Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Зонд на основе ПЦР в реальном времени подходов к количественному измерению микроРНК

doi: 10.3791/52586 Published: April 14, 2015

Summary

Циркуляционные микроРНК недавно появились в перспективных и новых биомаркеров различных видов рака и других заболеваний. Цель этой статьи является обсуждение трех различных зондов на основе реального времени платформы и методы, которые доступны для количественной оценки и определить содержание циркулирующих микроРНК ПЦР.

Abstract

Зонд на основе количественной ПЦР (КПЦР) является выступает способ измерения транскрипта изобилие, так как он является одним из наиболее чувствительных методов обнаружения, что обеспечивает точный и воспроизводимый анализ. Зонд на основе химии предлагает наименьшее фоновой флуоресценции по сравнению с другими (на основе красителя) химии. В настоящее время существует несколько платформ, доступных, что химия использование зонда на основе для количественного стенограмму изобилие. КПЦР в 96-луночный планшет является наиболее обычно используемый метод, однако, только максимум 96 образцов или микроРНК могут быть проверены за один проход. Это занимает много времени и утомительным, если большое количество образцов / микроРНК должны быть проанализированы. Высокая пропускная способность зонда на основе платформ, таких как микрофлюидики (например, TaqMan Массив Card) и нанофлюидики массивов (например, OpenArray) обеспечивают простоту воспроизводимо и эффективно обнаружить обилие нескольких микроРНК в большом количестве образцов в течение короткого времени. Здесь мы демонстрируем Экспериментальная установкай протокол для микроРНК количественного из сыворотки или образцов плазмы с ЭДТА, используя химию зонда на основе и три различных платформ (96-луночный планшет, Microfluidics и нанофлюидики массивы), которые предлагают повышение уровня производительности.

Introduction

Микро (микроРНК) составляют ~ 22 нуклеотидов некодирующая (NC) РНК, функционирует в качестве регуляторов экспрессии генов 1-3. Большинство микроРНК у животных функционировать через последовательности конкретных спаривания оснований с мРНК, ориентированные на 3 'UTR, что приводит к негативной регуляции экспрессии гена 2-4. Это обычно происходит путем ингибирования трансляции мРНК или рибосомальной высадки. микроРНК в обращении, как было показано, чтобы быть новых биомаркеров в клинических исследований и полей для различных заболеваний, таких как диабет, яичников 5-7 8, 9 простаты и рака молочной железы 10,11, гепатит В и 12 других аутоиммунных заболеваний 13. Исследование было проведено, чтобы определить обильные микроРНК в различных клеток или тканей, а также в обращении из человеческой плазмы и образцы сыворотки, который является более доступным и менее инвазивным 9,11-15.

Различные методы микроРНК количественного были электроннойукреплены с помощью нескольких платформ, таких как стандарт 96-луночного планшета платформы 4,12,16-18, в микрофлюидики Карточная платформа 12,18-23 и нанофлюидики массива платформы 17,24. Количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР) предоставляет возможность для измерения относительного или абсолютного числа транскриптов с использованием нескольких (dye- или зонда на основе) химические. Зонд на основе ПЦР в реальном времени химии предлагает преимущество низкой фоновой флуоресценции и высокой чувствительностью обнаруживать одну копию транскрипта. Это относительно Экономичность, простота в использовании и высокую воспроизводимость, что делает его излюбленным методом для количественной оценки и определения микроРНК выражение 25. Зонд-метод, основанный КПЦР как правило, включает в себя два этапа: с обратной транскрипцией (RT) и КПЦР 4,26,27. RT, где грунт Шпилька РТ гибридизуют со зрелой первичной или молекулы микроРНК и преобразуется в комплементарной (с) ДНК. Количественное определение кДНК продукт затем проводят с использованием микроРНК-специфической ПЦР праймеры26-28. Принцип зонда на основе количественной ПЦР основан на обнаружении комплементарной нити расширения в режиме реального времени, который включает гидролиз флуоресцентно-меченый зонд. Эти зонды предназначены для размещения флуоресцентный репортер и гаситель, которые только друга, чтобы FRET (флуоресцентного резонанса передачи энергии). Обнаружение излучения флуоресценции репортера (эмиттер) маскируется непосредственной близости от молекулы гасителя. При Taq-полимеразы (Pol) проходит от верхнего праймера и достигает вилку (5'-конца зонда), Taq-Pol экзонуклеазную активность гидролизует зонд, что приводит к физической диссоциации / разделения флуоресцентного эмиттера от гасителя. Этот релиз из одной молекулы флуоресцентного излучателя регистрировались детектором и представлены в качестве дополнительных увеличению сигнала флуоресценции от этой же / реакции. Увеличение флуоресценции пропорциональна количеству продукта ПЦР, генерируемого, что позволяет точную Куantification усиленного целевой 26,28.

С увеличением спроса на микроРНК количественного, от средней до высокой пропускной технологий были разработаны, чтобы позволить большее количество образцов, подлежащих обработке в течение короткого периода времени. TaqMan низкой плотности массива (TLDA) является средней пропускной инновационной Микрожидкостных конструкции на основе зонда на основе КПЦР химии предлагает увеличение числа микроРНК анализируемых на одной пластине. TLDA включать использование предварительно заданного пула RT-праймеров, используемых для синтеза кДНК. Эти кДНК затем прядут настроенной 384 и микро-жидкостный карты, чтобы определить выражение нескольких микроРНК с использованием КПЦР 22,26,29. Каждая лунка Карточка содержит сушат праймеры и зонды для амплификации конкретной микроРНК (ы), поэтому до 384 реакций могут быть обработаны в один TLDA карты 26.

Массив нанофлюидики является высокой пропускной платформа, которая используется для обнаружения генных транскриптов 24. Эта статья посвящена демонстрации того, как эти методы для количественного микроРНК в сыворотке / плазме выполняются и критические факторы, которые необходимо учитывать при выполнении и интерпретации таких данных. Взятые на счет, их индивидуальные преимущества и ограничения будут рассмотрены в этой статье.

Protocol

Общую РНК может быть выделена из сыворотки с использованием протокола, установленный в нашей лаборатории 30 или с помощью других коммерчески доступных наборов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные интерактивные таблицы для расчета объемов реакции в каждом эксперименте (с 5% избыточного объема приходится на пипеткой в ​​комплекте) предоставляются.

1. Зонд на основе реального времени КПЦР с использованием стандартного 96-луночного планшета платформы

  1. Синтез кДНК (обратная транскрипция) на образцах сыворотки / плазмы РНК для микроРНК
    1. Рассчитать и вывезти 10 нг РНК для каждой реакции синтеза кДНК. Добавить нуклеазы без воды, чтобы довести до конечного объема 10 нг РНК 1,67 мкл (для реакции 5 мкл). Хранить образцы на льду.
    2. Выберите Мирна и оттепель свои RT праймеров.
    3. Растаяйте компонентов смеси реагента RT: RT буфера (10х), дНТФ (100 мМ), РНКазы ингибитора (20 ед / мкл). Никогда не храните место фермента (рекомбинантный вируса мышиного лейкоза Молони(RMoMuLV)) (вируса мышиного лейкоза Молони recombinanat (rMoMuLV) обратной транскриптазы (50 ед / мкл) на льду. Не хранить его при температуре -20 ° C до необходимости или в морозильной блока.
    4. Подготовка RT смесь реагентов на льду, как описано в таблице 1А. Рекомендуется подготовить по крайней мере, 5% -ным избытком громкости для компенсации ошибки пипетки.
    5. Добавить 2,33 мкл смеси RT реагента каждого в 0,2 мл ПЦР трубки / пластины.
    6. Вихревые праймеров трубы RT перемешать, а затем центрифуги кратко на 10000 мкг в течение 10 сек. Добавить 1 мкл миРНК конкретной RT праймера с их соответствующими ПЦР пробирки или пластины. Добавить 1,67 мкл разбавленного РНК с их соответствующими ПЦР пробирки или лунки в пластине. Выполните все дополнения на льду.
    7. Центрифуга реакционной трубы или пластины при 1950 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
    8. Настройка программы синтеза кДНК микроРНК на термоциклере при следующих условиях установка: 16 ° C в течение 30 мин, 42 ° С в течение 30 мин, 85 °С в течение 5 мин и 4 ° С на удержание.
    9. Указан объем реакционной смеси до 10 мкл. Загрузите реакционные трубы или пластины в термоциклер. Начните бег RT. Хранить кДНК (RT) реакции при температуре от -20 ° С, если в режиме реального времени ПЦР-амплификации не сразу приступил.
  2. Зонд на основе реального времени КПЦР для обнаружения зрелых микроРНК
    1. Оттепель выбранный датчик на основе КПЦР анализов (20x) для соответствующего продукта РТ.
    2. Смешайте приличия единственным решением в режиме реального времени (ПЦР КПЦР смешивайте реагенты), вращая бутылку.
    3. Подготовьте смесь реагентов КПЦР для каждого микроРНК, которые будут проанализированы. Чтобы приготовить КПЦР получить стерильный 1,5 трубки микроцентрифужных мл для каждого образца микроРНК и добавить компоненты в каждую пробирку, как описано в таблице 1В. Рекомендуется подготовить по крайней мере, 5% -ным избытком громкости для компенсации ошибки пипетки.
    4. Добавить 4,2 мкл соответствующего КПЦР смеси реагента в каждую лунку оптического 96-луночного планшета (или труб). Добавить 0,8 мклсоответствующих реакции кДНК (синтезированного в шаге 1.1 для каждого микроРНК) в соответствующей скважины.
    5. Печать пластины с соответствующим оптическим покрытием. Центрифуга пластины (или трубки) в 1950 х г в течение 5 мин при 4 ° С
    6. Включите компьютер, 96-луночный планшет / микрофлюидики считывания массива и, наконец, запустить программное обеспечение. Убедитесь, что машины подключены правильно и корректно блок и нагревают крышка (для быстрой 96-луночного планшета) на месте.
    7. Выберите эксперимент, 96-а быстрый блочный (0,1 мл), стандартная кривая, TaqMan реагенты и быстрый режим. Установка КПЦР в системе ПЦР в реальном времени, используя следующие условия: Программа велосипедные 95 ° C в течение 20 сек, 50 циклов (95 ° C в течение 1 сек, 60 ° С в течение 30 сек).
    8. Указан объем реакционной смеси до 10 мкл. Загрузите реакционную трубку или пластину в инструменте. Нажмите "Пуск Выполнить". Программа занимает примерно 1 час, чтобы закончить.

2. Зонд на основе Microfluidics Массив Card (Caй А и В)

Примечание: Зонд на основе микроРНК панели приходит в виде набора из двух 384-луночных микрожидкостных карт (массив карточки А и массив карты B). Каждая карта содержит высушенные праймеры и зонды для до 380 микроРНК и контроля. кДНК продукт (с или без предварительного усиления), специфичные для карты А или карты B загружается на соответствующий массив для ПЦР в реальном времени.

  1. Обратной транскрипции (RT)
    1. Используйте этот протокол для тотальной РНК, вход 1-1,000 нг. Если вход между 1-350 нг, выполнить предварительной амплификации (предварительный усилитель) шаг. Для входа выше 350 нг, загрузите кДНК непосредственно на массиве карт без предварительного усилителя.
      Примечание: Для профилирования микроРНК в сыворотке, начинают со 100 нг полной РНК. Для полного профиля микроРНК, запустите два предопределенных бассейны RT-наборов праймеров РТ реакций (бассейн А и бассейн В) на образце.
    2. Оттепель следующие реагенты на льду. RT Грунтовки (10x): бассейн и бассейн B, дНТФ с дТТФ (100 мм), RT буфера (10x), MgCl 2 (25 мМ), РНКазы ингибитора (20 U / &# 181; L). Не держите фермента (рекомбинантный вируса мышиного лейкоза Молони (rMoMuLV)) обратной транскриптазы (50 U / мкл) на льду. Храните его при температуре от -20 ° C до необходимости.
    3. Аккуратно вихрь все реагенты, кроме фермента, а затем кратко центрифуги трубы при 10000 мкг в течение 10 сек.
    4. Зерноуборочный реагенты, как описано в Таблице 2А, в две пробирки; одна трубка для бассейна А, другой для пул B. Каждая трубка будет содержать только один предопределенный бассейн РТ набором праймеров, либо из Пула А или пул B. Рекомендуется подготовить по крайней мере, 5% -ным избытком громкость для компенсации ошибки пипетки ,
    5. Обратить перемешать, а затем центрифуги кратко на 10000 мкг в течение 10 сек. Аликвоты 100 нг каждого образца РНК в новую пробирку, затем добавить соответствующий объем нуклеазы без воды, чтобы в общей сложности 3 мкл.
    6. Аликвоты 4,5 мкл соответствующего реагента RT смесь в соответствующих трубах. Обратить перемешать, а затем кратко центрифуге при 10000 мкг в течение 10 сек. Инкубировать на льдув течение 5 мин.
    7. Место образцов в амплификаторе и начать RT с использованием следующих условий: 40 циклов (16 ° С в течение 2 мин, 42 ° С в течение 1 мин, 50 ° С в течение 1 сек), 85 ° С в течение 5 мин, удерживайте его на 4 ° C. Магазин кДНК генерируется с использованием этих предопределенных бассейн РТ-праймеров при температуре от -15 до -25 ° С или использовать немедленно.
  2. Предварительное усиление
    1. Оттепель предопределенный бассейн предварительного усилителя праймеров на льду. Аккуратно вихревые грунтовки, а затем кратко центрифуги их на 10 000 мкг в течение 10 сек. Swirl TaqMan PreAmp смешивайте реагенты (2X), осторожно разговоров, перемешать.
    2. Зерноуборочный реагенты, как описано в таблице 2B, на две пробирки; одна трубка для бассейна А, другой для пул B.
      Примечание: Как указано выше, бассейн предварительного усилителя праймеры пойдет на трубе А и бассейн B праймеры должны идти к трубке В. Рекомендуется подготовить по крайней мере, 5% -ным избытком громкости для компенсации ошибки пипетки.
    3. Обратить перемешать, а затем кратко центрифуге при 10000 мкг в течение 10 сек.Алиготе 22,5 мкл соответствующей смеси PreAmp реагента в новые пробирки. Аликвоты 2,5 мкл образца кДНК (полученного на стадии RT) в соответствующей трубе.
    4. Обратить перемешать, а затем кратко центрифуге при 10000 мкг в течение 10 сек. Инкубируют на льду в течение 5 минут. Место образцов в амплификаторе и начать цикл предусилителя. Велосипеде условия: 95 ° С в течение 10 мин, 55 ° С в течение 2 мин, 72 ° С в течение 2 мин, 12 циклов (95 ° C в течение 15 сек, 60 ° С в течение 4 мин), 99,9 ° С в течение 10 мин, провести при 4 ° С.
    5. Обратить предварительно усиливается кДНК перемешать, а затем кратко центрифуги при 10000 мкг в течение 10 сек. Добавить 75 мкл ТЕ-буфера 0.1x (рН 8,0) предварительно усиленный кДНК (1: 4 разбавление). Обратить разбавленные образцы предварительного усилителя перемешать, а затем кратко центрифуге при 10000 мкг в течение 10 сек. Магазин разбавленной предварительно усиливается кДНК в температуре от -15 до -25 ° С в течение одной недели, или использовать немедленно.
  3. Загрузка Microfluidics карты и выполнения КПЦР
    1. Держите MicrofluidicsмикроРНК карты за пределами, по крайней мере, половина часа до комнатной температуры. Оттепель разбавленный предварительно усиливается кДНК на льду и взболтайте трубы с последующим кратким спина. Смешайте КПЦР смешивайте реагенты, вращая бутылку.
    2. В новой пробирку добавить 450 мкл КПЦР смеси реагентов до 9 мкл разбавленного предварительно усиливается кДНК. Для карт А, используйте предварительно усиливается продукт, полученный с использованием праймера бассейн А. Добавить 441 мкл нуклеазы свободной воды, чтобы составить конечный объем до 900 мкл. Переверните пробирку для смешивания, а затем кратко центрифуге при 10000 мкг в течение 10 сек.
    3. Снимите TLDA карту из упаковки (когда она достигает комнатной температуре) и поместите его на чистую поверхность со стороной фольги вниз. Добавить 100 мкл ПЦР реакционной смеси в каждую из 8 заполнения портов на карте. Есть 2 порта на каждый из резервуара (8 водохранилищ в общей сложности на каждой карте).
      Примечание: заполнение порт большее отверстие, где реакционную смесь добавляют, в то время как газовыпускной канал меньшее отверстие. Каждый микроРНК TLDA карта имеет 8 резервуарс, каждый из которых ведет к 48 скважин (24 скважин в одном столбце х 2 колонки), поэтому загружаются все 384 скважин в карточке с одной и той же реакции ПЦР смеси. Убедитесь, что бассейн на и бассейн B каждого образца загружаются на соответствующих картах TLDA. Поместите массива карту в специализированных микрофлюидики массива держатель карты ведра в центрифуге.
    4. Для микрофлюидики массива карт, с помощью подходящего центрифуги (например, Heraeus Multifuge 3SR, 230 центрифуги) и конкретных ведра (например, «TaqMan Массив карта» держатели). Каждый ковш может вмещать до 3 карт (загружается / пустой). Всегда убедитесь, что все 3 слота из ведра заняты, а ведро уравновешивается размещения подобное ведро (это ведро должен также содержать 3 карты, либо пустыми, либо полными) в противоположном слот центрифуги. При размещении карту в держатель ковша, убедитесь, что 8 резервуаров проекта вверх и Лунки сталкиваются наружную стенку центрифуги.
      1. Спин карты на 331 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре. Послепервый спин, откройте центрифуги и визуально убедиться Реакционная смесь была подаваться через 384 скважин. Повторите вращение в одинаковых параметров для более 1 раза. Извлеките карту из ковша и обеспечить, чтобы уровень реакционной смеси в каждой из 8 резервуаров равномерна. Любые несоответствия в жидких объемов, оставленные в резервуары делают карты нецелесообразно использовать в дальнейшем.
    5. Microfluidics массива карточки должны специализированный герметик, который имеет точность пера в сборе (каретки) для герметизации жидкостью каналы сбыта массива и равномерно распределить реакционной смеси во всех лунках (общий реакционный объем 1 мкл / лунку).
    6. Принесите каретку в исходное положение и вставьте загруженную карту в уплотнителя со стороной фольги и выстроились к контактам стилусом на герметик. В медленной, упорной и единый унифицированный инсульта, давите на каретку по карте, пока не достигнет конечной точки герметиком. Удалить запечатанный массива карту, а затем отрезать резервуарс с карты с помощью ножниц.
    7. Убедитесь, что правильные блок, крышка и нагревают образец носитель, установленный в микрофлюидики массива реальном времени системы ПЦР / машины.
    8. Включите компьютер, то система микрофлюидики массива и, наконец, запустить программу. Убедитесь, что машины подключены правильно. Выберите эксперимент в виде массива карты, стандартной кривой, TaqMan реагентов и стандартном режиме. Импорт установочных файлов для любой из карт А и карты В. Сохраните файл.
    9. Поместите запечатанный карту в лоток прибора с хорошо A1 в верхнем левом углу и штрих-кодов к передней части инструмента. Нажмите "Start Run". Программа занимает примерно 2 часа до завершения.

