 4.5 il av lämplig RT reagensblandning i respektive rör. Invertera att blanda, och centrifugera sedan kort vid 10.000 xg under 10 sek. Inkubera på isunder 5 min.
    7. Placera proverna i en termocykler och börja RT med användning av följande betingelser: 40 cykler (16 ° C under 2 min, 42 ° C under 1 min, 50 ° C under 1 sek), 85 ° C under 5 min, paus vid 4 ° C. Butiks cDNA genereras genom användning av dessa fördefinierade pool av RT-primrar vid -15 till -25 ° C eller användes omedelbart.
  2. Pre-förstärkning
    1. Tina fördefinierade pool av pre-amp primers på is. Försiktigt virvel primers, och centrifugera sedan kort dem vid 10.000 xg under 10 sek. Swirl TaqMan Förstärkarnivå reagensblandning (2X) genom att slå lätt, att blanda.
    2. Kombinera reagens, såsom beskrivs i Tabell 2B, i två rör; en tub för Pool A, den andra för pool B.
      OBS: Som beskrivits ovan, kommer Pool En pre-amp primers gå till röret A och Pool B primers bör gå till röret B. Det rekommenderas att förbereda minst 5% överskottsvolym för att kompensera för pipettering fel.
    3. Invertera att blanda, och centrifugera sedan kort vid 10.000 xg under 10 sek.Alikvot 22,5 pl av lämplig Förstärkarnivå reagensblandning i nya rör. Alikvot 2.5 pl av cDNA provet (upprättad i RT steget) i respektive rör.
    4. Invertera att blanda, och centrifugera sedan kort vid 10.000 xg under 10 sek. Inkubera på is under 5 minuter. Placera prover i en termocykler och börja pre-amp cykel. Cykelbetingelser: 95 ° C under 10 min, 55 ° C under 2 min, 72 ° C under 2 min, 12 cykler (95 ° C under 15 sekunder, 60 ° C under 4 min), 99,9 ° C under 10 min, paus vid 4 ° C.
    5. Invertera pre-förstärkta cDNA att blanda, och sedan snabbt centrifugera vid 10.000 xg under 10 sek. Lägg 75 pl av 0,1 x TE-buffert (pH 8,0) till pre-amplifierat cDNA (1: 4 utspädning). Vänd utspädda pre-amp prover för att blanda, och centrifugera sedan kort vid 10.000 xg under 10 sek. Butiks utspädd förförstärks cDNA vid -15 till -25 ° C i upp till en vecka, eller användas omedelbart.
  3. Laddar mikrofluidik kort och utföra qPCR
    1. Håll mikrofluidikmiRNA kort utanför under minst en halvtimme för att nå rumstemperatur. Tina utspädd pre-förstärkta cDNA på is och blanda genom att vända rören följt av kort spinn. Blanda qPCR reagensblandning genom att snurra flaskan.
    2. I nya röret tillsätt 450 pl qPCR reagensblandning till 9 pl utspätt pre-förstärkt cDNA. För kort A, använder pre-förstärkta produkten framställd med användning primer Pool A. Lägg 441 pl nukleasfritt vatten för att kompensera den slutliga volymen till 900 pl. Vänd röret för att blanda, och centrifugera sedan kort vid 10.000 xg under 10 sek.
    3. Ta ut TLDA kortet ur förpackningen (när den når rumstemperatur) och placera den på ett rent område med folie sidan nedåt. Lägg 100 pl av PCR-reaktionsblandningen i var och en av de åtta påfyllningsportarna på kortet. Det finns två portar på varje av reservoaren (8 reservoarer i totalt på varje kort).
      OBS: påfyllningsöppning är det större hålet där reaktionsblandningen tillsätts, medan luftningsöppningen är det mindre hålet. Varje miRNA TLDA kort har 8 reservoars, var och leder till 48 brunnar (24 brunnar i en kolumn x 2 kolumner), vilket fyller alla 384 brunnar i kortet med samma PCR-reaktionsblandningen. Se till att Pool A och pool B i varje prov lastas på respektive TLDA kort. Placera array kortet i de specialiserade mikrofluidik array korthållare hinkar i centrifugen.
    4. För mikrofluidik array kort, använd en lämplig centrifug (t.ex. Heraeus Multifuge 3SR, 230V centrifug) och specifika hinkar (t.ex. "TaqMan Array kort" innehavare). Varje hink kan innehålla upp till 3 kort (lastad / tom). Se alltid till att alla 3 platser i en hink är ockuperat och skopan balanseras genom att placera liknande skopa (denna hink bör även innehålla 3 kort, antingen tomma eller fulla) i motsatt slits centrifugen. Medan placera kortet i hinken hållaren, se till att de åtta reservoarer skjuter uppåt och reaktionsbrunnar möter yttervägg centrifug.
      1. Snurra korten på 331 xg under 1 min vid rumstemperatur. Efterförsta spinn, öppnar centrifugen och visuellt se reaktionsblandningen har dispense igenom de 384 brunnarna. Upprepa spinn på samma inställningar för mer 1 gång. Ta ut kortet ur hinken och se till att nivån på reaktionsblandningen i varje av de åtta reservoarer är jämn. Eventuella inkonsekvenser i de flytande volymer kvar i behållarna gör kortet olämpligt att använda ytterligare.
    5. Microfluidics array kort behöver en specialiserad förseglare som har en precisions stylus aggregat (vagn) för att täta fluiddistributionskanalerna i matrisen och lika fördela reaktionsblandningen i alla brunnar (total reaktionsvolym 1 pl / brunn).
    6. Ta vagnen till utgångsläget och sätt den laddade kortet i sealer med folie sidan uppåt och uppradade till Stylus stiften på sealer. I en långsam, stadig och enda enhetlig stroke, skjut vagnen över kortet tills den når slutpunkten av sealer. Ta det förseglade array kortet och skär sedan bort behållarens från kortet med sax.
    7. Se till att rätt blocket, uppvärmd lock och provhållaren är installerad i mikrofluidik array realtids-PCR-system / maskin.
    8. Slå på datorn, då mikrofluidik array-system och slutligen starta programmet. Se till att maskinerna är rätt anslutna. Välj experiment som array-kort, standardkurva, TaqMan reagenser och standardläge. Importera installationsfilerna för någon av kortets A och kort B. Spara filen.
    9. Placera förseglade kortet i instrumentbehållaren med väl A1 i övre vänstra hörnet och streckkod mot framsidan av instrumentet. Tryck på "Start Kör". Programmet kommer att ta ca 2 tim för att slutföra.

