Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Imaging Ca Published: May 6, 2015 doi: 10.3791/52588
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2,3, 4,5, 1,2,3, 1
1Institute for Ophthalmic Research, University of Tübingen, 2Graduate School of Cellular & Molecular Neuroscience, University of Tübingen, 3Bernstein Centre for Computational Neuroscience, University of Tübingen, 4Molecular Genetics Laboratory, University of Tübingen, 5Centre for Ophthalmology, University of Tübingen

Summary

Vi beskriver en protokol til overvågning Ca 2+ dynamik i Axon terminaler kegle fotoreceptorer bruger en ex-vivo skive forberedelse af musen nethinden. Denne protokol giver mulighed for omfattende undersøgelser af kegle Ca2 + signalering i en vigtig pattedyr modelsystem, musen.

Abstract

Retinale kegle fotoreceptorer (kræmmerhuse) tjener vision dagslys og er grundlaget for farven diskrimination. De er underlagt degeneration, hvilket ofte fører til blindhed i mange retinale sygdomme. Calcium (Ca2 +), en central second messenger i fotoreceptor signalering og metabolisme, er blevet foreslået at være indirekte forbundet med fotoreceptordegenerering i forskellige dyremodeller. Systematisk studere disse aspekter af kegle fysiologi og patofysiologi er blevet hæmmet af vanskelighederne ved elektrisk optagelse fra disse små celler, især i musen, hvor nethinden er domineret af stang fotoreceptorer. For at omgå dette problem, vi etableret en to-foton Ca2 + imaging-protokol under anvendelse af en transgen mus linje, der udtrykker den genetisk indkodede Ca2 + biosensor TN-XL udelukkende kegler og kan krydset med musemodeller for fotoreceptordegenerering. Den her beskrevne protokol indebærer forbereder lodrette sektioner (R20, skiver ") af nethinder fra mus og optisk billeddannelse af lette stimulus-fremkaldte ændringer i kegle Ca 2+ niveau. Protokollen giver også mulighed "i-slice måling" absolutte Ca 2 + koncentrationer; som på båndene kan efterfølges af kalibrering. Denne protokol muliggør studier i funktionelle kegle egenskaber, og forventes at bidrage til forståelsen af keglen Ca 2 + signalering samt den potentielle inddragelse af Ca2 + i fotoreceptor død og retinal degeneration.

Introduction

Vision begynder med lys-induceret aktivering af lysoverførelsen i retinale fotoreceptorer. Rod fotoreceptorer tillader vision ved lave lysniveauer, mens kegle fotoreceptorer mægle farver og høj opløsning dagslys vision. Mange fotoreceptor-specifikke gener er modtagelige for mutationer, der fører til degeneration af disse celler. En række molekylære markører associeret med fotoreceptor tab er blevet identificeret 1, men indtil videre de detaljerede molekylære mekanismer og hændelsesforløbet fortsat uklare. Altered Ca2 + homøostase blev spekuleret at være en udløser af fotoreceptor celledød, en hypotese støttes af opregulering af aktiviteten af Ca2 + -afhængige calpain-proteaser under degeneration proces 2,3. Men til dato, denne hypotese ikke bakket op af fysiologiske målinger af Ca 2+. Uoverensstemmelser i flere undersøgelser om effekten af Ca 2+ kanal blokkere i retinal sygdomme anfægtede endvidere inddrages Ca 2+ i celledød 4-6, der opfordrer til metoder til direkte at vurdere Ca 2+ i mammale kegle fotoreceptorer.

Tidligere har de fleste elektriske optagelse og Ca 2+ billeddiagnostiske undersøgelser udført hos padder og krybdyr modeller på grund af den lettere adgang til kegler 7-9. Dog kan pattedyr fotoreceptor fysiologi være forskellig fra ikke-pattedyr 10 og især i forbindelse med menneskelige arvelig retinal degeneration, en bedre forståelse af pattedyr fotoreceptor fysiologi er en nøgle til udviklingen af innovative behandlinger. Mange musemodeller efterligner humane retinale sygdomme er tilgængelige, men lidt er kendt om Ca2 + dynamik i muse kegler 11. Elektriske teknikker er ikke egnede til high-throughput optagelser fra kegler, især ikke i mus, hvor stængerne (~ 97%) væsentligt overtal kegler (~ 3%) 12 2 + strøm, men ikke på absolutte intracellulære Ca 2 + koncentrationer. Derfor, på trods af lavere tidsmæssig opløsning, billedbehandling er den foretrukne metode, når man behandler spørgsmål om kegle Ca 2 + dynamik. Det centrale spørgsmål med billedbehandling er, hvordan man selektivt mærke keglerne med en fluorescerende Ca2 + indikatorfarvestof. Korrekt opdeling og cellespecificitet er svært at opnå ved "bulk-loading" syntetisk Ca2 + indikatorfarvestoffer i vævet. Som følge heraf mærkede kegler, stænger 13,14, og Müller gliaceller ikke pålideligt kan skelnes. Også syntetiske farvestoffer tendens til at sive ud af cellerne, forebygge langvarige optagelser under ensartede betingelser. Desuden lastning syntetiske Ca 2 + indikatorer i deres AM-esterform er problematisk, da det kræver devaskemidler (f.eks DMSO) og genererer formaldehyd 15. For absolutte Ca 2 + målinger ratiometriske indikatorer er obligatoriske. Men i øjeblikket den bedste syntetisk ratiometrisk indikator Fura-2 kræver excitation lys i området fra 700 til 760 nm (for to-foton excitation), som, afhængigt af dens intensitet, kan i sig selv stimulere kegler, og dermed hindre undersøgelser af, kegle Ca2 + dynamik under fysiologiske belysningsforhold.

Modsætning syntetiske farvestoffer, kan genetisk kodede Ca2 + indikatorer udtrykkes i en celletype-selektiv måde. De behøver ikke sive ud af celler, og derfor om blegning undgås, er mulige langvarige og pålidelige ratiometriske målinger. Celletype-selektive udtryk for Ca 2 + biosensorer, når den kombineres med to-foton mikroskopi, er et effektivt redskab til at vurdere og studere subcellulære Ca2 + under stort set fysiologiske forhold 13,16,17 2 + dynamik i en transgen Ca 2+ biosensor mus linje (HR2.1: TN-XL), som udtrykker FRET-baserede Ca 2+ biosensor TN-XL 18 selektivt i kegler, under den humane røde opsin promotor HR2.1 19. At få adgang til kegle terminaler blev en ex-vivo skive forberedelse 20 ansat. Protokollen blev allerede med succes anvendt i tre undersøgelser om kegle funktion hos raske mus 10,21,22. Desuden tillader den protokol studere kegle Ca 2 + signalering i specifikke genetiske forhold, fx ved at krydse musemodeller for arvelig retinal degeneration med HR2.1: TN-XL mus.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført at overholde de retningslinjer og love for dyrebeskyttelse bestemt af tyske forbundsregering og godkendt af den institutionelle dyrevelfærd udvalg fra University of Tübingen.

1. Animalske Modeller

  1. HR2.1: TN-XL Ca2 + biosensor mus
    1. Brug transgene HR2.1: TN-XL muse linje udtrykker Ca2 + biosensor TN-XL selektivt i kegle fotoreceptorer 10. Bruge 3 - 6 uger gamle mus af begge køn rejst med en standard 12 timer dag / nat rytme.

2. Retinal Dissektion

  1. Fysiologisk opløsning
    1. Forberede frisk 2 l ekstracellulær opløsning indeholdende 125 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 26 mM NaHCO3, 0,5 mM L-glutamin og 20 mM (+) glucose. Bland indtil alle ingredienser opløses.
    2. "Bubble" ekstracellulær opløsningmed carboxygen (95% O 2, 5% CO2) i 5 - 10 min. Tilføj CaCl2 for at nå en koncentration på 2 mM.
    3. Efter gennembobling den ekstracellulære opløsning måles dets pH. PH skal være 7,4, ellers er det sandsynligt, at der er begået fejl under fremstillingen af ​​opløsningen. Hold boblende sats og opløsningstemperatur konstant gennem eksperiment for at sikre en konstant pH.
    4. Adskil bestanden i 2 kolber, en for nethinden dissektion og en for opsætningen optagelse (perfusion).
  2. Eye enucleation og isolering af nethinden (5 - 10 min)
    1. Opretholde en svagt rød belysning i arbejdsområdet for enucleation. Brug LED'er med en topbølgelængde på 650 nm (eller længere) for at undgå blegning af kegler under dissektion.
    2. Dark-tilpasse musen i 2 timer ved at sætte sit bur i et godt ventileret, lystæt boks for at sikre, at kegler er fuldt sensibiliserede på tidspunktet for optagelserne.
    3. Bedøve musen under en laboratory hætte med isofluran (5%) ved anvendelse af en fordamper og en gastæt beholder, der holder en standard mus bur. Følg nøje de Producentens anvisninger ved håndtering af fordamperen. Brug handsker og ansigtsmaske at reducere eksponeringen for allergener.
    4. Brug en kikkert mikroskop med en 10 - 40X forstørrelse til dissektion.
    5. Ofre bedøvet mus ved halshugning.
    6. Til orientering, markerer toppen af ​​hvert øje (= dorsale) med en vandtæt pen. Hold styr på, om at bruge venstre eller højre øje.
    7. Fjern øjet forsigtigt ved hjælp krum saks ved at skære synsnerven bag øjeæblet. For dissektion, overføre øjeæblet til en petriskål indeholdende frisk carboxygenated ekstracellulær løsning. Til overførsel øjeæblet, hold det synsnerven stump.
    8. Gennembore øjet på ethvert punkt langs grænsen mellem hornhinden og sclera (dvs. ved ora serrata) med en skarp kanyle.
    9. Hold eI ved sclera med et par pincet og forsigtigt indsætte en saks klinge i hullet foretaget i det foregående trin. Skåret langs ora serrata at adskille den forreste del af øjet (hornhinden, linsen, glaslegemet) fra den bageste del (øjestykke). Skær øjestykket radialt (mod optisk disk) ved positionen af ​​pennen mærke, der angiver den dorsale position på nethinden.
      Bemærk: Udarbejdet på denne måde, de øjestykker kan holdes i konstant carboxygenated løsning til senere brug.
    10. Drej okularet i petriskålen, således at den dorsale skåret point væk fra sig selv. Grab sclera til venstre og højre side af øjestykket med et par pincet hver ved at indsætte tangen tips mellem nethinden og sclera.
    11. Frigør nethinden ved forsigtigt at vende den sclerale del af øjestykket. Endelig sender en synsnerven med micro dissekere saks for at frigøre nethinden fra sclera.
      Bemærk: Dette er et afgørende skridt. Undgå beskadigelse af nethinden (fx vedrørende og klemme den med en pincet).
    12. Hold en af ​​kanterne af nethinden med et par pincet og forsigtigt fjerne snavs og glaslegeme fra den retinale overflade ved anvendelse af et andet par pincet. Når retinal overfladen er ren, bruge mikro dissekere saks til at gøre tre yderligere kortere, radiale snit (ca. hver 90 °). Disse nedskæringer tillader en at omhyggeligt flade nethinden med fotoreceptor nedad i petriskålen (figur 1A).
  3. Slice forberedelse (10 - 15 min)
    1. Forbered på forhånd nitrocellulose filtermembraner for retinale udskæring og glas cover-sedler til montering skiver og overføre dem til optagelsen kammer. Skåret nitrocellulose filtermembran i ca. 10 x 5 mm store rektangulære stykker med en saks. Skåret dækglas i tilnærmelsesvis 10 x 5 mm store rektangulære stykker med en glasscutter.
    2. Langsomt nedsænke et objektglas i det ekstracellulære opløsning tæt påvæv. Forsigtigt trække nethinden på objektglas med ganglion celle opad ved at snuppe det på kanten ved hjælp af en pincet. Denne proces reducerer mekaniske skader og foldning af væv.
    3. Vælge det område af nethinden, der er relateret til den respektive problemstilling (se også Diskussion). Husk, den lange snit foretaget i trin 2.2.9 markerer den dorsale retinal halvdel (figur 1A). Skær en rektangulær, cirka 1 x 2 mm størrelse stykke ud for den valgte retinal region under anvendelse af en krum skalpel. Tør overskydende opløsning omkring vævet.
    4. Placer filteret membran oven på det stykke retina således at gangliecelle side klæber til membranen. Straks, tilsættes en dråbe ekstracellulære medium på membranen at fast fastgøre væv til membranen.
    5. Membranfilteret overføres monterede retinavæv til udskæring kammer, der indeholder frisk ekstracellulær opløsning.
    6. Skåret nethinden i lodrette skiver af 200 umtykkelse (figur 1B) under anvendelse af en frisk barberblad fastgjort til en vævshakker 23. Skift vinge til hver retinal stykke.
      Bemærk: barberblad skal være perfekt på linie med overfladen af ​​udskæring kammerets bund, således at hele membranen opdeler samtidigt, som angivet ved en "klikke" lyd, når der skæres - ellers bladet kan blive bøjet og beskadige skive.
    7. Lim en enkelt membran monteret skive til et glas cover-slip ved at anvende højt vakuum fedt til membranen slutter eneste (figur 1C). Hold glasoverfladen under nethinden fri for fedt.
    8. Hold dækglas monteret skiver er omfattet af en dråbe ekstracellulær løsning på bedriften kammer - en lukket og lystæt beholder, fx en petriskål med låget dækket med alufolie - under en carboxygen atmosfære ved stuetemperatur. Indføre carboxygen ved at boble en lille vandreservoir for at holde stemningen på bedriftenkammer befugtet; dette forhindrer skiverne i at tørre ud.
    9. Tillad skiver til hvile i den bedrift kammer i 10 - 15 minutter, før du flytter dem (én efter én) til optagelsen kammer. Skiver kan opretholdes op til 4-5 timer i holdekammeret ved stuetemperatur (~ 21 ° C).

3. To-foton Ca2 + Imaging

  1. To-foton mikroskopi
    1. Brug en Movable Mål mikroskop (MOM) -type to-foton mikroskop. Både MOM design og billedbehandling procedurer blev beskrevet tidligere 24, for detaljer se også 10,21,25 (for kilder og selskaber, se tabel 1).
      Bemærk: Enhver opretstående to-foton mikroskop, der opfylder følgende minimumskrav kan bruges: Det skal være udstyret med (a) en pulserende laser tuneable til ~ 860 nm, (b) mindst to samtidigt erhvervede fluorescens kanaler, (c ) filtrerer for ECFP og citrin fluorescens, (d)en lys stimulator (for mulige udformninger, se 24,26), og (e) software, hvor optagelse tidsforkortet billedsekvenser ved en rammehastighed er tilstrækkelig til at løse Ca2 + signaler af interesse.
    2. Start to-foton imaging system som angivet af fabrikanten. Nøje følge anlæggets retningslinjer laser sikkerhed. Start laseren og tune den til ~ 860 nm.
    3. Overfør en skive fra bedriften kammer til optagelsen kammer og straks begynde perfusion med carboxygenated ekstracellulære løsning. Opretholde en perfusion strømningshastighed på 2 ml / min og en temperatur på 37 ° C i optagelsen kammer.
    4. Brug en 20X 0,95 NA nedsænkning i vand mål. Hvis den er tilgængelig, skal du bruge et CCD-kamera i kombination med en infrarød LED nedenfor optagelse kammer til at lokalisere den retinale skive (figur 2). Ellers finde skive ved hjælp af to-foton-billeddannelse (se 3.1.5).
    5. Skift til to-foton billedbehandling for at se biosensor udtryk. Tændde to påvisning kanaler til fluorescens billeddannelse af ECFP og citrin.
    6. Brug billedoptagelse software, der styrer to-foton mikroskop for at scanne og vælge en række af kegle terminaler til optagelse (figur 3A). Set billedoptagelse til 128 x 16 pixel billeder (31,25 Hz) eller en lignende konfiguration. Begrænse scannede område at kegle terminaler for at undgå blegning af photopigments i ydre segmenter.
      Bemærk: For TN-XL calcium sensor (τ = ~ 0,6 sek for Ca 2+ binding, τ = ~ 0,2 sek for Ca 2+ uforpligtende, se 16) et minimum frame rate på ~ 8 Hz anbefales.
  2. Lys stimulering og registrering
    1. Brug en sub-scene fuld felt lys stimulator som beskrevet andetsteds 10,21,26 at udføre følgende trin.
      Bemærk: En enkel løsning til en fuld-felt lys stimulator er at bruge to band-pass-filtrerede lysdioder (f.eks "blå": 360 BP 12, "grønne": 578 BP 10)at matche bølgelængde følsomhed mus kegler, men samtidig ikke overlapper med de filtre, der anvendes til fluorescens detektion (jf. 3.2.4). Lyset fra LED'erne fokuseres af kondensatoren gennem bunden af optagelsen kammer (figur 2). For nærmere oplysninger om denne stimulator design, dets kalibrering anvendte lysintensiteter og den fremkaldte kegle foto-isomeriseringsbetingelser satser, se 10,21,26.
    2. Tænd laseren og tillade kegler til at tilpasse sig til scanning laser og stimulus baggrund lys (20 - 30 sek, se også potentielle faldgruber), før at præsentere lys stimuli (se 3.2.3), eller anvende farmakologiske midler.
    3. Start præsentation af vilkårlige stimuli (f.eks lysglimt, som vist i figur 3B, C). I tilfælde af stimulatoren beskrevet i trin 3.2.1, generere stimuli ved at modulere intensiteten af ​​de to LED'er over tid under anvendelse af en mikroprocessor bord kontrolleres af tilpasset software (foroplysninger, se 10,21,26).
    4. Starte optagelsen af de to fluorescenskanaler (fx ved 483 nm for "blå" FRET-donor ECFP og ved 535 nm for "gule" FRET-acceptor;. For specs se tabel 1) samtidigt ved hjælp af den respektivt billedplan erhvervelse software (se også 3.1 .6). For eksempel i tilfælde af lysglimt (figur 3B, C), optage mindst 8-10 stimulus præsentationer (forsøg).
  3. "In-slice" Ca 2+ kalibrering
    1. Optag Ca2 + signaler i kegle terminaler (som beskrevet i 3.1.6 og 3.2.4) og ekstraheres basislinjen Ca2 + niveau i et sæt af kegler (som beskrevet i 3.4).
    2. Skift til "Ca 2+ fri" ekstracellulære medium med 5 uM ionomycin (opløst i DMSO) og 10 mM EGTA (eller alternativt BAPTA) tilsættes. Optag kegle terminaler igen hver 5 min for at bestemme den minimale fluorescensforhold (R min), <em> dvs. forholdet i (nær) fravær af intracellulær Ca2 +. Dette kan tage et sted mellem 15-30 min.
      Bemærk: En perfusionssystem kræves der tillader at skifte mellem forskellige reservoirer.
    3. Skift til ekstracellulære medium med 5 pM ionomycin (opløst i DMSO) og 2,5 mM Ca2 +. Efter en inkubationstid på 5 min, optage kegler igen hver 5 min for at måle den maksimale fluorescens-forholdet (R max), dvs. forholdet i nærvær af mættende koncentrationer af intracellulær Ca2 +. Efter ionomycin ansøgning, kan det tage mellem 3-15 min for Ca 2+ forholdet til at blive stabil.
      Bemærk: Udsættelse skiverne til høj Ca2 + og ionomycin i en længere periode i sidste ende vil beskadige cellerne. Medtag kun celler i analysen, der bevarer deres normale morfologi. Koncentrationer (dvs. EGTA, ionomycin) skal muligvis tilpasses. For flere detaljer om Ca 2+ kalibreringprotokol, se 13,17.
  4. Dataanalyse
    Bemærk: Brug et billedbehandling og dataanalyse softwarepakke kompatibelt med den respektive mikroskop software og i stand til at køre brugerdefinerede analyse scripts.
    1. Læg et billeddannende datafil og tegne regioner af interesse (ROI'er) omkring hver kegle terminal (figur 3A). For hver ramme, gennemsnitlig fluorescensintensitet i ROI og trække baggrundsfluorescens, før beregningen af forholdet (R) mellem FRET-acceptor (citrin) og donor (ECFP) fluorescens (R = F A / F D, figur 3B, C). Dette forhold anvendes typisk som en proxy for relativ intracellulær Ca2 + koncentration, men efter kalibrering (se 3.3), også absolutte koncentrationer kan estimeres (se 3.4.3).
      Bemærk: De stilke kan genkendes ved deres placering i det ydre netformige lag og deres morfologi (noget fladtrykt "blobs" mindre end keglensomata, placeret for enden af ​​keglen axon).
    2. Gennemsnitlige stimulus forsøg (figur 4a). Uddrag respons parametre fra midlede spor (figur 4B), såsom Ca2 + baseline niveau (R base) før lys stimulation, peak amplitude (R amp), og arealet under kurven (R A) som foranstaltninger til reaktion størrelse. Også udtrække respons kinetik fra gennemsnit spor, såsom respons stigning (t stigning) og forfald tid (t henfald) (= respektive tidsintervaller mellem 20% og 80% af R amp; se illustrationen i figur 4B). For flere detaljer om, hvordan at bestemme disse parametre, se 10.
    3. Beregn et skøn over den absolutte kegle Ca2 + koncentration baseret på målinger fra trin 3.3.1-3.3.3. Brug nøgletal for minimal og maksimal Ca2 + -koncentration, Rmin og Rmax henholdsvis donor fluorescens i Ca2 + D, Ca-bundet), og -unbound (F D, Ca-fri) state, samt in vivo dissociationskonstant (K d = 0,77, se 16) til TN-XL med følgende ligning (analogt til 27):

Ligning 1

Representative Results

Ved at kombinere lodrette skiver (figur 1) fremstillet af HR2.1: TN-XL mus nethinden med to-foton imaging (figur 2), var vi i stand til at udføre ratiometriske målinger af lys stimulus-fremkaldte Ca 2 + signaler i kegle fotoreceptor Axon terminaler . Denne fremgangsmåde er en betydelig forbedring i adgangen og visualisere muse kegler i de allerede eksisterende optiske billeddannende metoder med syntetiske Ca2 + indikatorer. For eksempel er den kegle-specifikt udtryk for det genetisk kodet ratiometrisk Ca 2+ biosensor TN-XL lettet identifikation af kegle Axon terminaler (se ROIs i figur 3A). Derfor vores protokol eliminerer risikoen for optagesignalerne af uklar oprindelse, som f.eks "blandede" signaler med bidrag fra både kegle- og stang axonterminaler.

Vores tilgang gør det muligt at løse svar single-forsøg på niveau med den enkelte kdobbelt kegle Axon terminal. Lys-fremkaldte ekstrudering af Ca2 + fra keglen terminalen er præget af en stigning og et fald i donor og acceptor-fluorescens, (figur 3B). Faldet i fluorescens ratio (R) svarer til ekstrudering af Ca2 + fra keglen terminal (figur 3C), forårsaget af lys-inducerede hyperpolarisering af keglen og efterfølgende lukning af spændingsstyrede Ca2 + kanaler. Fordi flere kegle Axon terminaler kan overvåges på samme tid (figur 3A), datafangst er meget effektiv og hundredvis af kegle Ca 2+ svar kan opsamles i et enkelt forsøg. Ved at vurdere disse reaktioner kvantitativt (figur 4), kan kegle Ca 2 + signaler sammenlignes og vurderes i en række betingelser (se Diskussion).

Det er ofte tilstrækkeligt at anvende forholdet mellem FRET-acceptor (citrin) og -donor (ECFP) fluorescens(F A / F D for detaljer, se 3.4) som et relativt mål for den intracellulære Ca2 + niveau. Men når det er nødvendigt, at forholdet kan kalibreres til at opnå absolutte intracellulære Ca2 + koncentrationer ([Ca2 +]) (figur 5). På baggrund belysning anvendes i denne protokol (for detaljer, se 10 og figur 3 legende), kalibrering gav et estimat for den absolutte hvile [Ca 2+] i "vildtype" HR2.1: TN-XL mus kegle terminaler 243 ± 159 nM (middelværdi ± SD), der er inden for området rapporteret for mus i litteraturen 11.

Figur 1
Figur 1. Fremstilling af lodrette retinal skiver. (A) Isolerede og fladtrykt retina forberedt til udskæring. (B) rektangulært stykke af nethinden (see rød boks i A) monteret på filterpapir membran (mørkegrå) efter udskæring. (C) Ovenfra af membranen monteret retinal skive fastgjort på et dækglas under anvendelse af fedt. (D) Skematisk tegning af en del af en retinal skive (se rød boks i C). Cone fotoreceptorer er angivet med grønt. V ventrale,; D, dorsal; N, nasal; T, tidsmæssig; OS, ydre segment; ONL, ydre nukleare lag; OPL, ydre netformige lag; INL, indre nukleare lag; IPL, indre plexiform lag; GCL, ganglion cellelag. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. To-foton billedbehandling af retinale skiver: Illustration af optagelsen konfiguration Top:. Vand-nedsænkning objektiv fokusere væream af scanning laser (rød pil ned) i nethinden, og opsamling af det udsendte fluorescens (opadgående pile). Objektivet indsamler også transmitteret infrarødt lys fra en belysning LED monteret under kondensatoren når billeddannelse skive ved hjælp af et CCD-kamera Center:.. Retinal skive monteret i optagelsen kammer og perfunderet med ekstracellulær løsning Nederst: Kondensator linse fokus lyset fra stimulering lysdioder (og den infrarøde LED til CCD-kamera billeddannelse) gennem den transparente bund optagelsen kammeret ind nethindevævet. IR LED, infrarødt lys-dioder; CCD, charge-koblede enhed; BP, band-pass. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Light-EVOKEd Ca2 + responser i axonterminaler af muse kegle fotoreceptorer. (A) Venstre: Optagelser fokuseret på synaptiske terminaler (rød kasse) af kegle fotoreceptorer (grøn) i retinale skiver højre:. Eksempel for en optaget region med 7 individuelle terminaler. Fluorescens blev registreret ved anvendelse af to kanaler:. En til FRET-acceptor citrine (top; 535 BP 50), og en for FRET-donor ECFP (bund; 480 BP 32) (B) Light-fremkaldte ændringer i citrin (F A) og ECFP (F D) fluorescens registreres i et enkelt ROI. (C) Ca 2+ reaktioner (som forholdet F A / F D) af en kegle terminal til en serie af 1 sek lyse lysglimt i 5 sek intervaller. ROI, region af interesse; BP, båndpasfilter; F, fluorescensintensitet; au, arbitrære enheder; FRET, Forster resonansenergioverførsel; ECFP, forstærket cyan fluorescerende protein. Stimulus intensitet (som photo-isomeriserings sats i 10 3 · P · s -1 pr kegle):. 13,0 og 12,8 for M- og S-opsiner henholdsvis tilføjer på et baggrundsniveau (= lysdioder off, excitation laserscanning) på ~ 10 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Eksempler kvantitativ analyse af lys-fremkaldte kegle Ca 2+ reaktioner (A) Lette-fremkaldt Ca 2 + reaktioner (som ΔR) fra en enkelt kegle terminal (enkelt forsøg: grå spor, n = 16; middelværdi:. Sort trace ) (B) Parametre bestemt for det gennemsnitlige Ca2 + svar:. Resting Ca2 + niveau (R base) repræsenterer baseline forud for lys stimulation, respons størrelse som area-under-the-kurve (RA) og peak amplitude (R amp), kinetik respons indtræden (t stiger, tidsperioden fra 20% til 80% R amp) og offset (t henfald, tidsperioden fra 80% til 20% af R amp). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Estimering absolut Ca2 + -koncentration. Resting Ca2 + -koncentration ([Ca2 +], som forholdet F A / F D) registreres i 8 kegle axonterminaler i en TN-XL mus (cirkler, med middelværdi ± SD) for forskellige ekstracellulære løsninger: to gange i standard ekstracellulære medium (Ctrl 1 og 2), derefter med minimal ("nul") [Ca2 +] (10 mM EGTA) end med høj [Ca2 +] (2,5 mM), de to sidstnævnte forhold i nærvær af 5 uM ionomycin at ligevægt ekstracellulær og intracellulær Ca2 +. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Allerede eksisterende protokoller anvender elektrofysiologiske encellede optagelser eller Ca2 + billeddannelse med syntetiske fluorescerende indikatorer kæmper for at optage Ca 2+ dynamik i mus kegle fotoreceptorer for en række tekniske årsager (se Indledning). Den her beskrevne protokol tillader måling af Ca 2 + signaler og endda absolutte Ca 2+ niveauer i enkelte, identificerede mus kegle terminaler i en effektiv og relativt enkel måde.

Denne protokol er allerede blevet anvendt med succes i tre undersøgelser omhandler forskellige aspekter af kegle funktion i raske mus nethinden. I den første undersøgelse 10, at HR2.1: blev TN-XL mus karakteriseret ved hjælp af immunhistokemi, ERG optagelser, to-foton Ca 2+ billedbehandling, og farmakologi, der viser, at kegle-specifikke udtryk for Ca 2+ biosensor ikke hæmmer kegle anatomi og funktion. I den anden undersøgelse 21, kromatiskog akromatiske respons egenskaber af muse kegler blev kortlagt hele nethinden, demonstrerer slående forskelle i kegle funktion mellem den "grønne" opsin-dominerede ryg og "blå" opsin-dominerede ventrale mus nethinden. Disse regionale forskelle i kegle egenskaber matches forskellen kontrast fordeling i det naturlige miljø (dvs. himmel vs. jord), hvilket antyder, at de forskellige spektrale typer mus kegler fastsætte (nær) optimal prøvetagning af akromatiske kontraster og således kan tilbyde en evolutionær fordel. I den tredje undersøgelse 22 gensidig feedback, kegle axonterminaler modtager fra vandrette celler blev undersøgt. Som alle de foreslåede horisontale celle feedbackmekanismer handle på spændingsafhængige Ca 2 + kanaler i kegle Axon terminalerne 28, kan kegle terminal Ca 2+ fungere som en proxy til horisontale celle-til-kegle interaktioner. Undersøgelsen fra Kemmler og kolleger 22 understøtningerden opfattelse, at vandrette celler bruger en kompleks feedback-system, der omfatter flere mekanismer til at styre fotoreceptorer glutamatfrigivelse.

Disse undersøgelser viser alsidigheden af ​​den beskrevne protokol og vise, at den kan tilpasses til en lang række spørgsmål vedrørende kegle funktion og dens synaptiske kredsløb. Derudover muliggør den protokol studere lokale Ca 2+ signalering i de forskellige kegle rum, til en bedre forståelse af kegle fysiologi. En sådan viden er vigtigt at forstå patofysiologiske processer i degenererende kegler, at i sidste ende mulighed for en rationel udvikling af potentielle terapeutiske metoder, især for degenerative sygdomme, der rammer kegler.

I HR2.1: TN-XL muse linje, er Ca2 + biosensor udtrykt i hele keglen, med undtagelse af den ydre segment. Dette giver mulighed for direkte og ratiometrisk vurdering af Ca 2+ dynamiskesi forskellige kegle rum. Da ændringer i Ca 2 + strømme i det ydre segment afspejles i terminalerne via det potentiale og den deraf aktivering af spændingsafhængige Ca 2 + kanaler membran, kan processer i det ydre segment observeres indirekte.

Potentielle faldgruber:

Dissektion af nethinden er et kritisk trin: I mus, nethinden adskiller fra øjestykket normalt mellem fotoreceptor ydre segmenter og pigment epitel. Derfor er de lysfølsomme fotoreceptor ydre segmenter af det isolerede nethinde eksponeret og ekstremt følsomme over for mekanisk beskadigelse. Der skal udvises stor omhu for ikke at beskadige ved at berøre fotoreceptor side med værktøj eller ved at bevæge væv sidelæns på en klæbende overflade (fx en filtermembran).

Høj kvalitet retina skiver kan genkendes under mikroskopet ved deres rene skærefladen ogved en velorganiseret fotoreceptorlaget med klart definerede ydre segmenter. Funktionel vurdering af skive kvalitet kan hurtigt gøres ved blinkende lyse lys stimuli og bestemme den procentdel af responsive kegler (f.eks, i et synsfelt med 10 - 20 kegler). Her, bør respons kvalitet evalueres ved at beregne signal-støj-forholdet (S / N) (amplituden af baseline støj før lyset stimulus vs. amplituden af lyset respons); et S / N af 2 - 3 bør betragtes som minimumsgrænsen. Typisk vi kassere skiver med mindre end 50% responsive kegler. Også skiver med kogler, der viser overdreven spontane spiking adfærd (se figur 4 i 10) bør kasseres.

Skiver i optagelsen kammer, der opfylder de førnævnte anatomiske og funktionelle kriterier viser konsistente svar for 1 - 2 timer (for detaljer om svar konsistens, se 10). Fordi skiver overleve hvores i holdekammeret, kan et vellykket eksperiment vare op til 6 timer. Det er bemærkelsesværdigt, at der er nogle begrænsninger med hensyn til at studere lange spænder rumlige interaktioner mellem kegler og vandrette celler, som udskæring uundgåeligt skærer laterale forbindelser i retinale netværk. Men forøgelse af tykkelsen af retinale skiver til 300 um ameliorates dette emne 22.

Anvendelsen af lodrette retinal skiver undgår scanning af lysfølsomme kegle ydre segmenter af excitation laser og dermed i vid udstrækning forhindrer opsin blegning (for omfattende diskussion, se 10,21). Ikke desto mindre er de optagne Ca 2 + signaler ikke kun afhænge af de lette stimuli, men også blive påvirket af en baggrundsbelysning komponent genereres af scanningen excitation laser. Faktisk er den effektive baggrundsbelysningen i sådanne to-foton imaging eksperimenter er en kombination af spredt laserlys, fluorescerende lys udsendt af den optagede ceLLS, og enhver LED stimulus baggrund komponent. Derfor bør kegler have lov til at tilpasse i mindst 20 - 30 s til laser scanning (med baggrunden komponent af lyset stimulus tændt) forud for optagelsen.

Fordele og anvendelser:

Mens nogle anvendelser til denne kegle Ca2 + -imaging protokol er blevet beskrevet ovenfor 10,21,22, kan andre applikationer kan forestille sig: Farmakologiske studier i kombination med kegle Ca2 + billeddiagnostik kan validere Ca2 + signalveje i kogler og kunne være bruges til at teste effektiviteten og styrken af lægemidler rettet mod forskellige aktører i Ca 2 + -signaling 10. Dog kan en central ansøgning være at studere sygdomme hos kegle funktion. Mange retinal degeneration musemodeller efterligner humane sygdomme er tilgængelige. Eksempelvis keglen fotoreceptor tab 1 (CPFL 1) mus er en primær kegle degeneration model lidelserfra en Pde6c mutation 29. Omvendt stangen degeneration 1 (rd 1) mus lider af en Pde6b mutation. Mens dette medfører primære stang fotoreceptordegenerering 30, når rd 1 stang tab afsluttet, sekundære kegle degeneration sæt i 1. Krydsning disse dyr med HR2.1: TN-XL linje vil tillade at studere og sammenligne Ca 2+ dynamik i både primær og sekundær kegle degeneration og vil sandsynligvis give værdifuld indsigt i rollen som Ca2 + under kegle celledød. Også farmakologisk induceret kegle degeneration - eksempelvis ved hjælp af selektive PDE6 hæmmere - kan tjene til at identificere de efterfølgende mekanismer kegle degeneration 10,29,31.

Sammenfattende beskrevet protokollen her tillader måling Ca2 + i subcellulære rum i mus kegle fotoreceptorer og præsenterer store muligheder for at afdække kegle fysiologi under en bred viftefysiologiske og patofysiologiske tilstande. Derudover kan denne protokol anvendes til screening af farmakologiske midler beregnet til forstyrre kegle Ca 2+ -signaling og dermed bidrage til at etablere nye terapier for kegle sygdomme.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High vacuum grease Dow Corning 1018817 http://www.dowcorning.com
Cover slips R. Langenbrinck 24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
Glass slides R. Langenbrinck 76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Blades for tissue chopper MARTOR KG ARGENTAX No. 1044 0.25 mm; http://www.martor.de
Tissue chopper Custom-build Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert
Nitrocellulose filter membrane gridded Merck Millipore AABG01300 Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com
Isoflurane CP CP pharma AP/DRUGS/220/96 http://www.cp-pharma.de
UV/green LED-based full-field stimulator Custom-build for details, see10
Open source microprocessor board Arduino http://www.arduino.cc
Imaging software CfNT Custom-written developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany
IgorPro Wavemetrics http://www.wavemetrics.com
VC3-4 System focal perfusion system ALA Scientific Instrument with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser) Newport Spectra-Physics http://www.spectra-physics.com
Movable objective microscope (MOM),
Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany		 Sutter Instruments http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
Name Company Catalog Number Comments
XLUMPlanFL 20X/0.95w objective Olympus http://www.olympusamerica.com
Vaporizer 100 series Surgivet http://www.surgivet.com
Ionomycin, Calcium salt Life technologies I24222 http://www.lifetechnologies.com
EGTA Sigma-Aldrich E3889 https://www.sigmaaldrich.com
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 101191250 http://www.sigmaaldrich.com
Leica MZ95 leica microsystems http://www.leica-microsystems.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trifunovic, D., et al. Neuroprotective strategies for the treatment of inherited photoreceptor degeneration. Current Molecular Medicine. 12, 598-612 (2012).
  2. Paquet-Durand, F., et al. Calpain is activated in degenerating photoreceptors in the rd1 mouse. Journal of Neurochemistry. 96, 802-814 (2006).
  3. Paquet-Durand, F., et al. A key role for cyclic nucleotide gated (CNG) channels in cGMP-related retinitis pigmentosa. Human Molecular Genetics. 20, 941-947 (2011).
  4. Frasson, M., et al. Retinitis pigmentosa: rod photoreceptor rescue by a calcium-channel blocker in the rd mouse. Nature Medicine. 5, 1183-1187 (1999).
  5. Bush, R. A., Kononen, L., Machida, S., Sieving, P. A. The effect of calcium channel blocker diltiazem on photoreceptor degeneration in the rhodopsin Pro213His rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 2697-2701 (2000).
  6. Pawlyk, B. S., Li, T., Scimeca, M. S., Sandberg, M. A., Berson, E. L. Absence of photoreceptor rescue with D-cis-diltiazem in the rd mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 1912-1915 (2002).
  7. Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors. The Journal of General Physiology. 113, 267-277 (1999).
  8. Choi, S. Y., et al. Encoding light intensity by the cone photoreceptor synapse. Neuron. 48, 555-562 (2005).
  9. Krizaj, D. Calcium stores in vertebrate photoreceptors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 873-889 (2012).
  10. Wei, T., et al. Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 32, 6981-6994 (2012).
  11. Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Molecular Vision. 13, 887-919 (2007).
  12. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18, 8936-8946 (1998).
  13. Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nature Protocols. 1, 1057-1065 (2006).
  14. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46, 143-151 (2008).
  15. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290, 527-528 (1981).
  16. Hendel, T., et al. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro. The Journal of Neuroscience. 28, 7399-7411 (2008).
  17. Dreosti, E., Odermatt, B., Dorostkar, M. M., Lagnado, L. A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo. Nature Methods. 6, 883-889 (2009).
  18. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90, 1790-1796 (2006).
  19. Wang, Y., et al. A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes. Neuron. 9, 429-440 (1992).
  20. Connaughton, V. P. Zebrafish retinal slice preparation. Methods in Cell Science. 25, 49-58 (2003).
  21. Baden, T., et al. A tale of two retinal domains: near-optimal sampling of achromatic contrasts in natural scenes through asymmetric photoreceptor distribution. Neuron. 80, 1206-1217 (2013).
  22. Kemmler, R., Schultz, k, Dedek, K., Euler, T., Schubert, T. Differential regulation of cone calcium signals by different horizontal cell feedback mechanisms in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 34, 11826-11843 (2014).
  23. Werblin, F. S. Transmission along and between rods in the tiger salamander retina. The Journal of Physiology. 280, 449-470 (1978).
  24. Euler, T., et al. Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 457, 1393-1414 (2009).
  25. Baden, T., Berens, P., Bethge, M., Euler, T. Spikes in mammalian bipolar cells support temporal layering of the inner retina. Current Biology. 23, 48-52 (2013).
  26. Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).
  27. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).
  28. Thoreson, W. B., Mangel, S. C. Lateral interactions in the outer retina. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).
  29. Trifunovic, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).
  30. Sahaboglu, A., et al. Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms. Cell Death & Disease. 4, e488 (2013).
  31. Sahaboglu, A., et al. PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function. PloS One. 5, e15495 (2010).

Tags

Neurovidenskab Ca to-foton Ca celledød retinal skive forberedelse retinal degeneration
Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics i Cone Lysmodtageren Axon Terminals i Mouse Retina
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kulkarni, M., Schubert, T., Baden,… More

Kulkarni, M., Schubert, T., Baden, T., Wissinger, B., Euler, T., Paquet-Durand, F. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), e52588, doi:10.3791/52588 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter