イメージングカルシウム Published: May 6, 2015 doi: 10.3791/52588

DOI

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Manoj Kulkarni^1,2, Timm Schubert^1,3, Tom Baden^1,2,3, Bernd Wissinger^4,5, Thomas Euler^1,2,3, Francois Paquet-Durand¹

¹Institute for Ophthalmic Research, University of Tübingen, ²Graduate School of Cellular & Molecular Neuroscience, University of Tübingen, ³Bernstein Centre for Computational Neuroscience, University of Tübingen, ⁴Molecular Genetics Laboratory, University of Tübingen, ⁵Centre for Ophthalmology, University of Tübingen

Summary

我々は、マウス網膜のex vivoでのスライス標本を用いて、錐体光受容体の軸索末端におけるCa ²⁺動態を監視するためのプロトコルを記述します。このプロトコルは、重要な哺乳動物モデル系におけるコーンのCa ²⁺シグナル伝達の包括的研究、マウスを許可します。

Abstract

網膜錐体視細胞（コーン）昼光のビジョンを提供し、色判別の基礎となっています。彼らはしばしば、多くの網膜疾患で失明につながる、変性の対象となっています。カルシウム（Ca ^2+）、光受容体シグナル伝達および代謝において重要なセカンドメッセンジャーは、間接的に種々の動物モデルにおける光受容体変性と関連することが提案されています。体系コーン生理学および病態生理学のこれらの側面を研究することは、網膜が桿体によって支配されているマウスでは、特に、電気的にこれらの小さな細胞から記録することの難しさによって妨げられてきました。この問題を回避するために、我々はコーンでのみ遺伝的にコードされたCa ²⁺のバイオセンサーTN-XLを発現するトランスジェニックマウスラインを使用して、2つの光子のCa ²⁺イメージングプロトコルを設立し、光受容体変性のためのマウスモデルを交配させることができます。ここで説明するプロトコルは、垂直方向の切片を作製伴う（R20;マウス由来の網膜のスライス」）とコーンのCa ²⁺レベルの光刺激誘発変化の光学イメージング。プロトコルは、絶対のCa ²⁺濃度の「インスライス測定」を可能にします。録音は、キャリブレーションを行うことができますように。このプロトコルは、機能的なコーンプロパティに研究を可能にし、コーンのCa ²⁺シグナル伝達の理解だけでなく、光受容体の死と網膜変性におけるCa ²⁺の関与の可能性に貢献することが期待されます。

Introduction

ビジョンは、網膜の光受容体での光伝達カスケードの光誘起活性化から始まります。錐光受容体は、色と高解像度昼光ビジョンを媒介するのに対し、桿体は、低い光レベルでのビジョンを可能にします。多くの光受容体特異的遺伝子は、これらの細胞の変性を引き起こす変異の影響を受けやすいです。光受容体の損失に関連した分子マーカーの数が^1を同定されているが、今のところ詳細な分子機構やイベントの順序は不明です。改変されたCa ²⁺ホメオスタシスは光受容体細胞死のトリガー、変性プロセス^2,3の間のCa ²⁺依存性カルパイン型プロテアーゼの活性のアップレギュレーションによってサポート仮説であることが推測されました。しかし、今日まで、この仮説はのCa ²⁺の生理学的測定によってバックアップされていません。再中のCa ²⁺チャネル遮断薬の効果に関するいくつかの研究の不一致tinal疾患はさらに直接哺乳類錐体視細胞中のCa ^2+を評価する方法を求めて、細胞死^4-6中のCa ²⁺の関与に挑戦しました。

以前は、ほとんどの電気的記録およびCa ²⁺イメージング研究があるためコーン^7-9に簡単にアクセスの両生類と爬虫類のモデルで行われています。しかし、哺乳動物の光受容体の生理機能は、特に非哺乳類¹⁰とのそれとは異なる可能性があり、人間の遺伝性網膜変性との関連で、哺乳動物の光受容体の生理機能をよりよく理解するには、革新的な治療法の開発の鍵です。人間の網膜疾患を模倣する多くのマウスモデルが用意されていますが、少しは、マウスコーン¹¹におけるCa ²⁺動態について知られています。電気技術は、ロッド（〜97％）を大幅にコーン^{（〜10％）12を}上回っコーンから、特にないマウスでは、高スループットの録音に適していません2+電流ではなく、絶対的な細胞内Ca ²⁺濃度に関するデータを提供します。コーンのCa ²⁺動態についての質問に対処するときしたがって、低い時間分解能にもかかわらず、撮影が選択される方法です。イメージングとの重要な問題は、選択的蛍光のCa ²⁺指示薬色素でコーンを標識する方法です。適切な区画化および細胞特異性は、組織の中に、「バルク·ロード」の合成のCa ²⁺指示色素によって達成することは困難です。その結果、円錐を標識し^、13,14のロッド、およびミュラーグリア細胞を確実に区別することはできません。また、合成染料は、一貫性の条件の下で長時間の録音を防止する、細胞の外に漏出する傾向があります。それはドを必要とするまた、そのAM -エステルの形で合成のCa ²⁺指標をロードすると、問題がありますtergents（ 例えば、DMSO）およびホルムアルデヒド^15を生成します。絶対のCa ²⁺測定には、レシオメトリック指標は必須です。しかし、最善の、現在利用可能な合成レシオメトリック指示薬のFura-2は、その強度に応じて、それ自体が円錐を刺激し、ひいてはの研究を妨げることができ、760ナノメートル〜700の範囲の励起光（二光子励起用）を必要としますコーンのCa生理照明条件の下で²⁺動態。

合成染料とは異なり、遺伝的にコードされたCa ²⁺指標は、細胞型選択的に発現させることができます。彼らは、細胞外に漏れない、と漂白が回避された場合、したがって、長期の信頼性およびレシオメトリック測定が可能です。細胞型選択的二光子顕微鏡と組み合わせたCa ²⁺バイオセンサーの発現は、主に生理学的条件の下で^13,16,17細胞内のCa ^2+を評価し、研究するための強力なツールを表し、 2+のバイオセンサーTN-XL ^18を表現^し 、：ここでは、光刺激誘発コーンのCaトランスジェニックのCa ²⁺バイオセンサーマウスライン（TN-XL ^HR2.1）2+動態を研究するためのプロトコルを記述します選択コーンで、ヒト赤オプシンプロモーターHR2.1 ¹⁹の下。コーン端末にアクセスするために、 エクスビボのスライス標本^20を使用しました。プロトコルは、すでに正常健康なマウス^10,21,22でコーン機能の3つの研究で使用しました。また、プロトコルはHR2.1を伴う遺伝性網膜変性のためのマウスモデルを交配することにより、コーンのCa ²⁺特異的な遺伝的な条件でのシグナリング、 例えば勉強できます。TN-XLマウスを。

Protocol

全ての動物手順は、ドイツ連邦政府によって決定され、テュービンゲン大学の制度的動物福祉委員会により承認された動物の保護のためのガイドラインや法律に付着して実施しました。

1.動物モデル

1. HR2.1：TN-XLのCa ²⁺のバイオセンサーマウス
   1. トランスジェニックHR2.1を使用してください：TN-XLマウスラインは錐体視細胞¹⁰に選択のCa ²⁺バイオセンサーTN-XLを発現しています。標準の12時間昼/夜リズムに上げいずれかのセックスの6週齢のマウス - 3を使用してください。

2.網膜解剖

1. 生理溶液
   1. 125mMの塩化ナトリウム、2.5mMの塩化カリウム、1mMのMgCl _2、1.25ミリモルのNaH ₂ PO _4、26 mMの_炭酸水素ナトリウム、0.5mMのL-グルタミン、および20mM（+）グルコースを含む細胞外溶液を新たに2 Lを、準備。すべての成分が溶解するまで混合します。
   2. "バブル"細胞外溶液10分- 5用carboxygen（95％O _{2、5％CO 2）}です。 2mMの濃度に達するようにCaCl _2を加えます。
   3. 細胞外溶液をバブリングした後、そのpH値を測定します。 pHは、それ以外の場合は、ミスが溶液の調製の際に行われている可能性があり、7.4である必要があります。一定のpHを確保するために、実験を通してバブリング率、溶液温度を一定に保ちます。
   4. 2フラスコ、網膜解剖用と録画設定（灌流）のための1つに在庫を区切ります。
2. 目の除核および網膜のアイソレーション（5から10分）
   1. 除核のための作業領域に暗赤色の照明を維持します。解剖時にコーンの退色を避けるために、650ナノメートル（またはそれ以上）のピーク波長を有するLEDを使用してください。
   2. コー​​ンが完全に録音時の増感されることを保証するために、風通しのよい、遮光ボックスにケージを置くことによって2時間、マウスを暗適応させます。
   3. laborato下でマウスを麻酔し気化器および標準的なマウスケージを保持する気密な容器を使用してイソフルラン（5％）とRYフード。気化器を取り扱う際に慎重manufacturer's指示に従ってください。アレルゲンへの曝露を減らすために手袋、フェイスマスクを使用してください。
   4. 解剖のための40X倍率 - 10と双眼顕微鏡を使用してください。
   5. 断頭により麻酔マウスを生け贄に捧げます。
   6. オリエンテーションでは、防水ペンでそれぞれの目（=背側）のトップをマーク。左または右の目を使用しているかどうかのトラックを保管してください。
   7. 眼球の後ろの視神経を切断することにより、湾曲したハサミを使用して、慎重に目を削除します。解剖のために、新たにcarboxygenated細胞外溶液を含むペトリ皿に眼球を転送します。眼球を転送するために、視神経断端を持ってください。
   8. 鋭い注射針で角膜と（ 鋸状縁で、すなわち ）強膜との境界に沿った任意の点で目を突き刺します。
   9. 電子メールを保持します静かにピンセットとで強膜に、あなたがたは、一はさみ、前のステップで作られた穴にブレードを挿入します。後部（アイカップ）から眼（角膜、水晶体、硝子体）の前方部分を分離するために鋸状縁に沿って切断。網膜上の背側位置を示すためのペンマークの位置で半径方向（視神経乳頭に向かって）アイカップをカット。
      注：この方法を準備、アイカップは、後で使用するために常にcarboxygenated溶液中に維持することができます。
   10. 背が離れて自分のポイントをカットするように、ペトリ皿にアイカップを回します。網膜と強膜の間に鉗子先端を挿入して左と鉗子各一対のアイカップの右側に強膜をつかみます。
   11. 静かにアイカップの強膜の部分を反転させることにより、網膜を切り離します。最後に、強膜から網膜を解放するためにはさみを解剖マイクロを使用して視神経を切断します。
       注：これは重要なステップです。網膜への損傷を防ぐ（ 例えば、によって）タッチし、ピンセットでそれを絞ります。
   12. ピンセットで網膜のエッジのいずれかを持って、静かに鉗子の第二の対を使用して、網膜表面から破片や硝子体を除去します。網膜表面がきれいである場合には、3つの追加の短い、ラジアルカット（約90°毎）を作るためにはさみを解剖マイクロを使用しています。これらのカットは、一つは、慎重に感光側がペトリ皿（ 図1A）に下にして網膜を平らにすることができます。
3. スライス標本（10から15分）
   1. スライスを搭載し、記録室に転送するための網膜スライスし、ガラスカバースリップのために事前にニトロセルロースフィルター膜を準備します。ハサミを用いて約10×5ミリメートルサイズの長方形片にニトロセルロースフィルター膜をカットします。 glasscutterを用いて約10×5ミリメートルサイズの長方形片にカバーガラスをカット。
   2. ゆっくりに近い細胞外液中にスライドガラスを浸します組織。静かに、ピンセットを用いて、非常にエッジでそれをつかむことにより、神経節細胞の側を上にしてスライドガラス上に網膜を引っ張ります。このプロセスは、機械的損傷および組織の折り畳みを低減します。
   3. それぞれの研究課題に関連する網膜の領域を選択します（また、ディスカッションを参照してください）​​。ステップ2.2.9で作られた長いカットが背側網膜の半分（ 図1A）をマークし、覚えておいてください。湾曲した手術用メスの刃を使用して、選択した網膜領域外の矩形、約1×2ミリメートルサイズのピースをカット。組織の周りに余分な溶液を拭き取ってください。
   4. 神経節細胞側が膜に付着するように網膜の一部の上にフィルター膜を配置します。すぐに、しっかりと膜に組織を取り付けるために膜上に細胞外培地のドロップを追加します。
   5. 新鮮な細胞外溶液を含むスライスチャンバーに膜に取り付けられた網膜組織を転送します。
   6. 200μmの垂直スライスに網膜をカット組織チョッパー²³に取り付けられた新鮮なカミソリの刃を使用して、厚さ（ 図1B）。すべての網膜の部分のためのブレードを変更します。
      注：かみそりの刃は完全に切断する際に音 "をクリック"で示されるように膜全体が、同時に分割するようにスライスチャンバ底部の表面に整列する必要があります - そうしないと刃がスライスを曲がり、損傷することがあります。
   7. 膜に高真空グリースを適用することにより、ガラスカバースリップに単一の膜に取り付けられたスライスを接着するのみ（ 図1C）を終了します。グリースのない網膜下のガラス面にしてください。
   8. 閉鎖と遮光容器、 例えば、アルミ箔で覆われた蓋付きのペトリ皿- -保持チャンバー内の細胞外溶液の滴で覆われたカバーガラスに取り付けられたスライスを保つRTでcarboxygen雰囲気下。保持の雰囲気を保つために小さな水溜りをバブリングすることによりcarboxygenを紹介チャンバは、加湿しました;これは、乾燥からスライスを防ぐことができます。
   9. 記録チャンバーへ（一つずつ）を移動させる前に15分 - スライスが10のための収容室で休むことを可能にします。切片を室温（〜21℃）で容器を保持するの4~5時間まで維持することができます。

3.二光子のCa ²⁺イメージング

1. 二光子顕微鏡法
   1. 可動顕微鏡対物レンズ（MOM）型二光子顕微鏡を使用してください。両方のMOMの設計とイメージング手順が詳細については^、24以前のバージョンを記載した。また^{、10,21,25（}ソースや企業のために、 表1を参照）を参照してください^。
      二つ同時に取得の蛍光チャネルの（b）の最小値、それは〜860 nmの波長可変（a）はパルスレーザを装備しなければならない（C以下の最低限の要件を満たす任意の直立二光子顕微鏡を使用することができます。注意してくださいのeCFPとシトリン蛍光用）フィルタ、（D）光刺激（可能な設計のため^{、24,26参照} ）、興味のあるのCa ²⁺シグナルを解決するのに十分なフレームレートでの時間経過画像シーケンスを記録することができます（E）ソフトウェア。
   2. 製造業者によって示されるように、二光子イメージングシステムを起動します。厳密施設のレーザー安全ガイドラインに従ってください。 〜860 nmのレーザーとチューニングを開始します。
   3. 記録チャンバーに保持室からスライスを移し、すぐにcarboxygenated細胞外液で灌流し始めます。 2ml /分の灌流の流量と記録チャンバー内で37℃の温度を維持します。
   4. 20X 0.95 NAの水浸対物レンズを使用してください。利用可能な場合は、網膜スライス（ 図2）を見つけるために記録チャンバー下のLED赤外線と組み合わせて、CCDカメラを使用しています。それ以外の場合は（3.1.5を参照）は、2つの光子イメージングを使用してスライスを探します。
   5. バイオセンサーの発現を確認するために、2つの光子イメージングに切り替えます。オンにしますのeCFPとシトリンの蛍光イメージングのための2つの検出チャネル。
   6. スキャンした （ 図3A）を記録するためのコーン端末の行を選択するには、2つの光子顕微鏡を制御する画像取得ソフトウェアを使用してください。 128×16ピクセル画像（31.25 Hz）で、または類似の構成に画像取得を設定します。外側のセグメントにおける光色素の退色を避けるために、コーン端子に走査領域を制限します。
      注：TN-XLのカルシウムセンサーの場合（CAのτ=〜0.6秒のCa ²⁺のための結合、τ=〜0.2秒²⁺バインド解除^、16を参照してください）〜8ヘルツの最小フレームレートが推奨されます。
2. 光刺激と記録
   1. 他の場所^10,21,26に記載されているように、次の手順を実行するサブステージフル場光刺激装置を使用してください。
      注：フル場光刺激のための簡単な解決策は、二つのバンドパス·フィルタ処理のLEDを使用することである（360 BP 12、「緑」： 例えば、「青」を578 BP 10）そのマウスコーンの波長感度を一致が、同時に蛍光検出のために使用されるフィルタと重ならない（CF。3.2.4）。 LEDからの光は、記録室（ 図2）の底部を通って凝縮器によって集束されます。この刺激の設計、そのキャリブレーションの詳細については、光強度が使用され、誘発コーンフォト異性化率は^{、10,21,26を}参照してください。
   2. 光刺激を提示する（3.2.3を参照）、または薬剤を適用する前に - （30秒、また潜在的な落とし穴を参照20）レーザーをオンにし、コーンは走査型レーザーと刺激背景光に適応することができます。
   3. （ 図3B、Cに示すように、 例えば、光の点滅）、任意の刺激のプレゼンテーションを開始します。ステップ3.2.1で説明した刺激装置の場合には、カスタマイズされたソフトウェアによって制御されるマイクロプロセッサボード（用を用いて経時的に2つのLEDの強度を変調することにより刺激を発生させます詳細については^{、10,21,26を}参照してください）。
   4. 2の蛍光チャネルの記録を開始し（ 例えば 、「青」FRETドナーのeCFPのための483 nmで及び「黄」、FRETアクセプターのための535 nmで、スペックは表1を参照のこと）を同時にそれぞれの画像取得ソフトウェアを使用して（も3.1を参照してください。 0.6）。例えば、光が点滅します（ 図3B、C）の場合、レコードは少なくとも8から10刺激プレゼンテーション（トライアル）。
3. 「インスライス」のCa ²⁺校正
   1. レコードコーン端末におけるCa ²⁺シグナル（3.1.6と3.2.4で説明したように）とコーンのセットのベースラインのCa ²⁺レベル（3.4で説明したように）を抽出。
   2. に切り替える」のCa ²⁺フリー」5μMイオノマイシン（DMSOに溶解）および10mM EGTAと外培地（代わりに、または、BAPTA）を加えました。レコードコーン端末は再び5分ごとに最小の蛍光比（R _minを ）決定する、<しますem>のすなわち、細胞内Ca ²⁺の（近くの）非存在下での比率を。 30分 - これは、15との間にどこでも取ることができます。
      注：灌流システムは、異なるリザーバを切り替えることができることが必要です。
   3. 5μMイオノマイシン（DMSOに溶解）および2.5 mMののCa ²⁺で細胞外培地に切り替えます。 5分間のインキュベーション時間の後、レコードコーンは、再び5分毎に、 すなわち 、最大蛍光比（R _max）が、細胞内Ca ²⁺の飽和濃度の存在下での比率を測定します。安定するまでのCa ²⁺比のために、15分-イオノマイシンアプリケーションに続いて、それが3間がかかる場合があります。
      注：長い期間高のCa ²⁺およびイオノマイシンにスライスを公開すると、最終的に細胞を損傷します。彼らの正常な形態を維持し、分析の唯一の細胞が含まれます。濃度（ すなわち、EGTA、イオノマイシン）を適合させる必要があるかもしれません。のCa ²⁺キャリブレーションの詳細についてはプロトコル^、13,17を参照してください。
4. データ分析
   注：それぞれの顕微鏡ソフトウェアと互換性があり、カスタム分析スクリプトを実行可能な画像処理とデータ解析ソフトウェアパッケージを使用してください。
   1. 撮像データファイルを読み込み、各コーン端子（ 図3A）の周りに興味（ROIを）の領域を描画します。各フレームのROI内の平均蛍光強度およびFRETアクセプタ（シトリン）とドナー（のeCFP）蛍光（R = F _A / F _D; 図3B、C）との比（R）を計算する前に、バックグラウンド蛍光を差し引きます。この比率は、典型的には、相対的な細胞内Ca ²⁺濃度の代用として使用されるが、キャリブレーション（3.3参照）後に、また絶対的な濃度は、（3.4.3を参照）を推定することができます。
      注：茎は外網状層のそれぞれの位置で認識することができ、それらの形態は、（やや小さいコーンより「ブロブ」をフラット化コー​​ン軸索の末端に位置する細胞体）。
   2. 平均刺激試験（ 図4A）。応答サイズのための対策として、曲線（R _A）の下で光刺激、ピーク振幅（R _アンプ ）、面積の前に例えばCa ²⁺ベースラインレベル（R _ベース ）として平均化トレース（ 図4B）、からの応答パラメータを抽出します。また、このような応答の上昇（T _上昇 ）と減衰時間（t _崩壊 ）として平均トレースから応答速度を抽出し（20％R _アンプの80％の間=各時間間隔、 図4Bの図を参照）。これらのパラメータを決定する方法の詳細については^、10を参照してください。
   3. ステップ3.3.1-3.3.3からの測定値に基づいて、絶対コーンのCa ²⁺濃度の推定値を計算します。最小と最大のCa ²⁺濃度、R _minおよびR _maxのカリフォルニア州、それぞれ、ドナー蛍光のための比率を使用し²⁺ D、カルシウム結合型 ）と-unbound（F _{D、カルシウムを含まない} ）状態、ならびに以下でTN-XLのための生体内解離定数（K _d = ^0.77、16を参照してください）アップ式^（27アナログ）：

Representative Results

垂直スライスをHR2.1から調製した（ 図1）組み合わせることにより：二光子イメージング（ 図2）を備えたTN-XLマウス網膜を、私たちは、錐体光受容体の軸索末端に光刺激誘発のCa ²⁺シグナルのレシオメトリック測定を実行することができました。このアプローチは、合成のCa ²⁺指標と、既存の光学イメージング法にマウスコーンにアクセスし、視覚化の有意な改善を示しています。例えば、遺伝的にコードされたレシオメトリックのCa ²⁺のバイオセンサーTN-XLの円錐特異的な発現が大幅コーン軸索末端（ 図3AでのROIを参照）の識別を容易にしました。したがって、我々のプロトコルは、例えばのように、コーンとロッド軸索末端の両方からの寄与を有する「混合」信号を不明瞭由来の信号を記録する危険性を排除します。

我々のアプローチは、INDIVIのレベルで単一試行応答を解決することができますデュアルコーン軸索末端。コーン端末からのCa ²⁺の光誘発性押出しは増 ​​加し、ドナーとアクセプター蛍光、それぞれ（ 図3B）の減少によってマークされています。蛍光比（R）の減少は、コーンと電位依存性のCa ²⁺チャネルのその後の閉鎖の光誘発過分極に起因するコーン端子（ 図3C）からのCa ²⁺の押し出しに相当します。いくつかのコーン軸索末端が（ 図3A）を同時に監視することができるので、データの取得は非常に効率的であり、円錐の何百ものCa ²⁺応答は、1回の実験で回収することができます。 （ 図4）定量的にこれらの応答を評価することにより、コーンのCa ²⁺シグナルを比較することができ、条件（説明を参照）の範囲で評価しました。

それは多くの場合、FRETアクセプターの間の比率（シトリン）と-donor（のeCFP）蛍光を使用することで十分です細胞内Ca ²⁺レベルの相対的な尺度として、（F _A / F _Dは詳細については、3.4を参照してください）。しかし、必要に応じて、比率は、絶対細胞内Ca ²⁺濃度（の[Ca ^2+]）（ 図5）を得るために較正することができます。このプロトコルで使用される背景照明（詳細については^、10および図3の凡例を参照）では、キャリブレーションは、「野生型」HR2.1での[Ca ^2+]休息絶対の推定値が得られた：のTN-XLマウスコーン端末文献¹¹のマウスについて報告範囲内である243±159 nMの（平均±SD）。

垂直網膜スライスの調製図。 （A）を単離し、。網膜の（B）長方形ピース（Sをスライスするための準備網膜を平坦化AにおけるEE赤いボックス）グリースを使用して、カバーガラス上に固定され、膜に取り付けられた網膜スライスの。（C）は上面図をスライスした後、濾紙膜（ダークグレー）に搭載された。（D）網膜スライスの一部の概略図（Cの赤いボックスを参照してください）​​。錐体光受容体は、緑色で示されています。 V、腹。 D、背側; N、鼻。 T、時間的、 OS、外側セグメント; ONL、外顆粒層。 OPL、外網状層; INL、内顆粒層。 IPL、内網状層; GCL、神経節細胞層は、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

網膜のスライスの図2.二光子イメージング：記録設定のイラスト トップ ：水浸対物レンズを合焦すること網膜への走査型レーザ（赤下向きの矢印）の午前、および放射された蛍光（上向き矢印）を集めます。レンズは、照明から送信された赤外光を収集し、CCDカメラを使用してスライスを撮像する際に凝縮器の下方に取り付けられたセンター LED：網膜スライスを記録チャンバー内に装着し、細胞外溶液で灌流下 ：コンデンサーレンズは刺激のLEDからの光を集光します（CCDカメライメージングのための赤外線LED）網膜組織に記録チャンバーの透明な底部を通ります。 IR LED、赤外線発光ダイオード。 CCD、電荷結合素子。 BP、バンドパスは、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図3.ライト想起マウスの錐体光受容体の軸索末端中のdのCa ²⁺応答。 （A） 左 ：レコーディングは、網膜スライスにおける錐体視細胞（緑）のシナプス末端（赤箱）に焦点を当てた右：7個別の端末との記録領域についての例。蛍光は、二つのチャンネルを使用して記録した：;およびFRETドナーのeCFP（下; 480 BP 32）のための1つのFRETアクセプターシトリン（535 BP 50上）のための1つのシトリン中（B）の光誘発性の変化（F _A）とのeCFP（F _D）蛍光は、単一のROIに記録される。（C）のCa ²⁺応答5秒間隔で1秒明るい光が点滅一連のコーン端末の（比F _A / F _Dなど）。 ROI、関心領域。 BP、バンドパスフィルタ。 F、蛍光強度。 AU、任意の単位。 FRET、蛍光共鳴エネルギー移動。のeCFPは、シアン蛍光タンパク質を増強しました。刺激強度（Pとして10 ^{3·P·S -1}コーンあたり）でほうとう-異性化率：それぞれ13.0及びM-およびS-オプシンのための12.8、〜10のバックグラウンドレベル（= LEDが消灯、励起レーザ走査）に追加するをクリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。

図4.光誘発コーンのCa ²⁺応答の代表的な定量分析 （ΔRなど）（A）の光誘発性のCa ²⁺応答シングルコーン端子（単一試験から：グレーのトレース、N = 16;平均：黒トレースARのような従来の光刺激にベースラインを表すのCa ²⁺レベル（R _ベース ）一休みする、応答サイズ：平均のCa ²⁺応答を決定）（B）のパラメータEA曲線下（R _A）及びピーク振幅（R _アンプ ）、応答開始の動態（T _上昇 、R _アンプの20％〜80％までの時間間隔）とオフセット（T _減衰 、80％の時間間隔R _アンプの20％）に。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図5.絶対のCa ²⁺濃度を推定する。休憩のCa ²⁺濃度（の[Ca ^2+]、比F _A / F _Dとして）TN-XLマウスで8コーン軸索末端に記録（円、平均値±SDで）異なる細胞外溶液のための：二回の標準外培地中で（Ctrlキー1および2）は、最小限の（「ゼロ」）の[Ca ^2+]（10mMのEGTA）ANと高いとDの[Ca ^2+]（2.5 mM）の、細胞外および細胞内Ca ²⁺を平衡化するイオノマイシン、5μMの存在下で、後者の二つの条件。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

Discussion

電気生理学的単一細胞記録または合成蛍光指示薬とのCa ²⁺イメージングを使用して、既存のプロトコルには、技術的な理由（概要を参照してください）の数のマウスの錐体光受容体におけるCa ²⁺動態を記録するために苦労しています。ここで説明するプロトコルは、Ca ²⁺シグナルと、効率的で、比較的簡単な方法で個々の、識別されたマウスのコーン端末であっても絶対のCa ²⁺レベルの測定を可能にします。

このプロトコルは、すでに正常健康なマウス網膜において円錐機能のさまざまな側面に対処する3つの研究で使用されています。最初の研究¹⁰では、HR2.1：TN-XLマウスは、バイオセンサーのCa ²⁺の円錐特異的発現は妨げないことを示し、免疫組織化学、ERG記録、二光子のCa ²⁺イメージング、および薬理学を用いて特徴付けました。コー​​ン解剖学と機能。第二の研究²¹では、有彩色マウスコーンの無彩色応答特性は、「グリーン」オプシン支配背と「青」オプシン支配腹マウス網膜の間の円錐機能の著しい違いを実証し、網膜全体にマッピングしました。コーンのプロパティでこれらの地域差は、マウスコーンの異なるスペクトルタイプは無彩色コントラストの（近くの）最適サンプリングを提供することを示唆し、自然環境（地上対すなわち、空）の差動コントラスト分布と一致したと、このように、提供することができます進化上の利点。コーン軸索末端は、水平細胞から受け取ることを第三の研究²²往復フィードバックに調査しました。提案されたすべての水平細胞フィードバック機構はコーン軸索末端²⁸における電位依存性のCa ²⁺チャネルに作用するように、コーン端末Ca ^2+が 、水平細胞-コーン相互作用のためのプロキシとして機能することができます。 Kemmlerおよび共同研究者による研究²²のサポートビュー水平細胞は光受容体のグルタミン酸放出を制御するためのいくつかのメカニズムを含む複合フィードバックシステムを使用すること。

これらの研究は、記載されたプロトコールの多様性を示し、それは円錐関数とシナプス回路に関する質問の広い範囲に適応させることができることを示しています。また、プロトコルはコーン生理学のより良い理解に向けて、異なる円錐区画内にローカルのCa ²⁺シグナル伝達の研究を可能にします。このような知識は、最終的にはコーンに影響を与える変性疾患のために、特に、潜在的な治療アプローチの合理的開発を可能にするために、変性コーンにおける病態生理学的プロセスを理解することが重要です。

HR2.1で：TN-XLマウスライン、のCa ²⁺バイオセンサは外側セグメントを除いて、コーンを通して発現されます。これは、Ca ^2+、ダイナミックの直接およびレシオメトリック評価のための機会を提供します異なるコーン区画内の。カルシウムの変化は、外側セグメント内²⁺電流は膜電位と電位依存性のCa ²⁺チャネルの結果として活性化を介して端末に反映されているので、外側セグメントの処理が間接 ​​的に観察することができます。

落とし穴：

網膜の解剖は​​重要なステップである：マウスでは、網膜は、通常、光受容体の外側セグメントと色素上皮との間のアイカップから分離します。したがって、単離された網膜の感光光受容体の外側セグメントが公開され、機械的な損傷に非常に敏感。細心の注意は、ツールを使用して、感光体の側に触れることによって、または（ 例えば、濾過膜）の接着剤表面に横に組織を移動することによって損傷しないよう注意する必要があります。

高品質の網膜スライスがそのきれいな切断面によって顕微鏡下で認識することができ、明確に定義された外側セグメントとよく組織感光層による。スライス品質の機能評価を迅速に（ - 20コーン10との視野内に、例えば ）明るい光刺激を点滅し、応答性のコーンの割合を決定することによって行うことができます。ここで、応答の品質は、信号対雑音比（S / N）（光応答の振幅対光刺激の前にベースラインノイズの振幅）を算出することによって評価されるべきです。 2のS / N - 3が最小しきい値として考慮されるべきです。一般的に、我々は50％未満の応答コーンでスライスを捨てます。また、廃棄されるべきである^（10で図4を参照）、過度の自発的なスパイクの挙動を示すコーンでスライス。

（応答の一貫性の詳細については^、10を参照してください）2時間-上記の解剖学的および機能的基準を満たす記録チャンバー内のスライスを1に一貫した応答を示します。スライスは時間生き残るので保持室で私たちは、成功した実験では、6時間まで持続することができます。スライスは、必然的に、網膜ネットワークの横の接続を切断するように、それは、コーンと水平細胞間の長い範​​囲の空間的相互作用を研究に関していくつかの制限があることは注目に値します。しかし、300μmの網膜スライスの厚さを増加すると、この問題^を改善する^22。

垂直網膜スライスの使用は、励起レーザーによって感光コーン外側セグメントのスキャンを回避し、したがって、大部分が（広範な議論のために^{、10,21参照} ）オプシン漂白を防ぐことができます。それにもかかわらず、記録されたCa ²⁺シグナルだけでなく、光刺激に依存するだけでなく、走査励起レーザによって生成された背景照明成分によって影響を受けます。実際には、このような二光子イメージング実験において有効背景照明は、散乱レーザ光記録CEによって放出される蛍光の組み合わせでありますLLS、および任意のLED刺激背景成分。記録の前に（オン光刺激の背景成分と）レーザ走査に30秒 - そのため、コーンは、少なくとも20のために適応させるべきです。

利点と用途：

コーンでシグナル伝達経路のCa ²⁺を検証することができる円錐のCa ²⁺イメージングとの組み合わせで薬理学的研究をし、次のようになります。この円錐のCa ²⁺ -imagingプロトコルの一部のアプリケーションは^、10,21,22の上に記載されているが、他のアプリケーションを想定することができますカリフォルニア州の別の選手を標的薬の有効性および効力をテストするために使用^{2+ 10を} -signaling。しかし、主要なアプリケーションは、円錐機能に影響を及ぼす疾患を研究することであってもよいです。ヒト疾患を模倣する多くの網膜変性のマウスモデルが用意されています。例えば、錐体光受容体の損失1（CPFL 1）マウスは、一次コーン変性モデル苦しみですPde6c変異 ²⁹から。逆に、ロッド変性1（RD 1）マウスはPDE6B変異の影響を受けています。これは、主ロッド光受容体の変性^30、1 番目の 1ロッド損失が完了すると、二次コーン変性セットが発生しているが。 HR2.1でこれらの動物を交配：TN-XL線が勉強したり、プライマリとセカンダリの両方のコーン変性中のCa ²⁺動態を比較できるようにし、コーン細胞死中のCa ²⁺の役割に貴重な洞察を提供する可能性があります。また、薬理学的に円錐変性を誘起-例えば選択PDE6阻害剤を使用して-コーン変性^10,29,31の下流側の機構を識別するのに役立ち得ます。

要約すると、ここで説明するプロトコルは、マウスの錐体光受容体の細胞内区画中のCa ^2+を測定することができ、広い範囲の下でコーン生理学を発見するための素晴らしい機会を提供します生理学的および病態生理学的状態の。さらに、このプロトコルは、円錐のCa ²⁺ -signaling干渉するしたがってコーン疾患に対する新しい治療法を確立するのに役立つように設計された薬理学的薬剤のスクリーニングのために使用することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High vacuum grease	Dow Corning	1018817	http://www.dowcorning.com
Cover slips	R. Langenbrinck		24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
Glass slides	R. Langenbrinck		76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Blades for tissue chopper	MARTOR KG	ARGENTAX No. 1044	0.25 mm; http://www.martor.de
Tissue chopper	Custom-build		Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert
Nitrocellulose filter membrane gridded	Merck Millipore	AABG01300	Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com
Isoflurane CP	CP pharma	AP/DRUGS/220/96	http://www.cp-pharma.de
UV/green LED-based full-field stimulator	Custom-build		for details, see10
Open source microprocessor board	Arduino		http://www.arduino.cc
Imaging software CfNT	Custom-written		developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany
IgorPro	Wavemetrics		http://www.wavemetrics.com
VC3-4 System focal perfusion system	ALA Scientific Instrument		with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)	Newport Spectra-Physics		http://www.spectra-physics.com
Movable objective microscope (MOM), Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany	Sutter Instruments		http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html

Name	Company	Catalog Number	Comments
XLUMPlanFL 20X/0.95w objective	Olympus		http://www.olympusamerica.com
Vaporizer 100 series	Surgivet		http://www.surgivet.com
Ionomycin, Calcium salt	Life technologies	I24222	http://www.lifetechnologies.com
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	https://www.sigmaaldrich.com
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	101191250	http://www.sigmaaldrich.com
Leica MZ95	leica microsystems		http://www.leica-microsystems.com/