3. Probe-baserade nanofluidik Human miRNA Panel

  1. Omvänd transkription (RT)
    1. Använd detta protokoll för en total RNA ingång 50-200 ng, men 100 ng är optimal för de flesta prover. För en komplett miRNA profil, kör två predefiNed pooler av RT-primer uppsättningar RT reaktioner (Pool A och pool B) per prov.
    2. Tina reagens på is: fördefinierade pool av RT primeruppsättningar (10X), dNTP med dTTP (100 mM), RT Buffer (10x), MgCl2, (25 mM), RNas Inhibitor (20 U / l). Förvara inte enzymet (rekombinant Moloney murinleukemivirus (rMoMuLV) omvänt transkriptas (50 U / l) på is. Förvara den vid -20 ° C tills det behövs. Virvel försiktigt alla reagenser, förutom enzymet, och kortfattat centrifugera dem vid 10.000 xg under 10 sek.
    3. Kombinera reagens, såsom beskrivs i Tabell 3A, i två rör; ett rör för Pool A, den andra för Pool B. Varje rör innehåller endast en fördefinierad pool av RT-primer set, antingen från Pool A eller från Pool B. Det rekommenderas att förbereda minst 5% överskottsvolym för att kompensera för pipettering fel.
    4. Pipett för att blanda och centrifugera sedan kort vid 10.000 xg under 10 sek. Alikvotera 100 ng av varje RNA provet i ett nytt rör, lägg sedan till en lämplig volymav nukleasfritt vatten till totalt 3 pl. Alikvot 4.5 il av lämplig RT reagensblandning i respektive rör.
    5. Invertera att blanda, och centrifugera sedan kort vid 10.000 xg under 10 sek. Inkubera på is under 5 min. Placera prover i en termocykler och starta RT-programmet. Cykelbetingelser: 40 cykler (16 ° C under 2 min, 42 ° C under 1 min, 50 ° C under 1 sek), 85 ° C under 5 min, paus vid 4 ° C. Affär cDNA genereras med hjälp av dessa fördefinierade pool av RT-primer inställd på -15 till -25 ° C eller använd omedelbart.
  2. Pre-amplifiering (pre-amp)
    1. Tina fördefinierade pool av pre-amp primer inställd på is. Försiktigt virvel primers, sedan centrifugera dem kort vid 10.000 xg under 10 sek. Swirl TaqMan Förstärkarnivå reagensblandning (2X) för att blanda.
    2. Kombinera reagens, såsom beskrives i tabell 3B, i två rör; ett rör för Pool A, den andra för Pool B. Varje rör innehåller endast en fördefinierad pool av RT-primeruppsättningar, antingen frabout Pool A eller från Pool B. Det rekommenderas att förbereda minst 5% överskottsvolym för att kompensera för pipettering fel.
    3. Pipett för att blanda, och sedan kort centrifugera dem vid 10.000 xg under 10 sek. Alikvot 22,5 pl av lämplig Förstärkarnivå reagensblandning i nya rör. Alikvot 2.5 il av cDNA provet i respektive rör. Invertera att blanda, och centrifugera sedan kort rören vid 10.000 xg under 10 sek. Inkubera på is under 5 min.
    4. Placera prover i en termocykler och kör pre-amp. Ställ reaktionsvolymen till 25 | il. Cykelbetingelser: 95 ° C under 10 min, 55 ° C under 2 min, 72 ° C under 2 min, 12 cykler (95 ° C under 15 sekunder, 60 ° C under 4 min), 99,9 ° C under 10 min, paus vid 4 ° C.
    5. Invertera pre-förstärkta cDNA att blanda, och sedan snabbt centrifugera vid 10.000 xg under 10 sek. I nya rör till 4 pl förförstärks cDNA till 156 pl 0,1 x TE-buffert pH 8,0 (01:40 utspädning). Vänd utspädda pre-amp prover för att blanda, och sedan kort centrifuge vid 10.000 xg under 10 sek. Store utspätt och outspätt pre-förstärkta cDNA vid -15 till -25 ° C i upp till en vecka, eller använd omedelbart.
  3. Laddar nanofluidik matriser och Performing qPCR
    1. Ladda relevant plattfilen (.tpf) från webbplatsen 31 använder nanofluidik array slide serienummer. Detta innehåller information körning för specifika nanofluidik array slide.
    2. Tina utspädd pre-förstärkt cDNA och TaqMan Real-Time qPCR reagensblandning (om du använder för första gången) på is. Blanda qPCR reagensblandning genom att snurra flaskan. I nya rör till 22,5 pl qPCR reagensblandning till 22,5 pl utspätt pre-förstärkta cDNA. Försiktigt virvel för att blanda, och centrifugera sedan kort vid 10.000 xg under 10 sek.
    3. Alikvot 5 ìl av varje prov i 8 brunnar (2 kolumner, fyra rader) i nanofluidik arrayen arbetsflöde 384 brunnar provplatta. Se till att Pool A och pool B i varje prov är i angränsande 8 brunnar block (se Figure 1 eller kompletterande Excel-ark för layout).
      1. Varje prov platta kan innehålla upp till åtta diabilder värde av prover. Emellertid kan systemet för nanofluidik arrayen endast behandla 4 nanofluidik arrayer i en enda körning. Om mer än fyra diabilder värda prover skall lastas på ett enda prov platta, se de återstående avsnitten är förseglade. Täta med OpenArray provplatta sealer.
        OBS: Det är tillrådligt att förklippt sealer i de nödvändiga delarna, så sektionerna kan förseglas / oförseglad individuellt för att minska avdunstningen. Alternativt kan plattan tätas med en intakt sealer och sedan sektioner kan individuellt skära ut vid lastning.
    4. Centrifugera plattan vid 490 xg under 1 min vid 4 ° C. Ladda nanofluidik array glider inom 1 timme. På grund av den begränsade tid tillåts att täta bilderna, vänligen bara ladda en bild i taget. Avlägsna nanofluidik arrayen slide från frysen och låt den komma till rumstemperaturratur (~ 15 min).
    5. Säkerställ att det korrekta blocket, uppvärmt lock och provbärare är installerad i nanofluidik array-system. Slå på datorn, och realtids-PCR-system och laddningssystemet. Gå till respektive program och se till att maskinerna är anslutna. Ta förbrukningsladdningssystemet (Array slide lock, plug och nedsänkning vätska) ur förpackningen.
    6. Dra försiktigt i kolven av nedsänkning vätska sprutan för att lossa. Avlägsna locket, placera spetsen på och spola luft från spetsen. Placera laddningssystemet tips i maskinen och ta bort locket. Placera provplatta inom PCR-system.
    7. Sätt handskar på. Se till att de är tätt passande för att minimera risken att oavsiktligt märkning glidlocket. Öppna försiktigt slide förpackningar. Långsamt tip glida in handen. Rör inte toppen av bilden.
    8. Placera glida in PCR-systemet, med streckkoden på vänster. Avlägsna sealer från delen av provplattan är avsedd för lastning. Använd laddningssystemetprogramvara för att komma in i glid streckkod, skjut läge, provposition och dricks konfiguration.
    9. När alla relevanta kontroller är klara, tryck last slide. Medan PCR-systemet laddar bilden, ta bort den klara och röd plast från botten av glidlocket. När du är klar laddar, försiktigt bort och försegla bilden inom 90 sekunder.
      1. Placera bilden inom plattklämman. Placera glid locket på bilden. Klämma till 30 sek. Se till att locket är placerad så att streckkoden visas korrekt. Ta bort enheten från plattan klämman.
      2. Position nedsänkning vätska spruta inuti sliden så att spetsen trycker mot locket. Fyll långsamt slide med nedsänkning vätska, säkerställer vätske går längs locket. När full, täta bilden med pluggen, vrida skruven tills handtaget bryts av.
      3. Ta bort plastkåpan ovanpå glidlocket, och sedan försiktigt placera i glid bärare av realtids-PCR-system. Se till att det finns support på botten av bilden när den sänks, så det inte faller plötsligt, och inte röra toppen av bilden. Det är OK att röra sidorna av bilden / cassette.Initialize PCR-systemet och starta programmet för qPCR inom 1 timme.
    10. Välj "OpenArray" inom PCR-systemprogramvaran. Tryck på "Hitta Slide ID". Detta kommer att ta några minuter. Om programvaran inte hittar plattan ID, kommer den att be för att det ska skrivas in manuellt.
    11. Tryck på "Bekräfta Plate Centres". Återigen kommer det ta några minuter. Kontrollera att den röda pricken är i centrum och att det inte finns några fingeravtryck / märken på toppen av bilden. Ladda respektive .tpf fil för varje bild och ange ett namn resultat fil och plats. Tryck på "Start Kör". Programmet kommer att ta ca 2 tim för att slutföra.

Representative Results

Den rekommenderade volymen för en miRNA sond-baserad analys qPCR reaktion är 20 pl. OBS: Vi har bekräftat att en reaktionsvolym på 5 ^ kan producera liknande resultat som uppnås med hjälp av 20 il volym 4,7,30. Sänkning av reaktionsvolymen till 5 pl möjliggör en 75% minskning av reagenskostnaderna, utan nämnvärd förlust i känslighet. Som visas i Figur 2, reaktionsvolymer av 20 pl och 5 ^ visar en stark samarbets förhållande fram till 39 cykler (med r2 0,92, p = 0,0002).

Mikrofluidik array ger ett verktyg för att få uppgifter om 754 miRNA som uttrycks i ett prov på cirka 5 timmar (för kort A och kort B), vilket är ett mer effektivt sätt att analysera flera prover jämfört med konventionella platta med 96 brunnar PCR. Vi jämförde miRNA mikrofluidik array kort för samma prov (prov A och Prov En upprepning) Figur 3A -. B visar en Bland-Altman plot (<strong> 3A) och Korrelation plot (3B) för samtliga 754 miRNA testas för dessa prover. Det finns 3 olika kontroll miRNA (U6, RNU44 och RNU48) placerade slumpmässigt på båda korten (kort A och B) på flera platser. När U6 cykeltröskel (CT) värden jämförs mellan de två körningar, inte vi observera signifikanta skillnader mellan de värden (Tabell 4). Det är också viktigt att notera här att U6 uttrycks vid högre förekomst (lägre Ct-värde) i provet bedömas. Vi jämförde sedan alla miRNA som har Ct-värden mellan 0 till 19,99 i båda körningarna (n = 150), som hade liknande uttryck av miRNA övergripande med en koefficient på bestämning av 98% (figur 3C-D). Av alla de 277 miRNA som har Ct-värden mellan 20 och 29.99 i båda körningarna, 16 Mirs skilde sig signifikant mellan de ursprungliga och upprepa körningar (Figur 3E - F) Antalet miRNA med signifikant skillnad betwee.n körningarna ökat (89 av 327) när Ct-värden valdes mellan 30-40 för båda körningarna (Figur 3G - H).

Den nanofluidik array plattform tillhandahåller data för 754 miRNA från varje prov serum / plasma testade, som representeras i figur 4A Det är viktigt att undersöka dessa förstärkningskurvor -. Som det är med alla qPCR - att se till att resultatet är ett tecken på sann förstärkning. Var och en av de 48 subsystem (Figur 1) innehåller också en analys för de tre mest populära "hushållning" ncRNAs:. U6, RNU44 och RNU48 Figur 4B illustrerar en typisk klustring av U6 replikerar från ett enda prov. Dessa replikat visa låg standardavvikelse (SD <0,5) och så är en indikator på tillförlitlighet. Alternativt Figur 4C visar ökad variabilitet U6 replikat (SD> 0,5) i ett andra prov. Detta upphäver inte giltigheten of resterande analyser, även om det gör kräver en mer grundlig kritik. U6, som med de flesta "housekeeping" miRNA i biologiska vätskor, kan ha en variabel uttryck. Det bör noteras att en av de prover, som beskrivs i Figur 4C, visar 4 gånger mindre U6 innehåll än den som presenteras i Figur 4B. Eftersom nivån av U6 i prov presenteras i 4C är 75% mindre att börja med än den som presenteras i panel 4B, är större teknisk variabilitet förväntas på grund av Poisson fördelningen av transkript, som förvärras av den lilla reaktionsvolymen 17.

Ett annat viktigt redskap är de Kvalitetskontroll (QC) bilder, tillgängliga för export när körningen är klar. Ett urval av dessa använder fluorescens av ROX, den passiva färgämne som finns i qPCR reagensblandning, för att bekräfta att varje genomgående hål har laddats korrekt (Figur 5). Ett genomgående hål, eller faktiskt en sv däck subanordningen, inte kan lasta på grund av otillräcklig provvolym, avdunstning, bubblor närvarande i brunnarna i 384 brunnar provplatta, underlåtenhet att helt ta bort provplattan tätningen, eller defekter inom Accufill systemet eller dess tips. Varje lossas genomgående hål måste identifieras för att undvika märkning miRNA som "omätbara", när det i själva verket analysen aldrig laddad. Om detta problem uppstår, bekräftar att minst 5 l av prov / mastermix laddas in varje brunn på 384 brunnar provplatta provet plattan ordentligt centrifug före lastning, är folietätningen helt bort, och laddade OpenArray glid förseglas och köras inom den tilldelade tiden för alla efterföljande körningar. Om last frågor kvarstår, kan dessa mer sannolikt avseende specifika partiet eller sändningen av matriser eller relaterade förbruknings och ytterligare assistans bör begäras via tillverkaren.

"Src =" / filer / ftp_upload / 52.586 / 52586fig1.jpg "/>
Figur 1: Layout av prover för nanofluidik Array arbetsflöde: (A) Varje 384-väl provplatta kan hålla prover för upp till 8 nanofluidik arrayer. (B) efter utspädning, är pre-förstärkt cDNA placeras i åtta brunnar (2 kolumner med 4 rader), med pool A och Pool B i angränsande 8 brunnar grupper. Varje cirkel representerar en brunn. (C) Varje brunn i provplattan kommer att laddas in i en subanordningen av nanofluidik arrayen. Varje liten kvadrat representerar en subanordningen.

Figur 2
Figur 2: Co-relation analys för konventionella 96 brunnar PCR plattformar: Co-förhållande mellan 20 pl och 5 pl reaktionsvolym på TaqMan realtid qPCR med en vanlig 96-brunnar plattform i CT-värden (39 cykler). Vi jämförde fyra olika mikroRNA (MIR-375, MIR-30c miR-30d och MIR-7) i fyra olika humana serum- och plasmaprover. Endast 11 datapunkter plottas sedan de andra var omöjlig att upptäcka. R 2 = 0,92, p = 0,0002.

Figur 3
. Figur 3: Cirkulerande miRNA profilering använder mikrofluidik array kort Använda 2 mikrofluidik kort (kort A och kort-B), är en profil av 754 miRNA genereras (A - B). Som visas här, använde vi samma prov för 2 mikrofluidik array går att kontrollera reproducerbarhet mikrofluidik kortresultaten. Vi observerade en liknande uttryck för miRNA övergripande, med Ct-värden mellan 0 till 19,99 (C - D). Det finns få miRNA (16 av 277) med Ct-värden mellan 20-29,99 och betydande skillnader mellan upprepade körningar (E - F). Åttio nio av 327mikroRNA med högre Ct-värden (30-40) uppvisade signifikanta skillnader mellan de båda körningarna (G - H).   Data analyseras med parade T-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4: Representant Profil för PCR Produkt Amplification Kurvor: Är en representativ siffra på de kombinerade (A) förstärkning kurvor för alla miRNA mål för en människa plasmaprov. En analys för U6 (en gemensam styr ncRNA) placeras i varje undergrupp. Provet i (B) visar låg variabilitet (SD <0,5) medan (C) visar hög standardavvikelse (SD> 0,5) inom U6 replikerar. Båda proven är total RNA isolerad från human plasma. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5: QC Analys av nanofluidik arrayer: Kvalitetskontroll (QC) bilder av en korrekt laddat nanofluidik array (till vänster) och en felaktigt laddade nanofluidik array (höger). Den passiva färgämne, ROX (ingår i qPCR reagensblandning), fluorescerar att indikera en korrekt laddat genomgående hål. Arrayen till höger har flera subsystem / genomgående hål som inte läses in med qPCR reagensblandning och dessa bör identifieras som falskt negativa PCR-reaktioner.

Komponenter Volym per 5 pl reaktion (pl) RT-buffert (10 x) 0,5
dNTP (100 mM) 0,05
RNas-inhibitor 0,6
Nukleasfritt vatten 1,39
Reverse Transcriptase 0,33
Total volym 2,33

Tabell 1A: RT reagensblandningskomponenter i en 5 | il RT-reaktions förberedelse för TaqMan realtid qPCR med en vanlig 96-brunnar plattform.

Komponenter Volym per 5 pl reaktion (pl) Volym per 20 pl reaktion (pl)
Snabb PCR mastermix (2x) 2,5 10
TaqMan qPCR analys (20x) * 0,25 1
Nukleasfrittvatten 1,45 5,8
Total volym: 4,2 16,8

* Analys del baserad på den valda miRNA testade.

Tabell 1B: qPCR reagensblandningskomponenter i en 5 eller 20 | il qPCR reaktions förberedelse för TaqMan realtid qPCR med en vanlig 96-brunnar plattform.

Komponenter Volym per reaktion (pl)
Megaplex RT-primrar (10x) 0,8
dNTP med dTTP (100 mM) 0,2
Multiscribe Reverse Transcriptase (50 U / | il) 1,5
10X RT Buffer 0,8
MgCl2 (25 mM) 0,9
RNas Inhibitor & # 160; (20 U / | il) 0,1
Nukleasfritt vatten 0,2
Totalt 4,5

Tabell 2A: RT reagens mix komponenter i en 5 pl RT reaktion förberedelse för TLDA miRNA panelen.

Komponenter Volym per reaktion (pl)
TaqMan Förstärkarnivå Mastermix (2x) 12,5
Megaplex Preamp Primers (10x) 2,5
Nukleasfritt vatten 7,5
Totalt 22,5

Tabell 2B: Preamp reagens mix komponenter i en 25 ^ pre-amplifiering reaktion förberedelse för TLDA miRNA panelen.

"Cellspacing =" 0 "> Komponenter Volym per reaktion (pl) Megaplex RT-primrar (10x) 0,75 dNTP med dTTP (100 mM) 0,15 Multiscribe Reverse Transcriptase (50 U / | il) 1,5 10X RT Buffer 0,75 MgCl2 (25 mM) 0,9 RNas-inhibitor (20 U / | il) 0,09 Nukleasfritt vatten 0,35 Totalt 4,5

Tabell 3A: RT reagens mix komponenter i en 5 pl RT reaktion förberedelse för sondbaserade nanofluidik miRNA panel.

Komponents Volym per reaktion (pl)
TaqMan Förstärkarnivå Mastermix (2x) 12,5
Megaplex Preamp Primers (10x) 2,5
Nukleasfritt vatten 7,5
Totalt 22,5

Tabell 3B:. Preamp reagens mix komponenter i en 25 ^ pre-amplifiering reaktion förberedelse för sondbaserade nanofluidik miRNA panel OBS: Den interaktiva tilläggs excel kalkylblad föreskrivs de tre plattformarna, redan står för tillsättning 5% för att kompensera för pipettering fel.

Prov A Prov A upprepning
15,535 16,156
15,471 15,652
15.623 16,063
15,963 15,889
14,006 13,993
14,502 14,623
14,907 14,384
13,732 14,946

Tabell 4: Cirkulerande miRNA U6 profilering använder mikrofluidik array-kort. Använda två mikrofluidik array kort (A och B). Ct-värden på U6 kontroll miRNA från Prov A (totalt = 8). Konsekvent U6 kontroll miRNA överflöd observerats mellan körningarna.

Discussion

De kritiska steg inom probbaserade qPCR protokoll för att få exakta och reproducerbara resultat är att se till att 1) ​​samma volym och koncentration av RT-produkt är laddat i varje qPCR reaktion, 2) rätt nyckeltal och volymer av komponenterna som behövs för qPCR reaktion bereds och blandas väl, 3) korrekta och konsekventa volymer läggs till varje qPCR reaktion, och 4) förberedelse och lastning av varje prov och reaktionsblandning är klar på kortast tid som möjligt, men ändå medveten om ovanstående kritiska stegen nämnde tidigare.

De mikrofluidik array korten behöver lämplig centrifug och specifika hinkar. Varje hink kan innehålla upp till 3 kort (lastad / tom). Se alltid till att alla 3 platser i en hink är ockuperat och skopan balanseras genom att placera liknande skopa (denna hink bör även innehålla 3 kort, antingen tomma eller fulla) i motsatt slits centrifugen. Medan placera kortet i Bucket hållare, se till att de åtta reservoarer skjuter uppåt och reaktionsbrunnar möter yttervägg centrifug. Snurra korten på 331 xg under 1 min vid rumstemperatur. Efter första spin, öppnar centrifugen och visuellt se reaktionsblandningen har dispense igenom de 384 brunnarna. Upprepa spinn på samma inställningar för mer 1 gång. Ta ut kortet ur hinken och se till att nivån på reaktionsblandningen i varje av de åtta reservoarer är jämn. Eventuella inkonsekvenser i de flytande volymer kvar i behållarna gör kortet olämpligt att använda ytterligare.

Att ha samma koncentration av RT-produkten, är samma ingångskoncentration av RNA sattes in i varje RT-reaktion. Den totala RNA-koncentrationen mäts med en mikro volumespectrophotometer. Den observerade 260/280 förhållandet kan vara så låg som 1,3 för RNA isolerats från plasma / serum; Detta verkar inte ha en effekt på nedströms qPCR relaterad process eller data genererade 30. Likaså 260/280 förhållandet avRNA testade häri prover var mellan 1,3-1,7 utan onormala effekter i qPCR observerade.

Vid användning av låga innehåll prover RNA, såsom de från Biofluids, kan det vara svårt att kvantifiera RNA före behandling. Vi rekommenderar användning av syntetiska spik in på RNA isolering samt omvänd transkription stegen. Enligt vår erfarenhet Arabidopsis thaliana miRNA kandidater (ATH-MIR-159A och ath-MIR-172a) är att föredra framför Caenorhabditis elegans miRNA (såsom cel-MIR-39 eller cel-MIR-54), vilket enligt vår erfarenhet kan ha högre homologi än de från A. thaliana. Användningen av en sådan skedesspecifik spike-in kan svara för en normalisering av miRNA data över flera prover analyserades vid olika tidpunkter. Med hjälp av en fast ingångsvolym RNA för cDNA-syntes reaktion rekommenderas också 32,33.

De tre sondbaserade protokoll för miRNA kvantifiering beskrivs här kräver varierande mängderav total RNA-ingång, olika arbetsflöden och kostnader. Var och en av arbetsflöden är utformade för att tillgodose olika genomströmningar baserade på antalet miRNA mål och antalet prover som skall analyseras. Med ökande genomströmningen (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), kostnaden per reaktion minskar med en ökning av mängden data som erhålls under en tidsenhet. Eftersom alla dessa plattformar utnyttjar TaqMan kemi, kan förväntas kvaliteten på data som erhållits för att vara liknande. TaqMan qPCR är en väletablerad metod för att identifiera överflödet av miRNA i serum / plasmaprover 9,11,27. Fastän de tre plattformar som diskuteras här har samma kemi, en minskning av reaktionsvolymen leder till en minskning av dynamiskt intervall av transkriptet detektering (Farr RJ et al., Opublicerade data). Den 96-väl qPCR plattformen är en lägre genomströmning, men hög känslighet plattform och i våra ögon, den "gyllene standarden" för alla sondbaserade (eller färgämne baserat) PCR-plattformar. Detta kan dockinte vara det mest ekonomiska eller effektiv plattform om flera hundra eller tusen prover som analyseras och för flera mikroRNA. Mikrofluidik (TLDA) och nanofluidik (OA) plattformar är hög genomströmning / innehållsplattformar som syftar till att möjliggöra förvärv av större uppgifter på kortare tid. Även sats skillnader har observerats i TLDA korten, kan detta minimeras genom att begära TLDA kort från samma parti. Vi observerar att TLDA plattform (Figur 3) visade signifikant variation i 17% av mitten - låga överflöd miRNA vid testning med hjälp av samma prov på olika partier av TLDA kort. Vi rekommenderar därför att använda samma batchnummer för analys med hjälp TLDA kort. Denna variation kan också bero på den tekniska variabilitet inklusive eventuella lastnings- och pipetteringsfel. Vi rekommenderar dock beställning / begär samma parti TLDA kort. Ingen signifikant batch variation observerades på OA-plattformen. Trots detta TaqMan baserade experimental qPCR närmar erbjudande lätthet att mäta förekomsten av miRNA i plasma / serumprover. De metoder genomströmning låg, medium och hög diskuteras här erbjuder den flexibilitet för att analysera en rad prover och miRNA använder en mycket effektiv, reproducerbar och ren (lågt bakgrundsljud) kemi.

Disclosures

Artikel kostnader bearbetning / publicerings täcktes av Life Technologies, efter godkännande av detta manuskript för publicering.

Acknowledgments

Samtliga författare erkänna det stöd infrastrukturen från NHMRC CTC, University of Sydney, Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), Australien och Rebecca Cooper Foundation, Australien. Denna forskning har finansierats genom bidrag från svenska forskningsrådet (FT110100254) och JDRFEN, Australien (CRN201314) att Aah WW, RJF och MVJ utfört alla våta lab experiment, ASJ utfört dataanalys. WW skrev det första utkastet. AAH planerade studien och analyserade data. Alla författare läst och godkänt på den slutliga versionen av manuskriptet, siffror och kalkylblad som lämnats för publicering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well-platform
For Reverse transcription
TaqMan MicroRNA Assays INV SM  Applied Biosystems
 
4427975 https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975
The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems
 
4366597 or 4366596 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596
The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.
For qPCR run on a 96-well platform
2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG  Applied Biosystems
 
4367846 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846
The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on  the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml  Applied Biosystems 4346907 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product
Microfluidics platform (TLDA)
For Reverse transcription
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems
 
4399966 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966
The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 Applied Biosystems
 
4444281 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281
The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
OR OR
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 Applied Biosystems
 
4444750 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750
The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
For Pre-amplification
TaqMan PreAmp Master Mix Applied Biosystems
 
4391128 or 4488593 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593
The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0  Applied Biosystems
 
4444303 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303
The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems
 
4399233 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233
The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
1x TE Buffer (100 ml) Invitrogen 12090-015 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product
The 1x TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0  Applied Biosystems 4444913 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913
Nanofluidics platform (OpenArray)
For Reverse transcription
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).
For Pre-amplification
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)
To load and run the slides
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) Applied Biosystems
 
4470187 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit  Applied Biosystems
 
4469576 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576
OpenArray 384-well Sample Plates   Applied Biosystems
 
4406947 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix Applied Biosystems
 
4462159 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159
OpenArray AccuFill System Tips  Applied Biosystems
 
4457246 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246
Others
Nuclease-Free Water Qiagen 129117 http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 431, 350-355 (2004).
  2. Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. MicroRNA functions in animal development and human disease. Development. 132, 4653-4662 (2005).
  3. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  4. Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell. Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478 (2010).
  5. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes. Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).
  6. Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes. Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).
  7. Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development. Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).
  8. Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA profiling in ovarian cancer. Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).
  9. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).
  10. Mattie, M. D., et al. Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies. Mol Cancer. 5, 24 (2006).
  11. Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects. BMC Res Notes. 2, 89 (2009).
  12. Zhu, H. T., et al. Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients. Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).
  13. Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases. Clin Endocrinol (Oxf). (2014).
  14. Liu, R., et al. Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer. Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).
  15. Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PLoS One. 3, e3148 (2008).
  16. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3. Dev Biol. 311, 603-612 (2007).
  17. Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR. J Am Heart Assoc. 3, e000792 (2014).
  18. Wu, C., et al. Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma. PLoS One. 9, e92292 (2014).
  19. McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media. J Vis Exp. e50294 (2013).
  20. Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
  21. Genda, Y., et al. microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study. Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).
  22. Wang, B., et al. Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array. PLoS One. 6, e17167 (2011).
  23. Cuk, K., et al. Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer. Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).
  24. Morrison, T., et al. Nanoliter high throughput quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 34, e123 (2006).
  25. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16, 991-1006 (2010).
  26. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50, 244-249 (2010).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
  28. Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44, 31-38 (2008).
  29. Kodani, M., et al. Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens. J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).
  30. Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta,, V, M., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Exp Diabetes Res. 2012, 168368 (2012).
  31. TPF & SPF File Download Options [Internet]. Available from: http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html (2014).
  32. Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).
  33. Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).
Probe-baserade Real-time PCR Approaches för kvantitativ mätning av mikroRNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J. Vis. Exp. (98), e52586, doi:10.3791/52586 (2015).More

Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J. Vis. Exp. (98), e52586, doi:10.3791/52586 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter