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Neuroscience

Imagerie Ca Published: May 6, 2015 doi: 10.3791/52588
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2,3, 4,5, 1,2,3, 1
1Institute for Ophthalmic Research, University of Tübingen, 2Graduate School of Cellular & Molecular Neuroscience, University of Tübingen, 3Bernstein Centre for Computational Neuroscience, University of Tübingen, 4Molecular Genetics Laboratory, University of Tübingen, 5Centre for Ophthalmology, University of Tübingen

Summary

Nous décrivons un protocole à suivre Ca 2+ dynamique dans les terminaisons axonales des cônes photorécepteurs utilisant une préparation de tranches ex-vivo de la rétine de souris. Ce protocole permet à des études approfondies de cône Ca 2+ signalisation dans un important système modèle mammifère, la souris.

Abstract

Cônes photorécepteurs de la rétine (cônes) servent vision de jour et sont la base de la discrimination des couleurs. Ils sont soumis à la dégénérescence, ce qui conduit souvent à la cécité dans de nombreuses maladies de la rétine. Le calcium (Ca 2+), un second messager important dans la signalisation du photorécepteur et le métabolisme, a été proposé pour être indirectement liée à une dégénérescence des photorécepteurs dans divers modèles animaux. L'étude systématique de ces aspects de la physiologie et de la pathophysiologie de cône a été entravée par des difficultés de l'enregistrement de l'électricité à partir de ces petites cellules, en particulier chez la souris où la rétine est dominée par les photorécepteurs de la tige. Pour contourner ce problème, nous avons établi un à deux photons Ca 2+ protocole d'imagerie utilisant une lignée de souris transgénique qui exprime le Ca 2+ biocapteur TN-XL codé génétiquement exclusivement dans les cônes et peuvent être croisés avec des modèles de souris pour une dégénérescence des photorécepteurs. Le protocole décrit ici consiste à préparer des coupes verticales (R20; tranches ») de la rétine de souris et l'imagerie optique des changements de relance évoqués légers en cône Ca 2+ niveau. Le protocole permet également "dans la tranche de mesure" de absolus concentrations de Ca2 +; que les enregistrements peuvent être suivies par étalonnage. Ce protocole permet des études sur les propriétés fonctionnelles de cône et devrait contribuer à la compréhension du cône de signalisation Ca 2+ ainsi que la participation potentielle de Ca 2+ dans la mort des photorécepteurs et de la dégénérescence rétinienne.

Introduction

Vision commence avec l'activation de la cascade de phototransduction dans les photorécepteurs de la rétine induite par la lumière. Photorécepteurs tige permettent la vision à des niveaux de faible éclairage, tandis que les photorécepteurs à cônes médiation couleur et haute résolution vision de jour. De nombreux gènes spécifiques de photorécepteurs sont sensibles à des mutations qui conduisent à la dégénérescence de ces cellules. Un certain nombre de marqueurs moléculaires associés à la perte des photorécepteurs ont été identifiés 1, mais jusqu'à présent, les mécanismes moléculaires détaillées et la séquence des événements restent peu claires. Altered homéostasie de Ca2 + a été spéculé comme un déclencheur de la mort des cellules photoréceptrices, une hypothèse soutenue par la régulation à la hausse de l'activité des protéases dépendantes de Ca2 + de type calpaine pendant le processus de 2,3 dégénérescence. Cependant, à ce jour, cette hypothèse n'a pas été soutenu par des mesures physiologiques de Ca 2+. Incohérences dans plusieurs études sur l'effet des bloqueurs des canaux de Ca en remaladies intestinaux en outre contesté la participation de Ca 2+ dans la mort cellulaire 4-6, appelant à des méthodes pour évaluer directement Ca 2+ dans des cônes photorécepteurs de mammifères.

Auparavant, la plupart des enregistrements électriques et les études d'imagerie de Ca ont été réalisées dans les modèles d'amphibiens et de reptiles en raison de l'accès plus facile aux cônes 7-9. Cependant, la physiologie des mammifères photorécepteur peut être différente de celle des non-mammifères 10 et surtout, dans le contexte de la dégénérescence rétinienne héréditaire humaine, une meilleure compréhension de la physiologie des mammifères photorécepteur est une clé pour le développement de traitements innovants. Beaucoup de modèles de souris mimant les maladies rétiniennes humaines sont disponibles, mais on sait peu de Ca 2+ dynamique dans les cônes de souris 11. Techniques électriques ne sont pas adaptés pour les enregistrements à haut débit à partir de cônes, en particulier pas chez la souris, où les tiges (~ 97%) sont beaucoup plus nombreux cônes (~ 3%) 12 Ca2 + mais pas sur absolus intracellulaires concentrations de Ca2 +. Ainsi, malgré la résolution temporelle inférieure, l'imagerie est la méthode de choix pour traiter les questions au sujet de cône Ca 2+ dynamique. La question clé à l'imagerie est la façon d'étiqueter sélectivement les cônes avec un Ca 2+ indicateur colorant fluorescent. Compartimentation bonne et la spécificité de la cellule est difficile à réaliser par "chargement en vrac" synthétique Ca 2+ colorants indicateurs dans le tissu. En conséquence, les cônes marqués, des tiges 13,14, et les cellules gliales de Müller ne peuvent pas être distingués de façon fiable. En outre, les colorants synthétiques ont tendance à fuir hors des cellules, empêchant enregistrements prolongés dans des conditions compatibles. En outre, le chargement synthétiques Ca 2+ indicateurs dans leur forme AM-ester est problématique, car il nécessite dedétergents (par exemple, DMSO) et 15 génère formaldéhyde. Pour absolus Ca 2+ mesures, indicateurs ratiométriques sont obligatoires. Cependant, le meilleur indicateur ratiométrique synthétique actuellement disponible Fura-2 nécessite une lumière d'excitation dans la plage de 700 à 760 nm (par excitation à deux photons), qui, en fonction de son intensité, peut en elle-même stimuler les cônes, et ainsi entraver études de cône Ca 2+ dynamique dans des conditions d'éclairage physiologiques.

Contrairement aux colorants synthétiques, génétiquement codés indicateurs de Ca2 + peuvent être exprimés dans un type cellulaire manière sélective. Ils ne fuient hors des cellules, et par conséquent, si le blanchiment est évité, des mesures fiables et ratiométrique prolongées sont possibles. Type sélectif cellulaire expression de Ca 2+ biocapteurs, lorsqu'il est combiné avec la microscopie à deux photons, représente un outil puissant pour évaluer et étudier subcellulaire Ca 2+ dans des conditions physiologiques largement 13,16,17 Ca2 dynamique dans un Ca 2+ ligne biocapteur de souris transgénique (HR2.1: TN-XL), qui exprime la base FRET-Ca 2+ biocapteur TN-XL 18 sélectivement dans des cônes, sous la opsine rouge promoteur HR2.1 humaine 19. Pour accéder aux bornes de cône, une préparation de tranches ex-vivo de 20 a été utilisé. Le protocole a déjà été utilisé avec succès dans trois études sur la fonction de cône souris saines 10,21,22. En outre, le protocole permet d'étudier cône de signalisation Ca2 + dans des conditions génétiques spécifiques, par exemple, par croisement des modèles de souris pour la dégénérescence rétinienne héréditaire avec HR2.1: souris TN-XL.

Protocol

Toutes les procédures d'animaux ont été effectuées en respectant les directives et les lois pour la protection des animaux déterminés par le gouvernement fédéral allemand et approuvés par le comité de protection des animaux institutionnelle de l'Université de Tübingen.

1. Modèles animaux

  1. HR2.1: TN-XL Ca 2+ biocapteur souris
    1. Utilisez le HR2.1 transgénique: lignée de souris TN-XL exprimant le Ca 2+ biocapteur TN-XL sélectivement dans des cônes photorécepteurs 10. Utilisez 3 - 6 semaines les souris des deux sexes soulevé avec un 12 heures de jour / nuit rythmique standard.

2. rétine Dissection

  1. Une solution physiologique
    1. Préparer fraîchement 2 L de solution extracellulaire, contenant 125 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 1,25 mM de NaH 2 PO 4, 26 mM NaHCO3, 0,5 mM de L-glutamine et 20 mM de (+) glucose. Mélanger jusqu'à ce que tous les ingrédients se dissolvent.
    2. Solution extracellulaire "Bubble"avec carboxygen (95% O 2, 5% CO 2) pour 5-10 min. Ajouter CaCl 2 pour atteindre une concentration de 2 mM.
    3. Après bouillonnant la solution extracellulaire, mesurer son pH. Le pH doit être de 7,4, sinon il est probable que des erreurs ont été réalisés au cours de la préparation de la solution. Maintenir le taux et la solution bouillonnant température constante tout au long de l'expérience pour assurer pH constant.
    4. Séparer le stock en 2 flacons, l'un pour la dissection rétine et un pour la configuration de l'enregistrement (de perfusion).
  2. énucléation des yeux et de l'isolement de la rétine (5 - 10 min)
    1. Maintenir un éclairage rouge sombre dans la zone de travail pour l'énucléation. Utilisation LEDs avec une longueur d'onde de crête de 650 nm (ou plus) afin d'éviter le blanchiment de cônes lors de la dissection.
    2. Dark-adapter la souris pendant 2 heures en mettant sa cage dans une boîte étanche à la lumière bien ventilé pour assurer que les cônes soient pleinement sensibilisés à l'heure des enregistrements.
    3. Anesthésier la souris sous un laborary capot avec l'isoflurane (5%) à l'aide d'un vaporisateur et un récipient étanche aux gaz qui détient une cage de souris standard. Suivez attentivement les instructions manufacturer's lors de la manipulation du vaporisateur. Utiliser des gants et un masque pour réduire l'exposition aux allergènes.
    4. Utilisez un microscope binoculaire avec un 10 - 40X pour la dissection.
    5. Sacrifiez la souris anesthésiée par décapitation.
    6. Pour l'orientation, marquer le dessus de chaque oeil (= dorsale) avec un stylo imperméable. Gardez une trace de savoir si l'aide de l'œil gauche ou à droite.
    7. Retirer l'œil soigneusement à l'aide des ciseaux courbes en coupant le nerf optique derrière le globe oculaire. Pour dissection, transférer le globe oculaire à une boîte de Pétri contenant une solution extracellulaire fraîchement carboxygenated. Pour transférer le globe oculaire, le tenir par le nerf optique moignon.
    8. Pierce l'œil à tout point le long de la frontière entre la cornée et la sclérotique (c.-à l'ora serrata) avec une aiguille d'injection forte.
    9. Tenez le evous à la sclérotique avec une paire de pinces et doucement insérer une lame de ciseaux dans le trou fait dans l'étape précédente. Coupez le long de l'ora serrata pour séparer la partie antérieure de l'œil (cornée, le cristallin, corps vitré) de la partie postérieure (de l'œilleton). Couper l'œilleton radialement (vers le disque optique) à la position de la marque de stylo pour indiquer la position dorsale sur la rétine.
      Remarque: Préparé cette façon, les œilletons peuvent être conservés dans une solution constamment carboxygenated pour une utilisation ultérieure.
    10. Tournez l'œilleton dans la boîte de Pétri telle que la dorsale de points coupé de soi. Prenez la sclérotique sur la gauche et le côté droit de l'œilleton avec une paire de pinces chacun en insérant les forceps conseils entre la rétine et la sclérotique.
    11. Détachez la rétine en retournant doucement la partie scléral de l'œilleton. Enfin, couper le nerf optique à l'aide de micro dissection ciseaux pour libérer la rétine de la sclérotique.
      Note: Ceci est une étape critique. Évitez les dommages à la rétine (par exemple, paret touchant le serrant avec une pince).
    12. Tenir l'un des bords de la rétine avec une paire de forceps et doucement éliminer les débris et le corps vitré de la rétine à partir de la surface en utilisant une deuxième paire de pinces. Lorsque la surface de la rétine est propre, utiliser de micro dissection ciseaux pour faire trois courtes, des coupes supplémentaires radiales (environ tous les 90 °). Ces coupures permettent d'aplatir soigneusement la rétine avec le côté photorécepteur vers le bas dans la boîte de Petri (figure 1A).
  3. Slice préparation (10 - 15 min)
    1. Préparer à l'avance des membranes filtrantes de nitrocellulose pour tranchage et verre lamelles rétiniennes pour les tranches de montage et de les transférer à la chambre d'enregistrement. Couper membrane filtrante en nitrocellulose dans environ 10 x 5 mm morceaux rectangulaires de taille à l'aide de ciseaux. Couper des lamelles en morceaux rectangulaires d'environ 10 x 5 mm de taille en utilisant un glasscutter.
    2. Immerger lentement une lame de verre dans la solution extracellulaire près detissu. Doucement, tirez la rétine sur la lame de verre avec le côté des cellules ganglionnaires par le saisissant à la limite en utilisant une paire de pinces. Ce processus réduit les dommages mécaniques et le pliage du tissu.
    3. Choisissez la région de la rétine qui est lié à la question de recherche respectif (voir également la discussion). Rappelez-vous, la longue coupure faite à l'étape 2.2.9 marque la moitié de la rétine dorsale (figure 1A). Couper une, à environ 1 x 2 mm pièce rectangulaire de taille de la région de la rétine sélectionnées à l'aide d'une lame de scalpel incurvé. Essuyez l'excès de solution autour du tissu au large.
    4. Placer la membrane filtrante sur le dessus de la pièce de la rétine de sorte que le côté de la cellule de ganglion adhère à la membrane. Immédiatement, on ajoute une goutte de milieu extracellulaire sur la membrane pour fixer fermement le tissu de la membrane.
    5. Transférer le tissu rétinien membrane montée dans la chambre de coupe contenant une solution fraîche extracellulaire.
    6. Couper en tranches verticales rétine de 200 umépaisseur (figure 1B) en utilisant une lame de rasoir fraîche attaché à un broyeur de tissu 23. Lame changer pour chaque pièce de la rétine.
      Remarque: La lame de rasoir a besoin d'être parfaitement alignée avec la surface inférieure de la chambre de coupe de telle sorte que l'ensemble membrane divise en même temps, comme indiqué par un "cliquant" sonore lors de la coupe - sinon, la lame risque de se tordre et endommager la tranche.
    7. Collez une seule tranche de la membrane montée sur une lamelle de par l'application de la graisse à vide poussé à la membrane ne se termine que (figure 1C). Gardez la surface du verre en dessous de la rétine sans graisse.
    8. Gardez tranches lamelle monté couverts par une goutte de solution extracellulaire dans la chambre de retenue - un récipient fermé et étanche à la lumière, par exemple, une boîte de Pétri avec le couvercle recouvert d'une feuille d'aluminium - sous une atmosphère d'carboxygen à TA. Présentez carboxygen par barbotage d'un petit réservoir d'eau pour maintenir l'atmosphère dans la tenuechambre humidifiée; ce qui empêche les tranches de se dessécher.
    9. Autoriser les tranches de se reposer dans la chambre de retenue pendant 10 - 15 min avant de les (un par un) de passer à la chambre d'enregistrement. Les tranches peuvent être maintenues jusqu'à 5.4 heures en chambre de maintien à température ambiante (~ 21 ° C).

3. Deux photons Ca 2+ Imaging

  1. Microscopie à deux photons
    1. Utilisez un objectif de microscope mobile (MOM) de type microscope à deux photons. Les deux procédures de conception et d'imagerie MOM ont été décrites précédemment 24, pour plus de détails voir également 10,21,25 (pour les sources et les entreprises, voir le tableau 1).
      Remarque: Tous debout microscope à deux photons qui répond aux exigences minimales suivantes peuvent être utilisées: Il doit être équipé avec (a) un laser pulsé accordable à ~ 860 nm, (b) un minimum de deux canaux de fluorescence acquises simultanément, (c ) filtres pour ECFP et la fluorescence de citrine, (d)un stimulateur de lumière (pour les modèles possibles, voir 24,26), et (e) un logiciel qui permet d'enregistrer des séquences d'images de temps écoulé à un taux suffisant de cadre pour résoudre le Ca 2+ signaux d'intérêt.
    2. Démarrer le système d'imagerie à deux photons, comme indiqué par le fabricant. Suivre strictement les consignes de sécurité laser de l'installation. Lancer le laser et l'accorder à ~ 860 nm.
    3. Transférer une tranche de la chambre de retenue à la chambre d'enregistrement et de commencer immédiatement la perfusion avec une solution extracellulaire carboxygenated. Maintenir un débit de perfusion de 2 ml / min et une température de 37 ° C dans la chambre d'enregistrement.
    4. Utilisez un objectif 20X NA 0,95 immersion dans l'eau. Si possible, utilisez une caméra CCD en combinaison avec une LED ci-dessous chambre d'enregistrement infra-rouge pour localiser la tranche de la rétine (figure 2). Sinon localiser tranche en utilisant l'imagerie à deux photons (voir 3.1.5).
    5. Passez à l'imagerie à deux photons pour voir l'expression de biocapteur. Allumerles deux voies de détection pour l'imagerie de fluorescence et de ECFP citrin.
    6. Utilisez le logiciel d'acquisition d'image qui contrôle le microscope à deux photons pour analyser et sélectionner une rangée de bornes coniques pour l'enregistrement (figure 3A). Acquisition d'image réglée sur 128 x 16 images de pixels (31,25 Hz) ou une configuration similaire. Restreindre zone de numérisation à des bornes de cônes pour éviter le blanchiment d'photopigments en segments extérieurs.
      Remarque: Pour le TN-XL capteur de calcium (τ = ~ 0,6 sec pour le Ca 2+ contraignant, τ = ~ 0,2 sec pour le Ca 2+ déliaison, voir 16) un taux de trame minimum de ~ 8 Hz est recommandée.
  2. La stimulation lumineuse et l'enregistrement
    1. Utilisez un plein champ stimulateur de la lumière sous-étage comme décrit ailleurs 10,21,26 pour effectuer les étapes suivantes.
      Note: Une solution simple pour un stimulateur de la lumière plein champ est d'utiliser deux LED passe-bande-filtrées (par exemple, "bleu": 360 BP 12, "vert": 578 BP 10)qui correspondent à la sensibilité de longueur d'onde de cônes de souris, mais en même temps ne se chevauchent pas avec les filtres utilisés pour la détection de fluorescence (cf. 3.2.4). La lumière provenant des DEL est focalisée par le condenseur à travers le fond de la chambre d'enregistrement (figure 2). Pour plus de détails sur cette conception du stimulateur, son étalonnage, les intensités lumineuses utilisées et les cônes taux photo-isomérisation évoqués, voir 10,21,26.
    2. Allumez le laser et permettent cônes pour adapter à balayage du laser et la lumière relance de fond (20 - 30 sec, vous pouvez aussi pièges potentiels) avant de présenter des stimuli lumineux (voir 3.2.3) ou d'appliquer des agents pharmacologiques.
    3. Lancer la présentation de stimuli arbitraires (par exemple, des éclairs de lumière, comme le montre la figure 3B, C). Dans le cas du stimulateur décrit à l'étape 3.2.1, générer les stimuli en modulant l'intensité des deux LED au fil du temps en utilisant une carte à microprocesseur commandé par un logiciel personnalisé (pourde détails, voir 10,21,26).
    4. Commencer l'enregistrement des deux canaux de fluorescence (par exemple, à 483 nm pour "bleu" FRET donneur ECFP et à 535 nm pour FRET accepteur «jaune»;. Pour les spécifications voir le tableau 1) en utilisant simultanément le logiciel d'acquisition d'image respectif (voir aussi 3.1 0,6). Par exemple, dans le cas de la lumière clignote (figure 3B, C), fiche d'au moins 8 - 10 présentations de relance (essais).
  3. Calibration "Dans la tranche" Ca 2+
    1. Enregistrez Ca 2+ signaux dans les terminaux de cône (comme décrit dans 3.1.6 et 3.2.4) et extraire la ligne de base Ca 2+ niveau dans un ensemble de cônes (comme décrit au paragraphe 3.4).
    2. Switch to "Ca 2+ libre" milieu extracellulaire avec 5 uM d'ionomycine (dissous dans du DMSO) et 10 mM d'EGTA (ou, en variante, BAPTA) a été ajouté. les bornes de la fiche de cône de nouveau toutes les 5 min afin de déterminer le ratio de fluorescence minimale (R min), <em>-à-dire, le rapport de la (presque) absence de Ca2 + intracellulaire. Cela peut prendre entre 15 - 30 min.
      Note: Un système de perfusion est nécessaire qui permet une commutation entre différents réservoirs.
    3. Basculer vers le milieu extracellulaire avec 5 uM ionomycine (dissous dans du DMSO) et 2,5 mM de Ca 2+. Après un temps d'incubation de 5 min, fiche cônes de nouveau toutes les 5 min pour mesurer le rapport de la fluorescence maximale (R max), soit le rapport en présence de concentrations saturantes de Ca2 + intracellulaire. Après l'application ionomycine, il peut prendre de 3 - 15 min pour le rapport Ca 2+ pour devenir stable.
      Remarque: Exposer les tranches à haute Ca 2+ et ionomycine pendant une plus longue période finira par endommager les cellules. Inclure les seules cellules dans l'analyse qui conservent leur morphologie normale. Les concentrations (c.-à-EGTA, ionomycine) peuvent avoir besoin d'être adaptés. Pour plus de détails sur l'étalonnage Ca 2+protocole, consultez 13,17.
  4. L'analyse des données
    Remarque: Utilisez un logiciel de traitement d'images et l'analyse de données compatible avec le logiciel de microscope respective et peuvent exécuter des scripts d'analyse personnalisés.
    1. Charger un fichier de données d'imagerie et d'en tirer des régions d'intérêt (ROI) autour de chaque borne de cône (figure 3A). Pour chaque trame, l'intensité de fluorescence moyenne à l'intérieur de la ROI et soustraire la fluorescence de fond, avant de calculer le rapport (R) entre FRET-accepteur (citrine) et du donneur (ECFP) fluorescence (R = F A / F D; la figure 3B, C). Ce ratio est généralement utilisé comme un proxy pour le parent concentration intracellulaire de Ca 2+, mais après le calibrage (voir 3.3), également des concentrations absolues peut être estimé (voir 3.4.3).
      Remarque: Les pédicules peuvent être reconnus par leur emplacement dans la couche plexiforme externe et leur morphologie (un peu aplatis «blobs» plus petit que le cônesoma, situé à l'extrémité de l'axone du cône).
    2. Essais de relance moyens (figure 4A). Extrait paramètres de traces moyennes (figure 4B), tels que Ca 2+ niveau de référence (R de base) avant la stimulation lumineuse, amplitude crête (R ampères), et l'aire sous la courbe (R A) que les mesures de taille de la réponse réponse. Aussi, extraire la cinétique de réponse à partir de traces moyennes, tels que la montée de réponse (t de montée) et temps de décroissance (t de décroissance) (= intervalles de temps respectives entre 20% et 80% de la R amp; voir l'illustration à la figure 4B). Pour plus de détails sur la façon de déterminer ces paramètres, voir 10.
    3. Calculer une estimation du cône absolue concentration de Ca2 + sur la base des mesures prises par les étapes 3.3.1-3.3.3. Utilisez les ratios de concentration minimale et maximale Ca 2+, R min et R max, respectivement, la fluorescence du donneur dans le Ca 2+ D, Ca-bound) et -unbound (F D, Ca-libre) état, ainsi que l'in-vivo constante de dissociation (K d = 0,77, voir 16) pour TN-XL avec le suivant l'équation (analogique à 27):

Equation 1

Representative Results

En combinant tranches verticales (Figure 1) préparé à partir de HR2.1: rétine de souris TN-XL avec l'imagerie à deux photons (Figure 2), nous avons pu effectuer des mesures ratiométriques de Ca 2+ signaux de relance évoqués légers dans les terminaisons axonales cône photorécepteurs . Cette approche représente une amélioration significative dans l'accès et la visualisation de cônes de souris sur les méthodes d'imagerie optique pré-existantes avec synthétiques Ca 2+ indicateurs. Par exemple, l'expression spécifique cône de la Ca quotientométrique génétiquement codés 2+ biocapteur TN-XL a grandement facilité l'identification des terminaux cône axone (voir Rois à la figure 3A). Par conséquent, notre protocole élimine le risque de signaux d'enregistrement d'origine incertaine, comme par exemple les signaux "mixtes" avec des contributions de deux terminaux de cône et la tige axone.

Notre approche permet de résoudre les réponses seul essai au niveau de l'indiviprise à double cône de l'axone. Extrusion Light-évoquée de Ca2 + à partir de la borne de cône est marquée par une augmentation et une diminution de donneur et l'accepteur de fluorescence, respectivement (Figure 3B). Diminution du rapport de fluorescence (R) correspond à l'extrusion du Ca2 + à partir de la borne de cône (figure 3C), causée par la hyperpolarisation induite par la lumière du cône et la fermeture ultérieure de voltage-dépendants canaux Ca2 +. Parce que plusieurs terminaux cône d'axones peuvent être surveillés simultanément (figure 3A), l'acquisition de données est très efficace et des centaines de réponses de cône Ca peut être collectée dans une seule expérience. En évaluant ces réponses quantitativement (Figure 4), cône Ca 2+ signaux peuvent être comparées et évaluées dans une gamme de conditions (voir la discussion).

Il suffit souvent d'utiliser le rapport entre FRET-accepteur (citrine) et -donor (ECFP) fluorescence(F A / F D; pour plus de détails, voir 3.4) comme une mesure relative de la intracellulaire de Ca2 + niveau. Pourtant, chaque fois que nécessaire, le rapport peut être calibré pour obtenir intracellulaire de Ca 2+ concentrations absolues ([Ca 2+]) (figure 5). A l'éclairage de fond utilisé dans ce protocole (pour plus de détails, voir 10 et la figure 3 la légende), l'étalonnage a donné une estimation de l'absolu repos [Ca 2+] dans "de type sauvage" HR2.1: TN-XL terminaux de cône de la souris de 243 ± 159 nM (moyenne ± SD), qui se situe dans la fourchette indiquée pour les souris 11 dans la littérature.

Figure 1
Figure 1. Préparation de coupes verticales de la rétine. (A) isolé et aplati rétine préparé pour le tranchage. (B) pièce rectangulaire de la rétine (see boîte rouge en A) monté sur la membrane de papier filtre (gris foncé) après la coupe. (C) Vue de dessus de la tranche de la rétine membrane monté fixe sur une lamelle de verre avec de la graisse. (D) Schéma d'une partie d'une tranche de la rétine (voir encadré rouge dans C). cônes photorécepteurs sont indiquées en vert. V, ventrale; D, dorsale; N, nasale; T, temporelle; OS, segment externe; ONL, couche nucléaire externe; OPL, la couche plexiforme externe; INL, couche nucléaire interne; IPL, la couche plexiforme interne; GCL, couche de cellules ganglionnaires. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Deux photons imagerie de la rétine tranches: Illustration de la configuration d'enregistrement Haut:. Immersion dans l'eau objectif concentrant l'êtreh du laser à balayage (flèche vers le bas rouge) dans la rétine, et la collecte de la fluorescence émise (flèches vers le haut). La lentille recueille également transmis la lumière infrarouge à partir d'une LED d'éclairage monté au-dessous du condenseur lors de l'imagerie de la tranche en utilisant une caméra CCD Centre:.. Tranche de la rétine monté dans la chambre d'enregistrement et perfusé avec une solution extracellulaire Bottom: lentille condenseur focaliser la lumière provenant des DEL de stimulation (et la LED infrarouge pour l'imagerie par caméra CCD) à travers le fond transparent de la chambre d'enregistrement dans le tissu rétinien. LED IR, infrarouge diode électroluminescente; CCD, dispositif à couplage de charge; BP, passe-bande. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Light-évocationles réponses d Ca dans les terminaisons axonales des cônes photorécepteurs de la souris. (A) Gauche: Recordings portée sur les terminaux synaptiques (boîte rouge) de cônes photorécepteurs (vert) en tranches de la rétine droite:. Exemple pour une région enregistré avec 7 terminaux individuels. La fluorescence a été enregistrée en utilisant deux canaux:. Un pour la citrine FRET-accepteur (en haut; 535 BP 50) et une pour le FRET donneur ECFP (en bas; 480 BP 32) (B) La lumière change évoqués en citrine (F A) et ECFP (F D) de fluorescence enregistrée dans un seul ROI. Les réponses de (C) Ca (comme le rapport F A / F D) d'un terminal de cône à une série de 1 sec lumineux clignote en intervalles de 5 secondes. ROI, région d'intérêt; BP, le filtre passe-bande; F, l'intensité de fluorescence; au, unités arbitraires; FRET, Förster transfert d'énergie de résonance; ECFP, amélioré la protéine de fluorescence cyan. l'intensité de la stimulation (comme ptaux hoto-isomérisation dans 10 3 · P · s -1 par cône):. 13,0 et 12,8 pour M et S-opsines, respectivement, en ajoutant sur ​​un niveau de fond (= les voyants sont éteints, balayage laser d'excitation) de ~ 10 S'il vous plaît cliquer sur ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Analyse quantitative exemples de Light Cone-réponses évoquées Ca 2+ (A) légers évoqués Ca2 réponses (comme AR) à partir d'un terminal de cône unique (essais simples: des traces grises, n = 16; moyenne:. Trace noire ) (b) les paramètres déterminés pour la moyenne Ca 2+ réponse:. reposer Ca 2+ niveau (R base) représentant la ligne de base avant la stimulation lumineuse, la taille de réponse area-sous-le-courbe (R A) et amplitude crête (R amp), la cinétique de la réponse apparition (t hausse, intervalle de temps de 20% à 80% de la R ampli) et le décalage (t décroissance, intervalle de temps de 80% à 20% de la R ampli). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Estimation absolue concentration en Ca2 +. Repos concentration de Ca 2+ ([Ca 2+], comme le rapport F A / F D) enregistré dans les terminaisons axonales 8 de cône dans une souris TN-XL (cercles, avec une moyenne ± écart-type) pour différentes solutions extracellulaires: deux fois dans le milieu extracellulaire norme (Ctrl 1 et 2), puis avec un minimum ("zéro") [Ca 2+] (10 mM d'EGTA) und avec une grande [Ca 2+] (2,5 mM), les deux dernières conditions à la présence de 5 uM ionomycine pour équilibrer extracellulaire et intracellulaire de Ca2 +. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Préexistants protocoles utilisant des enregistrements électrophysiologiques unicellulaires ou Ca 2+ imagerie avec des indicateurs synthétiques fluorescentes luttent pour enregistrer les Ca 2+ dynamique dans des cônes photorécepteurs de la souris pour un certain nombre de raisons techniques (voir Introduction). Le protocole décrit ici permet la mesure de signaux Ca2 + et absolus même niveaux de Ca2 + dans les terminaux, de cône de la souris identifiés individuels d'une manière efficace et relativement simple.

Ce protocole a déjà été utilisé avec succès dans trois études portant sur différents aspects de la fonction de cône dans la rétine de souris en bonne santé. Dans la première étude 10, l'HR2.1: souris TN-XL a été caractérisée par immunohistochimie, enregistrements ERG, à deux photons Ca 2+ imagerie, et de la pharmacologie, montrant que l'expression spécifique cône du biocapteur Ca 2+ ne gêne pas l'anatomie et la fonction de cône. Dans la deuxième étude 21, chromatiqueet les propriétés de réponse achromatiques de cônes de souris ont été cartographiés à travers la rétine, ce qui démontre des différences frappantes dans la fonction de cône entre la dorsale de opsin-dominé "vert" et la rétine "bleu" de opsin dominé souris ventrale. Ces différences régionales dans les propriétés du cône correspondait à la distribution de contraste différentiel dans le milieu naturel (c.-ciel contre la terre), ce qui suggère que les différents types spectraux de cônes de souris prévoient (près de) échantillonnage optimal de contrastes achromatiques et, par conséquent, peuvent offrir une avantage évolutif. Dans la troisième étude 22, la rétroaction réciproque que les terminaux cône axonales reçoivent de cellules horizontales a été étudiée. Comme tous les mécanismes de rétroaction de la cellule horizontale proposées agissent sur ​​voltage-dépendants canaux Ca 2+ dans les terminaux cône axonales 28, terminal de cône Ca 2+ peut servir comme un proxy pour les interactions horizontales cellule à cône. L'étude menée par Kemmler et ses collègues 22 supportsle point de vue que les cellules horizontales utilisent un système de rétroaction complexe comprenant plusieurs mécanismes pour contrôler la libération de glutamate photorécepteur.

Ces études illustrent la polyvalence du protocole décrit et montrent qu'il peut être adapté à une large gamme de questions concernant la fonction de cône et ses circuits synaptiques. En outre, le protocole permet étudier la signalisation Ca 2+ locale dans les différents compartiments de cône, vers une meilleure compréhension de la physiologie cône. Une telle connaissance est important de comprendre les processus physiopathologiques dans des cônes dégénérescence, pour permettre éventuellement pour le développement rationnel des approches thérapeutiques potentielles, en particulier pour les maladies dégénératives qui affectent cônes.

Dans le HR2.1: lignée de souris TN-XL, le biocapteur du Ca est exprimée à travers le cône, à l'exception du segment externe. Ceci constitue une opportunité pour l'évaluation directe et ratiométrique de Ca 2+ dynamiques dans les différents compartiments de cône. Étant donné que les changements dans les courants de Ca2 + dans le segment externe sont reflétées dans les terminaux par l'intermédiaire du potentiel de membrane et l'activation résultant de voltage-dépendants canaux Ca2 +, des processus dans le segment extérieur peuvent être observés de manière indirecte.

Écueils potentiels:

La dissection de la rétine est une étape critique: Chez la souris, la rétine se sépare de l'œilleton généralement entre segments externes des photorécepteurs et l'épithélium pigmentaire. Par conséquent, les photorécepteurs sensibles à la lumière des segments extérieurs de la rétine isolée sont exposés et extrêmement sensible aux dommages mécaniques. Un grand soin doit être pris pour ne pas endommager en appuyant sur ​​le côté photorécepteur avec des outils ou en déplaçant latéralement le tissu sur une surface d'adhésif (par exemple, une membrane de filtration).

Tranches de la rétine de haute qualité peuvent être reconnus sous le microscope par leur surface de coupe propre etpar une couche de photorécepteur bien organisé avec des segments externes précises. L'évaluation fonctionnelle de la qualité de tranche peut être fait rapidement par le clignotement des stimuli lumineux intenses et déterminer le pourcentage de cônes sensibles (par exemple, dans un champ de vue avec 10 - 20 cônes). Ici, la qualité de la réponse doit être évaluée en calculant le rapport signal-sur-bruit (S / N) (amplitude du bruit de fond avant la stimulus lumineux vs amplitude de la réponse à la lumière); un rapport S / N de 2-3 doit être considérée comme le seuil minimum. Typiquement, nous écartons tranches avec moins de 50% des cônes sensibles. Tranches aussi avec des cônes qui affichent un comportement de dopage spontanée excessive (voir la figure 4 sur 10) doivent être jetés.

Tranches dans la chambre d'enregistrement qui répondent aux critères anatomiques et fonctionnels susmentionnés montrent des réponses cohérentes pour 1 - 2 h (pour plus de détails sur la cohérence des réponses, voir 10). Parce tranches survivent hnôtre dans la chambre de retenue, une expérience réussie peut durer jusqu'à 6 heures. Il est à noter qu'il ya des restrictions par rapport à l'étude de long allant interactions spatiales entre les cônes et les cellules horizontales, que le tranchage rompt inévitablement connexions latérales dans les réseaux de la rétine. Cependant, l'augmentation de l'épaisseur de la rétine tranches de 300 um améliore cette question 22.

L'utilisation de tranches verticales rétiniennes évite le balayage des cônes sensibles à la lumière des segments extérieurs par le laser d'excitation et, par conséquent, empêche largement opsin blanchiment (pour une discussion approfondie, voir 10,21). Néanmoins, les Ca 2+ signaux enregistrés ne dépendent pas seulement sur ​​les stimuli lumineux, mais aussi obtenir touchés par un composant fond d'éclairage généré par le laser à balayage d'excitation. En fait, le rétro-éclairage efficace dans de telles expériences d'imagerie à deux photons est une combinaison de lumière laser dispersée, la lumière fluorescente émise par la CE enregistréLLS, et tout composant de fond de relance de LED. Par conséquent, les cônes doivent pouvoir s'adapter pendant au moins 20 à 30 s à balayage laser (avec la composante d'arrière-plan du stimulus lumineux allumé) avant l'enregistrement.

Avantages et applications:

Alors que certaines demandes de ce cône Ca 2+ protocole -Imagerie ont été décrits ci-dessus 10,21,22, d'autres applications peuvent être envisagées: Les études pharmacologiques en combinaison avec cône Ca 2+ imagerie peut valider Ca 2+ voies de signalisation dans les cônes et pourraient être utilisé pour tester l'efficacité et la puissance des médicaments ciblant différents acteurs de Ca 2+ -signaling 10. Cependant, une application clé peut être pour étudier les maladies affectant la fonction de cône. De nombreux modèles de dégénérescence de la rétine de souris mimant les maladies humaines sont disponibles. Par exemple, la perte des photorécepteurs de cône 1 (CPFL 1) souris est un modèle de cône primaire dégénérescence souffranced'une mutation Pde6c 29. Inversement, la souris dégénérescence des bâtonnets 1 (e 1) souffre d'une mutation PDE6B. Bien que cela provoque une dégénérescence des photorécepteurs tige principale 30, une fois ème 1 perte de tige est terminée, ensembles secondaires de la dégénérescence des cônes en 1. Croisement ces animaux avec le HR2.1: ligne TN-XL permettra étudier et de comparer Ca 2+ dynamique à la fois dans la dégénérescence des cônes primaire et secondaire et est susceptible de fournir des informations précieuses sur le rôle de Ca 2+ lors de la mort des cellules de cône. Aussi, pharmacologiquement induite dégénérescence de cône - par exemple en utilisant des inhibiteurs sélectifs PDE6 - peut servir à identifier les mécanismes en aval de la dégénérescence des cônes 10,29,31.

En résumé, le protocole décrit ici permet de mesurer Ca 2+ dans les compartiments sous-cellulaires de cônes photorécepteurs de la souris et présente de grandes opportunités pour découvrir la physiologie cône dans une large gammedes conditions physiologiques et physiopathologiques. En outre, ce protocole peut être utilisé pour le criblage d'agents pharmacologiques conçues pour interférer avec cône Ca 2+ -signaling et contribuer ainsi à établir de nouvelles thérapies pour les maladies de cône.

Disclosures

Les auteurs ont rien à révéler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High vacuum grease Dow Corning 1018817 http://www.dowcorning.com
Cover slips R. Langenbrinck 24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
Glass slides R. Langenbrinck 76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Blades for tissue chopper MARTOR KG ARGENTAX No. 1044 0.25 mm; http://www.martor.de
Tissue chopper Custom-build Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert
Nitrocellulose filter membrane gridded Merck Millipore AABG01300 Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com
Isoflurane CP CP pharma AP/DRUGS/220/96 http://www.cp-pharma.de
UV/green LED-based full-field stimulator Custom-build for details, see10
Open source microprocessor board Arduino http://www.arduino.cc
Imaging software CfNT Custom-written developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany
IgorPro Wavemetrics http://www.wavemetrics.com
VC3-4 System focal perfusion system ALA Scientific Instrument with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser) Newport Spectra-Physics http://www.spectra-physics.com
Movable objective microscope (MOM),
Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany		 Sutter Instruments http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
Name Company Catalog Number Comments
XLUMPlanFL 20X/0.95w objective Olympus http://www.olympusamerica.com
Vaporizer 100 series Surgivet http://www.surgivet.com
Ionomycin, Calcium salt Life technologies I24222 http://www.lifetechnologies.com
EGTA Sigma-Aldrich E3889 https://www.sigmaaldrich.com
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 101191250 http://www.sigmaaldrich.com
Leica MZ95 leica microsystems http://www.leica-microsystems.com/

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