3. Зонд на основе панели нанофлюидики человека микроРНК

  1. Обратной транскрипции (RT)
    1. Используйте этот протокол для тотальной РНК, вход 50-200 нг, однако 100 нг является оптимальным для большинства образцов. Для полного профиля микроРНК, запустить два predefiNED бассейны RT-наборов праймеров РТ реакций (бассейн А и бассейн В) на образце.
    2. Оттепель реагенты на льду: предопределенный бассейн наборов RT праймеров (10x), дНТФ с дТТФ (100 мм), RT буфера (10x), MgCl 2, (25 мм), РНКазы ингибитора (20 U / мкл). Не держать фермент (рекомбинантного вируса мышиного лейкоза Молони (rMoMuLV) обратной транскриптазы (50 ед / мкл) на льду. Хранить при температуре от -20 ° С до использования. Аккуратно вихрь все реагенты, кроме фермента, и кратко центрифуги их на 10000 мкг в течение 10 сек.
    3. Зерноуборочный реагенты, как описано в таблице 3А, в две пробирки; одна трубка для бассейна А, другой для пул B. Каждая трубка будет содержать только один предопределенный пул RT-набор праймеров, либо из Пула А или пул B. Рекомендуется подготовить по крайней мере, 5% -ным избытком громкости для компенсации пипетки Ошибка.
    4. Внесите смешивать, а затем центрифуги кратко на 10000 мкг в течение 10 сек. Алиготе 100 нг каждого образца РНК в новую пробирку, затем добавить соответствующий объемнуклеазы без воды, чтобы сделать в общей сложности 3 мкл. Аликвоты 4,5 мкл соответствующего реагента RT смесь в соответствующей трубе.
    5. Обратить перемешать, а затем кратко центрифуге при 10000 мкг в течение 10 сек. Инкубируют на льду в течение 5 мин. Место образцов в амплификаторе и запустить программу RT. Велосипеде условия: 40 циклов (16 ° С в течение 2 мин, 42 ° С в течение 1 мин, 50 ° С в течение 1 сек), 85 & deg; С в течение 5 мин, провести при 4 ° С. Магазин кДНК получены с использованием этих предопределенных бассейн РТ-набор праймеров на -15 до -25 ° С или использовать немедленно.
  2. Предварительной амплификации (предусилитель)
    1. Оттепель предопределенный бассейн предварительного усилителя набора праймеров на льду. Аккуратно вихревые грунтовки, а затем кратко центрифуги их на 10 000 мкг в течение 10 сек. Swirl TaqMan PreAmp смешивайте реагенты (2X), чтобы перемешать.
    2. Зерноуборочный реагенты, как описано в таблице 3В, в две пробирки; одна трубка для бассейна А, другой для пул B. Каждая трубка будет содержать только один предопределенный бассейн наборов RT-праймеров, либо FRом бассейн или пул B. Рекомендуется подготовить по крайней мере, 5% -ным избытком громкости для компенсации пипетки ошибку.
    3. Внесите перемешать, а затем кратко центрифуги их на 10 000 мкг в течение 10 сек. Алиготе 22,5 мкл соответствующей смеси PreAmp реагента в новые пробирки. Аликвоты 2,5 мкл образца кДНК в соответствующие пробирки. Обратить перемешать, а затем кратко центрифуги трубы при 10000 мкг в течение 10 сек. Инкубируют на льду в течение 5 мин.
    4. Место образцов в амплификаторе и запустить предварительный усилитель. Указан объем реакционной смеси до 25 мкл. Велосипеде условия: 95 ° С в течение 10 мин, 55 ° С в течение 2 мин, 72 ° С в течение 2 мин, 12 циклов (95 ° C в течение 15 сек, 60 ° С в течение 4 мин), 99,9 ° С в течение 10 мин, провести при 4 ° С.
    5. Обратить предварительно усиливается кДНК перемешать, а затем кратко центрифуги при 10000 мкг в течение 10 сек. В новых труб добавить 4 мкл предварительно усиливается кДНК 156 мкл 0,1 x ТЕ-буфера рН 8,0 (1:40 разведение). Обратить разбавленные образцы предварительного усилителя перемешать, а затем кратко CEntrifuge на 10000 мкг в течение 10 сек. Магазин разбавляют и неразбавленным предварительно усиливается кДНК в температуре от -15 до -25 ° С в течение одной недели, или использовать немедленно.
  3. Загрузка нанофлюидики массивов и исполнительских КПЦР
    1. Скачать соответствующий файл пластины (.tpf) с сайта 31 с помощью нанофлюидики массива слайд серийный номер. Этот документ содержит информацию о перспективе для конкретного нанофлюидики массива слайда.
    2. Оттепели разбавленной предварительно усиленный кДНК и TaqMan в режиме реального времени КПЦР смесь реагентов (при использовании в первый раз) на льду. Смешайте КПЦР смешивайте реагенты, вращая бутылку. В новых труб добавить 22,5 мкл КПЦР смеси реагентов до 22,5 мкл разбавленного предварительно усиливается кДНК. Аккуратно вихрь перемешать, а затем кратко центрифуге при 10000 мкг в течение 10 сек.
    3. Алиготе 5 мкл каждого образца в 8 скважин (2 колонки, 4 строки) рабочего процесса нанофлюидики массив образца пластины 384-а. Убедитесь, что бассейн и бассейн B каждого образца в соседних блоках 8-а (см Figurе 1 или дополнительного Лист Excel для макета).
      1. Каждый образец пластина может содержать до восьми слайдов на сумму образцов. Тем не менее, система нанофлюидики массива может обрабатывать только 4 нанофлюидики массивов в один проход. Если более чем четыре горки стоит образцов должны быть загружены на одном образце пластины, пожалуйста, убедитесь, остальные разделы закрыты. Печать с OpenArray образец для планшета.
        Примечание: Желательно, чтобы заранее разрезать герметик в необходимых секциях, так что секции могут быть запечатаны / вскрыты по отдельности, чтобы уменьшить испарение. Альтернативно, пластина может быть запечатан с интактным герметиком, а затем секции могут быть индивидуально вырезали при загрузке.
    4. Центрифуга пластины при 490 мкг в течение 1 мин при 4 ° С. Загрузите нанофлюидики массива слайды в течение 1 часа. Из-за ограниченного времени, отведенного для герметизации слайды, пожалуйста, загрузить только один слайд в то время. Снимите нанофлюидики массива слайд из морозильника и позвольте ему прийти к комнатной температурературе (~ 15 мин).
    5. Убедитесь, что правильно блок, нагревается крышка и держатель образца устанавливается в системе нанофлюидики массива. Включите компьютер и системы реального времени ПЦР и системы загрузки. Доступ соответствующего программного обеспечения и убедиться, что машины подключены. Удалить систему загрузки расходных материалов (массив сдвижной крышки, подключи и иммерсионной жидкости) из упаковки.
    6. Осторожно потяните поршень шприца иммерсионной жидкости, чтобы ослабить. Снять крышку, поместите наконечник на и флеш воздух из кончика. Поместите кончики загрузки системы в машине и снять крышку. Поместите образец стекла в системе ПЦР.
    7. Положите перчатки. Гарантировать, что они плотно прилегают к минимуму риск случайного маркировки крышку слайд. Осторожно открыть слайд упаковка. Медленно наклоните слайд в руке. Не прикасайтесь к верхней части слайда.
    8. Поместите слайд в систему ПЦР, с штрих-кода слева. Удалить герметик из части образца пластины, предназначенной для загрузки. Используйте систему загрузкиПрограммное обеспечение для ввода слайд штрих-код, сдвиньте положение, положение образца и конфигурации наконечника.
    9. Когда все соответствующие проверки будут завершены, прижимающая нагрузка слайд. В то время как система ПЦР загружается слайд, удалить прозрачную и красного пластика с нижней крышкой слайд. После завершения загрузки, тщательно удалить и запечатать слайда в 90 сек.
      1. Поместите слайд внутри пластины зажима. Поместите крышку слайд на слайде. Зажим для 30 сек. Убедитесь, что крышка расположена так отображается правильно, что штрих-код. Снимите в сборе с пластиной зажима.
      2. Положение погружения шприц жидкости в стекло так, что наконечник давит на крышке. Медленно заполните слайд с иммерсионной жидкости, обеспечивая жидкости проходит вдоль крышки. После того, как полный, печать слайд с вилкой, повернув винт до тех пор, ручка не обрывается.
      3. Удалить пластиковую крышку на верхней части крышки слайд, а затем осторожно поместить в слайд-носителя в реальном времени системы ПЦР. Убедитесь, что имеется суpport на нижней части слайда, как это в настоящее время снижается, так что это не может внезапно упасть, а не прикасайтесь к верхней части слайда. Это нормально, касается сторон слайд-системы / cassette.Initialize ПЦР и запустите программу для количественной ПЦР в течение 1 часа.
    10. Выберите "OpenArray" в ПЦР-системного программного обеспечения. Нажмите "Найти идентификаторов слайдов". Это займет несколько минут. Если программное обеспечение не может найти пластину ID, он будет просить, чтобы он был введен вручную.
    11. Нажмите "Подтвердить Латы центров". Опять же, это займет несколько минут. Убедитесь, что красная точка в центре, и что нет никаких отпечатков пальцев / знаки на верхней части слайда. Загрузите соответствующий .tpf файл для каждого слайда и укажите имя файла результатов и местоположение. Нажмите "Start Run". Программа занимает примерно 2 часа до завершения.

Representative Results

Рекомендуемый объем для реакции микроРНК зонд на основе анализа КПЦР 20 мкл. ПРИМЕЧАНИЕ: Мы подтвердили, что реакционный объем 5 мкл способен производить результаты, аналогичные тем, которые достигаются с помощью 20 мкл объема 4,7,30. Снижение объема реакции до 5 мкл позволяет получить 75% -ное снижение расходов реагентов без заметной потери чувствительности. Как показано на фиг.2, реакционные объемы по 20 мкл и 5 мкл показывают сильное взаимодействие отношение вплоть до 39 циклов (с R 2 0,92, р = 0,0002).

Microfluidics массива обеспечивает инструмент для получения данных о 754 микроРНК, выраженные в образце примерно 5 часов (для карты A и B карты), который является более эффективным способом анализа нескольких образцов по сравнению с обычными 96-луночных ПЦР пластины. Мы сравнили микроРНК карты микрофлюидики массив для того же образца (образец А и попробовать повтор) Рисунок 3A -. В показывает мягкий-Альтман сюжет (<STRONG> 3А) и корреляции участок (3B) для всех 754 микроРНК, протестированных на этих образцах. Есть 3 различных микроРНК контроля (U6, RNU44 и RNU48), хаотично размещенные по обе карты (Card А и В) в нескольких местах. При достижении порога U6 цикл (КТ) значения сравниваются между 2 работает, мы не наблюдали существенных различий между значениями (таблица 4). Важно также отметить, что U6 выражается в большем количестве (нижнее значение Ct) в образце оценены. Затем мы сравнили все микроРНК, которые имеют значения Ct между 0-19.99 в обоих опытах (п = 150), которые имели подобную экспрессию микроРНК в целом с коэффициентом определения 98% (фиг.3С-D). Из всех 277 микроРНК, которые имеют значения Ct между 20 и 29,99 в обоих опытах, 16 Миры значительно различались между оригиналом и повторных запусков (Рисунок 3E - F) количество микроРНК с существенным различием betwee.п пробеги увеличивается (89 327), когда значения Ct были выбраны в пределах 30-40 для обеих серий (рис 3G - H).

Платформа нанофлюидики массив содержит данные для 754 микроРНК из каждого образца сыворотки / плазмы протестированных как представлено на рисунке 4A Важно изучить эти кривые усиления. - Как это со всей кПЦР - для того, чтобы результат указывает на истинного усиления. Каждый из 48 подмассивов (Рисунок 1) также содержит анализ для трех наиболее популярных "домашнего хозяйства" нкРНК:. U6, RNU44 и RNU48 иллюстрирует типичный кластеризация U6 повторяет от одного образца. Эти повторов демонстрируют низкую стандартное отклонение (SD <0,5) и поэтому показатель надежности. С другой стороны, фиг 4C демонстрирует повышенную изменчивость U6 повторов (SD> 0,5) во втором образце. Это не отменяет действия OF остальных анализов, хотя она требует более тщательного критики. U6, как и в большинстве "домашнего хозяйства" микроРНК в биологических жидкостях, может иметь переменную выражение. Следует отметить, что один из образцов, описанных на фиг.4С, отображаются четыре раза меньше, чем содержание U6, что представлено на фиг.4В. Поскольку уровень U6 в образце, представленном в 75% меньше, чтобы начать с чем один представлены в панели 4B, большая степень технической изменчивость, как ожидается, в связи с распределением Пуассона транскриптов, который усугубляется небольшой объем реакционной смеси 17.

Другой полезный инструмент контроля качества (QC) изображений, доступных для экспорта, как только бежать завершена. Выбор из них использует флуоресценции ROX, пассивной краситель обнаружили в смеси реагентов КПЦР, чтобы подтвердить, что каждое сквозное отверстие было правильно загружена (рисунок 5). Через отверстие, или действительно EN шины подмассив, может не загружаться из-за недостаточного объема пробы, испарения, пузыри присутствует в колодцах образца пластины 384-а, неспособность полностью удалить образец стекла печать, или дефекты в системе Accufill или его советы. Любой выгружаются сквозные отверстия должны быть определены, чтобы избежать маркировки микроРНК, как "обнаружить", когда на самом деле анализ не был загружен. Если эта проблема встречается, подтверждают, что по меньшей мере 5 мкл образца / Mastermix загружают в каждую лунку для образца пластины 384-луночный, образец пластина правильно центрифугировали перед погрузкой, печать фольги полностью удалены, и загружается OpenArray слайд запечатан и запустить в течение отведенного времени для всех последовательных запусков. Если вопросы загрузки все еще сохраняются, они могут быть более вероятно, относящиеся к конкретной партии или партии массивов или связанных с расходными материалами и дополнительной помощи, следует обращаться производителя.

"SRC =" / файлы / ftp_upload / 52586 / 52586fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Схема образцов для массива процесса нанофлюидики: () Каждый образец пластина 384-а может вместить образцы до 8 нанофлюидики массивов. (B) Разводненная предварительно усиливается кДНК помещают в 8 скважин (2 колонки по 4 строк), с видом на бассейн А и пул B в соседних группах 8-а. Каждый круг представляет одну скважину. (С) В каждую лунку для образца пластины будут загружены в один подмассива массива нанофлюидики. Каждый малый квадрат представляет один подмассив.

Фиг.2
Рисунок 2: Анализ Co-отношение для обычных 96-а платформы ПЦР: Co-связь между 20 мкл и 5 реакционных объемов мкл на TaqMan в режиме реального времени КПЦР с использованием стандартных 96-а платформу пластины в значениях CT (39 циклов). Мы сравнили 4 разных микроРНК (микроРНК-375, микроРНК-30с Мир-30d и Мир-7) в 4 различных сыворотки и плазмы образцов человека. Только 11 точек данных строятся так как остальные были обнаружить. R 2 = 0,92, р = 0,0002.

Рисунок 3
. Рисунок 3: Циркуляционный микроРНК профилирования с помощью микрофлюидики массива карт с использованием 2 Microfluidics карты (карта-А и карты-B), профиль 754 микроРНК генерируется (- B). Как показано здесь, мы использовали тот же образец в течение 2 микрофлюидики массива работает, чтобы проверить воспроизводимость результатов микрофлюидики карт. Мы наблюдали аналогичное выражение микроРНК в целом, со значениями Ct между 0-19.99 (C - D). Есть несколько микроРНК (16 из 277) со значениями Ct между 20-29.99 и существенных различий между повторными работает (E - F). Восемьдесят девять из 327микроРНК с более высокими значениями Ct (30-40) выставлены существенные различия между двумя трасс (G - H).   Данные анализируют с помощью парного критерия Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4
Рисунок 4: представитель профиля продукта ПЦР амплификации кривых: Является представителем фигура комбинированных () усиления кривых всех целей микроРНК для человека образца плазмы. Анализ на U6 (общее управление ncRNA) помещают в каждую подмассива. Образец в (B) показывает низкую изменчивость (SD <0,5), тогда как (C) показывает высокую стандартное отклонение (SD> 0,5) в течение U6 повторяет. Оба образца являются Тотал РНК, выделенной из плазмы крови человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5
Рисунок 5: QC Анализ нанофлюидики массивов: Контроль качества (QC) изображения правильно уложенным нанофлюидики массива (слева) и неправильно загружен нанофлюидики массива (справа). Пассивный краситель, ROX (в настоящее время в смеси реагентов КПЦР), флуоресцирует, чтобы указать правильно загружена сквозное отверстие. Массив справа имеет несколько подмассива / сквозные отверстия, которые не загружаются смесью реагентов КПЦР, и они должны быть определены как ложно-отрицательных реакций ПЦР.

Компоненты Объем на 5 мкл реакции (мкл) RT буфера (10х) 0,5
дНТФ (100 мМ) 0,05
РНКазы ингибитор 0,6
Нуклеазы без воды 1,39
Обратной транскриптазы 0,33
Общий объем 2.33

Таблица 1A: компонентов смеси реагента RT в 5 мкл RT реакционную подготовки для TaqMan в режиме реального времени с использованием количественной ПЦР стандартную платформу 96-луночного планшета.

Компоненты Объем на 5 мкл реакции (мкл) Объем на 20 мкл реакции (мкл)
Быстрый ПЦР Mastermix (2x) 2,5 10
TaqMan КПЦР анализ (20x) * 0,25 1
Нуклеазывода 1,45 5,8
Общий объем: 4,2 16,8

* Анализ компонент на основе выбранного микроРНК испытания.

Таблица 1B: КПЦР компонентов смеси реагента в 5 или 20 мкл КПЦР подготовки реакционной для TaqMan в режиме реального времени с использованием количественной ПЦР стандартную платформу 96-луночного планшета.

Компоненты Объем на реакцию (мкл)
Megaplex RT Грунтовки (10x) 0,8
дНТФ с дТТФ (100 мм) 0,2
Multiscribe обратной транскриптазы (50 ед / мкл) 1,5
10X RT буфера 0,8
MgCl 2 (25 мМ) 0,9
РНКазы ингибитор & # 160; (20 U / мкл) 0,1
Нуклеазы без воды 0,2
Общий 4,5

Таблица 2А: компоненты смешивайте реагенты RT в 5 мкл RT подготовки реакции на панели TLDA микроРНК.

Компоненты Объем на реакцию (мкл)
TaqMan PreAmp Mastermix (2x) 12,5
Megaplex предусилитель Грунтовки (10x) 2,5
Нуклеазы без воды 7,5
Общий 22,5

Таблица 2B: предусилитель компонентов смеси реагентов в подготовке реакции 25 мкл предварительно amplication для панели TLDA микроРНК.

"CELLSPACING =" 0 "> Компоненты Объем на реакцию (мкл) Megaplex RT Грунтовки (10x) 0,75 дНТФ с дТТФ (100 мм) 0,15 Multiscribe обратной транскриптазы (50 ед / мкл) 1,5 10X RT буфера 0,75 MgCl 2 (25 мМ) 0,9 РНКазы ингибитор (20 U / мкл) 0,09 Нуклеазы без воды 0,35 Общий 4,5

Таблица 3A: компоненты смешивайте реагенты RT в 5 мкл RT подготовки реакции на зонд на основе нанофлюидики микроРНК панели.

Компонентс Объем на реакцию (мкл)
TaqMan PreAmp Mastermix (2x) 12,5
Megaplex предусилитель Грунтовки (10x) 2,5
Нуклеазы без воды 7,5
Общий 22,5

Таблица 3b. Предусилитель компонентов смеси реагентов в подготовке реакции 25 мкл предварительно amplication для зонда на основе нанофлюидики микроРНК панели ПРИМЕЧАНИЕ: интерактивный дополнительный таблицы Excel, предусмотренных для трех платформ, уже составляет 5% того, чтобы компенсировать пипетки ошибку.

Образец Пример повторения
15,535 16,156
15,471 15,652
15.623 16,063
15,963 15,889
14,006 13,993
14,502 14,623
14,907 14,384
13,732 14,946

Таблица 4: Циркуляционный микроРНК U6 профилирование с помощью Microfluidics массива карту. Использование двух карт микрофлюидики Array и В). CT-значения контрольных U6 микроРНК из образца А (всего = 8). Равномерное управление U6 микроРНК изобилия наблюдается между запусками.

Discussion

Критические шаги внутри зонда на основе протоколов КПЦР для получения точных и воспроизводимых результатов, чтобы убедиться, 1) такой же объем и концентрация RT-продукта загружается в каждой реакции КПЦР, 2) правильные отношения и объемы компонентов, необходимых для Реакция КПЦР подготовлены и хорошо перемешивают, 3) правильное и последовательное объемы добавляются к каждой реакции КПЦР, и 4) подготовка и загрузка каждого образца и реакционной смеси завершается в кратчайшие сроки, как это возможно, в то же время помнить о выше важные шаги уже упоминалось ранее.

В микрофлюидики массива карты необходимо соответствующее центрифуги и конкретные ведра. Каждый ковш может вмещать до 3 карт (загружается / пустой). Всегда убедитесь, что все 3 слота из ведра заняты, а ведро уравновешивается размещения подобное ведро (это ведро должен также содержать 3 карты, либо пустыми, либо полными) в противоположном слот центрифуги. При размещении карту в Buckeт держатель, убедитесь, что 8 резервуаров проекта вверх и Лунки сталкиваются наружную стенку центрифуги. Спин карты на 331 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре. После первого спина, откройте центрифуги и визуально убедиться Реакционная смесь была подаваться через 384 скважин. Повторите вращение в одинаковых параметров для более 1 раза. Извлеките карту из ковша и обеспечить, чтобы уровень реакционной смеси в каждой из 8 резервуаров равномерна. Любые несоответствия в жидких объемов, оставленные в резервуары делают карты нецелесообразно использовать в дальнейшем.

Чтобы иметь такую ​​же концентрацию в RT-продукта, так же, концентрация входного РНК добавляли в каждую реакцию RT. Общая концентрация РНК измеряется с помощью микро-volumespectrophotometer. Наблюдаемое отношение 260/280 может быть как 1,3 для РНК, выделенной из плазмы / сыворотки; это, кажется, не имеют эффекта на последующий процесс КПЦР или косвенно связанные с данных, полученных 30. Кроме того, отношение 260/280образцы РНК проверенные здесь были между 1,3-1,7 без каких-либо аномальных эффектов в кПЦР наблюдается.

При использовании низкие образцы содержания РНК, такие как те, от biofluids, это может быть трудно определить количественно РНК перед обработкой. Мы рекомендуем использование синтетических шип из-за пределов выделения РНК, а также обратные этапы транскрипции. По нашему опыту, Arabidopsis THALIANA микроРНК кандидатов (ATH-Мир-159A и ATH-Мир-172A) являются предпочтительными по сравнению Caenorhabditis Элеганс микроРНК (например, чел-МИР-39 или чел-МИР-54), который в нашем опыте, может иметь более гомологии, чем от A. THALIANA. Использование такой стадии конкретных шип-ин может объяснить для нормализации данных микроРНК на нескольких образцах, проанализированных в разное время. Использование фиксированного объема ввода РНК для реакции синтеза кДНК также рекомендуется 32,33.

Три протокола зонда основе для микроРНК количественного описано здесь требуют различное количествоот общего ввода РНК, различных технологических процессов и затрат. Каждый из рабочих процессов предназначены для удовлетворения различных пропускных зависимости от количества мишеней микроРНК и количества анализируемых образцов. С увеличением пропускной способности (96 RXN 384 RXN 3072 RXN), стоимость реакции уменьшается с увеличением количества данных, полученных за единицу времени. Поскольку все эти платформы используют TaqMan химия, качество данных, полученных может быть как ожидается, будет похож. TaqMan КПЦР является хорошо признанным методом для выявления обилие микроРНК в образцах сыворотки / плазмы 9,11,27. Хотя эти три платформы, обсуждаемые здесь, одни и те же химию, уменьшение реакционного объема приводит к уменьшению динамического диапазона обнаружения транскрипта (Farr RJ и др., Неопубликованные данные). 96-а платформа КПЦР является меньшая пропускная, но платформа высокая чувствительность и, на наш взгляд, "золотым стандартом" для всех зонда на основе (или краситель на основе) ПЦР платформ. Тем не менее, это можетне может быть наиболее экономичный или эффективную платформу, если несколько сотен или тысяч образцов в настоящее время анализируют и для нескольких микроРНК. Microfluidics (TLDA) и нанофлюидики (ОА) платформы платформы с высокой пропускной способностью / контент разработана, чтобы позволить приобретение больших данных за более короткое время. Хотя пакетные различия наблюдались в картах TLDA, это может быть сведено к минимуму путем запроса TLDA карты из той же партии. Заметим, что TLDA платформа (Рисунок 3) показали значительное изменение в 17% Средний уровень - низкие микроРНК изобилия при тестировании с использованием того же образца на различных партий TLDA карт. Поэтому мы рекомендуем использовать одни и те же номера партий для анализа с использованием TLDA карты. Это изменение может быть также из-за технической изменчивости с учетом всех возможных погрузки и пипеток ошибок. Тем не менее, мы рекомендуем заказывать / запрос ту же самую партию TLDA карт. Нет существенные различия партия не наблюдалось на ОА платформы. Несмотря на это, TaqMan основе экспериментальТаль КПЦР подходы обеспечивают простоту измерение содержания микроРНК в образцах плазмы / сыворотки. Низкого, среднего и высокую пропускную способность подходы, обсуждаемые здесь предлагают гибкость, чтобы проанализировать целый ряд образцов и микроРНК с использованием высокоэффективной, воспроизводимый и чистый (низкий фоновый шум) химию.

Disclosures

Статья расходы обработки / публикации были покрыты Life Technologies, после принятия этой рукописи для публикации.

Acknowledgments

Все авторы признают инфраструктуры поддержки от NHMRC КТК, Университет Сиднея, в отношении несовершеннолетних диабета исследовательский фонд (JDRF), Австралии и Ребекка Купер фонда, Австралия. Это исследование было профинансировано за счет субсидий из Научного Совета Австралии (FT110100254) и JDRF, Австралия (CRN201314), чтобы ааа WW, RJF и MVJ осуществляется мокрым лаборатории эксперименты, ASJ проведен анализ данных. WW написал первый проект. AAH планируется исследование и анализ данных. Все авторы читали и соглашались на финальной версии рукописи, рисунки и рабочие, представленных для публикации.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well-platform
For Reverse transcription
TaqMan MicroRNA Assays INV SM  Applied Biosystems
 
4427975 https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975
The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems
 
4366597 or 4366596 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596
The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.
For qPCR run on a 96-well platform
2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG  Applied Biosystems
 
4367846 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846
The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on  the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml  Applied Biosystems 4346907 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product
Microfluidics platform (TLDA)
For Reverse transcription
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems
 
4399966 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966
The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 Applied Biosystems
 
4444281 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281
The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
OR OR
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 Applied Biosystems
 
4444750 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750
The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
For Pre-amplification
TaqMan PreAmp Master Mix Applied Biosystems
 
4391128 or 4488593 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593
The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0  Applied Biosystems
 
4444303 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303
The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems
 
4399233 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233
The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
1x TE Buffer (100 ml) Invitrogen 12090-015 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product
The 1x TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0  Applied Biosystems 4444913 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913
Nanofluidics platform (OpenArray)
For Reverse transcription
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).
For Pre-amplification
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)
To load and run the slides
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) Applied Biosystems
 
4470187 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit  Applied Biosystems
 
4469576 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576
OpenArray 384-well Sample Plates   Applied Biosystems
 
4406947 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix Applied Biosystems
 
4462159 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159
OpenArray AccuFill System Tips  Applied Biosystems
 
4457246 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246
Others
Nuclease-Free Water Qiagen 129117 http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 431, 350-355 (2004).
  2. Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. MicroRNA functions in animal development and human disease. Development. 132, 4653-4662 (2005).
  3. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  4. Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell. Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478 (2010).
  5. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes. Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).
  6. Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes. Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).
  7. Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development. Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).
  8. Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA profiling in ovarian cancer. Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).
  9. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).
  10. Mattie, M. D., et al. Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies. Mol Cancer. 5, 24 (2006).
  11. Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects. BMC Res Notes. 2, 89 (2009).
  12. Zhu, H. T., et al. Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients. Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).
  13. Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases. Clin Endocrinol (Oxf). (2014).
  14. Liu, R., et al. Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer. Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).
  15. Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PLoS One. 3, e3148 (2008).
  16. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3. Dev Biol. 311, 603-612 (2007).
  17. Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR. J Am Heart Assoc. 3, e000792 (2014).
  18. Wu, C., et al. Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma. PLoS One. 9, e92292 (2014).
  19. McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media. J Vis Exp. e50294 (2013).
  20. Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
  21. Genda, Y., et al. microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study. Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).
  22. Wang, B., et al. Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array. PLoS One. 6, e17167 (2011).
  23. Cuk, K., et al. Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer. Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).
  24. Morrison, T., et al. Nanoliter high throughput quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 34, e123 (2006).
  25. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16, 991-1006 (2010).
  26. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50, 244-249 (2010).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
  28. Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44, 31-38 (2008).
  29. Kodani, M., et al. Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens. J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).
  30. Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta,, V, M., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Exp Diabetes Res. 2012, 168368 (2012).
  31. TPF & SPF File Download Options [Internet]. Available from: http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html (2014).
  32. Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).
  33. Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).
Зонд на основе ПЦР в реальном времени подходов к количественному измерению микроРНК
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J. Vis. Exp. (98), e52586, doi:10.3791/52586 (2015).More

Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J. Vis. Exp. (98), e52586, doi:10.3791/52586 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter