Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Probe-baserte Real-time PCR tilnærminger for kvantitativ måling av microRNAs

doi: 10.3791/52586 Published: April 14, 2015

Summary

Sirkulerende microRNAs har nylig dukket opp som lovende og nye biomarkører for ulike krefttyper og andre sykdommer. Målet med denne artikkelen er å diskutere tre ulike probe-basert real-time PCR-plattformer og metoder som er tilgjengelige for å kvantifisere og bestemme overflod av sirkulerende microRNAs.

Abstract

Probe-basert kvantitativ PCR (qPCR) er en foretrukket metode for måling av transkripsjon overflod, siden det er en av de mest sensitive deteksjonsmetoder som gir en nøyaktig og reproduserbar analyse. Probe-basert kjemi har minst bakgrunnsfluorescens i forhold til andre (fargestoffbaserte) kjemi. For tiden er det flere plattformer tilgjengelig som bruk probe-basert kjemi for å kvantifisere transkripsjon overflod. qPCR i en 96-brønners plate er den mest rutinemessig brukt metode er imidlertid bare et maksimum på 96 prøver eller mirnas kan testes i en enkelt kjøring. Dette er tidkrevende og kjedelig hvis et stort antall prøver / mirnas skal analyseres. High-throughput probe-baserte plattformer som MicroFluidics (f.eks TaqMan Array kort) og nanofluidikk arrays (f.eks OpenArray) tilbud lette å reproduserbart og effektivt oppdage overflod av flere microRNAs i et stort antall prøver i løpet av kort tid. Her viser vi den eksperimentelle oppsettet ennd protokoll for miRNA kvantifisering fra serum eller plasma-EDTA prøver, ved hjelp av sonde-basert kjemi og tre forskjellige plattformer (96 brønners plate, MicroFluidics og nanofluidikk arrays) tilbyr økende nivåer av gjennomstrømming.

Introduction

MicroRNAs (mirnas) er ~ 22 nucleotide ikke-kodende (nc) RNA, som fungerer som regulatorer av genuttrykk 1-3. De fleste mirnas hos dyr fungere gjennom sekvens-spesifikk baseparring med et mRNA, rettet mot 3 'UTR, noe som fører til negativ regulering av genekspresjon 2-4. Dette skjer vanligvis via hemming av mRNA oversettelse eller ved ribosomal drop-off. mirnas i omløp har vist seg å være nye biomarkører i forskning og kliniske felt for en rekke sykdommer, så som diabetes 5-7, eggstokkreft 8, 9 prostata og brystcancer 10,11, hepatitt B-12 og andre autoimmune sykdommer 13. Forskning har vært gjennomført for å identifisere rikelig mirnas i forskjellige celler eller vev, så vel som i sirkulasjon fra humant plasma og serumprøver, som er lettere tilgjengelig og mindre invasiv 9,11-15.

Ulike metoder for kvantifisering miRNA har vært eopprettet ved hjelp av flere plattformer, som for eksempel standard 96-brønns plate plattform 4,12,16-18, den MicroFluidics kort plattform 12,18-23 og nanofluidikk array plattform 17,24. Kvantitativ real-time PCR (qPCR) tilbyr muligheten til å måle relative eller absolutte tall av vitnemål ved hjelp av flere (farve eller probe-basert) kjemi. Probe-basert real-time PCR kjemi tilbyr fordelen av lav bakgrunnsfluorescens og høy sensitivitet for å påvise en enkelt transkripsjon kopi. Det er relativt kostnadseffektivt, enkel å bruke og svært reproduserbare, noe som gjør det til et yndet metode for å kvantifisere og bestemme miRNA uttrykket 25. Probe-baserte qPCR metode generelt omfatter to trinn: revers transkripsjon (RT) og qPCR 4,26,27. RT er der stammesløyfe RT primeren blir hybridisert til en moden eller primær miRNA molekyl og konvertert til komplementær (c) DNA. Kvantifisering av cDNA-produktet blir deretter utført ved anvendelse av miRNA-spesifikke PCR-primere26-28. Prinsippet for probe-baserte qPCR er basert på påvisning av komplementære tråden forlengelse i sann tid, noe som innebærer hydrolyse av det fluorescens-merkede probe. Disse probene er utformet for å inneholde en fluoriserende reporter og et quencher som er like hverandre for å tillate FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Påvisning av utslipp fra fluorescens reporter (sender) er maskert av nærhet av slukkeren molekylet. Når Taq-polymerase (pol) strekker seg fra oppstrømsprimeren og når en gaffel (5'-enden av proben), hydrolyserer Taq-pol-eksonukleaseaktivitet sonden, hvilket fører til en fysisk dissosiasjon / separasjon av den fluorescerende emitter fra slukkeren. Denne frigjøring av et enkelt molekyl av fluorescens emitter er registrert av detektoren, og presentert som en inkrementell økning i fluorescens-signalet fra den brønn / reaksjon. Økningen i fluorescens er proporsjonal med mengden av PCR-produkt som genereres, slik at en nøyaktig quantification av den forsterkede target 26,28.

Med økende etterspørsel i miRNA kvantifisering, har middels til høy gjennomstrømning teknologier blitt utviklet for å tillate et større antall prøver som skal behandles i en kort tidsperiode. TaqMan Low Density Array (TLDA) er et medium-throughput innovative mikrofluid design basert på probe-baserte qPCR kjemi gir en økning i antall mirnas analysert på en plate. TLDA innebære bruk av et forhåndsdefinert pool av RT-primere som brukes til å syntetisere cDNA. Disse cDNAs blir deretter spunnet inn i en tilpasset 384 godt mikro-fluidic kort for å bestemme uttrykket av flere mirnas bruker qPCR 22,26,29. Hver brønn av kortet inneholder tørket primere og prober for å amplifisere spesifikke miRNA (s), således opp til 384 reaksjoner kan behandles i ett TLDA kortet 26.

Den nanofluidikk matrise er en high-throughput-plattform som brukes for deteksjon av gentranskriptene 24. Denne artikkelen fokuserer på å vise hvordan disse metodene for å kvantifisere mirnas i serum / plasma er utført og de kritiske faktorene som må vurderes når du utfører og tolke slike data. Tatt til konto, vil deres individuelle fordeler og begrensninger bli diskutert i denne artikkelen.

Protocol

Total-RNA kan isoleres fra serum ved hjelp av en protokoll etablert i vårt laboratorium 30 eller ved hjelp av andre kommersielt tilgjengelige sett.

MERK: Utfyllende interaktive regneark for beregning av reaksjonsvolumer i hvert forsøk (med 5% overflødig volum utgjorde pipettering inkludert) er gitt.

1. Probe-basert real-time qPCR hjelp av en standard 96-brønns plate Platform

  1. cDNA syntese (revers transkripsjon) på serum / plasma RNA prøver for miRNA
    1. Beregne og ta ut 10 ng av RNA for hver cDNA syntese reaksjon. Legg nuclease-fritt vann for å bringe det endelige volum på 10 ng RNA i 1,67 ul (for en 5 pl reaksjons). Hold prøvene på is.
    2. Velg miRNA og tine sine RT-primere.
    3. Tine RT reagens blandingskomponenter: RT-buffer (10X), dNTPs (100 mM), RNase inhibitor (20 U / ul). Aldri holde sted enzym (rekombinant Moloney murine leukemi virus(RMoMuLV)) (recombinanat Moloney murine leukemivirus (rMoMuLV) reverstranskriptase (50 U / ul) på is. Oppbevar det ved -20 ° C inntil det er nødvendig, eller i en fryseblokk.
    4. Forbered RT reagens blanding på is som beskrevet i Tabell 1A. Det anbefales å fremstille i det minste 5% overskudd volum for å kompensere for pipetteringsfeil.
    5. Legg 2,33 mL av RT reagensblanding hver inn i et 0,2 ml PCR-rør / plate.
    6. Vortex RT primer rør for å blande, så sentrifuger kort på 10.000 xg i 10 sek. Tilsett 1 mL av miRNA spesifikke RT primer til sine respektive PCR-rør eller plate. Legg 1,67 ul av den fortynnede RNA til sine respektive PCR-rør eller brønner i platen. Utføre alle tilleggene på is.
    7. Sentrifuger reaksjonsrøret eller plate ved 1950 xg i 5 min ved 4 ° C.
    8. Sett opp miRNA cDNA syntese program på termosykler med følgende innstillings betingelser: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 min, 85 °C i 5 minutter, og 4 ° C på vent.
    9. Still reaksjon volum til 10 pl. Laste reaksjonsrørene eller plate i termosykler. Start RT løp. Oppbevar cDNA (RT) reaksjoner ved -20 ° C, hvis sanntid PCR-amplifikasjon ikke straks begynte.
  2. Probe-baserte Real time qPCR for påvisning av modne miRNAs
    1. Tine de valgte probe-baserte qPCR analyser (20X) for de respektive RT produktet.
    2. Bland anstendighet eneste løsning av real-time PCR (qPCR reagensblanding) ved å svinge flasken.
    3. Forberede qPCR reagensblanding for hver miRNA som skal analyseres. For å fremstille qPCR oppnå et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør for hver miRNA prøven og tilsett komponentene i hvert rør, som beskrevet i Tabell 1B. Det anbefales å fremstille i det minste 5% overskudd volum for å kompensere for pipetteringsfeil.
    4. Legg 4,2 mL av den respektive qPCR reagens blanding til hver brønn av en optisk 96-brønns plate (eller rør). Legg 0,8 mLav respektive cDNA reaksjon (syntetisert i trinn 1.1 for hver mirnas) til respektive godt.
    5. Tett plate med passende optisk dekselet. Sentrifuger plate (eller rør) ved 1950 xg i 5 min ved 4 ° C
    6. Slå på datamaskinen, 96-brønns plate / MicroFluidics rekke leser og endelig starte programvaren. Sikre at maskinene er koblet korrekt og riktig blokk og oppvarmet lokk (for rask 96 brønners plate) er på plass.
    7. Velg eksperiment som 96-brønns fast blokk (0,1 ml), standardkurve, TaqMan reagenser og rask modus. Sett opp qPCR på Real Time PCR system ved hjelp av følgende program sykkelforholdene: 95 ° C i 20 sek, 50 sykluser (95 ° C i 1 sek, 60 ° C i 30 sek).
    8. Still reaksjon volum til 10 pl. Installering av reaksjonsrøret eller plate inn i instrumentet. Trykk på "Start run". Programmet vil ta omtrent en time å fullføre.

2. Probe-basert Microfluidics Array-kort (Card A og B)

MERK: Probe-baserte miRNA panel kommer som et sett med to 384-brønnen microfluidic kort (Array kort A og Array kort B). Hvert kort inneholder tørkede Primere og prober for opptil 380 mirnas og kontroller. cDNA-produktet (med eller uten forhåndsforsterkning) som er spesifikk for kort A eller kort B er lastet på den respektive rekke i sanntid PCR.

  1. Revers transkripsjon (RT)
    1. Bruk denne protokollen for en total RNA inngang på 1-1,000 ng. Hvis inngangen er mellom 1-350 ng, utføre en pre-forsterkning (pre-amp) trinn. For innganger over 350 ng, legger cDNA direkte på tabellkort uten pre-amp.
      MERK: For serum miRNA profilering, start med 100 ng av total RNA. For en komplett miRNA-profil, kjøre to forhåndsdefinerte bassenger av RT-primer sett med RT reaksjoner (Pool A og Pool B) per prøve.
    2. Tine følgende reagenser på is. RT Primere (10x): Pool A og Pool B, dNTPs med dTTP (100 mm), RT Buffer (10x), MgCI2 (25 mm), RNase Inhibitor (20 U / &# 181; l). Ikke holde enzymet (rekombinant Moloney murine leukemi virus (rMoMuLV)) revers transkriptase (50 U / mL) på is. Lagre det ved -20 ° C inntil nødvendig.
    3. Forsiktig vortex alle reagenser, med unntak av enzymet, og deretter raskt sentrifugere rørene ved 10.000 xg i 10 sek.
    4. Kombiner reagenser, som beskrevet i tabell 2A, inn i to rør; ett rør for Pool A, den andre for Pool B. Hvert rør vil inneholde bare ett forhåndsdefinert pool av RT primer sett, enten fra Pool A eller fra Pool B. Det anbefales å forberede minst 5% overflødig volum for å kompensere for pipetteringsfeil .
    5. Invertere å blande, og deretter sentrifuger kort på 10.000 xg i 10 sek. Alikvoter 100 ng av hver RNA-prøve i et nytt rør, og deretter legge et passende volum av nuclease-fritt vann for å gi totalt 3 ul.
    6. Alikvoter 4,5 pl av den aktuelle RT reagens blanding inn i de respektive rør. Invertere å blande, og deretter raskt sentrifuger ved 10.000 xg i 10 sek. Inkuber på isi 5 min.
    7. Plasser prøver i en termosykler og starte RT ved bruk av følgende betingelser: 40 sykluser (16 ° C i 2 minutter, 42 ° C i 1 min, 50 ° C i 1 sek), 85 ° C i 5 min, hold ved 4 ° C. Butikk cDNA generert ved hjelp av disse forhåndsdefinerte pool av RT-primere ved -15 til -25 ° C eller brukes umiddelbart.
  2. Pre-forsterkning
    1. Tine den forhåndsdefinerte pool av pre-amp primere på is. Forsiktig vortex primere, og deretter raskt sentrifuger dem på 10.000 xg i 10 sek. Swirl TaqMan PreAmp reagensblanding (2X) ved forsiktig tapping, å blande.
    2. Kombiner reagenser, som beskrevet i tabell 2B, inn i to rør; ett rør for Pool A, den andre for Pool B.
      MERK: Som beskrevet ovenfor, vil Pool En pre-amp primere gå til tube A og Pool B primere bør gå til tube B. Det anbefales å forberede minst 5% overskytende volumet for å kompensere for pipetteringsfeil.
    3. Invertere å blande, og deretter raskt sentrifuger ved 10.000 xg i 10 sek.Delmengde 22,5 mL av den aktuelle PreAmp reagensblanding inn nye rør. Alikvoter 2,5 pl av cDNA-prøven (fremstilt i RT-trinnet) i det respektive rør.
    4. Invertere å blande, og deretter raskt sentrifuger ved 10.000 xg i 10 sek. Inkuber på is i 5 minutter. Plasser prøvene i en termo og starte pre-amp syklus. Sykkel betingelser: 95 ° C i 10 min, 55 ° C i 2 minutter, 72 ° C i 2 minutter, 12 sykluser (95 ° C i 15 sek, 60 ° C i 4 minutter), 99,9 ° C i 10 min, hold ved 4 ° C.
    5. Inverter pre-forsterket cDNA å blande, og deretter raskt sentrifuger ved 10.000 xg i 10 sek. Legg 75 ul av 0,1X TE-buffer (pH 8,0) for å pre-amplifisert cDNA (1: 4 fortynning). Invertere utvannet pre-amp prøver å blande, og deretter raskt sentrifuger ved 10.000 xg i 10 sek. Butikk utvannet forforsterket cDNA ved -15 til -25 ° C i opptil en uke, eller brukes umiddelbart.
  3. Laster Microfluidics kort og utføre qPCR
    1. Hold MicroFluidicsmiRNA kort utenfor i minst en halv time å nå romtemperatur. Tine utvannet forforsterket cDNA på is og bland ved å snu rørene etterfulgt av kort spinn. Bland qPCR reagensblanding ved å svinge flasken.
    2. I ny tube legge 450 mL av qPCR reagensblanding til 9 mL fortynnet forforsterket cDNA. For kort A, bruker forforsterket produkt tilberedt med primer Pool A. Legg 441 mL nukleasefritt fritt vann for å gjøre opp den endelige volumet til 900 mL. Snu røret for å blande, og deretter raskt sentrifuger ved 10.000 xg i 10 sek.
    3. Ta ut TLDA kortet ut av innpakningen (når den når romtemperatur) og plassere den på et rent område med foliesiden ned. Tilsett 100 ul av PCR-reaksjonsblanding inn i hver av de 8 fyllportene på kortet. Det er 2 porter på hver av reservoaret (8 reservoarer totalt på hvert kort).
      MERK: fylleåpning er større hull hvor reaksjonsblandingen blir tilsatt, mens ventileringsporten er mindre hull. Hver miRNA TLDA kortet har 8 reservoars, som hver fører til 48 brønner (24 brønner i en kolonne x 2 kolonner), for således å legge alle brønner 384 i kortet med den samme PCR-reaksjonsblanding. Sørg for at Pool A og Pool B for hver prøve er lastet på respektive TLDA kort. Plasser array-kort i de spesialiserte MicroFluidics array-kortholderen bøtter i sentrifugen.
    4. For de Microfluidics array-kort, bruk en passende sentrifuge (for eksempel Heraeus Multifuge 3SR, 230V sentrifuge) og spesifikke bøtter (for eksempel "TaqMan Array kort" holdere). Hver bøtte kan holde opp til tre kort (lastet / tom). Pass alltid på at alle tre sporene av en bøtte er okkupert og bøtta er balansert ved å plassere lignende bøtte (dette bøtte bør også inneholde tre kort, enten tom eller full) i motsatt sporet av sentrifugen. Mens du setter kortet i bøtta holderen, sørg for at de åtte reservoarer projisere oppover og reaksjonsbrønnene møter ytterveggen av sentrifuge.
      1. Snurre kortene på 331 xg i 1 min ved romtemperatur. Etterførste spin, åpner sentrifuge og visuelt sikre reaksjonsblandingen er utlevert gjennom de 384 brønnene. Gjenta spinn på samme innstillingene for en mer tid. Ta ut kortet fra bøtte og sikre at nivået av reaksjonsblandingen i hver av de 8 reservoarene er ensartet. Eventuelle uoverensstemmelser i væskevolumene igjen i reservoarene gjøre kortet upassende å bruke videre.
    5. Microfluidics array-kort trenger en spesialisert fangstskuta som har en presisjon stylus enheten (vogn) å forsegle væskedistribusjonskanaler i matrisen og like distribuere reaksjonsblandingen i alle brønner (total reaksjon volum 1 ul / brønn).
    6. Bringe vognen til utgangsposisjonen og sett den lastet kortet inn i fangstskuta med folie side opp og stilte opp til pekepennen pinnene på fangstskuta. I en langsom, jevn og enkelt uniform slag, presse vognen over kortet til den når endepunktet av sealer. Fjern den forseglede array-kort og deretter kuttet av reservoarets fra kortet ved hjelp av saks.
    7. Kontroller at riktig blokk, oppvarmet lokk og prøvebærer er installert i MicroFluidics rekke real time PCR system / maskin.
    8. Slå på datamaskinen, og deretter den MicroFluidics array system og endelig starte programvaren. Sikre at maskinene er riktig tilkoblet. Velg eksperiment som array-kort, standardkurve, TaqMan reagenser og standardmodus. Importere installasjonsfilene for enten av kortet A og kort B. Lagre filen.
    9. Plasser forseglet i instrumentbrettet med brønn A1 øverst til venstre hjørne og strekkode mot fronten av instrumentet. Trykk "Start Run". Programmet vil ta ca 2 timer å fullføre.

3. Probe-baserte nanofluidikk Menneskelig miRNA Panel

  1. Revers transkripsjon (RT)
    1. Bruker denne protokoll for en total RNA inngang på 50 til 200 ng, 100 ng, men er optimalt for de fleste prøver. For en komplett miRNA-profil, kjøre to predefidefinerte bassenger av RT-primer sett av RT reaksjoner (Pool A og Pool B) per prøve.
    2. Tine reagensene på is: forhåndsdefinert pool av RT primersett (10x), dNTPs med dTTP (100 mM), RT-buffer (10 x), MgCl2 (25 mM), RNase inhibitor (20 U / ul). Ikke holde enzymet (rekombinant Moloney murine leukemi virus (rMoMuLV) revers transkriptase (50 U / mL) på is. Oppbevar den ved -20 ° C inntil nødvendig. Forsiktig vortex alle reagenser, bortsett fra enzymet, og kort sentrifuger dem på 10.000 x g i 10 sek.
    3. Kombiner reagenser, som beskrevet i tabell 3A, inn i to rør; ett rør for Pool A, den andre for Pool B. Hvert rør vil inneholde bare ett forhåndsdefinert pool av RT-primer sett, enten fra Pool A eller fra Pool B. Det anbefales å forberede minst 5% overflødig volum for å kompensere for pipettering feil.
    4. Pipette for å blande og deretter sentrifuger kort på 10.000 xg i 10 sek. Alikvoter 100 ng av hver RNA-prøve i et nytt rør, og deretter legge et passende volumav nuklease-fritt vann for å gjøre totalt 3 ul. Alikvoter 4,5 pl av den aktuelle RT reagens blanding inn i det respektive rør.
    5. Invertere å blande, og deretter raskt sentrifuger ved 10.000 xg i 10 sek. Inkuber på is i 5 min. Plasser prøvene i en termo og starte RT program. Sykkel betingelser: 40 sykluser (16 ° C i 2 minutter, 42 ° C i 1 min, 50 ° C i 1 sek), 85 ° C i 5 min, hold ved 4 ° C. Butikk cDNA generert ved hjelp av disse forhåndsdefinerte pool av RT-primer satt ved -15 til -25 ° C eller bruk umiddelbart.
  2. Pre-amplifikasjon (forforsterker)
    1. Tine den forhåndsdefinerte pool av pre-amp primer satt på is. Forsiktig vortex primere, deretter kort sentrifuger dem på 10.000 xg i 10 sek. Swirl TaqMan PreAmp reagensblanding (2X) for å blande.
    2. Kombiner reagenser, som beskrevet i tabell 3B, inn i to rør; ett rør for Pool A, den andre for Pool B. Hvert rør vil inneholde bare ett forhåndsdefinert pool av RT-primersettene, enten from Pool A eller fra Pool B. Det anbefales å forberede minst 5% overskytende volumet for å kompensere for pipetteringsfeil.
    3. Pipette for å blande, og deretter raskt sentrifuger dem på 10.000 xg i 10 sek. Delmengde 22,5 mL av den aktuelle PreAmp reagensblanding inn nye rør. Alikvoter 2,5 pl av cDNA-prøven i de respektive rør. Invertere for å blande og deretter raskt sentrifugere rørene ved 10.000 xg i 10 sek. Inkuber på is i 5 min.
    4. Plasser prøvene i en termo og kjøre pre-amp. Still reaksjon volum til 25 mikroliter. Sykkel betingelser: 95 ° C i 10 min, 55 ° C i 2 minutter, 72 ° C i 2 minutter, 12 sykluser (95 ° C i 15 sek, 60 ° C i 4 minutter), 99,9 ° C i 10 min, hold ved 4 ° C.
    5. Inverter pre-forsterket cDNA å blande, og deretter raskt sentrifuger ved 10.000 xg i 10 sek. I nye rør legge 4 mL av pre-forsterket cDNA til 156 mL av 0.1x TE buffer pH 8,0 (1:40 fortynning). Invertere utvannet pre-amp prøver å blande, og deretter raskt centrifuge på 10.000 xg i 10 sek. Butikk utvannet og ufortynnet forforsterket cDNA ved -15 til -25 ° C i opptil en uke, eller bruk umiddelbart.
  3. Laster nanofluidikk Arrays og Performing qPCR
    1. Last ned den aktuelle plate fil (.tpf) fra nettsiden 31 bruker nanofluidikk rekke lysbildeserienummer. Dette inneholder informasjonen kjøre for den spesifikke nanofluidikk rekke lysbilde.
    2. Tine utvannet forforsterket cDNA og TaqMan Real-Time qPCR reagensblanding (hvis du bruker for første gang) på is. Bland qPCR reagensblanding ved å svinge flasken. I nye rør legger 22,5 mL av qPCR reagensblanding til 22,5 mL av fortynnet forforsterket cDNA. Forsiktig vortex å blande, og deretter raskt sentrifuger ved 10.000 xg i 10 sek.
    3. Delmengde 5 mL av hver prøve til 8 brønner (2 kolonner, 4 rader) av nanofluidikk rekke arbeidsflyt 384-vel prøve plate. Sørg for at Pool A og Pool B for hver prøve er i tilstøtende 8-brønners blokker (se Figure en eller Supplerende excel-ark for layout).
      1. Hver prøve plate kan inneholde opptil åtte lysbilder igjen av prøvene. Imidlertid kan systemet for nanofluidikk matrise bare behandle fire nanofluidikk arrays i et enkelt løp. Hvis mer enn fire lysbilder igjen av prøvene skal lastes på en prøve plate, må du sørge for de gjenværende delene er forseglet. Forsegle med OpenArray sample plate sealer.
        MERK: Det anbefales å skjære fangstskuta inn de nødvendige deler, så seksjonene kan være forseglet / utette individuelt for å redusere fordampning. Alternativt kan platen forsegles med en intakt tetningsmiddel, og deretter seksjonene kan individuelt skåret ut ved lasting.
    4. Sentrifuger plate ved 490 x g i 1 minutt ved 4 ° C. Laste nanofluidikk array-lysbilder innen 1 time. På grunn av begrenset tid lov til å forsegle lysbilder, kan du bare legge ett lysbilde om gangen. Ta av nanofluidikk rekke lysbilde fra fryseren og la den komme til romtemplitteraturen (~ 15 min).
    5. Kontroller at riktig blokk, oppvarmet lokk og prøvebærer er installert i nanofluidikk array system. Slå på datamaskinen, og real-time PCR system og lastesystemet. Åpne respektive programvare og sikre at maskinene er koblet til. Fjerne lastesystemforbruksartikler (Array lysbilde lokk, plug og nedsenking væske) fra emballasjen.
    6. Dra forsiktig på stempelet på nedsenking væske sprøyte å løsne. Ta av lokket, plasser tuppen på og skyll luft fra spissen. Plasser lastesystem tips i maskinen og fjern lokket. Plasser prøven plate innen PCR system.
    7. Sette hansker på. Sikre at de er tettsittende å minimere risikoen for uhell merking lysbilde lokket. Nøye åpen lysbilde emballasje. Sakte tipse lysbilde i hånd. Ikke berør toppen av lysbildet.
    8. Plasser lysbilde i PCR system, med strekkoden til venstre. Fjern sealer fra den delen av prøveplaten beregnet for lasting. Bruk lastesystemetprogramvare for å komme inn i lysbildet strekkode, skyver posisjon, prøve posisjon og tips konfigurasjon.
    9. Når alle relevante kontroller er gjennomført, trykk last lysbilde. Mens PCR systemet lastes raset, fjerne den klare og rød plast fra bunnen av raset lokket. Når ferdig lastet, forsiktig fjerne og forsegle dekselet innen 90 sek.
      1. Plasser dekselet innen plate klemme. Plasser glide lokket på lysbildet. Klips til 30 sek. Sørg for at lokket er plassert slik at strekkoden vises korrekt. Ta av forsamlingen fra platen klemme.
      2. Posisjon nedsenking fluid sprøyte i løpet av sleiden slik at spissen trykker mot lokket. Sakte fylle lysbilde med nedsenking væske, noe som sikrer væske går langs lokket. Når full, forsegle lysbilde med pluggen, skru skruen inntil håndtaket bryter av.
      3. Fjern plastdekselet på toppen av lysbildet lokket, og deretter forsiktig plassere inn i raset bærer av real-time PCR system. Sørg for at det er support på bunnen av lysbildet som det blir senket, slik at den ikke faller brått, og ikke berør toppen av lysbildet. Det er OK å berøre sidene av raset / cassette.Initialize PCR-systemet og starte programmet for qPCR innen 1 time.
    10. Velg "OpenArray" innenfor PCR-systemprogramvaren. Trykk på "Finn Slide IDer". Dette vil ta noen minutter. Hvis programvaren ikke finner plate ID, vil det be om det legges inn manuelt.
    11. Trykk "Bekreft Plate sentre". Igjen, vil dette ta noen minutter. Kontroller at den røde prikken er i sentrum, og at det ikke er noen fingeravtrykk / merker på toppen av lysbildet. Legg den respektive .tpf fil for hvert bilde og angi et resultat filnavn og plassering. Trykk "Start Run". Programmet vil ta ca 2 timer å fullføre.

Representative Results

Anbefalt volum for en miRNA probe-baserte analysen qPCR reaksjon er 20 mL. MERK: Vi har bekreftet at et reaksjonsvolum på 5 ul er i stand til å gi resultater som ligner de som ble oppnådd ved anvendelse av 20 ul volum 4,7,30. Senking av reaksjonsvolumet til 5 pl tillater en 75% reduksjon i reagens-kostnader, uten nevneverdig tap i følsomhet. Som vist i figur 2, reaksjonsvolum på 20 pl og 5 pl viser en sterk co-forhold inntil 39 sykluser (med r2 på 0,92, p = 0,0002).

Microfluidics matrisen gir et verktøy for å fremskaffe data på 754 mirnas uttrykt i en prøve på rundt 5 timer (for kort A og Kort B), som er en mer effektiv måte å analysere flere prøver, sammenlignet med konvensjonelle 96-brønners plate PCR. Vi sammenlignet miRNA MicroFluidics array-kort for samme prøve (prøve A og Prøve En gjenta) figur 3A -. B viser en Bland-Altman plot (<strong> 3A) og korrelasjon plot (3B) for alle 754 mirnas testet for disse prøvene. Det finnes tre forskjellige kontroll mirnas (U6, RNU44 og RNU48) plassert tilfeldig på begge kortene (kort A og B) på flere steder. Når U6 syklus terskelverdier (CT) er sammenlignet mellom de to kjøringer, gjorde vi ikke observere signifikante forskjeller mellom verdiene (tabell 4). Det er også viktig å merke seg her at U6 er uttrykt i større grad (lavere Ct-verdien) i prøven vurderes. Deretter sammenlignes alle mirnas som har Ct-verdier mellom 0 til 19,99 i begge kjøringene (n = 150), som hadde tilsvarende uttrykk for mirnas samlet med en koeffisient for bestemmelse av 98% (figur 3C-D). Av alle de 277 mirnas som har Ct verdier mellom 20 og 29.99 i både løyper, 16 Mirs signifikant forskjellig mellom de opprinnelige og gjentatte kjøringer (Figur 3E - F) Antallet mirnas med signifikant forskjell betwee.n løypene økt (89 av 327) når de Ct-verdier ble valgt mellom 30-40 for begge omganger (Figur 3G - H).

Den nanofluidikk array plattform gir data for 754 mirnas fra hvert serum / plasma-prøven som ble testet, som representert i figur 4A er det viktig å undersøke disse forsterkningskurver -. Som det er med alle qPCR - for å sikre at resultatet er en indikasjon på sann forsterkning. Hver av de 48 underordnede rekker (figur 1) inneholder også en analyse for de tre mest populære "husholdnings" ncRNAs:. U6, RNU44 og RNU48 Figur 4B illustrerer et typisk gruppering av U6 replikerer fra en enkelt prøve. Disse replika vise lavt standardavvik (SD <0,5) og så er en indikator på pålitelighet. Alternativt viser figur 4C økt variasjon av U6 replikater (SD> 0,5) i en andre prøve. Dette opphever ikke gyldigheten of de resterende analyser, selv om den gjør det nødvendig med en mer grundig kritikk. U6, som med de fleste "housekeeping" mirnas i biologiske væsker, kan ha en variabel uttrykk. Det bør bemerkes at en av prøvene, som er skissert på figur 4C, viser fire ganger mindre U6-innhold enn det som vist i figur 4B. Siden nivået av U6 i prøven presenteres i 4C er 75% mindre til å begynne med enn de som er presentert i panel 4B, er større teknisk variabilitet forventet på grunn av Poisson-fordeling av transkriptene, som er forsterket av den lille reaksjonsvolum 17.

Et annet nyttig verktøy er de Kvalitetskontroll (QC) bilder, tilgjengelig for eksport når kjøringen er fullført. Et utvalg av disse bruker fluorescens av ROX, den passive fargestoff som finnes i qPCR reagensblanding, for å bekrefte at hver gjennomgående hull er korrekt lastet (Figur 5). Et gjennomgående hull, eller faktisk en en dekk undergruppe, kanskje ikke inn på grunn av utilstrekkelig prøvevolum, fordampning, bobler til stede i brønnene på 384-brønnen sample plate, unnlatelse av å fjerne prøven plate segl, eller defekter innenfor Accufill systemet eller dets tips. Enhver losset gjennomgående hull må identifiseres for å unngå merking mirnas som "usynlige", når det i realiteten analysen ble aldri lastet. Hvis det oppstår dette problemet, bekrefter at minst 5 mL av prøven / Mastermix er lastet inn i hver brønn på 384-vel prøve plate, prøven plate skikkelig sentrifugert før lasting, er folieforseglingen helt fjernet, og den lastet OpenArray lysbilde er forseglet og kjøre innenfor den avsatte tiden for alle etterfølgende kjøringer. Hvis lasteproblemer fortsatt vedvarer, kan disse være mer sannsynlig knyttet til spesifikke batch eller mye av arrays eller relaterte forbruksvarer og videre assistanse bør søkes gjennom produsenten.

"Src =" / files / ftp_upload / 52586 / 52586fig1.jpg "/>
Figur 1: Oppsett av prøver for nanofluidikk Array arbeidsflyt: (A) Hver 384-vel prøve plate kan holde prøver for opptil 8 nanofluidikk arrays. (B) utvannet, er pre-forsterket cDNA plassert i åtte brønner (2 kolonner med 4 rader), med Pool A og Pool B i tilstøtende 8-brønngrupper. Hver sirkel representerer en brønn. (C) Hver brønn av prøveplaten vil bli lastet inn i en undergruppe av nanofluidikk array. Hver lille firkanten representerer en undergruppe.

Figur 2
Figur 2: Co-forhold analyse for konvensjonelle 96-brønners PCR plattformer: Co-forhold mellom 20 ul og 5 mL reaksjonsvolumer på TaqMan Real-time qPCR ved hjelp av en standard 96-brønns plate plattform i CT-verdier (39 sykluser). Vi sammenlignet fire ulike microRNAs (Mir-375, Mir-30c, Mir-30d og Mir-7) i fire forskjellige humant serum og plasmaprøver. Kun 11 datapunkter er plottet siden de andre var umulig å oppdage. R2 = 0,92, p = 0,0002.

Figur 3
. Figur 3: Sirkulasjons miRNA profilering ved hjelp MicroFluidics array-kort Ved hjelp av to Microfluidics kort (kort-A og kort-B), er en profil av 754 mirnas generert (A - B). Som vist her, brukte vi samme prøve for to MicroFluidics rekke kjøringer for å kontrollere reproduserbarheten av MicroFluidics kort resultater. Vi observerte en lignende uttrykk for mirnas samlet, med Ct verdier mellom 0 til 19,99 (C - D). Det er få mirnas (16 av 277) med Ct verdier mellom 20 til 29,99 og signifikante forskjeller mellom gjentatte kjøringer (E - F). Åtti ni av 327microRNAs med høyere Ct-verdiene (30-40) viste signifikante forskjeller mellom begge omganger (G - H).   Dataene analyseres med paret t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Representative Profil av PCR Product Amplification Curves: Er en representativ figur av de kombinerte (a) forsterkningskurver i alle miRNA mål for en human plasmaprøve. En analyse for U6 (en felles styre ncRNA) er plassert i hver undergruppe. Prøven i (B) viser lav variasjon (SD <0,5) mens (C) viser høyt standardavvik (SD> 0,5) innen U6 gjentak. Begge prøvene er total RNA isolert fra humant plasma. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: QC Analyse av nanofluidikk Arrays: Kvalitetskontroll (QC) bilder av en korrekt lastet nanofluidikk array (til venstre) og en feil lagt nanofluidikk array (til høyre). Den passive fargestoff, ROX (til stede i qPCR reagensblanding), fluoresces å indikere en riktig lastet gjennomgående hull. Rekken til høyre har flere undergrupper / gjennom-hull som ikke er lastet med qPCR reagensblanding og disse bør identifisert som falske negative PCR reaksjoner.

Komponenter Volum per 5 pl reaksjons (pl) RT buffer (10x) 0.5
dNTP (100 mM) 0,05
RNase inhibitor 0.6
Nukleasefritt vann 1.39
Revers transkriptase 0,33
Totalt volum 2.33

Tabell 1A: RT reagens blandingskomponenter i en 5 pl RT reaksjons forberedelse for TaqMan Sanntids qPCR ved hjelp av en standard 96-brønns plate plattform.

Komponenter Volum per 5 pl reaksjons (pl) Volum per 20 pl reaksjons (pl)
Fast PCR Mastermix (2x) 2,5 10
TaqMan qPCR analyse (20x) * 0,25 1
Nukleasefrittvann 1,45 5.8
Totalt volum: 4.2 16.8

* Analysekomponent basert på den valgte miRNA testet.

Tabell 1B: qPCR reagens blandingskomponenter i en 5 eller 20 pl qPCR reaksjons forberedelse for TaqMan Sanntids qPCR ved hjelp av en standard 96-brønns plate plattform.

Komponenter Volum per reaksjon (pl)
Megaplex RT Primere (10x) 0.8
dNTP med dTTP (100 mm) 0.2
Multiscribe revers transkriptase (50 U / mikroliter) 1.5
10X RT Buffer 0.8
MgCl2 (25 mM) 0.9
RNase Inhibitor & # 160; (20 U / mikroliter) 0.1
Nukleasefritt Water 0.2
Total 4.5

Tabell 2A: RT reagensblanding komponenter i en 5 pl RT reaksjon forberedelse for TLDA miRNA panel.

Komponenter Volum per reaksjon (pl)
TaqMan PreAmp Mastermix (2x) 12.5
Megaplex preamp Primere (10x) 2,5
Nukleasefritt vann 7.5
Total 22.5

Tabell 2B: preamp reagensblanding komponenter i en 25 mL pre-amplication reaksjon forberedelse for TLDA miRNA panel.

"Cellspacing =" 0 "> Komponenter Volum per reaksjon (pl) Megaplex RT Primere (10x) 0.75 dNTP med dTTP (100 mm) 0.15 Multiscribe revers transkriptase (50 U / mikroliter) 1.5 10X RT Buffer 0.75 MgCl2 (25 mM) 0.9 RNase Inhibitor (20 U / mikroliter) 0.09 Nukleasefritt Water 0.35 Total 4.5

Tabell 3A: RT reagens blandingskomponenter i en 5 pl RT reaksjons forberedelse for probe-baserte nanofluidikk miRNA panel.

Komponents Volum per reaksjon (pl)
TaqMan PreAmp Mastermix (2x) 12.5
Megaplex preamp Primere (10x) 2,5
Nukleasefritt vann 7.5
Total 22.5

Tabell 3B:. Preamp reagensblanding komponenter i en 25 mL pre-amplication reaksjon forberedelse for probe-baserte nanofluidikk miRNA panel MERK: Den interaktive tilleggs excel regneark gitt for de tre plattformene, allerede står for 5% tillegg for å kompensere for pipetteringsfeil.

Prøve A Smak En gjenta
15,535 16,156
15,471 15,652
15.623 16,063
15,963 15,889
14,006 13,993
14,502 14,623
14,907 14,384
13,732 14,946

Tabell 4: Sirkulasjons miRNA U6 profilering ved hjelp MicroFluidics array-kort. Ved hjelp av to MicroFluidics array-kort (A og B). Ct-verdier av U6 kontroll miRNA fra Sample A (total = 8). Konsekvent U6 kontroll miRNA overflod observert mellom kjøringene.

Discussion

De kritiske trinnene i sondebaserte qPCR protokoller for å oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater er å sørge for at 1) det samme volum og konsentrasjon av RT-produkt som ligger i hvert qPCR reaksjon, 2) de riktige forholdstall og volumer av komponentene som trengs for qPCR reaksjon er forberedt og blandes godt, 3) de riktige og konsistente volumer er lagt til hver qPCR reaksjon, og 4) utarbeidelse og lasting av hver prøve og reaksjonsblandingen er ferdig på kortest mulig tid som mulig, samtidig oppmerksom på de ovennevnte kritiske trinn nevnt tidligere.

De MicroFluidics array-kort må egnet sentrifuge og spesifikke bøtter. Hver bøtte kan holde opp til tre kort (lastet / tom). Pass alltid på at alle tre sporene av en bøtte er okkupert og bøtta er balansert ved å plassere lignende bøtte (dette bøtte bør også inneholde tre kort, enten tom eller full) i motsatt sporet av sentrifugen. Mens du setter kortet i Buckest holder, sørg for at de åtte reservoarer projisere oppover og reaksjonsbrønnene møter ytterveggen av sentrifuge. Snurre kortene på 331 xg i 1 min ved romtemperatur. Etter første spin, åpner sentrifuge og visuelt sikre reaksjonsblandingen er utlevert gjennom de 384 brønnene. Gjenta spinn på samme innstillingene for en mer tid. Ta ut kortet fra bøtte og sikre at nivået av reaksjonsblandingen i hver av de 8 reservoarene er ensartet. Eventuelle uoverensstemmelser i væskevolumene igjen i reservoarene gjøre kortet upassende å bruke videre.

For å ha samme konsentrasjon av RT-produkt, er samme inngangs konsentrasjon av RNA tilsatt i hver RT-reaksjonen. Den totale RNA-konsentrasjonen blir målt ved anvendelse av en mikro-volumespectrophotometer. Den observerte 260/280 forholdet kan være så lavt som 1,3 for RNA isolert fra plasma / serum; Dette synes ikke å ha en effekt på nedstrøms qPCR-relaterte prosesser eller data generert 30. Likeledes er 260/280 forholdet avRNA prøvene testet her var mellom 1,3-1,7 med ingen unormale effekter i qPCR observert.

Ved bruk av lave RNA-innhold prøver, slik som de fra biofluids, kan det være vanskelig å kvantifisere RNA før behandling. Vi anbefaler bruk av syntetisk spike-in på RNA isolering samt revers transkripsjon etapper. I vår erfaring, Arabidopsis thaliana miRNA kandidater (ATH-Mir-159a og ath-Mir-172a) er foretrukket over Caenorhabditis elegans mirnas (som cel-Mir-39 eller cel-Mir-54), som etter vår erfaring kan ha høyere homologi enn de fra A. thaliana. Bruken av en slik scene spesifikke spike-in kan gjøre rede for normalisering av miRNA data på tvers av flere prøver analysert på ulike tidspunkter. Ved hjelp av en fast inngangsvolum RNA for cDNA syntese reaksjon er også anbefalt 32,33.

De tre probe-baserte protokoller for miRNA kvantifisering beskrevet her krever varierende mengderav total RNA-inngang, ulike arbeidsprosesser og kostnader. Hver av arbeidsflyter er konstruert for å ta forskjellige hastigheter basert på antall miRNA mål og antall prøver som skal analyseres. Med økende gjennomløp (96 Rxn 384 Rxn 3072 Rxn), kostnaden per reaksjonen avtar med en økning i mengden av data som er innhentet i løpet av en tidsenhet. Siden alle disse plattformer benytter TaqMan kjemi, kan kvaliteten på data oppnådd forventes å være lik. TaqMan qPCR er en veletablert metode for å identifisere overflod av mirnas i serum / plasmaprøver 9,11,27. Selv om de tre plattformer som er omtalt her har samme kjemi, en reduksjon i reaksjonsvolumet fører til en reduksjon i dynamisk område av transkriptet deteksjon (Farr RJ et al., Upubliserte data). 96-brønns qPCR plattformen er en lavere gjennomstrømming, men høy følsomhet plattform og etter vårt syn, "gullstandarden" for alle probe-basert (eller dye-basert) PCR plattformer. Dette kan imidlertidikke være den mest økonomiske eller effektive plattformen dersom flere hundre eller tusenvis av prøver blir analysert, og for flere microRNAs. Microfluidics (TLDA) og nanofluidikk (OA) plattformene er high-throughput / innholds plattformer er utformet for å tillate at anskaffelse av større data i en kortere tid. Selv batch forskjeller har blitt observert i TLDA kort, kan dette reduseres ved å be om TLDA kort fra samme parti. Vi observerer at TLDA plattform (figur 3) viste betydelig variasjon i 17% av mid - lav overflod mirnas når testet ved hjelp av den samme prøven på ulike grupper av TLDA kort. Vi anbefaler derfor å bruke de samme batchnumre for analyse ved hjelp TLDA kort. Denne variasjonen kan også være på grunn av teknisk variasjon inkludert eventuelle lasting og pipettering feil. Vi anbefaler imidlertid bestilling / ber om det samme batch av TLDA kort. Ingen signifikant batch variasjon ble observert på OA plattformen. Til tross for dette, TaqMan basert experimental qPCR nærmer tilbud lette å måle overflod av mirnas i plasma / serumprøver. Lav, medium og høy gjennomstrømning tilnærminger diskutert her tilbyr fleksibilitet til å analysere en rekke prøver og mirnas ved hjelp av en svært effektiv, reproduserbar og ren (lav bakgrunnsstøy) kjemi.

Disclosures

Artikkel prosessering / publiseringskostnadene ble dekket av Life Technologies, etter aksept av dette manuskriptet for publisering.

Acknowledgments

Alle forfatterne erkjenner støtte infrastrukturen fra NHMRC CTC, University of Sydney, Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), Australia og Rebecca Cooper Foundation, Australia. Denne forskningen ble finansiert gjennom tilskudd fra Australian Research Council (FT110100254) og JDRF, Australia (CRN201314) til Aah WW, RJF og MVJ utført alle våt lab eksperimentering, gjennomført ASJ ut dataanalyse. WW skrev det første utkastet. AAH planlagt studien og analysert dataene. Alle forfattere lese og blitt enige om den endelige versjonen av manuskriptet, tall og regneark innsendt for publisering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well-platform
For Reverse transcription
TaqMan MicroRNA Assays INV SM  Applied Biosystems
 
4427975 https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975
The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems
 
4366597 or 4366596 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596
The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.
For qPCR run on a 96-well platform
2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG  Applied Biosystems
 
4367846 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846
The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on  the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml  Applied Biosystems 4346907 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product
Microfluidics platform (TLDA)
For Reverse transcription
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems
 
4399966 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966
The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 Applied Biosystems
 
4444281 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281
The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
OR OR
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 Applied Biosystems
 
4444750 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750
The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
For Pre-amplification
TaqMan PreAmp Master Mix Applied Biosystems
 
4391128 or 4488593 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593
The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0  Applied Biosystems
 
4444303 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303
The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems
 
4399233 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233
The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
1x TE Buffer (100 ml) Invitrogen 12090-015 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product
The 1x TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0  Applied Biosystems 4444913 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913
Nanofluidics platform (OpenArray)
For Reverse transcription
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).
For Pre-amplification
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)
To load and run the slides
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) Applied Biosystems
 
4470187 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit  Applied Biosystems
 
4469576 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576
OpenArray 384-well Sample Plates   Applied Biosystems
 
4406947 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix Applied Biosystems
 
4462159 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159
OpenArray AccuFill System Tips  Applied Biosystems
 
4457246 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246
Others
Nuclease-Free Water Qiagen 129117 http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 431, 350-355 (2004).
  2. Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. MicroRNA functions in animal development and human disease. Development. 132, 4653-4662 (2005).
  3. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  4. Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell. Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478 (2010).
  5. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes. Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).
  6. Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes. Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).
  7. Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development. Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).
  8. Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA profiling in ovarian cancer. Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).
  9. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).
  10. Mattie, M. D., et al. Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies. Mol Cancer. 5, 24 (2006).
  11. Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects. BMC Res Notes. 2, 89 (2009).
  12. Zhu, H. T., et al. Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients. Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).
  13. Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases. Clin Endocrinol (Oxf). (2014).
  14. Liu, R., et al. Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer. Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).
  15. Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PLoS One. 3, e3148 (2008).
  16. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3. Dev Biol. 311, 603-612 (2007).
  17. Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR. J Am Heart Assoc. 3, e000792 (2014).
  18. Wu, C., et al. Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma. PLoS One. 9, e92292 (2014).
  19. McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media. J Vis Exp. e50294 (2013).
  20. Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
  21. Genda, Y., et al. microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study. Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).
  22. Wang, B., et al. Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array. PLoS One. 6, e17167 (2011).
  23. Cuk, K., et al. Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer. Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).
  24. Morrison, T., et al. Nanoliter high throughput quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 34, e123 (2006).
  25. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16, 991-1006 (2010).
  26. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50, 244-249 (2010).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
  28. Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44, 31-38 (2008).
  29. Kodani, M., et al. Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens. J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).
  30. Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta,, V, M., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Exp Diabetes Res. 2012, 168368 (2012).
  31. TPF & SPF File Download Options [Internet]. Available from: http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html (2014).
  32. Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).
  33. Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).
Probe-baserte Real-time PCR tilnærminger for kvantitativ måling av microRNAs
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J. Vis. Exp. (98), e52586, doi:10.3791/52586 (2015).More

Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J. Vis. Exp. (98), e52586, doi:10.3791/52586 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter