Summary
हम माउस रेटिना के एक पूर्व विवो टुकड़ा तैयारी का उपयोग कर कोन फोटोरिसेप्टर के अक्षतंतु टर्मिनल में सीए 2 + गतिशीलता की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन। इस प्रोटोकॉल एक महत्वपूर्ण स्तनधारी मॉडल प्रणाली में कोन सीए 2 + संकेतन का व्यापक अध्ययन, माउस की अनुमति देता है।
Abstract
रेटिना कोन फोटोरिसेप्टर (शंकु) दिन के उजाले दृष्टि की सेवा और रंग भेदभाव का आधार हैं। वे अक्सर कई रेटिना रोगों में अंधापन के लिए अग्रणी, अध: पतन के अधीन हैं। कैल्शियम (सीए 2 +), फोटोरिसेप्टर संकेतन और चयापचय में एक महत्वपूर्ण दूसरे के दूत, परोक्ष रूप से विभिन्न पशु मॉडल में फोटोरिसेप्टर अध: पतन के साथ जुड़े होने के लिए प्रस्तावित किया गया है। व्यवस्थित शंकु शरीर क्रिया विज्ञान के इन पहलुओं का अध्ययन और pathophysiology विद्युत रेटिना रॉड फोटोरिसेप्टर का प्रभुत्व है जहां माउस में विशेष रूप से, इन छोटे कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग की कठिनाइयों से प्रभावित किया गया है। इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, हम शंकु में विशेष रूप से आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सीए 2 + biosensor तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज व्यक्त किया और फोटोरिसेप्टर अध: पतन के लिए माउस मॉडल के साथ संकर जा सकता है कि एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन का उपयोग कर एक दो फोटॉन सीए 2 + इमेजिंग प्रोटोकॉल की स्थापना की। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल खड़ी वर्गों की तैयारी शामिल है (आर20; चूहों और शंकु सीए 2 + स्तर में प्रकाश उत्तेजना पैदा परिवर्तन के ऑप्टिकल इमेजिंग से रेटिना के स्लाइस ")। प्रोटोकॉल भी पूर्ण सीए 2 + सांद्रता के "में टुकड़ा माप" की अनुमति देता है; रिकॉर्डिंग अंशांकन द्वारा पीछा किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल कार्यात्मक शंकु गुणों में पढ़ाई के लिए सक्षम बनाता है और शंकु की समझ सीए 2 + संकेत के रूप में अच्छी तरह से फोटोरिसेप्टर मौत और रेटिना अध: पतन में सीए 2 + की संभावित भागीदारी के लिए योगदान करने की उम्मीद है।
Introduction
विजन रेटिना फोटोरिसेप्टर में phototransduction झरना का प्रकाश प्रेरित सक्रियण के साथ शुरू होता है। कोन फोटोरिसेप्टर रंग और उच्च संकल्प दिन के उजाले दृष्टि मध्यस्थता जबकि रॉड फोटोरिसेप्टर, कम रोशनी स्तरों पर दृष्टि अनुमति देते हैं। कई फोटोरिसेप्टर विशिष्ट जीन इन कोशिकाओं का अध: पतन के लिए नेतृत्व कि म्यूटेशन के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। फोटोरिसेप्टर नुकसान के साथ जुड़े आणविक मार्कर के एक नंबर 1 की पहचान की गई है, लेकिन अभी तक विस्तृत आणविक तंत्र और घटनाओं के अनुक्रम अस्पष्ट रहते हैं। बदल सीए 2 + समस्थिति फोटोरिसेप्टर कोशिका मृत्यु का एक ट्रिगर, अध: पतन की प्रक्रिया 2,3 दौरान सीए की गतिविधि 2 + निर्भर Calpain प्रकार प्रोटिएजों की अप-विनियमन द्वारा समर्थित एक परिकल्पना होने का अनुमान लगाया गया था। हालांकि, आज तक, इस परिकल्पना सीए 2 + की शारीरिक माप के द्वारा समर्थित नहीं है। पुनः में सीए 2 + चैनल ब्लॉकर्स के प्रभाव पर कई अध्ययनों में विसंगतियांtinal रोगों आगे सीधे स्तनधारी कोन फोटोरिसेप्टर में सीए 2 + का आकलन करने के तरीकों के लिए बुला रही है, कोशिका मृत्यु 4-6 में सीए 2 + की भागीदारी को चुनौती दी।
इससे पहले, सबसे अधिक बिजली रिकॉर्डिंग और सीए 2 + इमेजिंग अध्ययन क्योंकि शंकु 7-9 के लिए आसान पहुँच के उभयचर और साँप मॉडल में प्रदर्शन किया गया है। हालांकि, स्तनधारी फोटोरिसेप्टर फिजियोलॉजी गैर स्तनधारी 10 और विशेष रूप से अलग हो सकता है, मानव वंशानुगत रेटिना अध: पतन के संदर्भ में, स्तनधारी फोटोरिसेप्टर शरीर क्रिया विज्ञान का एक बेहतर समझ अभिनव उपचार के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। मानव रेटिना रोगों नकल उतार कई माउस मॉडल उपलब्ध हैं, लेकिन थोड़ा माउस शंकु 11 में सीए 2 + गतिशीलता के बारे में जाना जाता है। विद्युत तकनीक विशेष रूप से नहीं चूहों में, शंकु से उच्च throughput रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं, जहां छड़ (~ 97%) काफी कोन (~ 3%) संख्या से बढ़ना 12 2 + सांद्रता पर सीए 2 + धाराओं पर डेटा लेकिन नहीं प्रदान करते हैं। कोन सीए 2 + गतिशीलता के बारे में सवालों को संबोधित इसलिए, जब कम अस्थायी समाधान के बावजूद, इमेजिंग पसंद की विधि है। इमेजिंग के साथ प्रमुख मुद्दा चुनिंदा एक फ्लोरोसेंट सीए 2 + सूचक डाई के साथ शंकु लेबल करने के लिए कैसे है। उचित compartmentalization और सेल विशिष्टता के ऊतकों में "थोक लोड हो रहा है" सिंथेटिक सीए 2 + सूचक रंगों से प्राप्त करने के लिए कठिन है। एक परिणाम के लेबल, शंकु के रूप में, 13,14 छड़, और मुलर glial कोशिकाओं मज़बूती से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, सिंथेटिक रंगों के अनुरूप शर्तों के तहत लंबे समय तक रिकॉर्डिंग रोकने, कोशिकाओं के बाहर रिसाव के लिए करते हैं। यह डे की आवश्यकता के रूप में इसके अलावा, उनके पूर्वाह्न-एस्टर रूप में सिंथेटिक सीए 2 + संकेतक लोड हो रहा है, समस्याग्रस्त हैtergents (जैसे, DMSO) और formaldehyde 15 उत्पन्न करता है। पूर्ण सीए 2 + माप के लिए, ratiometric संकेतक अनिवार्य हैं। हालांकि, सबसे अच्छा वर्तमान में उपलब्ध कृत्रिम ratiometric सूचक Fura-2 इसकी तीव्रता पर निर्भर करता है, अपने आप में शंकु को बढ़ावा, और इस प्रकार की पढ़ाई बाधित कर सकते हैं, जो 760 एनएम के लिए 700 की रेंज में उत्तेजना प्रकाश (दो photon उत्तेजना के लिए), की आवश्यकता है कोन सीए शारीरिक रोशनी की शर्तों के तहत 2 + गतिशीलता।
सिंथेटिक रंगों के विपरीत, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सीए 2 + संकेतक एक प्रकार की कोशिका-चयनात्मक तरीके से व्यक्त किया जा सकता है। वे कोशिकाओं के बाहर लीक नहीं करते, और विरंजन बचा है, तो इसलिए, लंबे समय तक और विश्वसनीय ratiometric माप संभव हो रहे हैं। दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त जब सेल प्रकार चयनात्मक सीए 2 + biosensors के अभिव्यक्ति, काफी हद तक शारीरिक स्थितियों 13,16,17 के तहत सीए 2 + आकलन और subcellular अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है 2 + biosensor माउस लाइन में 2 + गतिशीलता: झल्लाहट आधारित सीए 2 + biosensor तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज 18 को व्यक्त करता है जो (HR2.1 तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज), चुनिंदा शंकु में, मानव लाल opsin के प्रमोटर HR2.1 19 के तहत। कोन टर्मिनलों का उपयोग करने के लिए, एक पूर्व विवो टुकड़ा तैयारी 20 नियोजित किया गया था। प्रोटोकॉल पहले से ही सफलतापूर्वक स्वस्थ चूहों 10,21,22 में कोन समारोह पर तीन अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, प्रोटोकॉल शंकु सीए का अध्ययन करने की अनुमति देता है 2 + जैसे विशिष्ट आनुवंशिक स्थितियों में संकेत, HR2.1 साथ वंशानुगत रेटिना अध: पतन के लिए माउस मॉडल crossbreeding द्वारा: तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज चूहों।
Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं जर्मन संघीय सरकार द्वारा निर्धारित और विश्वविद्यालय के Tübingen के संस्थागत पशु कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित जानवरों की सुरक्षा के लिए दिशा निर्देशों और नियमों के पालन से बाहर किए गए।
1. पशु मॉडल
- HR2.1: तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज सीए 2 + biosensor माउस
- ट्रांसजेनिक HR2.1 का उपयोग करें: तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज माउस लाइन कोन फोटोरिसेप्टर 10 में चुनिंदा सीए 2 + biosensor तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज व्यक्त। एक मानक 12 बजे दिन / रात लय के साथ उठाया या तो सेक्स के 6 सप्ताह पुरानी चूहों - 3 का उपयोग करें।
2. रेटिना विच्छेदन
- शारीरिक समाधान
- 125 मिमी NaCl, 2.5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 1.25 मिमी नाह 2 पीओ 4, 26 मिमी 3 NaHCO, 0.5 मिमी एल glutamine, और 20 मिमी (+) ग्लूकोज युक्त कोशिकी समाधान के हौसले 2 एल, तैयार करें। सभी सामग्री को भंग जब तक मिलाएं।
- "बुलबुला" कोशिकी समाधान10 मिनट - 5 के लिए carboxygen (95% ओ 2, 5% सीओ 2) के साथ। 2 मिमी की एक एकाग्रता तक पहुँचने के लिए 2 CaCl जोड़ें।
- कोशिकी समाधान बुदबुदाती के बाद, अपनी पीएच को मापने। पीएच अन्यथा यह गलतियों के समाधान की तैयारी के दौरान बनाया गया है कि संभावना है, 7.4 होना चाहिए। लगातार पीएच सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग भर बुदबुदाती दर और समाधान तापमान स्थिर रखें।
- 2 बोतल, रेटिना विच्छेदन के लिए एक और रिकॉर्डिंग सेटअप (छिड़काव) के लिए एक में शेयर से अलग करें।
- आँखों का स्पष्टीकरण और रेटिना के अलगाव (5 - 10 मिनट)
- स्पष्टीकरण के लिए काम कर क्षेत्र में एक धुंधला लाल रोशनी बनाए रखें। विच्छेदन के दौरान शंकु की विरंजन से बचने के लिए 650 एनएम (या अब) की एक चोटी तरंगदैर्ध्य के साथ एल ई डी का उपयोग करें।
- शंकु पूरी तरह से रिकॉर्डिंग के समय पर अवगत कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक अच्छी तरह हवादार, lightproof बॉक्स में अपने पिंजरे डालने से 2 बजे के लिए माउस डार्क अनुकूल।
- एक laborato के तहत माउस चतनाशून्यएक vaporizer और एक मानक माउस पिंजरे रखती है कि एक गैस तंग कंटेनर का उपयोग कर isoflurane (5%) के साथ RY हुड। Vaporizer से निपटने ध्यान से जब manufacturer's निर्देशों का पालन करें। एलर्जी के लिए जोखिम को कम करने के लिए दस्ताने और चेहरे नकाब का प्रयोग करें।
- विच्छेदन के लिए 40x बढ़ाई - एक 10 के साथ एक दूरबीन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
- कत्ल के द्वारा anaesthetized माउस बलिदान।
- उन्मुखीकरण के लिए, एक निविड़ अंधकार कलम के साथ हर आंख (= पृष्ठीय) के शीर्ष निशान। बाईं या दाईं आंख का उपयोग करते हुए इस बात पर नज़र रखें।
- नेत्रगोलक पीछे ऑप्टिक तंत्रिका काटने से ध्यान से घुमावदार कैंची का उपयोग आँख निकालें। विच्छेदन के लिए, हौसले से carboxygenated कोशिकी समाधान युक्त एक पेट्री डिश के लिए नेत्रगोलक हस्तांतरण। नेत्रगोलक स्थानांतरित करने के लिए, ऑप्टिक तंत्रिका स्टंप से इसे पकड़।
- एक तेज इंजेक्शन की सुई के साथ कॉर्निया और (ora serrata में यानी,) श्वेतपटल के बीच सीमा पर किसी भी बिंदु पर आंख पियर्स।
- ई पकड़ोधीरे से एक संदंश की जोड़ी और साथ श्वेतपटल पर तु एक कैंची पिछले चरण में किए गए छेद में ब्लेड डालें। पीछे भाग (eyecup) से आंख (कॉर्निया, लेंस, कांच का शरीर) के पूर्वकाल भाग को अलग करने के ora serrata साथ काटें। रेटिना पर पृष्ठीय स्थिति का संकेत करने के लिए कलम चिह्न की स्थिति में (ऑप्टिक डिस्क की ओर) त्रिज्यात eyecup काटें।
नोट: इस तरह से तैयार, eyecups बाद में उपयोग के लिए लगातार carboxygenated समाधान में रखा जा सकता है। - पृष्ठीय दूर अपने से अंक में कटौती ऐसी है कि पेट्री डिश में eyecup मुड़ें। रेटिना और श्वेतपटल के बीच संदंश सुझावों डालने से छोड़ दिया और संदंश प्रत्येक की एक जोड़ी के साथ eyecup के सही पक्ष पर श्वेतपटल ले लो।
- धीरे eyecup के स्क्लेरल हिस्सा inverting द्वारा रेटिना अलग करें। अंत में, श्वेतपटल से रेटिना मुक्त करने के लिए कैंची विदारक माइक्रो का उपयोग ऑप्टिक तंत्रिका में कटौती।
नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है। रेटिना (जैसे, द्वारा को नुकसान से बचनेछू और) संदंश के साथ यह फैलाएंगे। - संदंश की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग रेटिना की सतह से मलबे और कांच का शरीर को दूर धीरे संदंश की एक जोड़ी के साथ रेटिना के किनारों में से एक को पकड़ो और। रेटिना सतह साफ हो गया है, तीन अतिरिक्त छोटे, रेडियल कटौती (लगभग हर 90 डिग्री) बनाने के लिए कैंची विदारक सूक्ष्म का उपयोग करें। इन में कटौती एक सावधानी से फोटोरिसेप्टर पक्ष पेट्री डिश (चित्रा 1 ए) में नीचे का सामना करना पड़ के साथ रेटिना समतल करने के लिए अनुमति देते हैं।
- टुकड़ा तैयारी (10 - 15 मिनट)
- स्लाइस बढ़ते और रिकार्डिंग कक्ष के लिए उन्हें स्थानांतरित करने के लिए रेटिना टुकड़ा करने की क्रिया और गिलास को कवर फिसल जाता है के लिए पहले से nitrocellulose फिल्टर झिल्ली तैयार करें। कैंची का उपयोग लगभग 10 एक्स 5 मिमी आकार आयताकार टुकड़ों में nitrocellulose फिल्टर झिल्ली कट। एक glasscutter का उपयोग कर लगभग 10 एक्स 5 मिमी आकार आयताकार टुकड़ों में coverslips के काटें।
- धीरे धीरे बंद करने के लिए बाह्य समाधान में एक गिलास स्लाइड विसर्जितऊतक। धीरे, संदंश की एक जोड़ी का उपयोग बहुत किनारे पर इसे हथियाने के द्वारा नाड़ीग्रन्थि सेल पक्ष के साथ गिलास स्लाइड पर रेटिना खींच। यह प्रक्रिया यांत्रिक क्षति और ऊतकों की तह कम कर देता है।
- संबंधित अनुसंधान प्रश्न से संबंधित है कि रेटिना के क्षेत्र चुनें (यह भी चर्चा देखें)। कदम 2.2.9 में की गई लंबी कटौती पृष्ठीय रेटिना आधे (चित्रा 1 ए) के निशान, याद रखें। एक घुमावदार स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर चयनित रेटिना क्षेत्र के बाहर एक आयताकार, लगभग 1 एक्स 2 मिमी आकार के टुकड़े काट लें। ऊतक के आसपास अतिरिक्त समाधान से साफ कर लें।
- नाड़ीग्रन्थि सेल की ओर झिल्ली का पालन करता है कि इस तरह के रेटिना के टुकड़े के शीर्ष पर फिल्टर झिल्ली रखें। इसके तत्काल बाद, मजबूती से झिल्ली के लिए ऊतक संलग्न करने की झिल्ली पर कोशिकी मध्यम की एक बूंद जोड़ें।
- ताजा कोशिकी समाधान युक्त टुकड़ा करने की क्रिया चैम्बर के लिए झिल्ली पर चढ़कर रेटिना ऊतक स्थानांतरण।
- 200 माइक्रोन के ऊर्ध्वाधर स्लाइस में रेटिना कटएक ऊतक हेलिकॉप्टर 23 से जुड़ी ताजा धार का उपयोग मोटाई (चित्रा 1 बी)। हर रेटिना टुकड़े के लिए ब्लेड बदलें।
नोट: धार से संकेत के रूप में पूरे झिल्ली, एक साथ विभाजन ऐसा है कि पूरी तरह से टुकड़ा करने की क्रिया चैम्बर नीचे की सतह के साथ गठबंधन करने की जरूरत है एक काटने ध्वनि जब "क्लिक" - अन्यथा ब्लेड मोड़ सकते हैं और टुकड़ा को नुकसान पहुंचा। - झिल्ली के लिए उच्च वैक्यूम तेल लगाने से एक गिलास को कवर पर्ची के लिए एक एकल झिल्ली पर चढ़कर टुकड़ा गोंद केवल (चित्रा 1C) समाप्त हो जाती है। तेल से मुक्त रेटिना के नीचे कांच की सतह रखें।
- होल्डिंग कक्ष में कोशिकी समाधान की एक बूंद के द्वारा कवर coverslip के घुड़सवार स्लाइस रखें - उदाहरण के लिए एक बंद और lightproof कंटेनर, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर ढक्कन के साथ एक पेट्री डिश - आरटी पर एक carboxygen वातावरण के अंतर्गत। जोत में माहौल बनाए रखने के लिए एक छोटा सा पानी जलाशय बुदबुदाती द्वारा carboxygen का परिचयचैम्बर humidified; इस बाहर सुखाने से स्लाइस को रोकता है।
- रिकॉर्डिंग कक्ष के लिए उन्हें (एक एक करके) जाने से पहले 15 मिनट - स्लाइस 10 के लिए होल्डिंग कक्ष में आराम करने के लिए अनुमति दें। स्लाइस आरटी पर चैम्बर पकड़ में 4-5 बजे तक रखा जा सकता है (~ 21 डिग्री सेल्सियस)।
3. दो फोटॉन सीए 2 + इमेजिंग
- दो photon माइक्रोस्कोपी
- एक जंगम उद्देश्य माइक्रोस्कोप (माँ) प्रकार दो photon माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। विवरण भी देख लिए दोनों माँ डिजाइन और इमेजिंग प्रक्रियाओं, पहले 24 में वर्णित किया गया 10,21,25 (स्रोतों और कंपनियों के लिए, 1 टेबल देखें)।
नोट: इस्तेमाल किया जा सकता निम्नलिखित न्यूनतम आवश्यकताओं को पूरा है कि किसी भी ईमानदार दो photon माइक्रोस्कोप: यह ~ 860 एनएम के लिए tuneable (क) एक स्पंदित लेजर, (ख) दो एक साथ हासिल कर ली प्रतिदीप्ति चैनल की एक न्यूनतम, (ग के साथ सुसज्जित किया जाना है )) eCFP और सिट्रीन प्रतिदीप्ति, (घ के लिए फिल्टरएक प्रकाश उत्तेजक (संभव डिजाइन के लिए, 24,26 देखें), और पर्याप्त एक फ्रेम दर पर समय-व्यपगत छवि दृश्यों रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है कि (ई) सॉफ्टवेयर सीए के हित के लिए 2 + संकेतों को हल करने के लिए। - निर्माता द्वारा संकेत के रूप में दो photon इमेजिंग प्रणाली शुरू। सख्ती सुविधा के लेजर सुरक्षा के दिशा निर्देशों का पालन करें। ~ 860 एनएम लेजर और यह धुन प्रारंभ करें।
- रिकॉर्डिंग कक्ष में पकड़े कक्ष से एक टुकड़ा हस्तांतरण और तुरंत carboxygenated कोशिकी समाधान के साथ perfusing शुरू करते हैं। 2 मिलीग्राम / मिनट की एक छिड़काव प्रवाह दर और रिकार्डिंग कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान को बनाए रखें।
- एक 20X 0.95 एनए पानी विसर्जन उद्देश्य का प्रयोग करें। यदि उपलब्ध है, रेटिना टुकड़ा (चित्रा 2) का पता लगाने रिकॉर्डिंग कक्ष नीचे एलईडी एक बुनियादी लाल के साथ संयोजन में एक सीसीडी कैमरा का उपयोग करें। अन्यथा दो photon इमेजिंग (3.1.5 देखें) का उपयोग कर टुकड़ा की स्थिति जानें।
- Biosensor अभिव्यक्ति देखने के लिए दो photon इमेजिंग के लिए स्विच करें। चालू करोeCFP और सिट्रीन के प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए दो का पता लगाने के चैनल।
- स्कैन और (चित्रा 3) की रिकॉर्डिंग के लिए कोन टर्मिनलों की एक पंक्ति का चयन करने के लिए दो photon माइक्रोस्कोप है कि नियंत्रण छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। 128 x 16 पिक्सेल छवियों (31.25 हर्ट्ज) या एक समान विन्यास के लिए सेट छवि अधिग्रहण। बाहरी क्षेत्रों में photopigments की विरंजन से बचने के लिए कोन टर्मिनलों के लिए स्कैन क्षेत्र को सीमित करें।
नोट: (सीए unbinding 2 + के लिए बाध्यकारी कैरियर के लिए τ = ~ 0.6 सेकंड 2 +, τ = ~ 0.2 सेकंड, 16 देखें) तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज कैल्शियम संवेदक के लिए ~ 8 हर्ट्ज की एक न्यूनतम फ्रेम दर की सिफारिश की है।
- एक जंगम उद्देश्य माइक्रोस्कोप (माँ) प्रकार दो photon माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। विवरण भी देख लिए दोनों माँ डिजाइन और इमेजिंग प्रक्रियाओं, पहले 24 में वर्णित किया गया 10,21,25 (स्रोतों और कंपनियों के लिए, 1 टेबल देखें)।
- प्रकाश उत्तेजना और रिकॉर्डिंग
- कहीं और 10,21,26 वर्णित के रूप में निम्न चरणों का पालन करने के लिए एक उप-चरण पूरे क्षेत्र प्रकाश उत्तेजक का उपयोग करें।
नोट: एक पूर्ण क्षेत्र प्रकाश उत्तेजक लिए एक सरल उपाय दो बैंड-फ़िल्टर पारित एल ई डी (: 360 बीपी 12, "ग्रीन": 578 बी पी 10 जैसे, "ब्लू") का उपयोग करने के लिए हैकि माउस शंकु की तरंग दैर्ध्य संवेदनशीलता से मेल खाते हैं, लेकिन एक ही समय में प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया फिल्टर के साथ ओवरलैप नहीं है (CF। 3.2.4)। एल ई डी से प्रकाश रिकॉर्डिंग कक्ष (चित्रा 2) के नीचे के माध्यम कंडेनसर से ध्यान केंद्रित किया है। इस उत्तेजक डिजाइन, अपने अंशांकन पर जानकारी के लिए, प्रकाश तीव्रता का इस्तेमाल किया और पैदा शंकु फोटो isomerisation दरें, 10,21,26 देखते हैं। - प्रकाश उत्तेजनाओं (3.2.3 देखें) पेश करने या औषधीय एजेंटों लागू करने से पहले - (यह भी संभावित नुकसान से देखते हैं, 30 सेकंड 20) लेजर पर मुड़ें और शंकु स्कैनिंग लेजर और प्रोत्साहन पृष्ठभूमि प्रकाश के लिए अनुकूल करने के लिए अनुमति देते हैं।
- (चित्रा 3 बी, सी के रूप में दिखाया प्रकाश की जैसे, चमक,) मनमाना उत्तेजनाओं की प्रस्तुति शुरू करो। कदम 3.2.1 में वर्णित उत्तेजक के मामले में, अनुकूलित सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित एक माइक्रोप्रोसेसर बोर्ड (के लिए उपयोग कर समय के साथ दो एल ई डी की तीव्रता modulating द्वारा उत्तेजनाओं उत्पन्नविवरण,) 10,21,26 देखते हैं।
- दो प्रतिदीप्ति चैनलों शुरू रिकॉर्डिंग (। उदाहरण के लिए, "ब्लू" झल्लाहट दाता eCFP के लिए 483 एनएम और "पीला" झल्लाहट स्वीकर्ता के लिए 535 एनएम, चश्मा 1 टेबल देखें) एक साथ संबंधित छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर (भी 3.1 देखें .6)। उदाहरण के लिए, प्रकाश चमक (चित्रा 3 बी, सी), रिकॉर्ड कम से कम 8 के मामले में - 10 प्रोत्साहन प्रस्तुतियों (परीक्षण)।
- कहीं और 10,21,26 वर्णित के रूप में निम्न चरणों का पालन करने के लिए एक उप-चरण पूरे क्षेत्र प्रकाश उत्तेजक का उपयोग करें।
- "इन-टुकड़ा" सीए 2 + अंशांकन
- रिकॉर्ड सीए (3.4 में वर्णित) (3.1.6 और 3.2.4 में वर्णित है) और शंकु का एक सेट में आधारभूत सीए 2 + स्तर निकालने शंकु टर्मिनलों में 2 + का संकेत है।
- 5 माइक्रोन (DMSO में भंग) ionomycin और 10 मिमी EGTA के साथ "सीए 2 + मुक्त" कोशिकी मध्यम करने के लिए स्विच (या, वैकल्पिक रूप से, BAPTA) जोड़ा गया। रिकॉर्ड शंकु टर्मिनलों फिर से हर 5 मिनट के न्यूनतम प्रतिदीप्ति अनुपात (आर मिनट) का निर्धारण, <के लिएउन्हें> यानी, इंट्रासेल्युलर सीए की (पास) अनुपस्थिति में अनुपात 2 +। 30 मिनट - यह कहीं भी 15 के बीच लग सकता है।
नोट: एक छिड़काव प्रणाली विभिन्न जलाशयों के बीच स्विच करने की अनुमति देता है कि आवश्यक है। - (DMSO में भंग) 5 माइक्रोन ionomycin और 2.5 मिमी सीए 2 + साथ कोशिकी मध्यम करने के लिए स्विच करें। 5 मिनट की एक ऊष्मायन समय के बाद, रिकॉर्ड शंकु फिर हर 5 मिनट यानी अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति अनुपात (आर अधिकतम), 2 + इंट्रासेल्युलर सीए की सांद्रता saturating की उपस्थिति में अनुपात को मापने के लिए। स्थिर बनने के लिए सीए 2 + अनुपात के लिए 15 मिनट - ionomycin आवेदन के बाद, यह 3 के बीच ले सकते हैं।
नोट: 2 + उच्च सीए करने के लिए स्लाइस प्रकाश में लाने और अंत में कोशिकाओं को नुकसान होगा एक लंबी अवधि के लिए ionomycin। अपने सामान्य आकृति विज्ञान बनाए रखने कि विश्लेषण में केवल कोशिकाओं में शामिल हैं। सांद्रता (यानी, EGTA, ionomycin) अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। सीए 2 + अंशांकन के बारे में अधिक जानकारी के लिएप्रोटोकॉल, 13,17 देखते हैं।
- डेटा विश्लेषण
नोट: संबंधित माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के साथ संगत और कस्टम विश्लेषण लिपियों चलाने में सक्षम एक छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करें।- एक इमेजिंग डेटा फ़ाइल लोड और प्रत्येक शंकु टर्मिनल (चित्रा 3) के आसपास ब्याज (ROIs) के क्षेत्रों आकर्षित। आरओआई के भीतर प्रत्येक फ्रेम, औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए और झल्लाहट स्वीकर्ता (सिट्रीन) और दाता (eCFP) प्रतिदीप्ति (आर = एफ ए / एफ डी, चित्रा 3 बी, सी) के बीच का अनुपात (आर) की गणना करने से पहले, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटाना। इस अनुपात में आम तौर पर रिश्तेदार इंट्रासेल्युलर सीए 2 + एकाग्रता के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में प्रयोग किया जाता है, लेकिन अंशांकन (3.3 देखें) के बाद, यह भी पूर्ण सांद्रता (3.4.3 देखें) अनुमान लगाया जा सकता है।
नोट: pedicles बाहरी plexiform परत में उनके स्थान द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है और उनकी आकृति विज्ञान (कुछ छोटे कोन की तुलना में "चारों" चपटाsomata,) कोन अक्षतंतु के अंत में स्थित है। - औसत प्रोत्साहन परीक्षण (चित्रा -4 ए)। प्रतिक्रिया आकार के लिए उपाय के रूप में वक्र (आर ए) के तहत प्रकाश उत्तेजना, शिखर आयाम (आर एएमपी), और इस क्षेत्र के लिए पहले इस तरह के सीए 2 + आधारभूत स्तर (आर आधार) के रूप में औसतन निशान (4B चित्रा) से प्रतिक्रिया मापदंडों को निकालें। इसके अलावा, इस तरह की प्रतिक्रिया वृद्धि (टी वृद्धि) और क्षय समय (टी क्षय) के रूप में औसतन निशान से प्रतिक्रिया कैनेटीक्स निकालने (20% और आर amp के 80% के बीच = संबंधित समय अंतराल, चित्रा 4 बी में चित्रण देखें)। इन मापदंडों का निर्धारण कैसे करें के बारे में अधिक जानकारी के लिए, 10 को देखते हैं।
- चरणों 3.3.1-3.3.3 से माप के आधार पर पूर्ण शंकु सीए 2 + एकाग्रता के एक अनुमान की गणना। न्यूनतम और अधिकतम सीए 2 + एकाग्रता, आर मिनट और आर अधिकतम CA में, क्रमशः, दाता प्रतिदीप्ति के लिए अनुपात का उपयोग 2 + डी, CA-बाउंड) और -unbound अप (एफ डी, CA-मुक्त) राज्य है, साथ ही इन विवो हदबंदी निरंतर निम्नलिखित के साथ तमिलनाडु-XL के लिए (कश्मीर डी = 0.77, 16 देखें) समीकरण (27 एनालॉग):
- एक इमेजिंग डेटा फ़ाइल लोड और प्रत्येक शंकु टर्मिनल (चित्रा 3) के आसपास ब्याज (ROIs) के क्षेत्रों आकर्षित। आरओआई के भीतर प्रत्येक फ्रेम, औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए और झल्लाहट स्वीकर्ता (सिट्रीन) और दाता (eCFP) प्रतिदीप्ति (आर = एफ ए / एफ डी, चित्रा 3 बी, सी) के बीच का अनुपात (आर) की गणना करने से पहले, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटाना। इस अनुपात में आम तौर पर रिश्तेदार इंट्रासेल्युलर सीए 2 + एकाग्रता के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में प्रयोग किया जाता है, लेकिन अंशांकन (3.3 देखें) के बाद, यह भी पूर्ण सांद्रता (3.4.3 देखें) अनुमान लगाया जा सकता है।
Representative Results
खड़ी स्लाइस HR2.1 से तैयार (चित्रा 1) के संयोजन से: दो photon इमेजिंग (चित्रा 2) के साथ तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज माउस रेटिना, हम कोन फोटोरिसेप्टर अक्षतंतु टर्मिनल में प्रकाश उत्तेजना पैदा सीए 2 + संकेतों के ratiometric माप प्रदर्शन करने में सक्षम थे । यह दृष्टिकोण पहुँचने और सिंथेटिक सीए 2 + संकेतक के साथ पूर्व मौजूदा ऑप्टिकल इमेजिंग तरीकों पर माउस शंकु दृश्यमान करने में एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रतिनिधित्व करता है। उदाहरण के लिए, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग ratiometric सीए के कोन-विशिष्ट अभिव्यक्ति 2 + biosensor तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज बहुत शंकु अक्षतंतु टर्मिनल की पहचान (चित्रा 3 ए में ROIs देखें) में मदद की। इसलिए, हमारे प्रोटोकॉल दोनों शंकु और रॉड अक्षतंतु टर्मिनल से योगदान के साथ उदाहरण "मिश्रित" संकेतों के लिए के रूप में, यह स्पष्ट नहीं मूल की रिकॉर्डिंग के संकेतों के खतरे को समाप्त।
हमारा दृष्टिकोण व्यक्तिगत के स्तर पर एकल परीक्षण प्रतिक्रियाओं को हल करने की अनुमति देता हैदोहरी शंकु अक्षतंतु टर्मिनल। कोन टर्मिनल से सीए 2 + का प्रकाश पैदा बाहर निकालना वृद्धि हुई है और दाता और स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति, क्रमशः (3B चित्रा) में कमी के रूप में चिह्नित है। प्रतिदीप्ति अनुपात (आर) में कमी शंकु और वोल्टेज-गेटेड सीए 2 + चैनलों के बाद बंद होने के प्रकाश प्रेरित hyperpolarization की वजह से कोन टर्मिनल (चित्रा -3 सी), से सीए के बाहर निकालना 2 + से मेल खाती है। कई शंकु अक्षतंतु टर्मिनल (चित्रा 3) एक साथ नजर रखी जा सकती है, क्योंकि डाटा अधिग्रहण बहुत ही कुशल है और कोन सीए 2 + प्रतिक्रियाओं के सैकड़ों एक ही प्रयोग में एकत्र किया जा सकता है। (चित्रा 4) मात्रात्मक इन प्रतिक्रियाओं का आकलन करके, शंकु सीए 2 + संकेतों तुलना की जा सकती और शर्तों (चर्चा देखें) की एक श्रेणी में मूल्यांकन किया है।
यह झल्लाहट स्वीकर्ता (सिट्रीन) और -donor (eCFP) प्रतिदीप्ति के बीच अनुपात का उपयोग करने के लिए अक्सर पर्याप्त हैइंट्रासेल्युलर सीए 2 + स्तर के एक रिश्तेदार उपाय के रूप में, (एफ ए / एफ डी जानकारी के लिए, 3.4 देखें)। फिर भी, जब भी आवश्यक है, अनुपात पूर्ण इंट्रासेल्युलर सीए 2 + सांद्रता ([सीए 2 +]) (चित्रा 5) प्राप्त करने के लिए calibrated किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल पृष्ठभूमि रोशनी में (विवरण के लिए, 10 को देखते हैं और चित्रा 3 कथा), अंशांकन [सीए 2 +] में "जंगली प्रकार" HR2.1 आराम निरपेक्ष के लिए एक अनुमान झुकेंगे: की तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज माउस शंकु टर्मिनलों 243 ± 159 साहित्य 11 में चूहों के लिए सूचना दी सीमा के भीतर है, जो न्यू मैक्सिको (मतलब ± एसडी),।
खड़ी रेटिना स्लाइस की 1. तैयारी चित्रा। रेटिना के (ए) और अलग रेटिना टुकड़ा करने की क्रिया के लिए तैयार चपटे। (बी) आयताकार टुकड़ा (ओंटुकड़ा करने की क्रिया के बाद फिल्टर पेपर झिल्ली (डार्क ग्रे) पर घुड़सवार) एक में लाल बॉक्स ee। (सी) तेल का उपयोग कर एक गिलास coverslip पर तय की झिल्ली पर चढ़कर रेटिना टुकड़ा के शीर्ष दृश्य। (डी) एक रेटिना टुकड़ा के एक भाग के योजनाबद्ध ड्राइंग (सी में लाल देखें बॉक्स)। कोन फोटोरिसेप्टर हरे रंग में संकेत कर रहे हैं। वी, उदर; विकास, पृष्ठीय; एन, नाक; टी, अस्थायी; ओएस, बाहरी खंड; ONL, बाहरी परमाणु परत; OPL, बाहरी plexiform परत; लीग, भीतर परमाणु परत; आईपीएल, भीतरी plexiform परत; GCL, नाड़ीग्रन्थि सेल परत। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
रेटिना स्लाइस की चित्रा 2. दो photon इमेजिंग: रिकॉर्डिंग विन्यास का चित्रण ऊपर:। पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस ध्यान केंद्रित होस्कैनिंग रेटिना में लेजर (लाल नीचे तीर), और उत्सर्जित प्रतिदीप्ति (उर्ध्व तीर) इकट्ठा करने का AM। लेंस भी एक सीसीडी कैमरे का उपयोग टुकड़ा जब इमेजिंग कंडेनसर नीचे घुड़सवार एक एलईडी रोशनी से अवरक्त प्रकाश प्रेषित एकत्र केंद्र:।। कोशिकी समाधान के साथ रिकार्डिंग कक्ष में रखा और perfused रेटिना टुकड़ा नीचे: कंडेनसर लेंस उत्तेजना एल ई डी से प्रकाश ध्यान केंद्रित (और सीसीडी कैमरा इमेजिंग के लिए अवरक्त एलईडी) रेटिना ऊतक में रिकार्डिंग कक्ष के पारदर्शी नीचे के माध्यम से। आईआर एलईडी, अवरक्त प्रकाश उत्सर्जक डायोड; सीसीडी, आरोप डिवाइस युग्मित; बीपी, बैंड पास। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. प्रकाश आह्वानमाउस कोन photoreceptors के अक्षतंतु टर्मिनल में डी सीए 2 + हिमायती हैं। (ए) वाम: रिकॉर्डिंग रेटिना स्लाइस में कोन फोटोरिसेप्टर (हरा) की synaptic टर्मिनलों (लाल बॉक्स) पर ध्यान केंद्रित अधिकार:। उदाहरण के एक रिकॉर्ड क्षेत्र के लिए 7 अलग-अलग टर्मिनलों के साथ। प्रतिदीप्ति दो चैनलों का उपयोग कर दर्ज किया गया था। (; 535 बीपी 50 ऊपर) और झल्लाहट दाता eCFP के लिए एक (नीचे; 480 बीपी 32) झल्लाहट स्वीकर्ता सिट्रीन के लिए एक (बी) सिट्रीन में प्रकाश पैदा परिवर्तन (एफ ए) और eCFP (एफ डी) प्रतिदीप्ति एक भी आरओआई में दर्ज की गई। (सी) सीए 2 + प्रतिक्रियाओं 5 सेकंड के अंतराल में 1 सेकंड उज्ज्वल प्रकाश चमक की एक श्रृंखला के लिए एक शंकु टर्मिनल की (अनुपात एफ ए / एफ डी के रूप में)। रॉय, ब्याज के क्षेत्र; बीपी, बैंड-पास फिल्टर; एफ, प्रतिदीप्ति तीव्रता; मनमाना इकाइयों, ए.यू.; झल्लाहट, Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण; eCFP, सियान प्रतिदीप्ति प्रोटीन बढ़ाया। उत्तेजना तीव्रता (पी के रूप में। 13.0 और एक पृष्ठभूमि के स्तर पर जोड़ने क्रमशः एम और एस opsins, के लिए 12.8, (के ~ 10 = एल ई डी बंद, उत्तेजना लेजर स्कैनिंग): 10 3 · पी · एस -1) शंकु प्रति में hoto-isomerization दर क्लिक करें यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।
प्रकाश पैदा शंकु सीए 2 + प्रतिक्रियाओं की चित्रा 4. अनुकरणीय मात्रात्मक विश्लेषण (ए) एक एकल कोन टर्मिनल से (ΔR के रूप में) प्रकाश पैदा सीए 2 + प्रतिक्रियाओं (एकल परीक्षणों: ग्रे निशान, एन = 16; मतलब है:। काले ट्रेस ) (बी) पैरामीटर मतलब सीए 2 + प्रतिक्रिया के लिए निर्धारित:। पूर्व प्रकाश उत्तेजना के लिए आधारभूत का प्रतिनिधित्व) सीए 2 + स्तर (आर आधार आराम कर, प्रतिक्रिया आकार की गिरफ्तारी के रूप मेंईए के तहत वक्र 80% से (आर ए) और शिखर आयाम (आर एएमपी), प्रतिक्रिया शुरू होने के कैनेटीक्स (टी वृद्धि, अनुसंधान amp के 20% से 80% से समय अंतराल) और ऑफसेट (टी क्षय, समय अंतराल आर amp के 20%) करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5. पूर्ण सीए 2 + एकाग्रता का आकलन। आराम सीए 2 + एकाग्रता ([सीए 2 +], अनुपात एफ ए / एफ डी के रूप में) एक तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज माउस में 8 शंकु अक्षतंतु टर्मिनल में दर्ज की गई है (हलकों, एसडी मतलब ± के साथ) अलग कोशिकी समाधान के लिए: दो बार मानक कोशिकी माध्यम में (Ctrl 1 और 2), तो कम से कम ("शून्य") [सीए 2 +] (10 मिमी EGTA) एक साथउच्च [सीए 2 +] (2.5 मिमी) के साथ विकास, बाह्य और intracellular सीए 2 + संतुलित करने के लिए ionomycin 5 माइक्रोन की उपस्थिति में बाद के दो शर्तें। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
Electrophysiological एकल कक्ष रिकॉर्डिंग या सिंथेटिक फ्लोरोसेंट संकेतक के साथ सीए 2 + इमेजिंग का उपयोग पूर्व मौजूदा प्रोटोकॉल तकनीकी कारणों से (परिचय देखें) के एक नंबर के लिए माउस कोन फोटोरिसेप्टर में सीए 2 + गतिशीलता रिकॉर्ड करने के लिए संघर्ष। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल सीए 2 + संकेतों और एक कुशल और अपेक्षाकृत सरल तरीके से व्यक्ति की पहचान माउस शंकु टर्मिनलों में भी पूर्ण सीए 2 + स्तर की माप की अनुमति देता है।
इस प्रोटोकॉल पहले से ही सफलतापूर्वक स्वस्थ माउस रेटिना में शंकु समारोह के विभिन्न पहलुओं को संबोधित तीन अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है। पहले अध्ययन में 10 में, HR2.1: तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज माउस सीए 2 + biosensor के कोन-विशिष्ट अभिव्यक्ति में बाधा नहीं है कि दिखा, immunohistochemistry, एर्ग रिकॉर्डिंग, दो photon सीए 2 + इमेजिंग, और औषध विज्ञान का उपयोग कर विशेषता थी कोन शारीरिक रचना और कार्य करते हैं। दूसरे अध्ययन 21 में, रंगीनऔर माउस शंकु की अवर्णी प्रतिक्रिया गुण "हरी" opsin बहुल पृष्ठीय और "ब्लू" opsin बहुल उदर माउस रेटिना के बीच कोन समारोह में हड़ताली मतभेद का प्रदर्शन, रेटिना भर में मैप किया गया। कोन गुणों में ये क्षेत्रीय मतभेद माउस शंकु के विभिन्न प्रकार के वर्णक्रम इस प्रकार, अवर्णी विरोधाभासों (पास) इष्टतम नमूना लेने के लिए प्रदान करते हैं और सुझाव है कि प्राकृतिक वातावरण में अंतर विपरीत वितरण (यानी, जमीन बनाम आकाश) मिलान, एक पेशकश कर सकते हैं विकासवादी लाभ। कोन अक्षतंतु टर्मिनलों क्षैतिज कोशिकाओं से प्राप्त होने वाले तीसरे अध्ययन 22 पारस्परिक प्रतिक्रिया में जांच की गई। सभी प्रस्तावित क्षैतिज सेल प्रतिक्रिया तंत्र शंकु अक्षतंतु टर्मिनलों 28 में वोल्टेज-गेटेड सीए 2 + चैनलों पर कार्रवाई के रूप में, कोन टर्मिनल सीए 2 + क्षैतिज सेल के लिए कोन बातचीत के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में सेवा कर सकते हैं। Kemmler और से अध्ययन 22 का समर्थन करता है सहकर्मियोंदेखें क्षैतिज कोशिकाओं फोटोरिसेप्टर ग्लूटामेट रिहाई को नियंत्रित करने के लिए कई तंत्र जिसमें एक जटिल राय प्रणाली का उपयोग करें।
इन अध्ययनों से वर्णित प्रोटोकॉल की चंचलता को वर्णन है और यह कोन समारोह और उसके अन्तर्ग्रथनी सर्किट से संबंधित प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल शंकु शरीर क्रिया विज्ञान का एक बेहतर समझ की दिशा में, अलग शंकु डिब्बों में स्थानीय सीए 2 + संकेतन का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है। इस तरह के ज्ञान अंततः शंकु को प्रभावित करने अपक्षयी रोगों के लिए विशेष रूप से, संभावित चिकित्सकीय दृष्टिकोण के तर्कसंगत विकास के लिए अनुमति देने के लिए, degenerating शंकु में pathophysiological प्रक्रियाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
HR2.1 में: तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज माउस लाइन, सीए 2 + biosensor बाहरी खंड के अपवाद के साथ, शंकु भर में व्यक्त किया जाता है। इस CA 2 + गतिशील के प्रत्यक्ष और ratiometric आकलन के लिए एक अवसर प्रदान करता हैअलग शंकु डिब्बों में एस। सीए में परिवर्तन के बाद से बाहरी क्षेत्र में 2 + धाराओं झिल्ली क्षमता और वोल्टेज-गेटेड सीए 2 + चैनलों के परिणामस्वरूप सक्रियण के माध्यम से टर्मिनलों में परिलक्षित होते हैं, बाहरी क्षेत्र में प्रक्रियाओं परोक्ष रूप से देखा जा सकता है।
संभावित ख़तरे:
रेटिना के विच्छेदन एक महत्वपूर्ण कदम है: माउस में रेटिना आमतौर पर फोटोरिसेप्टर बाहरी क्षेत्रों और वर्णक उपकला के बीच eyecup से अलग करती है। इसलिए, अलग रेटिना के प्रकाश के प्रति संवेदनशील फोटोरिसेप्टर बाहरी क्षेत्रों उजागर कर रहे हैं और यांत्रिक क्षति के प्रति बेहद संवेदनशील। महान देखभाल उपकरणों के साथ फोटोरिसेप्टर पक्ष छूकर या एक चिपकने वाला सतह पर बग़ल में (उदाहरण के लिए, एक फिल्टर झिल्ली) ऊतक को ले जाकर नुकसान नहीं लिया जाना चाहिए।
उच्च गुणवत्ता वाले रेटिना स्लाइस उनकी साफ काटने की सतह से माइक्रोस्कोप के तहत मान्यता प्राप्त किया जा सकता है औरस्पष्ट रूप से परिभाषित बाहरी क्षेत्रों के साथ एक अच्छी तरह से संगठित फोटोरिसेप्टर परत से। टुकड़ा गुणवत्ता के कार्यात्मक मूल्यांकन जल्दी से (- 20 शंकु 10 के साथ देखने का एक क्षेत्र में, उदाहरण के लिए) उज्ज्वल प्रकाश उत्तेजनाओं चमकती और उत्तरदायी शंकु का प्रतिशत निर्धारित किया जा सकता है। इधर, प्रतिक्रिया की गुणवत्ता के संकेत करने वाली शोर अनुपात (एस / एन) (प्रकाश प्रतिक्रिया के आयाम बनाम प्रकाश उत्तेजना से पहले आधारभूत शोर के आयाम) की गणना के द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए; एक एस / 2 के एन - 3 न्यूनतम सीमा के रूप में माना जाना चाहिए। आमतौर पर, हम कम से कम 50% उत्तरदायी शंकु के साथ स्लाइस त्यागें। इसके अलावा अत्यधिक सहज spiking के व्यवहार (10 में चित्रा 4 देखें) त्याग किया जाना चाहिए कि प्रदर्शन शंकु के साथ स्लाइस।
Aforementioned के संरचनात्मक और कार्यात्मक मानदंडों को पूरा करती रिकॉर्डिंग कक्ष में स्लाइस 1 के लिए लगातार प्रतिक्रियाएं शो - 2 घंटा (प्रतिक्रिया स्थिरता पर जानकारी के लिए, 10 देखें)। स्लाइस घंटे के लिए जीवित रहने की वजहपकड़े कक्ष में हमारा, एक सफल प्रयोग 6 घंटा के लिए पिछले कर सकते हैं। यह टुकड़ा करने की क्रिया को अनिवार्य रूप से रेटिना नेटवर्क में पार्श्व कनेक्शन severs के रूप में शंकु और क्षैतिज कोशिकाओं के बीच लंबे समय से लेकर स्थानिक बातचीत का अध्ययन करने के लिए सम्मान के साथ कुछ प्रतिबंध है, कि वहाँ उल्लेखनीय है। हालांकि, 300 माइक्रोन के लिए रेटिना स्लाइस की मोटाई में वृद्धि इस मुद्दे पर 22 ameliorates।
खड़ी रेटिना स्लाइस के उपयोग काफी हद तक (10,21 देखते हैं, व्यापक चर्चा के लिए) opsin विरंजन से बचाता है, इस प्रकार, उत्तेजना लेजर द्वारा प्रकाश के प्रति संवेदनशील शंकु बाहरी क्षेत्रों की स्कैनिंग से बचा जाता है और। फिर भी, दर्ज की गई सीए 2 + संकेतों न केवल प्रकाश उत्तेजनाओं पर निर्भर करती है, लेकिन यह भी स्कैनिंग उत्तेजना लेजर द्वारा उत्पन्न एक पृष्ठभूमि रोशनी घटक से प्रभावित हो। वास्तव में, इस तरह के दो photon इमेजिंग प्रयोगों में प्रभावी पृष्ठभूमि रोशनी बिखरे हुए लेजर प्रकाश, दर्ज सीई द्वारा उत्सर्जित फ्लोरोसेंट रोशनी का एक संयोजन हैLLS, और किसी भी एलईडी प्रोत्साहन पृष्ठभूमि घटक। रिकॉर्डिंग करने से पहले (चालू होने पर प्रकाश प्रोत्साहन की पृष्ठभूमि घटक के साथ) लेजर स्कैनिंग के लिए 30 एस - इसलिए, शंकु कम से कम 20 के लिए अनुकूल करने की अनुमति दी जानी चाहिए।
फायदे और अनुप्रयोगों:
शंकु में रास्ते संकेतन 2 + सीए को मान्य हो सकता है कोन सीए 2 + इमेजिंग के साथ संयोजन में औषधीय अध्ययन और हो सकता है: इस शंकु सीए 2 + -imaging प्रोटोकॉल के लिए कुछ अनुप्रयोगों 10,21,22 ऊपर वर्णित किया गया है, जबकि अन्य अनुप्रयोगों की कल्पना की जा सकती है प्रभावकारिता और सीए में विभिन्न खिलाड़ियों को लक्षित दवाओं की शक्ति का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल 2 + 10 -signaling। हालांकि, एक प्रमुख आवेदन शंकु समारोह को प्रभावित रोगों का अध्ययन करने के लिए हो सकता है। मानव रोगों नकल उतार कई रेटिना अध: पतन माउस मॉडल उपलब्ध हैं। उदाहरण के लिए, कोन फोटोरिसेप्टर नुकसान 1 (cpfl 1) माउस एक प्राथमिक शंकु अध: पतन मॉडल पीड़ा हैएक Pde6c उत्परिवर्तन 29 से। इसके विपरीत, रॉड अध: पतन 1 (आरडी 1) माउस एक Pde6b उत्परिवर्तन से ग्रस्त है। इस प्राथमिक रॉड फोटोरिसेप्टर अध: पतन 30, 1 में आरडी 1 रॉड नुकसान पूरा हो गया है एक बार, माध्यमिक शंकु अध: पतन का कारण बनता सेट है। HR2.1 साथ इन जानवरों crossbreeding: तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज लाइन का अध्ययन और दोनों को प्राथमिक और माध्यमिक शंकु अध: पतन में सीए 2 + गतिशीलता की तुलना की अनुमति है और कोन सेल मौत के दौरान सीए 2 + की भूमिका में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए की संभावना है जाएगा। इसके अलावा, औषधीय शंकु अध: पतन प्रेरित - उदाहरण के लिए चयनात्मक PDE6 अवरोधकों का उपयोग कर - शंकु अध: पतन 10,29,31 के बहाव के तंत्र की पहचान करने के लिए सेवा कर सकता है।
सारांश में, प्रोटोकॉल यहां माउस कोन फोटोरिसेप्टर के subcellular डिब्बों में सीए 2 + मापने की अनुमति देता है और एक विस्तृत श्रृंखला के तहत शंकु शरीर क्रिया विज्ञान को उजागर करने के लिए महान अवसर प्रस्तुत वर्णितशारीरिक और pathophysiological शर्तों की। साथ ही, इस प्रोटोकॉल शंकु सीए 2 + -signaling के साथ हस्तक्षेप है और इस तरह शंकु रोगों के लिए नए उपचारों स्थापित करने में मदद करने के लिए डिजाइन औषधीय एजेंटों की स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High vacuum grease | Dow Corning | 1018817 | http://www.dowcorning.com |
| Cover slips | R. Langenbrinck | 24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com | |
| Glass slides | R. Langenbrinck | 76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com | |
| Blades for tissue chopper | MARTOR KG | ARGENTAX No. 1044 | 0.25 mm; http://www.martor.de |
| Tissue chopper | Custom-build | Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert | |
| Nitrocellulose filter membrane gridded | Merck Millipore | AABG01300 | Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com |
| Isoflurane CP | CP pharma | AP/DRUGS/220/96 | http://www.cp-pharma.de |
| UV/green LED-based full-field stimulator | Custom-build | for details, see10 | |
| Open source microprocessor board | Arduino | http://www.arduino.cc | |
| Imaging software CfNT | Custom-written | developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany | |
| IgorPro | Wavemetrics | http://www.wavemetrics.com | |
| VC3-4 System focal perfusion system | ALA Scientific Instrument | with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/ | |
| Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser) | Newport Spectra-Physics | http://www.spectra-physics.com | |
| Movable objective microscope (MOM), Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany |
Sutter Instruments | http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XLUMPlanFL 20X/0.95w objective | Olympus | http://www.olympusamerica.com | |
| Vaporizer 100 series | Surgivet | http://www.surgivet.com | |
| Ionomycin, Calcium salt | Life technologies | I24222 | http://www.lifetechnologies.com |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | https://www.sigmaaldrich.com |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 101191250 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Leica MZ95 | leica microsystems | http://www.leica-microsystems.com/ |
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