Summary
وصفنا بروتوكول لمراقبة كا 2+ ديناميكية في محطات محوار مبصرات مخروط باستخدام إعداد شريحة فيفو السابقين في شبكية العين الماوس. هذا البروتوكول يسمح دراسات شاملة للمخروط الكالسيوم 2+ الإشارات في نظام المهم نموذج الثدييات، والفأر.
Abstract
خلايا مستقبلة للضوء في شبكية العين مخروط (المخاريط) تخدم رؤية ضوء النهار وهي أساس تمييز الألوان. تخضع الأسعار لانحطاط، وغالبا ما تؤدي إلى العمى في كثير من أمراض شبكية العين. الكالسيوم (الكالسيوم 2+)، رسول الثاني رئيسيا في إشارة مستقبلة للضوء والتمثيل الغذائي، وقد اقترح أن تكون مرتبطة بشكل غير مباشر مع انحطاط مستقبلة للضوء في مختلف النماذج الحيوانية. دراسة منهجية هذه الجوانب من مخروط علم وظائف الأعضاء وأعيقت الفيزيولوجيا المرضية التي كتبها الصعوبات تسجيل كهربائيا من هذه الخلايا الصغيرة، ولا سيما في الماوس حيث تهيمن على شبكية العين عن طريق المستقبلات الضوئية قضيب. للتحايل على هذه المشكلة، أنشأنا اثنين من الفوتون الكالسيوم 2+ بروتوكول التصوير باستخدام خط الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن المشفرة وراثيا الكالسيوم 2+ جهاز الاستشعار البيولوجي TN-XL حصرا في الأقماع ويمكن تهجينها مع نماذج الماوس لانحطاط مبصرة. بروتوكول الموصوفة هنا ينطوي على إعداد المقاطع الرأسية (R20؛ شرائح ") من شبكية العين من الفئران والتصوير الضوئي من التغيرات أثار التحفيز الخفيفة في مخروط كا مستوى 2+. بروتوكول يسمح أيضا "في شريحة قياس" للمطلقة الكالسيوم 2+ تركيزات؛ كما التسجيلات يمكن اتباعها من قبل المعايرة. هذا البروتوكول يتيح الدراسات إلى خصائص مخروط وظيفية، ويتوقع أن تسهم في فهم مخروط الكالسيوم 2+ يشير فضلا عن تورط محتمل ل Ca 2+ في مبصرة الموت وتنكس الشبكية.
Introduction
الرؤية تبدأ مع تفعيل الناجم عن ضوء سلسلة phototransduction في المستقبلات الضوئية في شبكية العين. مبصرات قضيب تسمح الرؤية في ضوء المستويات المنخفضة، في حين أن خلايا مستقبلة للضوء مخروطية تتوسط اللون وعالية الدقة للرؤية ضوء النهار. العديد من الجينات مبصرة محددة عرضة للطفرات التي تؤدي إلى تدهور هذه الخلايا. وقد تم تحديد عدد من الواسمات الجزيئية المرتبطة مع فقدان مبصرة 1، ولكن حتى الآن الآليات الجزيئية مفصلة وتسلسل الأحداث لا تزال غير واضحة. وتكهن تغيير كا 2+ التوازن ليكون نقطة انطلاق لموت الخلايا المستقبلة للضوء، وهي الفرضية التي يدعمها تنظيم يصل لنشاط الكالسيوم 2+ معتمد على البروتياز calpain من نوع خلال 2،3 عملية انحطاط. ولكن، حتى الآن، لا تدعمها هذه الفرضية من قبل القياسات الفسيولوجية من الكالسيوم 2+. التناقضات في العديد من الدراسات حول تأثير الكالسيوم 2+ حاصرات قناة في إعادةمزيد من الطعن الأمراض tinal مشاركة الكالسيوم 2+ في موت الخلايا 4-6، داعيا إلى أساليب لتقييم مباشرة الكالسيوم 2+ في مبصرات مخروط الثدييات.
سابقا، وقد تم تنفيذ معظم تسجيل الكهربائية والدراسات التصوير الكالسيوم 2+ في نماذج من البرمائيات والزواحف بسبب سهولة الحصول على المخاريط 7-9. ومع ذلك، قد يكون الثدييات علم وظائف الأعضاء مبصرة يختلف عن ذلك من غير الثدييات 10 وخاصة، في سياق البشري تنكس الشبكية الوراثي، فهم أفضل من الثدييات علم وظائف الأعضاء مبصرة هو المفتاح لتطوير علاجات مبتكرة. كثيرة نماذج الماوس محاكاة أمراض الشبكية البشرية المتاحة ولكن لا يعرف الكثير عن الكالسيوم 2+ ديناميكية في المخاريط الماوس 11. التقنيات الكهربائية ليست مناسبة للتسجيلات عالية الإنتاجية من المخاريط، ولا سيما ليس في الفئران، حيث قضبان (~ 97٪) يفوق عدد كبير المخاريط (~ 3٪) 12 2+ التيارات ولكن ليس على الكالسيوم داخل الخلايا 2+ تركيزات المطلقة. وبالتالي، على الرغم من القرار الزماني أقل، والتصوير هو الأسلوب المفضل عند معالجة تساؤلات حول مخروط الكالسيوم 2+ ديناميات. القضية الرئيسية مع التصوير هي كيفية تسمية انتقائي المخاريط مع الكالسيوم الفلورسنت 2+ صبغ المؤشر. التقسيم السليم وخصوصية خلية من الصعب تحقيقه من خلال "الجزء الأكبر التحميل" الاصطناعية الكالسيوم 2+ الأصباغ المؤشر في الأنسجة. ونتيجة لذلك، والأقماع المسمى، قضبان 13،14، والخلايا الدبقية مولر لا يمكن تمييزها بشكل موثوق. أيضا، والأصباغ الاصطناعية تميل إلى يتسرب من الخلايا، ومنع التسجيلات لفترات طويلة في ظل ظروف مماثلة. وعلاوة على ذلك، وتحميل الاصطناعية مؤشرات الكالسيوم 2+ في شكل AM استر على إشكالية، لأنها تتطلب ديtergents (على سبيل المثال، DMSO) ويولد الفورمالديهايد 15. لالمطلقة الكالسيوم 2+ القياسات والمؤشرات ratiometric إلزامية. ومع ذلك، فإن أفضل مؤشر ratiometric الاصطناعية المتاحة حاليا FURA-2 يتطلب ضوء الإثارة في نطاق 700-760 نانومتر (لمدة الفوتون الإثارة)، والتي، اعتمادا على كثافة، ويمكن في حد ذاته تحفيز المخاريط، وبالتالي عرقلة دراسات مخروط الكالسيوم 2+ ديناميكية في ظل ظروف الإضاءة الفسيولوجية.
على عكس الأصباغ الاصطناعية، ويمكن التعبير عن المشفرة وراثيا الكالسيوم 2+ المؤشرات في نوع الانتقائي الخلية الطريقة. انهم لا يتسرب من الخلايا، وبالتالي، إذا تم تجنب التبييض، وقياسات ratiometric طويلة وموثوق بها أمر ممكن. عندما جنبا إلى جنب مع اثنين من الفوتون المجهري، يمثل نوع انتقائي الخلايا التعبير كا 2+ أجهزة الاستشعار أداة قوية لتقييم ودراسة دوين الخلوي الكالسيوم 2+ في ظل الظروف الفسيولوجية إلى حد كبير 13،16،17 2+ ديناميكية في المعدلة وراثيا الكالسيوم 2+ خط جهاز الاستشعار البيولوجي الماوس (HR2.1: TN-XL)، والذي يعبر عن القائم الحنق الكالسيوم 2+ جهاز الاستشعار البيولوجي TN-XL 18 انتقائي في المخاريط، تحت البشرية أوبسين الأحمر المروج HR2.1 19. للوصول إلى محطات مخروط، كان يعمل على إعداد شريحة الجسم الحي السابقين 20. تم بالفعل استخدام بروتوكول بنجاح في ثلاث دراسات على وظيفة مخروط في الفئران السليمة 10،21،22. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول يسمح بدراسة مخروط الكالسيوم 2+ يشير في ظروف جينية محددة، على سبيل المثال، من خلال تهجين نماذج الماوس لتنكس الشبكية الوراثي مع HR2.1: الفئران TN-XL.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية من التمسك بالمبادئ التوجيهية والقوانين لحماية الحيوانات التي تحددها الحكومة الاتحادية الألمانية والتي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان المؤسسية للجامعة توبنغن.
1. نماذج حيوانية
- HR2.1: TN-XL الكالسيوم 2+ جهاز الاستشعار البيولوجي الماوس
- استخدام HR2.1 المعدلة وراثيا: TN-XL خط الماوس يعبرون عن كا 2+ جهاز الاستشعار البيولوجي TN-XL بشكل انتقائي في خلايا مستقبلة للضوء مخروط 10. استخدام 3 - الفئران 6 أسابيع من العمر من كلا الجنسين أثار مع معيار 12 ساعة اليوم / ليلة الإيقاع.
2. الشبكية تشريح
- حل الفسيولوجية
- إعداد طازجة 2 L من حل خارج الخلية، التي تحتوي على 125 ملي كلوريد الصوديوم، و 2.5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 1.25 ملي ناه 2 PO 4 و 26 ملي NaHCO 3، 0.5 ملي L-الجلوتامين، و 20 ملم (+) الجلوكوز. خلط جميع المكونات حتى تذوب.
- "فقاعة" حل خارج الخليةمع carboxygen (95٪ O 2، 5٪ CO 2) ل5-10 دقيقة. إضافة CaCl 2 للوصول إلى تركيز 2 مم.
- بعد محتدما الحل خارج الخلية، وقياس درجة الحموضة. يجب أن يكون الأس الهيدروجيني 7.4، وإلا فمن المرجح أن أخطاء ارتكبت خلال إعداد الحل. الإبقاء على سعر وحل محتدما درجة حرارة ثابتة طوال التجربة لضمان درجة الحموضة المستمرة.
- فصل الأوراق المالية في 2 قوارير، واحدة للتشريح شبكية العين واحد لإعداد تسجيل (التروية).
- قلع العين والعزلة من شبكية العين (5-10 دقيقة)
- المحافظة على الإضاءة الخافتة الحمراء في مجال العمل لاستئصال. استخدام المصابيح مع طول موجة الذروة من 650 نانومتر (أو أكثر) لتجنب التبييض من المخاريط خلال تشريح.
- داكنة التكيف مع الماوس لمدة 2 ساعة عن طريق وضع قفصه في مربع lightproof جيد التهوية لضمان المخاريط توعية كاملة في وقت التسجيلات.
- تخدير الماوس تحت laboratoراي غطاء محرك السيارة مع isoflurane (5٪) باستخدام المرذاذ وحاوية غاز الضيق الذي يحمل قفص الماوس القياسية. اتبع التعليمات بعناية manufacturer's عند التعامل مع المرذاذ. استخدام قفازات وقناع الوجه للحد من التعرض لمسببات الحساسية.
- استخدام المجهر مجهر مع 10 - 40X التكبير للتشريح.
- التضحية الماوس مخدرة بقطع الرأس.
- للتوجيه، بمناسبة رأس كل عين (= الظهرية) مع قلم للماء. تتبع بشأن ما إذا كان استخدام العين إلى اليمين أو اليسار.
- إزالة العين بعناية باستخدام مقص منحني بقطع العصب البصري وراء مقلة العين. للتشريح، ونقل مقلة العين إلى طبق بتري تحتوي carboxygenated الطازجة حل خارج الخلية. لنقل مقلة العين، وعقد من قبل الجدعة العصب البصري.
- يخترق العين في أي نقطة على طول الحدود بين القرنية والصلبة (أي في مشرشر أورا) مع حقن إبرة حادة.
- عقد هأنتم في الصلبة مع زوج من الملقط وبلطف إدراج واحد مقص شفرة في حفرة المحرز في الخطوة السابقة. قطع على طول مشرشر أورا للفصل بين الجزء الأمامي من العين (القرنية، العدسة والجسم الزجاجي) من الجزء الخلفي (فنجان العين). قطع فنجان العين شعاعيا (نحو القرص البصري) في موقف للعلامة القلم للإشارة إلى موقف الظهرية على شبكية العين.
ملاحظة: أعد بهذه الطريقة، يمكن أن تبقى eyecups في حل carboxygenated باستمرار لاستخدامها لاحقا. - تحويل فنجان العين في طبق بتري بحيث الظهرية قطع نقطة بعيدا عن النفس. انتزاع الصلبة على اليسار وعلى الجانب الأيمن من فنجان العين مع زوج من ملقط كل بإدراج نصائح ملقط بين شبكية العين والصلبة.
- فصل الشبكية التي كتبها قلب بلطف الجزء الصلبة من فنجان العين. أخيرا، وقطع العصب البصري باستخدام مقص الجزئي تشريح لتحرير الشبكية من الصلبة.
ملاحظة: هذا هو خطوة حاسمة. تجنب تلف في الشبكية (على سبيل المثال، من خلالاللمس والضغط عليه مع ملقط). - عقد واحد من حواف الشبكية مع زوج من الملقط وبلطف إزالة الأنقاض والجسم الزجاجي من سطح الشبكية باستخدام الزوج الثاني من الملقط. عندما سطح الشبكية نظيف، استخدم الجزئي تشريح المقص لجعل ثلاثة أقصر، تخفيضات إضافية شعاعي (تقريبا كل 90 درجة). هذه التخفيضات تسمح لأحد لشد بعناية شبكية العين مع الجانب مبصرة لأسفل في طبق بتري (الشكل 1A).
- إعداد شريحة (10-15 دقيقة)
- إعداد مسبقا الأغشية مرشح النيتروسليلوز لشبكية العين تشريح وغطاء زجاجي زلات لتركيب شرائح ونقلهم إلى غرفة تسجيل. قطع نتروسليلوز غشاء مرشح في حوالي 10 × 5 مم قطع مستطيلة الحجم باستخدام المقص. قطع coverslips إلى قطع مستطيلة حوالي 10 × 5 مم الحجم باستخدام glasscutter.
- تزج ببطء شريحة زجاجية في حل خارج الخلية على مقربة منالأنسجة. بلطف، وسحب شبكية العين على شريحة زجاجية مع الجانب الخلايا العقدية من قبل الاستيلاء عليه في حافة جدا باستخدام زوج من الملقط. هذه العملية تقلل من الأضرار الميكانيكية وقابلة للطي من الأنسجة.
- اختر منطقة الشبكية التي تتعلق بمسألة البحوث المعنية (انظر أيضا مناقشة). تذكر، وقطع طويل مصنوع في الخطوة 2.2.9 يصادف النصف الشبكية الظهري (الشكل 1A). قطع مستطيلة، حوالي 1 × 2 مم الحجم قطعة من المنطقة الشبكية المحدد باستخدام شفرة مشرط المنحنية. تمحو الحل الزائدة حول الأنسجة.
- وضع غشاء مرشح على رأس قطعة من شبكية العين مثل أن الجانب الخلايا العقدية تلتزم الغشاء. على الفور، إضافة قطرة من المتوسط خارج الخلية على الغشاء إرفاق بحزم الأنسجة إلى الغشاء.
- نقل أنسجة الشبكية محمولة على الغشاء إلى غرفة التشريح التي تحتوي على حل خارج الخلية الطازجة.
- قطع شبكية العين إلى شرائح عمودية من 200 ميكرونسمك (الشكل 1B) باستخدام شفرة حلاقة جديدة تعلق على المروحية الأنسجة 23. تغيير شفرة لكل قطعة في شبكية العين.
ملاحظة: تحتاج شفرة حلاقة لتكون متسقة تماما مع سطح تشريح غرفة أسفل بحيث الغشاء كله انشقاقات في وقت واحد، كما هو مبين من قبل "النقر" سليمة عندما قطع - على خلاف ذلك النصل قد ينحني وتلف شريحة. - الغراء شريحة محمولة على غشاء واحد إلى غطاء زجاجي الانزلاق من خلال تطبيق عالية الشحوم فراغ إلى غشاء ينتهي فقط (الشكل 1C). الحفاظ على سطح الزجاج تحت شبكية العين خالية من الشحوم.
- إبقاء شرائح محمولة ساترة التي كتبها قطرة من حل خارج الخلية في غرفة عقد مغطاة - حاوية مغلقة وlightproof، عن مثل طبق بيتري مع غطاء مغطاة بورق الألومنيوم - في ظل جو carboxygen في RT. إدخال carboxygen التي ظهرت على السطح خزان المياه الصغيرة للحفاظ على الجو في عقدترطيب الغرفة؛ هذا يمنع شرائح من الجفاف.
- السماح شرائح للراحة في الغرفة بعقد لمدة 10 - 15 دقيقة قبل أن ينتقل منها (واحدة تلو الأخرى) إلى غرفة تسجيل. يمكن الحفاظ على شرائح تصل إلى 4-5 ساعات في عقد الغرفة في RT (~ 21 ° C).
3. ثنائي الفوتون الكالسيوم 2+ التصوير
- ثنائي الفوتون المجهري
- استخدام المجهر الهدف المنقول (MOM) من نوع المجهر ثنائي الفوتون. وقد وصفت كلا إجراءات التصميم والتصوير MOM في وقت سابق 24، لمزيد من التفاصيل انظر أيضا 10،21،25 (عن مصادر والشركات، انظر الجدول 1).
ملاحظة: أي تستقيم المجهر ثنائي الفوتون يلبي متطلبات الحد الأدنى التالية يمكن استخدامها: يتعين أن تكون مجهزة مع (أ) ليزر نابض يمكن تقسيمه وتضبيطه إلى ~ 860 نانومتر، (ب) ما لا يقل عن اثنين من القنوات مضان المكتسبة في وقت واحد، (ج ) مرشحات للeCFP والسترين مضان، (د)مشجعا الخفيف (لتصاميم الممكنة، انظر 24،26)، و (ه) والبرمجيات التي تسمح تسجيل تسلسل الصور-ساقطا الوقت بمعدل زمنية كافية لحل كا 2+ إشارات من الفائدة. - بدء تشغيل نظام التصوير ثنائي الفوتون كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة. اتبع بدقة إرشادات السلامة ليزر للمنشأة. بدء تشغيل الليزر وتصل قيمتها إلى ~ 860 نانومتر.
- نقل شريحة من غرفة القابضة إلى غرفة تسجيل والبدء فورا perfusing مع حل خارج الخلية carboxygenated. الحفاظ على معدل تدفق نضح من 2 مل / دقيقة ودرجة حرارة 37 ° C في غرفة تسجيل.
- استخدام NA الهدف الغمر بالماء 20X 0.95. إذا كانت متوفرة، استخدم كاميرا CCD في تركيبة مع الأشعة تحت الحمراء الصمام أدناه غرفة تسجيل لتحديد شريحة الشبكية (الشكل 2). تحديد خلاف ذلك شريحة باستخدام التصوير ثنائي الفوتون (انظر 3.1.5).
- التبديل إلى اثنين من الفوتون التصوير لعرض جهاز الاستشعار البيولوجي التعبير. شغلالقنوات كشف اثنين للتصوير مضان من eCFP والسترين.
- استخدام البرنامج الحصول على الصور التي تسيطر على مجهر ثنائي الفوتون لمسح وتحديد صف من محطات مخروط لتسجيل (الشكل 3A). مجموعة الحصول على الصور إلى 128 × 16 بكسل الصور (31.25 هرتز) أو تكوين مماثل. تقييد المنطقة الممسوحة ضوئيا إلى محطات مخروط لتجنب تبييض photopigments في قطاعات الخارجي.
ملاحظة: ل-XL TN استشعار الكالسيوم (τ = ~ 0.6 ثانية ل Ca 2+ ملزمة، τ = ~ 0.2 ثانية ل Ca 2+ غير ملزم؛ انظر 16) الحد الأدنى للمعدل إطار ~ 8 هرتز يوصى.
- استخدام المجهر الهدف المنقول (MOM) من نوع المجهر ثنائي الفوتون. وقد وصفت كلا إجراءات التصميم والتصوير MOM في وقت سابق 24، لمزيد من التفاصيل انظر أيضا 10،21،25 (عن مصادر والشركات، انظر الجدول 1).
- التحفيز خفيفة والتسجيل
- استخدام مرحلة شبه كامل الحقل ضوء مشجعا كما هو موضح في مكان آخر 10،21،26 لتنفيذ الخطوات التالية.
ملاحظة: هناك حل بسيط للمشجعا ضوء كامل الحقل هو استخدام اثنين من المصابيح مرور تصفيتها الفرقة (على سبيل المثال، "الأزرق": 360 BP 12، "الخضراء": 578 BP 10)التي تتطابق مع الحساسيات الطول الموجي من المخاريط الماوس ولكن في نفس الوقت لا تتداخل مع الفلاتر المستخدمة للكشف عن مضان (راجع. 3.2.4). وتركز الضوء من المصابيح التي كتبها المكثف من خلال الجزء السفلي من غرفة تسجيل (الشكل 2). لمزيد من التفاصيل على هذا التصميم مشجعا والمعايرة لها، وشدة الضوء المستخدمة وأثار مخروط معدلات الصور الأزمرة، انظر 10،21،26. - بدوره على الليزر والسماح المخاريط على التكيف مع الليزر المسح الضوئي وضوء خلفية التحفيز (20 - 30 ثانية، وانظر أيضا المزالق المحتملة) قبل تقديم المحفزات ضوء (انظر 3.2.3) أو تطبيق وكلاء الدوائية.
- بدء تقديم المحفزات التعسفي (على سبيل المثال، ومضات من الضوء، كما هو مبين في الشكل 3B، C). في حالة مشجعا هو موضح في الخطوة 3.2.1، توليد مؤثرات عن طريق تحوير شدة المصابيح اثنين على مر الزمن باستخدام لوحة المعالجات الدقيقة التي تسيطر عليها برامج مخصصة (لمزيد من التفاصيل، انظر 10،21،26).
- بدء تسجيل القنوات مضان اثنين (على سبيل المثال، في 483 نانومتر ل "الأزرق" الحنق الجهات المانحة eCFP وعلى 535 نانومتر ل "الأصفر" الحنق متقبل؛ لالمواصفات انظر الجدول 1) في وقت واحد باستخدام منها برنامج الحصول على الصور (انظر أيضا 3.1 0.6). على سبيل المثال، في حالة ومضات ضوء (الشكل 3B، C)، وسجل لا يقل عن 8 - 10 عروض التحفيز (تجارب).
- استخدام مرحلة شبه كامل الحقل ضوء مشجعا كما هو موضح في مكان آخر 10،21،26 لتنفيذ الخطوات التالية.
- "في شريحة" كا 2+ المعايرة
- سجل الكالسيوم 2+ إشارات في المحطات مخروط (كما هو موضح في 3.1.6 و3.2.4) واستخراج خط الأساس مستوى الكالسيوم في 2+ مجموعة من المخاريط (كما هو موضح في 3.4).
- (بدلا من ذلك، BAPTA أو،) وأضاف التحول إلى "كا 2+ الحر" المتوسطة خارج الخلية مع 5 ميكرومتر ionomycin (الذائبة في DMSO) و 10 ملي EGTA. محطات سجل مخروط مرة أخرى في كل 5 دقائق لتحديد نسبة الحد الأدنى من مضان (R دقيقة)، <م> أي نسبة في (قرب) غياب الكالسيوم داخل الخلايا 2+. وهذا قد يستغرق ما بين 15-30 دقيقة.
ملاحظة: مطلوب نظام الارواء التي تسمح التبديل بين مختلف الخزانات. - التبديل إلى متوسطة خارج الخلية مع 5 ميكرومتر ionomycin (الذائبة في DMSO) و 2.5 ملي كا 2+. بعد فترة حضانة من 5 دقائق، والأقماع سجل مرة أخرى في كل 5 دقائق لقياس نسبة القصوى مضان (R كحد أقصى)، أي نسبة في وجود تشبع تركيزات الكالسيوم داخل الخلايا 2+. بعد تطبيق ionomycin، فإنه قد يستغرق ما بين 3-15 دقيقة لنسبة الكالسيوم 2+ لتصبح مستقرة.
ملاحظة: فضح شرائح لارتفاع الكالسيوم 2+ وionomycin لفترة أطول سيضر في النهاية الخلايا. وتشمل الخلايا الوحيدة في التحليل التي تحتفظ التشكل وضعها الطبيعي. قد تحتاج إلى أن تتكيف تركيزات (أي EGTA، ionomycin). لمزيد من التفاصيل حول معايرة الكالسيوم 2+بروتوكول، انظر 13،17.
- تحليل البيانات
ملاحظة: استخدام ومعالجة الصور وتحليل البيانات مجموعة من البرامج المتوافقة مع البرنامج المجهر المعنية والقادرة على تشغيل البرامج النصية تحليل المخصصة.- تحميل ملف بيانات التصوير ورسم المناطق ذات الاهتمام (رويس) حول كل محطة مخروط (الشكل 3A). لكل إطار، ومتوسط كثافة مضان داخل ROI وطرح مضان الخلفية، قبل احتساب نسبة (R) بين الحنق متقبل (السترين) والجهات المانحة (eCFP) مضان (R = F A / F D؛ الشكل 3B، C). وعادة ما تستخدم هذه النسبة كمؤشر لالنسبي داخل الخلايا تركيز الكالسيوم 2+، ولكن بعد معايرة (انظر 3.3)، أيضا تركيزات المطلقة يمكن تقدير (انظر 3.4.3).
ملاحظة: يمكن التعرف على السويقات التي كتبها موقعها في طبقة ضفيري الخارجي والتشكل (بالارض نوعا ما "النقط" أصغر من مخروطsomata، وتقع في نهاية محور عصبي مخروط). - تجارب التحفيز متوسط (الشكل 4A). استخراج المعلمات استجابة من آثار المتوسط (الشكل 4B)، مثل الكالسيوم مستوى خط الأساس 2+ (قاعدة R) قبل التحفيز الضوء، السعة الذروة (R أمبير)، والمنطقة تحت المنحنى (R A) عن اتخاذ تدابير لحجم الاستجابة. أيضا، استخراج حركية رد من آثار المتوسط، مثل ارتفاع استجابة (ر الارتفاع) والوقت تسوس (ر الاضمحلال) (= فترات زمنية كل منها ما بين 20٪ و 80٪ من R أمبير؛ انظر الشكل في الشكل 4B). لمزيد من المعلومات حول كيفية تحديد هذه المعايير، انظر 10.
- حساب تقدير للمخروط المطلق الكالسيوم تركيز 2+ على أساس القياسات من الخطوات 3.3.1-3.3.3. استخدام نسب الحد الأدنى والحد الأقصى تركيز الكالسيوم 2+، R دقيقة وR كحد أقصى، على التوالي، مضان المانحة في كاليفورنيا 2+ D، متجهة الى كاليفورنيا) و-unbound (F D، خالية من الكالسيوم) دولة، وكذلك في الجسم الحي التفكك المستمر (K = 0.77 د، يرى 16) لTN-XL بما يلي المعادلة (التماثلي إلى 27):
- تحميل ملف بيانات التصوير ورسم المناطق ذات الاهتمام (رويس) حول كل محطة مخروط (الشكل 3A). لكل إطار، ومتوسط كثافة مضان داخل ROI وطرح مضان الخلفية، قبل احتساب نسبة (R) بين الحنق متقبل (السترين) والجهات المانحة (eCFP) مضان (R = F A / F D؛ الشكل 3B، C). وعادة ما تستخدم هذه النسبة كمؤشر لالنسبي داخل الخلايا تركيز الكالسيوم 2+، ولكن بعد معايرة (انظر 3.3)، أيضا تركيزات المطلقة يمكن تقدير (انظر 3.4.3).
Representative Results
من خلال الجمع بين شرائح عمودية (الشكل 1) التي أعدت من HR2.1: TN-XL الماوس شبكية العين مع اثنين من الفوتون التصوير (الشكل 2)، تمكنا من إجراء قياسات ratiometric من ضوء أثار التحفيز الكالسيوم 2+ إشارات في محطات محوار مخروط مبصرة . هذا النهج يمثل تحسنا كبيرا في الوصول إلى تصور والمخاريط الماوس فوق أساليب التصوير الضوئية الموجودة مسبقا مع الاصطناعية مؤشرات الكالسيوم 2+. على سبيل المثال، والتعبير عن مخروط محددة من الكالسيوم ratiometric المشفرة وراثيا 2+ جهاز الاستشعار البيولوجي TN-XL سهلت كثيرا من تحديد محطات مخروط محور عصبي (انظر رويس في الشكل 3A). لذلك، لدينا بروتوكول يزيل خطر إشارات تسجيل الأصل غير واضح، على سبيل المثال إشارات "مختلطة" مع مساهمات من كل مخروط وقضيب محور عصبي المحطات.
نهجنا يسمح حل ردود احد للمحاكمة في مستوى indiviالمزدوج محطة مخروط محور عصبي. ويتميز النتوء الخفيف أثار كا 2+ من محطة مخروط بزيادة ونقصان في المانحة ومتقبل مضان، على التوالي (الشكل 3B). انخفاض في نسبة مضان (R) يتوافق مع قذف الكالسيوم 2+ من محطة مخروط (الشكل 3C)، الناجم عن فرط الاستقطاب الناجم عن الضوء للمخروط وإغلاق لاحق من الجهد بوابات الكالسيوم 2+ القنوات. لأنه لا يمكن رصدها عدة محطات مخروط محور عصبي في وقت واحد (الشكل 3A)، الحصول على البيانات فعال جدا ومئات من الردود مخروط الكالسيوم 2+ يمكن جمعها في تجربة واحدة. من خلال تقييم هذه الردود كميا (الشكل 4)، مخروط الكالسيوم 2+ إشارات يمكن مقارنتها وتقييمها في مجموعة من الظروف (انظر مناقشة).
غالبا ما يكون كافيا لاستخدام النسبة بين الحنق متقبل (السترين) و-donor (eCFP) مضان(F A / F D؛ لمزيد من التفاصيل، انظر 3.4) كإجراء النسبي من الخلايا مستوى الكالسيوم 2+. ومع ذلك، وكلما لزم الأمر، يمكن معايرة نسبة الحصول المطلقة الكالسيوم داخل الخلايا 2+ تركيزات ([كا 2+]) (الشكل 5). في الإضاءة الخلفية المستخدمة في هذا البروتوكول (لمزيد من التفاصيل، انظر 10 والشكل 3 أسطورة)، أسفرت عن معايرة تقديرا ليستريح المطلق [كا 2+] في "البرية من نوع" HR2.1: TN-XL محطات الماوس مخروط 243 ± 159 نيوتن متر (يعني ± SD)، والذي هو ضمن نطاق ذكرت بالنسبة للفئران في الأدب (11).
الشكل 1. إعداد شرائح الشبكية العمودية. (A) معزولة وسوت شبكية العين أعدت للتشريح. (B) قطعة مستطيلة من شبكية العين (قه ه المربع الأحمر في A) التي شنت على غشاء رقة الترشيح (رمادي غامق) تشريح بعد. (C) أعلى نظرا للشريحة الشبكية محمولة على غشاء ثابتة على ساترة الزجاج باستخدام الشحوم. (D) الرسم التخطيطي لجزء من شريحة الشبكية (انظر الإطار الأحمر في C). يشار إلى مبصرات مخروط باللون الأخضر. V، بطني. D، الظهرية. N، الأنف. T والزمنية. OS، الجزء الخارجي؛ ONL، طبقة النووية الخارجي؛ اوبل، طبقة ضفيري الخارجي؛ INL، طبقة النووية الداخلية. IPL، طبقة ضفيري الداخلية؛ GCL، طبقة الخلايا العقدية. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. ثنائي الفوتون التصوير من شرائح الشبكية: رسم توضيحي لتكوين تسجيل أعلى: مياه الغمر عدسة موضوعية تركز على أن يكونصباحا من الليزر المسح الضوئي (أحمر السهم نحو الانخفاض) في شبكية العين، وجمع مضان المنبعثة (الأسهم الصاعدة). عدسة ايضا تجمع تنتقل عن طريق الأشعة تحت الحمراء من LED الإضاءة التي شنت تحت المكثف عند تصوير شريحة باستخدام كاميرا CCD المركز:. شريحة الشبكية التي تقام في غرفة تسجيل ومع perfused حل خارج الخلية أسفل: عدسة المكثف تركز الضوء من المصابيح التحفيز (وLED الأشعة تحت الحمراء للتصوير كاميرا CCD) من خلال الجزء السفلي شفاف للغرفة تسجيل في أنسجة الشبكية. IR LED، الأشعة تحت الحمراء الصمام الثنائي الباعثة للضوء. CCD، جهاز إلى جانب المسؤول. BP، الفرقة تمرير. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. خفيفة إستدعردود د كا 2+ في محطات محوار من المستقبلات الضوئية الماوس مخروط. (A) بقي من الزمن: تركز تسجيلات على المحطات متشابك (مربع أحمر) من مبصرات مخروط (الأخضر) في شرائح الشبكية الحق: مثال لمنطقة تسجيلها مع 7 محطات الفردية. وسجلت مضان باستخدام قناتين: واحد للالسترين الحنق متقبل (أعلى؛ 535 BP 50) واحد للالحنق الجهات المانحة eCFP (أسفل؛ 480 BP 32) (B) التغييرات الخفيفة، أثار في السترين (F A) وeCFP (F D) مضان سجلت في ROI واحد. الردود (C) كا 2+ (كنسبة F A / F D) من محطة مخروط لسلسلة من 1 ثانية ومضات الضوء الساطع في 5 فترات ثانية. العائد على الاستثمار، والمنطقة في المصالح؛ BP، وتصفية الفرقة تمرير؛ F، كثافة مضان. الاتحاد الافريقي، وحدات التعسفي. الحنق، فورستر نقل الطاقة الرنين. eCFP، وتعزيز البروتين مضان سماوي. كثافة التحفيز (كما صمعدل النموذجية المتعلقة بصحة-المماكبة في 10 3 · ف · ق -1 في مخروط): 13.0 و 12.8 لM- وS-opsins، على التوالي، مضيفا على مستوى الخلفية (= المصابيح قبالة والمسح الضوئي الإثارة ليزر) 10 ~ الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. التحليل الكمي المثالية لمخروط أثار الخفيف الكالسيوم 2+ الردود (A) خفيفة أثار كا 2+ الردود (كما ΔR) من محطة مخروط واحدة (المحاكمات واحدة: آثار الرمادية، ن = 16؛ يعني: أثر أسود ) (B) المعلمات لتحديد متوسط الكالسيوم 2+ رد: يستريح الكالسيوم 2+ مستوى (قاعدة R) الذي يمثل خط الأساس قبل التحفيز الخفيفة، حجم الاستجابة كما ARعصام قيد منحنى (R A) وذروة السعة (R أمبير)، حركية بداية استجابة (ر الارتفاع، الفاصل الزمني من 20٪ إلى 80٪ من R أمبير) وتعويض (ر الاضمحلال، والفاصل الزمني من 80٪ 20٪ من R أمبير). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. تقدير المطلق تركيز الكالسيوم 2+. يستريح الكالسيوم 2+ تركيز ([كا 2+]، ونسبة F A / F D) المسجلة في محطات محوار 8 مخروط في الماوس TN-XL (الدوائر، مع متوسط ± SD) لمختلف الحلول خارج الخلية: مرتين في القياسية المتوسطة خارج الخلية (السيطرة 1 و 2)، ثم مع الحد الأدنى ("صفر") [كا 2+] (10 ملي EGTA) لد مع ارتفاع [كا 2+] (2.5 ملم)، وهذا الأخير شرطين في وجود 5 ميكرومتر ionomycin لكي تتوازن خارج الخلية والكالسيوم داخل الخلايا 2+. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
موجودة مسبقا البروتوكولات باستخدام التسجيلات وحيدة الخلية الكهربية أو الكالسيوم 2+ التصوير مع مؤشرات الفلورسنت الاصطناعية تكافح لتسجيل كا 2+ ديناميكية في الماوس مبصرات مخروط لعدد من الأسباب الفنية (انظر المقدمة). بروتوكول الموصوفة هنا يسمح قياس الكالسيوم 2+ الإشارات وحتى المطلقة مستويات الكالسيوم في 2+ الفردية، حدد المحطات الماوس مخروط بطريقة فعالة وبسيطة نسبيا.
وقد تم بالفعل استخدام هذا البروتوكول بنجاح في ثلاثة الدراسات التي تتناول جوانب مختلفة من وظيفة مخروط في شبكية العين الماوس صحية. في الدراسة الأولى 10، وHR2.1: تميزت TN-XL الماوس باستخدام المناعية، تسجيلات أرج، واثنين من الفوتون الكالسيوم 2+ التصوير، والصيدلة، وتبين أن التعبير مخروط محددة من جهاز الاستشعار البيولوجي الكالسيوم 2+ لا يعيق تشريح مخروط وظيفة. في الدراسة الثانية 21، لونيوتم تعيين خصائص استجابة الوني من المخاريط الماوس عبر شبكية العين، مما يدل على الاختلافات البارزة في وظيفة مخروط بين "الأخضر" الظهرية التي يهيمن عليها أوبسين و "الزرقاء" بطني شبكية العين الماوس التي يهيمن عليها أوبسين. هذه الاختلافات الإقليمية في خصائص مخروط الملائمة توزيع الفرق التباين في البيئة الطبيعية (أي السماء مقابل الأرض)، مما يشير إلى أن أنواع الأطياف المختلفة من المخاريط الماوس تنص على (قرب) أخذ العينات المثلى من التناقضات الوني، وبالتالي، قد تقدم ميزة تطورية. وفي الدراسة الثالثة 22 ردود الفعل المتبادل أن محطات مخروط محور عصبي تتلقى من الخلايا الأفقية والتحقيق فيها. وجميع آليات التغذية المرتدة الخلايا الأفقية المقترحة تعمل على الجهد بوابات الكالسيوم 2+ القنوات في محطات مخروط محور عصبي 28، محطة مخروط الكالسيوم 2+ يمكن أن تكون بمثابة وكيل لالأفقية الخلية الى مخروط التفاعلات. الدراسة التي Kemmler وزملاء العمل 22 دعاماتويرى أن الخلايا الأفقية تستخدم نظام التغذية المرتدة معقدة تتألف من عدة آليات للسيطرة على مستقبلة للضوء الإفراج الغلوتامات.
وتوضح هذه الدراسات براعة بروتوكول صفها وتبين أنه يمكن تكييفها لمجموعة واسعة من المسائل المتعلقة ظيفة مخروط ودوائره متشابك. وبالإضافة إلى ذلك، فإن البروتوكول يتيح يدرسون المحلية كا 2+ يشير في المقصورات مخروط مختلفة، من أجل التوصل إلى فهم أفضل للمخروط علم وظائف الأعضاء. هذه المعرفة هي مهمة لفهم العمليات الفيزيولوجية المرضية في المخاريط التردي، للسماح في نهاية المطاف لتنمية عقلانية النهج العلاجية المحتملة، ولا سيما بالنسبة للأمراض التنكسية التي تؤثر على المخاريط.
في HR2.1: TN-XL خط الماوس، وأعرب عن كا 2+ جهاز الاستشعار البيولوجي في جميع أنحاء مخروط، باستثناء الجزء الخارجي. وهذا يوفر فرصة للتقييم المباشر وratiometric من الكالسيوم 2+ ديناميكيةالصورة في مقصورات مخروط مختلفة. منذ التغييرات في كا تنعكس 2+ التيارات في الجزء الخارجي في المحطات عبر غشاء المحتملة وتفعيل الناتجة من الجهد بوابات الكالسيوم 2+ القنوات والعمليات في الجزء الخارجي يمكن ملاحظة غير مباشرة.
المزالق المحتملة:
تشريح شبكية العين هو خطوة حاسمة: في الماوس، وشبكية العين يفصل من فنجان العين عادة بين قطاعات مبصرة الخارجي والظهارة الصبغية. لذلك، تتعرض مبصرة حساسة للضوء شرائح الخارجية للشبكية العين معزولة وحساسة للغاية لالتلف الميكانيكي. يجب توخي الحذر الشديد لا يلحق الضرر عن طريق لمس الجانب مبصرة مع الأدوات أو عن طريق تحريك الأنسجة جانبية على سطح لاصق (على سبيل المثال، غشاء فلتر).
ويمكن التعرف على شرائح الشبكية عالية الجودة تحت المجهر من قبل سطح القطع نظيفة وبواسطة طبقة مبصرة منظمة تنظيما جيدا مع قطاعات الخارجية واضحة المعالم. التقييم الوظيفي للجودة شريحة يمكن القيام به بسرعة من خلال إضاءة مؤثرات الضوء الساطع وتحديد نسبة من المخاريط تستجيب (على سبيل المثال، في مجال الرؤية مع 10-20 المخاريط). هنا، يجب أن يتم تقييم نوعية استجابة عن طريق حساب نسبة الإشارة إلى الضوضاء (S / N) (السعة من الضوضاء الأساسي قبل الحافز ضوء مقابل مدى الاستجابة الخفيفة)؛ وينبغي النظر في 3 كحد ادنى عتبة - وS / N من 2. عادة، ونحن تجاهل شرائح مع المخاريط تستجيب أقل من 50٪. شرائح أيضا مع الأقماع التي تعرض المفرط السلوك العفوي ارتفاعه (انظر الشكل 4 في 10) وينبغي التخلص منها.
شرائح في غرفة تسجيل تلبي معايير التشريحية والوظيفية المذكورة أعلاه تظهر استجابات متسقة ل1-2 ساعة (لمزيد من التفاصيل على اتساق الاستجابة، انظر 10). لأن شرائح البقاء على قيد الحياة لحبلدنا في غرفة القابضة، ويمكن تجربة ناجحة تستغرق ما يصل الى 6 ساعات. ومن الجدير بالذكر أن هناك بعض القيود فيما يتعلق بدراسة تتراوح طويلة التفاعلات المكانية بين الأقماع والخلايا الأفقية، كما تشريح يقطع حتما الاتصالات الجانبية في شبكات الشبكية. إلا أن زيادة سمك شرائح الشبكية إلى 300 ميكرومتر إلى التقليل هذه المسألة 22.
استخدام شرائح الشبكية العمودية يتجنب مسح مخروط حساسة للضوء شرائح الخارجي بواسطة الليزر الإثارة، وبالتالي يمنع إلى حد كبير تبيض أوبسين (للمناقشة مستفيضة، انظر 10،21). ومع ذلك، فإن سجلت الكالسيوم 2+ إشارات يعتمد ليس فقط على مؤثرات الضوء، ولكن أيضا الحصول على المتضررين من عنصر الإضاءة الخلفية التي تم إنشاؤها بواسطة الليزر المسح الإثارة. في الواقع، فإن الإضاءة الخلفية فعالة في مثل هذه التجارب التصوير ثنائي الفوتون هو مزيج من ضوء الليزر متناثرة، وعلى ضوء الفلورسنت المنبعثة من م سجلتLLS، وأي مكون الخلفية LED التحفيز. ولذلك، ينبغي أن يسمح المخاريط للتكيف لا يقل عن 20 - 30 ثانية لمسح الليزر (مع المكون خلفية التحفيز ضوء تشغيل) قبل التسجيل.
المزايا والتطبيقات:
في حين أن بعض التطبيقات لهذا المخروط الكالسيوم 2+ بروتوكول -imaging وقد وصفت أعلاه 10،21،22، تطبيقات أخرى يمكن تصوره: الدراسات الدوائية في تركيبة مع مخروط الكالسيوم 2+ التصوير قد تحقق كا 2+ مسارات إشارات في الأقماع ويمكن أن تكون استخدامها لاختبار فعالية وفاعلية من العقاقير التي تستهدف مختلف اللاعبين في كا 2+ -signaling 10. ومع ذلك، قد يكون مفتاح التطبيق لدراسة الأمراض التي تصيب ظيفة مخروط. تتوفر العديد من النماذج تنكس الشبكية الماوس محاكاة الأمراض التي تصيب الإنسان. على سبيل المثال، (cpfl 1) الماوس فقدان مخروط مبصرة 1 هو مخروط الأساسي نموذج انحطاط المعاناةمن طفرة Pde6c 29. على العكس، فإن الماوس قضيب انحطاط 1 (الثالثة 1) يعاني من طفرة Pde6b. في حين أن هذا يسبب قضيب الأساسي مبصرة انحطاط 30، بمجرد الانتهاء من الثالثة 1 قضيب الخسارة، الثانوية مجموعات انحطاط مخروط في 1. تهجين هذه الحيوانات مع HR2.1: سوف TN-XL خط تسمح دراسة ومقارنة كا 2+ ديناميكية في كل من انحطاط مخروط الابتدائي والثانوي، ومن المرجح أن توفر معلومات قيمة حول دور الكالسيوم 2+ خلال موت الخلايا المخروطية. أيضا، التي يسببها دواء انحطاط مخروط - على سبيل المثال باستخدام مثبطات انتقائية PDE6 - قد تساعد على تحديد الآليات المصب من انحطاط مخروط 10،29،31.
باختصار، وصف بروتوكول هنا يسمح قياس الكالسيوم 2+ في مقصورات التحت خلوية من المستقبلات الضوئية الماوس مخروط، ويقدم فرصا كبيرة للكشف عن مخروط علم وظائف الأعضاء في إطار مجموعة واسعةمن الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص وكلاء الدوائية مصممة لتتداخل مع مخروط الكالسيوم 2+ -signaling وبالتالي تساعد على إنشاء علاجات جديدة لأمراض مخروط.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High vacuum grease | Dow Corning | 1018817 | http://www.dowcorning.com |
| Cover slips | R. Langenbrinck | 24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com | |
| Glass slides | R. Langenbrinck | 76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com | |
| Blades for tissue chopper | MARTOR KG | ARGENTAX No. 1044 | 0.25 mm; http://www.martor.de |
| Tissue chopper | Custom-build | Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert | |
| Nitrocellulose filter membrane gridded | Merck Millipore | AABG01300 | Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com |
| Isoflurane CP | CP pharma | AP/DRUGS/220/96 | http://www.cp-pharma.de |
| UV/green LED-based full-field stimulator | Custom-build | for details, see10 | |
| Open source microprocessor board | Arduino | http://www.arduino.cc | |
| Imaging software CfNT | Custom-written | developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany | |
| IgorPro | Wavemetrics | http://www.wavemetrics.com | |
| VC3-4 System focal perfusion system | ALA Scientific Instrument | with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/ | |
| Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser) | Newport Spectra-Physics | http://www.spectra-physics.com | |
| Movable objective microscope (MOM), Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany |
Sutter Instruments | http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XLUMPlanFL 20X/0.95w objective | Olympus | http://www.olympusamerica.com | |
| Vaporizer 100 series | Surgivet | http://www.surgivet.com | |
| Ionomycin, Calcium salt | Life technologies | I24222 | http://www.lifetechnologies.com |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | https://www.sigmaaldrich.com |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 101191250 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Leica MZ95 | leica microsystems | http://www.leica-microsystems.com/ |
References
- Trifunovic, D., et al. Neuroprotective strategies for the treatment of inherited photoreceptor degeneration. Current Molecular Medicine. 12, 598-612 (2012).
- Paquet-Durand, F., et al. Calpain is activated in degenerating photoreceptors in the rd1 mouse. Journal of Neurochemistry. 96, 802-814 (2006).
- Paquet-Durand, F., et al. A key role for cyclic nucleotide gated (CNG) channels in cGMP-related retinitis pigmentosa. Human Molecular Genetics. 20, 941-947 (2011).
- Frasson, M., et al. Retinitis pigmentosa: rod photoreceptor rescue by a calcium-channel blocker in the rd mouse. Nature Medicine. 5, 1183-1187 (1999).
- Bush, R. A., Kononen, L., Machida, S., Sieving, P. A. The effect of calcium channel blocker diltiazem on photoreceptor degeneration in the rhodopsin Pro213His rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 2697-2701 (2000).
- Pawlyk, B. S., Li, T., Scimeca, M. S., Sandberg, M. A., Berson, E. L. Absence of photoreceptor rescue with D-cis-diltiazem in the rd mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 1912-1915 (2002).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors. The Journal of General Physiology. 113, 267-277 (1999).
- Choi, S. Y., et al. Encoding light intensity by the cone photoreceptor synapse. Neuron. 48, 555-562 (2005).
- Krizaj, D. Calcium stores in vertebrate photoreceptors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 873-889 (2012).
- Wei, T., et al. Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 32, 6981-6994 (2012).
- Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Molecular Vision. 13, 887-919 (2007).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18, 8936-8946 (1998).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nature Protocols. 1, 1057-1065 (2006).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46, 143-151 (2008).
- Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290, 527-528 (1981).
- Hendel, T., et al. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro. The Journal of Neuroscience. 28, 7399-7411 (2008).
- Dreosti, E., Odermatt, B., Dorostkar, M. M., Lagnado, L. A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo. Nature Methods. 6, 883-889 (2009).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90, 1790-1796 (2006).
- Wang, Y., et al. A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes. Neuron. 9, 429-440 (1992).
- Connaughton, V. P. Zebrafish retinal slice preparation. Methods in Cell Science. 25, 49-58 (2003).
- Baden, T., et al. A tale of two retinal domains: near-optimal sampling of achromatic contrasts in natural scenes through asymmetric photoreceptor distribution. Neuron. 80, 1206-1217 (2013).
- Kemmler, R., Schultz, k, Dedek, K., Euler, T., Schubert, T. Differential regulation of cone calcium signals by different horizontal cell feedback mechanisms in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 34, 11826-11843 (2014).
- Werblin, F. S. Transmission along and between rods in the tiger salamander retina. The Journal of Physiology. 280, 449-470 (1978).
- Euler, T., et al. Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 457, 1393-1414 (2009).
- Baden, T., Berens, P., Bethge, M., Euler, T. Spikes in mammalian bipolar cells support temporal layering of the inner retina. Current Biology. 23, 48-52 (2013).
- Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).
- Thoreson, W. B., Mangel, S. C. Lateral interactions in the outer retina. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).
- Trifunovic, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).
- Sahaboglu, A., et al. Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms. Cell Death & Disease. 4, e488 (2013).
- Sahaboglu, A., et al. PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function. PloS One. 5, e15495 (2010).
