Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Probe-baseret real-time PCR metoder til kvantitativ måling af microRNA

doi: 10.3791/52586 Published: April 14, 2015

Summary

Cirkulerende microRNA har for nylig vist sig som lovende og nye biomarkører for forskellige kræftformer og andre sygdomme. Målet med denne artikel er at diskutere tre forskellige probe-baseret real-time PCR-platforme og metoder, der er til rådighed til at kvantificere og bestemme den overflod af cirkulerende microRNA.

Abstract

Probe-baserede kvantitativ PCR (qPCR) er en foretrukne metode til måling af transkript overflod, da det er en af ​​de mest følsomme metoder til påvisning, der tilvejebringer en nøjagtig og reproducerbar analyse. Probe-baserede kemi giver mindst baggrundsfluorescens sammenlignet med andre (farvestof-baserede) kemier. I øjeblikket er der flere platforme til rådighed, at brugen probe-baseret kemi til kvantificering transkript overflod. qPCR i en 96-brønds plade er den mest rutinemæssigt anvendte metode, dog kun maksimalt 96 prøver eller miRNA kan afprøves i en enkelt kørsel. Dette er tidskrævende og trættende, hvis et stort antal prøver / miRNA skal analyseres. High-throughput probe-baserede platforme, såsom mikrofluidik (f.eks TaqMan Array kort) og nanofluidics arrays (f.eks OpenArray) ved let til reproducerbart og effektivt detektere overflod af flere microRNA i et stort antal prøver på kort tid. Her viser vi forsøgsopstillingen ennd protokol for miRNA kvantificering af serum eller plasma-EDTA prøver ved hjælp af probe-baseret kemi og tre forskellige platforme (plade med 96 brønde, mikrofluidik og nanofluidics arrays) tilbyder stigende niveauer af gennemløb.

Introduction

MikroRNA'er (miRNA) er ~ 22 nukleotid ikke-kodende (NC) RNA'er, der fungerer som regulatorer af genekspression 1-3. De fleste miRNA i dyr fungerer gennem sekvensspecifik baseparring med et mRNA, der er målrettet 3'UTR, hvilket fører til negativ regulering af genekspression 2-4. Dette sker normalt via hæmning af mRNA translation eller ved ribosomal drop-off. miRNA i omløb har vist sig at være hidtil ukendte biomarkører i forskning og kliniske områder for en række sygdomme, såsom diabetes 5-7, ovarie- 8, prostata 9 og brystkræft 10,11, hepatitis B 12 og andre autoimmune sygdomme 13. Forskning er blevet udført for at identificere rigelige miRNA i forskellige celler eller væv, såvel som i omløb fra humant plasma og serum prøver, som er mere tilgængelig og mindre invasive 9,11-15.

Forskellige metoder til miRNA kvantificering har været eblev oprettet ved hjælp af flere platforme, såsom standard 96 brønde platform 4,12,16-18, den mikrofluidik kort platform 12,18-23 og nanofluidics matrix platform 17,24. Kvantitativ real-time PCR (qPCR) giver mulighed for at måle relative eller absolutte antal af udskrifter ved hjælp af flere (farvestofbaseret eller probe-baseret) kemier. Probe-baserede real-time PCR kemi tilbyder fordelen ved lav baggrund fluorescens og høj følsomhed til at detektere en enkelt udskrift. Den er forholdsvis omkostningseffektive, enkel at bruge og meget reproducerbar, hvilket gør det et yndet metode til at kvantificere og bestemme miRNA udtryk 25. Probe-baserede qPCR metode generelt indebærer to trin: revers transkription (RT) og qPCR 4,26,27. RT er hvor hårnåle-RT-primeren hybridiseres til en moden eller primær miRNA molekyle og omdannes til komplementære (c) DNA. Kvantificering af cDNA-produktet udføres derefter ved hjælp af miRNA-specifikke PCR-primere26-28. Princippet om probe-baseret qPCR er baseret på påvisning af komplementære streng forlængelse i realtid, der involverer hydrolyse af fluorescens-mærkede probe. Disse prober er designet til at indeholde en fluorescerende reporter og quencher, der er lige fra hinanden for at tillade FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Påvisning af emissionen fra fluorescens reporter (emitter) er maskeret af den tætte nærhed af quencher molekylet. Når Taq-polymerase (pol) strækker sig fra den opstrøms primer og når en gaffel (5 'enden af ​​sonden), Taq pol exonukleaseaktivitet hydrolyserer probe, hvilket fører til en fysisk dissociation / adskillelse af fluorescerende emitter fra quencheren. Denne udgave af et enkelt molekyle fluorescens emitter registreres af detektoren og præsenteres som en trinvis forhøjelse i fluorescens signal fra det godt / reaktion. Stigningen i fluorescens er proportional med mængden af ​​PCR-produkt genereret, så en nøjagtig quantification af det amplificerede mål 26,28.

Med stigende efterspørgsel i miRNA kvantificering, har medium til avanceret teknologi er udviklet til at give et større antal prøver, der skal behandles i et kort stykke tid. TaqMan Low Density Array (TLDA) er en medium-throughput innovativt microfluidic design baseret på probe-baserede qPCR kemi tilbyder en stigning i antallet af miRNA analyseret på én plade. TLDA involverer anvendelsen af ​​en foruddefineret pulje af RT-primere, der anvendes til at syntetisere cDNA. Disse cDNA'er derefter spindes til en tilpasset 384 godt mikro-strømningsteknisk kort til at bestemme ekspressionen af flere miRNA hjælp qPCR 22,26,29. Hver brønd af kortet indeholder tørrede primere og prober til amplifikation specifik miRNA (r), derfor op til 384 reaktioner kan behandles i én TLDA kort 26.

Den nanofluidics array er en high-throughput platform, der anvendes til påvisning af gentranskripter 24. Denne artikel fokuserer på at demonstrere, hvordan disse metoder til kvantificering miRNA i serum / plasma udføres og de kritiske faktorer, der skal overvejes, når du udfører og fortolke sådanne data. Taget til konto, vil deres individuelle fordele og begrænsninger diskuteres i denne artikel.

Protocol

Total RNA kan isoleres fra serum ved hjælp af en protokol etableret i vores laboratorium 30 eller ved hjælp af andre kommercielt tilgængelige kits.

BEMÆRK: Supplerende interaktive regneark til beregning af reaktionsvolumener i hvert forsøg (med overskydende volumen 5% udgjorde pipettering inkluderet) er forudsat.

1. Probe-baseret real-time qPCR hjælp af en standard 96 brønde Platform

  1. cDNA-syntese (revers transkription) på serum / plasma RNA-prøver til miRNA
    1. Beregn og tage ud 10 ng af RNA for hver cDNA syntese reaktion. Tilføj nuclease-frit vand til at bringe det endelige volumen af ​​10 ng RNA til 1,67 pi (for 5 pi reaktion). Hold prøver på is.
    2. Vælg miRNA og tø deres RT-primere.
    3. Optø RT reagensblanding komponenter: RT Buffer (10X), dNTP'er (100 mM), RNase Inhibitor (20 U / ul). Opbevar aldrig sted enzym (rekombinant Moloney murin leukæmivirus(RMoMuLV)) (recombinanat Moloney murin leukæmivirus (rMoMuLV) revers transkriptase (50 U / ul) på is. Opbevar den ved -20 ° C indtil brug eller i en fryser blok.
    4. Forbered RT reagensblanding på is som beskrevet i tabel 1A. Det anbefales at forberede mindst 5% overskydende mængde for at kompensere for pipetteringsfejl.
    5. Tilføj 2.33 pi RT reagensblanding hver i et 0,2 ml PCR-rør / plade.
    6. Vortex RT primer rør til at blande, så centrifugeres kortvarigt ved 10.000 xg i 10 sek. Tilsæt 1 pi af miRNA specifikke RT primer til deres respektive PCR-rør eller plade. Tilføj 1.67 pi fortyndet RNA til deres respektive PCR-rør eller brønde i pladen. Udfør alle tilføjelser på is.
    7. Centrifugeres reaktionsrøret eller plade ved 1.950 xg i 5 min ved 4 ° C.
    8. Opsætning af miRNA cDNA syntese program på den termiske variator med følgende indstilling betingelser: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 min, 85 °C i 5 min og 4 ° C på hold.
    9. Indstil reaktionsvolumen til 10 pi. Læg reaktionsrørene eller plade i termiske cykler. Start RT løb. Opbevar cDNA (RT) reaktioner ved -20 ° C, hvis real time PCR amplifikation ikke umiddelbart fortsatte.
  2. Probe-baseret real time qPCR til detektering af modne miRNA
    1. Optø valgte probe-baserede qPCR assays (20X) for den pågældende RT produktet.
    2. Bland lovligheden eneste løsning af real-time PCR (qPCR reagens mix) ved omrystning af flasken.
    3. Forbered qPCR reagens mix for hver miRNA, der skal analyseres. Til fremstilling af qPCR opnå en steril 1,5 ml mikrocentrifugerør for hver miRNA prøve og tilføje komponenterne i hvert rør som beskrevet i tabel 1B. Det anbefales at forberede mindst 5% overskydende mængde for at kompensere for pipetteringsfejl.
    4. Tilføj 4.2 pi af respektive qPCR reagensblanding til hver brønd af en optisk plade med 96 brønde (eller rør). Tilføj 0,8 piaf respektive cDNA reaktion (syntetiseret i trin 1.1 for hver miRNA) til respektive godt.
    5. Forsegle skiltet med passende optisk dækning. Centrifugeres pladen (eller rør) ved 1.950 xg i 5 min ved 4 ° C
    6. Tænd for computeren, plade med 96 brønde / mikrofluidik vifte læser og til sidst starte softwaren. Sørg for, at maskinerne er tilsluttet korrekt og korrekt blok og opvarmet låg (for hurtig plade med 96 brønde) er på plads.
    7. Vælg eksperiment som 96 brønde hurtig blok (0,1 ml), standardkurve, TaqMan reagenser og hurtigt mode. Opsætning qPCR på Real Time PCR-system under anvendelse af følgende program cykling betingelser: 95 ° C i 20 sek, 50 cykler (95 ° C i 1 sek, 60 ° C i 30 sek).
    8. Indstil reaktionsvolumen til 10 pi. Læg reaktionsrøret eller plade i instrumentet. Tryk på "Start run". Programmet tager ca. 1 time at fuldføre.

2. Probe-baserede Microfluidics Array Card (Card A og B)

BEMÆRK: Probe-baserede miRNA panel kommer som et sæt af to 384-godt mikrofluide kort (Array kort A og Array kort B). Hvert kort indeholder tørrede Primere og prober til op til 380 miRNA og kontroller. cDNA-produktet (med eller uden præ-amplifikation) specifikke for kort A eller kort B er lagt på respektive array til real time PCR.

  1. Revers transskription (RT)
    1. Brug denne protokol for en total RNA input 1-1000 ng. Hvis indgangen er mellem 1-350 ng, udføre en pre-forstærkning (forforstærker) trin. For input over 350 ng, indlæse cDNA direkte på array-kort uden forforstærker.
      BEMÆRK: serum miRNA profilering, start med 100 ng af total RNA. For en komplet miRNA profil, køre to på forhånd definerede pools af RT-primer sæt RT reaktioner (Pulje A og Pulje B) pr prøve.
    2. Optø følgende reagenser på is. RT primere (10x): Pulje A og Pulje B, dNTP'er med dTTP (100 mm), RT Buffer (10x), MgCl2 (25 mM), RNase Inhibitor (20 U / &# 181; l). Må ikke holde enzymet (rekombinant Moloney murin leukæmivirus (rMoMuLV)) revers transkriptase (50 U / ul) på is. Opbevar den ved -20 ° C indtil brug.
    3. Forsigtigt vortex alle reagenser, undtagen enzymet, og derefter kortvarigt centrifugeres rørene ved 10.000 xg i 10 sek.
    4. Kombiner reagenser, som beskrevet i tabel 2A, i to rør; et rør til Pool A, den anden til Pool B. Hvert rør indeholder kun en foruddefineret pulje af RT primer sæt, enten fra Pool A eller fra Pool B. Det anbefales at forberede mindst 5% overskydende mængde for at kompensere for pipetteringsfejl .
    5. Vend for at blande, og derefter centrifugeres kortvarigt ved 10.000 xg i 10 sek. Alikvot 100 ng af hver RNA-prøve i et nyt rør, hvorefter der tilsættes en passende mængde af nuclease-frit vand til at gøre i alt 3 pi.
    6. Alikvot 4,5 pi af den passende RT reagensblanding ind i respektive rør. Vend for at blande, og tryk derefter kortvarigt centrifugeres ved 10.000 xg i 10 sek. Inkuber på isfor 5 min.
    7. Anbring prøverne i en thermocycler og starte RT anvendelse af følgende betingelser: 40 cyklusser (16 ° C i 2 min, 42 ° C i 1 min, 50 ° C i 1 sek), 85 ° C i 5 minutter, hold ved 4 ° C. Store cDNA genereret ved hjælp af disse foruddefinerede pulje af RT-primere ved -15 til -25 ° C eller anvendes straks.
  2. Pre-amplifikation
    1. Optø den foruddefinerede pulje af forforstærker primere på is. Forsigtigt vortex primere, og tryk derefter kortvarigt centrifugeres dem ved 10.000 xg i 10 sek. Swirl TaqMan PREAMP reagens mix (2X) ved en let banken, for at blande.
    2. Kombiner reagenser, som beskrevet i tabel 2B i to rør; ene den anden for Pool B. rør til Pool A,
      BEMÆRK: Som beskrevet ovenfor vil Pool En forforstærker primere gå til rør A og Pulje B primere skal gå til rør B. Det anbefales at forberede mindst 5% overskydende mængde for at kompensere for pipetteringsfejl.
    3. Vend for at blande, og tryk derefter kortvarigt centrifugeres ved 10.000 xg i 10 sek.Alikvot 22,5 pi af passende forforstærker reagens mix i nye rør. Alikvot 2,5 pi cDNA prøve (fremstillet i RT trin) i det respektive rør.
    4. Vend for at blande, og tryk derefter kortvarigt centrifugeres ved 10.000 xg i 10 sek. Inkuber på is i 5 minutter. Anbring prøverne i en thermocycler og start pre-amp cyklus. Cycling betingelser: 95 ° C i 10 min, 55 ° C i 2 min, 72 ° C i 2 min, 12 cyklusser (95 ° C i 15 sek, 60 ° C i 4 min), 99,9 ° C i 10 min, hold ved 4 ° C.
    5. Inverter pre-forstærket cDNA at blande, og derefter kortvarigt centrifugeres ved 10.000 xg i 10 sek. Tilføj 75 pi 0,1X TE-buffer (pH 8,0) til at pre-amplificeret cDNA (1: 4 fortynding). Vend fortyndede forforstærker prøver at blande, og tryk derefter kortvarigt centrifugeres ved 10.000 xg i 10 sek. Store fortyndet pre-amplificeret cDNA ved -15 til -25 ° C i op til en uge eller anvendes straks.
  3. Henter mikrostrømning kort og udføre qPCR
    1. Hold mikrofluidikmiRNA-kort uden for mindst en halv time for at nå stuetemperatur. Optø fortyndet forhånd forstærket cDNA på is og bland ved at vende rørene efterfulgt af kort spin. Bland qPCR reagens mix ved omrystning af flasken.
    2. I nye rør tilsættes 450 pi qPCR reagensblanding til 9 pi fortyndet pre-amplificeret cDNA. For kort A, anvender pre-amplificeret produkt fremstillet ved anvendelse af primer Pool A. Tilføj 441 pi nukleasefrit vand op det endelige volumen til 900 pi. Vend røret for at blande, og tryk derefter kortvarigt centrifugeres ved 10.000 xg i 10 sek.
    3. Tag TLDA kortet ud af emballagen (når den når stuetemperatur) og læg den på et rent område med folie nedad. Tilsæt 100 pi PCR-reaktionsblandingen i hver af de 8 påfyldningsportene på kortet. Der er 2 porte på hver af reservoiret (8 reservoirer i alt på hvert kort).
      BEMÆRK: påfyldningsåbning er større hul, hvor der tilsættes reaktionsblandingen, mens udluftningsporten er mindre hul. Hver miRNA TLDA kort har 8 reservoirs, hver førende til 48 brønde (24 brønde i en kolonne x 2 kolonner), således loading alle 384 brønde i kortet med samme PCR-reaktionsblandingen. Sørg for, at Pool A og Pulje B af hver prøve er læsset på respektive TLDA kort. Placer array kort i de specialiserede mikrofluidik array-card holder spande i centrifugen.
    4. For mikrostrømning array-kort, skal du bruge en egnet centrifuge (såsom Heraeus Multifuge 3SR, 230V centrifuge) og specifikke spande (såsom indehavere "TaqMan Array Card"). Hver spand kan indeholde op til 3 kort (indlæst / tom). Sørg altid for, at alle 3 pladser i en spand er besat, og spanden afbalanceres ved at placere tilsvarende spand (denne spand bør også indeholde 3 kort, enten tomme eller fulde) i den modsatte slot af centrifugen. Mens placere kort i spanden holderen, skal du sørge for, at de 8 reservoirer rager opad og reaktionsbrønde står ydervæg centrifuge.
      1. Spin kortene ved 331 xg i 1 min ved stuetemperatur. Efterførste tur, skal du åbne centrifugen og visuelt sikre reaktionsblandingen er blevet afgivet gennem 384 boringer. Gentag centrifugering ved samme indstillinger for 1 mere tid. Fjern kortet fra spanden og sikre, at niveauet for reaktionsblandingen i hver af de 8 reservoirer er ensartet. Eventuelle uoverensstemmelser i de væskevolumener tilbage i reservoirerne gøre kortet uhensigtsmæssigt at bruge yderligere.
    5. Microfluidics array-kort skal en specialiseret sealer, der har en nøjagtighed stylus samling (transport) at forsegle fluid distributionskanaler arrayet og lige fordele reaktionsblandingen i alle brønde (totalt reaktionsvolumen 1 pl / brønd).
    6. Bring vognen til startpositionen og indsæt indlæst kortet i sealer med folie opad og linet op til pennen ben på sealer. I et langsomt, roligt og enkelt ensartet slag, skub vognen hen over kortet indtil den når slutpunktet af sealer. Tag den forseglede vifte kortet og derefter afbrød reservoirs fra kortet ved hjælp af en saks.
    7. Kontroller, at den korrekte blok, opvarmet låg og prøve bærer er installeret i mikrofluidik matrix real time PCR system / maskine.
    8. Tænd for computeren, så mikrofluidik matrix-systemet og til sidst starte softwaren. Sørg for, at maskinerne er korrekt tilsluttet. Vælg eksperiment som matrix-kort, standardkurve, TaqMan reagenser og standard mode. Importer setup filer til enten af ​​kortet A og kort B. Gem filen.
    9. Placer forseglet i instrumentbakken med godt A1 i øverste venstre hjørne og stregkode mod forsiden af ​​instrumentet. Tryk på "Start Kør". Programmet vil tage ca. 2 timer at fuldføre.

3. Probe-baserede Nanofluidics menneskelige miRNA Panel

  1. Revers transskription (RT)
    1. Brug denne protokol for en total RNA input på 50-200 ng dog 100 ng er optimal for de fleste prøver. For en komplet miRNA profil, køre to predefidefinerede pools af RT-primer sæt RT reaktioner (Pulje A og Pulje B) pr prøve.
    2. Optø reagenserne på is: foruddefineret pulje af RT primersæt (10x), dNTP'er med dTTP (100 mM), RT puffer (10x), MgCl2 (25 mM), RNase Inhibitor (20 U / ul). Må ikke holde enzymet (rekombinant Moloney murin leukæmivirus (rMoMuLV) revers transkriptase (50 U / ul) på is. Opbevar den ved -20 ° C indtil brug. Forsigtigt vortex alle reagenser, undtagen enzymet, og kortvarigt centrifugeres dem ved 10.000 xg i 10 sek.
    3. Kombiner reagenser, som beskrevet i tabel 3A, i to rør; et rør til Pool A, den anden til Pool B. Hvert rør indeholder kun en foruddefineret pulje af RT-primer sæt, enten fra Pool A eller fra Pool B. Det anbefales at forberede mindst 5% overskydende mængde for at kompensere for pipettering fejl.
    4. Pipette at blande og derefter centrifugeres kortvarigt ved 10.000 xg i 10 sek. Alikvot 100 ng af hver RNA-prøve i et nyt rør, tilsæt derefter en passende mængdeaf nuclease-frit vand til at gøre i alt 3 pi. Alikvot 4,5 pi af den passende RT reagensblanding i det respektive rør.
    5. Vend for at blande, og tryk derefter kortvarigt centrifugeres ved 10.000 xg i 10 sek. Inkuber på is i 5 min. Anbring prøverne i en thermocycler og start RT-programmet. Cycling betingelser: 40 cyklusser (16 ° C i 2 min, 42 ° C i 1 min, 50 ° C i 1 sek), 85 ° C i 5 minutter, hold ved 4 ° C. Store cDNA genereret ved anvendelse af disse foruddefinerede pulje af RT-primersæt ved -15 til -25 ° C eller anvendes straks.
  2. Pre-amplifikation (forforstærker)
    1. Optø den foruddefinerede pulje af forforstærker primer sat på is. Forsigtigt vortex primere, derefter kortvarigt centrifugeres dem ved 10.000 xg i 10 sek. Swirl TaqMan PREAMP reagens mix (2X) at blande.
    2. Kombiner reagenser, som beskrevet i tabel 3B, i to rør; et rør til Pool A, den anden til Pool B. Hvert rør indeholder kun en foruddefineret pulje af RT-primersæt, enten frfra Pool B. Det anbefales about Pool A eller til at forberede mindst 5% overskydende mængde for at kompensere for pipetteringsfejl.
    3. Pipette at blande, og derefter kortvarigt centrifugeres dem ved 10.000 xg i 10 sek. Alikvot 22,5 pi af passende forforstærker reagens mix i nye rør. Alikvot 2,5 pi cDNA prøve i de respektive rør. Vend for at blande, og tryk derefter kortvarigt centrifugeres rørene ved 10.000 xg i 10 sek. Inkuber på is i 5 min.
    4. Anbring prøverne i en thermocycler og køre pre-amp. Indstil reaktionsvolumen til 25 pi. Cycling betingelser: 95 ° C i 10 min, 55 ° C i 2 min, 72 ° C i 2 min, 12 cyklusser (95 ° C i 15 sek, 60 ° C i 4 min), 99,9 ° C i 10 min, hold ved 4 ° C.
    5. Inverter pre-forstærket cDNA at blande, og derefter kortvarigt centrifugeres ved 10.000 xg i 10 sek. I nye rør tilsættes 4 pi af præ-amplificerede cDNA til 156 pi 0,1X TE-buffer pH 8,0 (1:40 fortynding). Vend fortyndede forforstærker prøver at mikse og derefter kortvarigt centrifuge ved 10.000 xg i 10 sek. Store fortyndet og ufortyndet på forhånd forstærket cDNA ved -15 til -25 ° C i op til en uge, eller brug med det samme.
  3. Loading Nanofluidics Arrays og Performing qPCR
    1. Hent den relevante plade fil (.tpf) fra hjemmesiden 31 Brug af nanofluidics vifte slide serienummer. Dette indeholder oplysninger om den specifikke nanofluidics vifte slide løb.
    2. Thaw fortyndet på forhånd forstærket cDNA og TaqMan Real-Time qPCR reagens mix (hvis du bruger for første gang) på is. Bland qPCR reagens mix ved omrystning af flasken. I nye rør tilføje 22,5 pi qPCR reagensblanding til 22,5 pi fortyndet pre-amplificeret cDNA. Forsigtigt vortex at blande, og tryk derefter kortvarigt centrifugeres ved 10.000 xg i 10 sek.
    3. Alikvot 5 pi af hver prøve i 8 brønde (2 kolonner, 4 rækker) af arrayet nanofluidics workflow 384 brønde prøveplade. Sørg for, at Pool A og Pulje B af hver prøve er i tilstødende 8 brønde blokke (se Figure 1 eller supplerende excel ark til layout).
      1. Hver prøve plade kan indeholde op til otte dias værd af prøver. Imidlertid kan systemet til nanofluidics matrix kun behandle 4 nanofluidics arrays i en enkelt kørsel. Hvis mere end fire dias værd af prøverne skal læsses på en prøve plade, skal du sikre de resterende afsnit er forseglet. Seal med OpenArray prøve pladeforsegler.
        BEMÆRK: Det er tilrådeligt at pre-skære sealer til de foreskrevne sektioner, så afsnittene kan forsegles / tætnet individuelt for at reducere fordampning. Alternativt kan pladen forsegles med en intakt sealer, og derefter sektioner kan klippe individuelt ud ved ilægning.
    4. Centrifuge plade ved 490 xg i 1 min ved 4 ° C. Læg nanofluidics Array glider inden for 1 time. På grund af den begrænsede tid lov til at forsegle dias, skal du kun lægge ét dias ad gangen. Fjern nanofluidics vifte dias fra fryseren og lad den komme til stuetemperaturratur (~ 15 min).
    5. Sørg for, at den korrekte blok, opvarmet låg og prøve luftfartsselskab er installeret i nanofluidics matrix-systemet. Tænd for computeren, og real-time PCR-system og lastning system. Gå til respektive software og sikre, at maskinerne er forbundet. Fjern lastning systemet forbrugsstoffer (Array slide låg, plug og fordybelse væske) fra emballagen.
    6. Træk forsigtigt på stemplet af fordybelse væske sprøjte det at løsne. Fjern hætten, placere tip om og flush luft fra spidsen. Placer lastning systemet tip i maskinen og fjern låget. Anbring prøveplade i PCR-system.
    7. Sæt handsker på. Sikre, at de tætsluttende at minimere risikoen for uheld markerer skydelåget. Åbn forsigtigt slide emballage. Langsomt tip dias i hånden. Rør ikke ved toppen af ​​dias.
    8. Placer glide ind i PCR-system, med stregkode til venstre. Fjern sealer fra den del af prøven plade beregnet til læsning. Brug læssesystemsoftware til at komme ind i dias stregkode skubbe position, prøve position og drikkepenge konfiguration.
    9. Når alle relevante kontroller er afsluttet, skal du trykke på load dias. Mens PCR-system indlæser slide, fjerne den klare og rød plastik fra bunden af ​​slæden låget. Når du er færdig lastning, fjern forsigtigt og forsegle dias inden 90 sek.
      1. Placér i pladen klemme. Placer slide låg på objektglasset. Clamp i 30 sek. Sørg låget er placeret, så stregkoden vises korrekt. Fjern samlingen fra pladen klemme.
      2. Position fordybelse væske sprøjte i dias, så spidsen presser mod låget. Fyld langsomt slide med fordybelse væske, sikrer væsken løber langs låget. Når fuld, forsegle dias med stikket, dreje skruen, indtil håndtaget knækker.
      3. Fjern plastik dæksel på toppen af ​​dias låg, og derefter forsigtigt placere på slide bærer af real-time PCR-system. Sørg support på bunden af ​​slæden, da det er ved at blive sænket, så den ikke falder pludseligt, og rør ikke ved toppen af ​​dias. Det er OK at røre siderne af dias / cassette.Initialize PCR-systemet og starte programmet for qPCR inden for 1 time.
    10. Vælg "OpenArray" i PCR-systemsoftware. Tryk på "Find Slide id'er". Det vil tage et par minutter. Hvis softwaren ikke kan finde pladen ID, vil det bede om det skal indtastes manuelt.
    11. Tryk på "Bekræft Plate Centres". Igen vil det tage et par minutter. Kontroller, at den røde prik er i centrum, og at der ikke er fingeraftryk / mærker på toppen af ​​dias. Læg den respektive .tpf fil for hver dias og angive et resultat filnavn og placering. Tryk på "Start Kør". Programmet vil tage ca. 2 timer at fuldføre.

Representative Results

Den anbefalede mængde for en miRNA probe-baseret assay qPCR reaktion er 20 pi. BEMÆRK: Vi har bekræftet, at en reaktion volumen på 5 pi er i stand til at producere resultater, der ligner dem, der opnås ved anvendelse af 20 pi volumen 4,7,30. Sænkning af reaktionen volumen til 5 pi giver mulighed for en reduktion på 75% i reagensomkostninger uden væsentligt tab i følsomhed. Som vist i figur 2, reaktionsprodukter volumener 20 pi og 5 pi viser en stærk co-relation indtil 39 cykler (med R 2 på 0,92, p = 0,0002).

Microfluidics matrix giver et værktøj til at skaffe oplysninger om 754 miRNA udtrykt i en prøve i omkring 5 timer (for kort A og Card B), hvilket er en mere effektiv måde at analysere flere prøver sammenlignet med konventionelle plade med 96 brønde PCR'er. Vi sammenlignet miRNA mikrofluidik array-kort til den samme prøve (prøve A og prøve en gentagelse) Figur 3A -. B viser et Bland-Altman plot (<strong> 3A) og korrelationskurve (3B) for alle 754 testet for disse prøver miRNA. Der er 3 forskellige kontrol miRNA (U6, RNU44 og RNU48) placeret tilfældigt på både kort (Card A og B) i flere steder. Når der sammenlignes (CT) værdier U6 cyklus tærskel mellem de 2 kørsler, vi ikke observere signifikante forskelle mellem værdierne (tabel 4). Det er også vigtigt at bemærke her, at U6 udtrykkes større overflod (lavere Ct-værdi) i prøven vurderes. Vi derefter sammenlignet alle miRNA, der har Ct-værdier mellem 0 til 19,99 i begge kørsler (n = 150), som havde lignende udtryk for miRNA samlet med en koefficient på bestemmelse af 98% (figur 3C-D). Af alle de 277 miRNA, der har Ct-værdier mellem 20 og 29.99 i begge kørsler, 16 Mirs afveg betydeligt mellem de oprindelige og gentagne kørsler (figur 3E - F) Antallet af miRNA med signifikant forskel betwee.n kører forøget (89 af 327), da der blev udvalgt Ct-værdier mellem 30-40 for begge kørsler (figur 3G - H).

Den nanofluidics vifte platform giver data for 754 miRNA fra hver serum / plasma prøve testet, som er repræsenteret i figur 4A Det er vigtigt at undersøge disse forstærkning kurver -. Som det er med alle qPCR - at sikre, at resultatet er tegn på sand forstærkning. Hver af de 48 subarrays (figur 1) indeholder også et assay for de tre mest populære "husholdning" ncRNAer:. U6, RNU44 og RNU48 Figur 4B illustrerer en typisk gruppering af U6 replikerer fra en enkelt prøve. Disse gentagelser vise lav standardafvigelse (SD <0,5) og så er en indikator for pålidelighed. Alternativt Figur 4C viser øget variabilitet i U6 gentagelser (SD> 0,5) i en anden prøve. Det ophæver ikke gyldigheden of de resterende analyser, selv om det gør nødvendiggøre en mere grundig kritik. U6, som med de fleste "husholdning" miRNA i biologiske væsker, kan have en variabel ekspression. Det skal bemærkes, at en af de prøver, der er skitseret i figur 4C, viser 4-fold mindre U6 indhold end der præsenteres i figur 4B. Da graden af U6 i prøve præsenteres i 4C er 75% mindre til at begynde med end den vist i panel 4B, forventes større teknisk variabilitet på grund af Poisson fordeling af transkripter, som forværres af den lille reaktionsvolumen 17.

Et andet nyttigt værktøj er kvalitetskontrollen (QC) billeder, til rådighed til eksport, når kørslen er afsluttet. Et udvalg af disse anvender fluorescens ROX, den passive farvestof findes i qPCR reagensblanding, at bekræfte, at hver gennemgående hul er blevet indlæst (figur 5) korrekt. Et gennemgående hul, eller endog en en dæk undergrupperingen, indlæses muligvis ikke som følge af utilstrækkelig prøvemængde, fordampning, bobler til stede i brøndene i 384-godt prøve plade, manglende helt at fjerne prøven plade segl eller mangler i Accufill systemet eller dets tips. Enhver losses gennemgående huller skal identificeres for at undgå mærkning miRNA som "målbart", når de i virkeligheden analysen blev aldrig indlæst. Hvis problemet er stødt på, bekræfter, at mindst 5 pi prøve / mastermiksens indlæses i hver brønd i 384-godt prøve plade prøven pladen centrifugeret ordentligt før pålæsning, folieforseglingen er helt fjernet, og den belastede OpenArray slide er forseglet og køre inden for den tildelte tid for alle på hinanden følgende kørsler. Bør søges gennem producenten, hvis lastning problemer der stadig er, disse kan være mere tilbøjelige vedrørende specifikke partiet af arrays eller relaterede forbrugsvarer og yderligere assistance.

"Src =" / files / ftp_upload / 52586 / 52586fig1.jpg "/>
Figur 1: Layout af prøver til den Nanofluidics Array arbejdsgang: (A) Hver 384-godt prøve plade kan rumme op til 8 nanofluidics arrays. (B) fortyndet, der på forhånd forstærket cDNA anbragt i 8 brønde (2 kolonner ved 4 p), med pool A og Pulje B i tilstødende 8 brønde grupper. Hver cirkel repræsenterer en brønd. (C) Hver brønd af prøven plade vil blive indlæst i en undergruppering af nanofluidics array. Hver lille firkant repræsenterer en undergrupperingen.

Figur 2
Figur 2: Co-forhold analyse for konventionelle 96-brønds PCR-platforme: Co-forhold mellem 20 pi og 5 pi reaktionsvolumener på TaqMan Real-time qPCR hjælp af en standard 96-brønds plade platform i CT-værdier (39 cykler). Vi sammenlignede 4 forskellige microRNA (miR-375, miR-30c, miR-30d og miR-7) i 4 forskellige humane serum- og plasmaprøver. Kun 11 datapunkter plottes da de andre var målbart. R 2 = 0,92, p = 0,0002.

Figur 3
. Figur 3: Cirkulerende miRNA profilering ved hjælp mikrofluidik array-kort Brug 2 mikrostrømning kort (kort-A og kort-B), er en profil af 754 miRNA genereret (A - B). Som vist her, vi brugte samme prøve i 2 mikrofluidik vifte løber at tjekke reproducerbarhed af resultaterne microfluidics kort. Vi observerede et lignende udtryk for miRNA samlet, med Ct-værdier mellem 0 til 19,99 (C - D). Der er få miRNA (16 af 277) med Ct-værdier mellem 20-29,99 og betydelige forskelle mellem gentagne kørsler (E - F). Firs ni af 327microRNA med højere Ct-værdier (30-40) udviste signifikante forskelle mellem de to kørsler (G - H).   Data analyseres ved hjælp af parret t-test. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4
Figur 4: repræsentativ profil af PCR-produkt Amplification Curves: er et repræsentativt tal af de kombinerede (A) amplifikationsprodukter kurver alle miRNA mål for en human plasmaprøve. Et assay for U6 (en fælles kontrol ncRNA) er placeret i hver undergrupperingen. Prøven i (B) viser lav variation (SD <0,5), medens (C) viser høj standardafvigelse (SD> 0,5) i U6 replikater. Begge prøver er Total RNA isoleret fra humant plasma. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5
Figur 5: QC Analyse af Nanofluidics Arrays: Kvalitetskontrol (QC) billeder af en korrekt indlæst nanofluidics array (til venstre) og en forkert læsset nanofluidics array (til højre). Den passive farvestof, ROX (til stede i qPCR reagenset mix), fluorescerer at angive en korrekt indlæst gennemgående hul. Rækken til højre har flere subarrays / gennemgående huller, som ikke er fyldt med det qPCR reagenset mix og disse bør identificeres som falsk negative PCR-reaktioner.

Komponenter Volumen pr 5 pi reaktion (pi) RT puffer (10x) 0,5
dNTP'er (100 mM) 0.05
RNase inhibitor 0,6
Nuclease-frit vand 1.39
Revers transkriptase 0,33
Samlet 2.33

Tabel 1A: Rt reagensblanding komponenter i en 5 pi RT-reaktionen forberedelse til TaqMan Real-time qPCR hjælp af en standard 96-brønds plade platform.

Komponenter Volumen pr 5 pi reaktion (pi) Volumen pr 20 pi reaktion (pi)
Fast PCR mastermiksens (2x) 2.5 10
TaqMan qPCR assay (20x) * 0.25 1
Nuclease-freevand 1.45 5.8
Total Volume: 4.2 16.8

* Assaykomponent baseret på afprøvet den valgte miRNA.

Tabel 1B: qPCR reagensblanding komponenter i en 5 eller 20 pi qPCR reaktion forberedelse til TaqMan Real-time qPCR hjælp af en standard 96-brønds plade platform.

Komponenter Volumen pr reaktion (pi)
Megaplex RT primere (10x) 0,8
dNTP'er med dTTP (100 mM) 0.2
Multiscribe revers transkriptase (50 U / pl) 1.5
10X RT Buffer 0,8
MgCl2 (25 mM) 0,9
RNase Inhibitor & # 160; (20 U / pl) 0.1
Nuclease-frit vand 0.2
Total 4,5

Tabel 2a: RT reagensblanding komponenter i en 5 pi RT-reaktionen forberedelse til TLDA miRNA panel.

Komponenter Volumen pr reaktion (pi)
TaqMan Preamp Mastermix (2x) 12.5
Megaplex Preamp primere (10x) 2.5
Nuclease-frit vand 7.5
Total 22.5

Tabel 2B: preamp reagens mix komponenter i en 25 pi præ-amplifikation forberedelse reaktion til TLDA miRNA panel.

"Cellspacing =" 0 "> Komponenter Volumen pr reaktion (pi) Megaplex RT primere (10x) 0,75 dNTP'er med dTTP (100 mM) 0,15 Multiscribe revers transkriptase (50 U / pl) 1.5 10X RT Buffer 0,75 MgCl2 (25 mM) 0,9 RNase Inhibitor (20 U / pl) 0,09 Nuclease-frit vand 0,35 Total 4,5

Tabel 3A: Rt reagensblanding komponenter i en 5 pi RT-reaktionen forberedelse til probe-baserede nanofluidics miRNA panel.

Komponents Volumen pr reaktion (pi)
TaqMan Preamp Mastermix (2x) 12.5
Megaplex Preamp primere (10x) 2.5
Nuclease-frit vand 7.5
Total 22.5

Tabel 3B:. Preamp reagens mix komponenter i en 25 pi præ-amplifikation forberedelse reaktion til probe-baserede nanofluidics miRNA panel BEMÆRK: Den interaktive supplerende Excel-regneark, der er fastsat for de tre platforme, der allerede tegner sig for 5% tillæg til at kompensere for pipetteringsfejl.

Prøve A Prøve en gentagelse
15,535 16,156
15,471 15,652
15.623 16,063
15,963 15,889
14,006 13,993
14,502 14,623
14,907 14,384
13,732 14,946

Tabel 4: Cirkulerende miRNA U6 profilering hjælp mikrofluidik matrix kort. Anvendelse af to mikrofluidik array-kort (A og B). Ct-værdier for U6 kontrol miRNA fra prøve A (total = 8). Konsekvent U6 kontrol miRNA overflod observeret mellem kørsler.

Discussion

De kritiske skridt i probe-baseret qPCR protokoller til at opnå nøjagtige og reproducerbare resultater er for at sikre, 1) den samme mængde og koncentration af RT-produkt er lagt i hver qPCR reaktion, 2) de korrekte forhold og mængder af komponenterne er nødvendige for qPCR reaktion er forberedt og blandes godt, 3) korrekt og konsekvent volumener til hver qPCR reaktion, og 4) forberedelse og lastning af hver prøve og reaktion mix er afsluttet i kortest tid som muligt, mens du stadig opmærksomme på ovennævnte kritiske trin nævnt tidligere.

De mikrofluidik array-kort skal egnet centrifuge og specifikke spande. Hver spand kan indeholde op til 3 kort (indlæst / tom). Sørg altid for, at alle 3 pladser i en spand er besat, og spanden afbalanceres ved at placere tilsvarende spand (denne spand bør også indeholde 3 kort, enten tomme eller fulde) i den modsatte slot af centrifugen. Mens placere kort i Bucket holder, skal du sørge for, at de 8 reservoirer rager opad og reaktionsbrønde står ydervæg centrifuge. Spin kortene ved 331 xg i 1 min ved stuetemperatur. Efter første tur, skal du åbne centrifugen og visuelt sikre reaktionsblandingen er blevet afgivet gennem 384 boringer. Gentag centrifugering ved samme indstillinger for 1 mere tid. Fjern kortet fra spanden og sikre, at niveauet for reaktionsblandingen i hver af de 8 reservoirer er ensartet. Eventuelle uoverensstemmelser i de væskevolumener tilbage i reservoirerne gøre kortet uhensigtsmæssigt at bruge yderligere.

At have den samme koncentration af RT-produkt, samme input koncentration af RNA tilsat til hver RT-reaktionen. Den totale RNA-koncentrationen måles ved anvendelse af en mikro-volumespectrophotometer. Den observerede 260/280 Forholdet kan være så lav som 1,3 til RNA isoleret fra plasma / serum; dette synes ikke at have en effekt på nedstrøms qPCR-relaterede proces eller data genereret 30. Ligeledes 260/280 forholdetde testede heri RNA-prøver var mellem 1,3-1,7 med unormale effekter i qPCR observeret.

Ved anvendelse af lave RNA indhold prøver, såsom dem fra Biofluids, kan det være vanskeligt at kvantificere RNA før forarbejdning. Vi anbefaler brug af syntetisk spike-in på RNA-isolering samt revers transkription etaper. Det er vores erfaring, Arabidopsis thaliana miRNA kandidater (ATH-miR-159A og ATH-miR-172a) er foretrukket frem Caenorhabditis elegans miRNA (såsom cel-miR-39 eller cel-miR-54), som efter vores erfaring kan have højere homologi end dem fra A. thaliana. Anvendelsen af ​​sådanne trinspecifik spike-in kan redegøre for en normalisering af miRNA data på tværs af flere prøver analyseret på forskellige tidspunkter. Ved hjælp af en fast input volumen af RNA til cDNA-syntese reaktion anbefales også 32,33.

De tre probe-baserede protokoller for miRNA kvantificering beskrevet her kræver varierende mængderaf total RNA input forskellige arbejdsgange og omkostninger. Hver af de arbejdsgange er designet til at imødekomme forskellige gennemløb baseret på antallet af miRNA mål og antallet af prøver, der skal analyseres. Med stigende gennemløb (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), den pris pr reaktion falder med en stigning i mængden af ​​data, der er opnået i løbet af en tidsenhed. Da alle disse platforme benytter TaqMan kemi, kan kvaliteten af ​​data forventes at være ens. TaqMan qPCR er en veletableret metode til at identificere den overflod af miRNA i serum / plasma prøver 9,11,27. Selv om de tre platforme diskuteret her deler den samme kemi, et fald i reaktion volumen fører til et fald i dynamikområde transkript detektion (Farr RJ et al., Upublicerede data). Den 96-godt qPCR platform er en lavere overførselshastighed, men høj følsomhed platform og efter vores mening "gold standard" for alle sonde-baserede (eller farvestofbaseret) PCR-platforme. Men dette kanikke være den mest økonomiske eller effektiv platform, hvis flere hundrede eller tusindvis af prøver, der analyseres og for flere microRNA'er. Microfluidics (TLDA) og nanofluidics (OA) platforme er high-throughput / indholdsplatforme formål at muliggøre køb af større data på kortere tid. Selv om der er observeret batch forskelle i TLDA kort, kan dette blive minimeret ved at anmode TLDA kort fra det samme parti. Vi observerer, at TLDA platform (figur 3) viste betydelig variation i 17% af midten - lav hyppighed miRNA ved test under anvendelse af samme prøve på forskellige batches af TLDA kort. Vi anbefaler derfor, at bruge de samme batchnumre til analyse ved hjælp TLDA kort. Denne variation kan også skyldes den tekniske variation, herunder eventuelle lastning og pipetteringsfejl. Men vi anbefaler bestilling / anmodning om samme parti TLDA kort. Ingen signifikant batch variation blev observeret på OA platform. På trods af dette, TaqMan baseret eksperimenterendetal qPCR tilgange tilbyde lethed at måle overflod af miRNA i plasma / serumprøver. De lave, medium og høj tilgange diskuteres her tilbyde fleksibilitet til at analysere en række prøver og miRNA ved hjælp af en meget effektiv, reproducerbar og ren (lav baggrundsstøj) kemi.

Disclosures

Artikel behandling / publikationer var dækket af Life Technologies, efter accept af dette manuskript til offentliggørelse.

Acknowledgments

Alle forfattere anerkender infrastrukturen støtte fra NHMRC CTC, University of Sydney, Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), Australien og Rebecca Cooper Foundation, Australien. Denne forskning blev finansieret via tilskud fra forskningsrådet australske (FT110100254) og JDRF, Australien (CRN201314) til AAH WW, RJF og MVJ gennemført alle våde lab eksperimenter, ASJ gennemført dataanalyse. WW skrev det første udkast. AAH planlagde undersøgelsen og analyseres dataene. Alle forfattere læst og accepteret af den endelige udgave af de håndskrevne, tal og regneark indsendt til offentliggørelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well-platform
For Reverse transcription
TaqMan MicroRNA Assays INV SM  Applied Biosystems
 
4427975 https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975
The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems
 
4366597 or 4366596 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596
The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.
For qPCR run on a 96-well platform
2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG  Applied Biosystems
 
4367846 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846
The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on  the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml  Applied Biosystems 4346907 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product
Microfluidics platform (TLDA)
For Reverse transcription
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems
 
4399966 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966
The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 Applied Biosystems
 
4444281 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281
The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
OR OR
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 Applied Biosystems
 
4444750 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750
The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
For Pre-amplification
TaqMan PreAmp Master Mix Applied Biosystems
 
4391128 or 4488593 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593
The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0  Applied Biosystems
 
4444303 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303
The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems
 
4399233 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233
The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
1x TE Buffer (100 ml) Invitrogen 12090-015 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product
The 1x TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0  Applied Biosystems 4444913 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913
Nanofluidics platform (OpenArray)
For Reverse transcription
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).
For Pre-amplification
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)
To load and run the slides
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) Applied Biosystems
 
4470187 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit  Applied Biosystems
 
4469576 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576
OpenArray 384-well Sample Plates   Applied Biosystems
 
4406947 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix Applied Biosystems
 
4462159 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159
OpenArray AccuFill System Tips  Applied Biosystems
 
4457246 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246
Others
Nuclease-Free Water Qiagen 129117 http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 431, 350-355 (2004).
  2. Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. MicroRNA functions in animal development and human disease. Development. 132, 4653-4662 (2005).
  3. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  4. Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell. Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478 (2010).
  5. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes. Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).
  6. Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes. Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).
  7. Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development. Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).
  8. Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA profiling in ovarian cancer. Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).
  9. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).
  10. Mattie, M. D., et al. Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies. Mol Cancer. 5, 24 (2006).
  11. Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects. BMC Res Notes. 2, 89 (2009).
  12. Zhu, H. T., et al. Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients. Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).
  13. Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases. Clin Endocrinol (Oxf). (2014).
  14. Liu, R., et al. Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer. Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).
  15. Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PLoS One. 3, e3148 (2008).
  16. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3. Dev Biol. 311, 603-612 (2007).
  17. Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR. J Am Heart Assoc. 3, e000792 (2014).
  18. Wu, C., et al. Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma. PLoS One. 9, e92292 (2014).
  19. McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media. J Vis Exp. e50294 (2013).
  20. Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
  21. Genda, Y., et al. microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study. Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).
  22. Wang, B., et al. Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array. PLoS One. 6, e17167 (2011).
  23. Cuk, K., et al. Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer. Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).
  24. Morrison, T., et al. Nanoliter high throughput quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 34, e123 (2006).
  25. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16, 991-1006 (2010).
  26. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50, 244-249 (2010).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
  28. Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44, 31-38 (2008).
  29. Kodani, M., et al. Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens. J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).
  30. Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta,, V, M., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Exp Diabetes Res. 2012, 168368 (2012).
  31. TPF & SPF File Download Options [Internet]. Available from: http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html (2014).
  32. Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).
  33. Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).
Probe-baseret real-time PCR metoder til kvantitativ måling af microRNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J. Vis. Exp. (98), e52586, doi:10.3791/52586 (2015).More

Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J. Vis. Exp. (98), e52586, doi:10.3791/52586 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter