Summary
우리는 마우스 망막의 생체 외 슬라이스 준비를 사용하여 콘 광 수용체의 축삭 터미널에서 칼슘 역학을 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 중요한 포유 동물 모델 시스템에서 콘 칼슘 신호의 포괄적 인 연구, 마우스를 할 수 있습니다.
Abstract
망막 원뿔 광 수용체 (콘) 일광 비전을 제공하고 색상 차별의 기초입니다. 그들은 종종 많은 망막 질환으로 실명에 이르는, 변성 될 수 있습니다. 칼슘 (Ca 2+), 감광체 시그널링 및 대사에서 중요한 제 메신저는 간접적 다양한 동물 모델에서 감광체 퇴행과 연계 될 것이 제안되어왔다. 체계적으로 콘 생리학의 이러한 측면을 공부하고 병태 생리는 전기적으로 망막이로드 광 수용체에 의해 지배 마우스에서 특히,이 작은 세포에서 기록하는 어려움에 의해 방해되었다. 이 문제를 회피하기 위해, 우리는 콘에서 독점적으로 유 전적으로 인코딩 된 칼슘 바이오 센서 TN-XL을 표현하고 광 수용체의 변성에 대한 마우스 모델과 교배 할 수있는 유전자 변형 마우스 줄을 사용하여 두 광자 칼슘 이미징 프로토콜을 설립했다. 여기에 설명 된 프로토콜이 수직 섹션을 포함 제조 (R20; 마우스와 콘 칼슘 수준에서 빛 자극 유발 변경의 광학 영상에서 망막의 조각 "). 프로토콜은 절대 칼슘 농도 "에 슬라이스 측정"을 할 수 있습니다; 녹음은 교정 다음에 할 수있다. 이 프로토콜은 기능 콘 특성에 대한 연구를 가능하게하고 콘의 이해 칼슘 신호뿐만 아니라 광 수용체의 죽음과 망막 변성에 칼슘의 잠재적 인 참여에 기여할 것으로 예상된다.
Introduction
비전은 망막 광 수용체의 phototransduction 캐스케이드의 빛에 의한 활성화로 시작합니다. 콘 광 수용체 색상과 고해상도 일광 비전을 중재하는 반면로드 광 수용체는 낮은 조명 수준에서 비전을 할 수 있습니다. 많은 광 수용체 관련 유전자는이 세포의 변성을 초래할 돌연변이에 취약하다. 감광체 손실과 관련된 분자 표지의 수는 1 식별되었지만, 지금까지 상세한 분자 메커니즘 및 이벤트의 시퀀스는 불분명. 변경된 칼슘 항상성은 시각 세포 사멸의 트리거, 변성 처리 2,3- 중의 Ca 2+ 의존성 카르 파인 활성 형 단백질 분해 효소의 상향 조절 (up-regulation)에 의해지지 가설 것으로 추측되었다. 그러나, 지금까지,이 가설은 칼슘의 생리 학적 측정에 의해 백업되지 않습니다. 재에서 칼슘 채널 차단제의 효과에 대한 여러 연구에서 불일치tinal 질병은 더 직접 포유류 콘 광 수용체에서 칼슘을 평가하는 방법을 요구, 세포 사멸 4-6에서 칼슘의 참여를 도전했다.
이전에는 대부분의 전기 녹음 및 칼슘 이미징 연구 때문에 콘 7-9에 쉽게 액세스의 양서류 및 파충류 모델에서 수행되고있다. 그러나, 포유 동물 생리학 감광체 비 포유 동물, 특히 10의 것과 상이 할 수 있고, 인간 유전 적 망막 변성증의 맥락에서, 포유 동물 생리학 감광체의 더 나은 이해는 혁신적인 치료법의 개발에 중요하다. 인간의 망막 질환을 흉내 낸 많은 마우스 모델은 사용할 수 있지만 작은 마우스 콘 (11)에 칼슘 역학에 대해 알려져있다. 전기 기술은 특히하지 마우스에, 콘에서 높은 처리량 녹음에 적합하지 않은 경우로드 (~ 97 %) 크게 콘 (~ 3 %)보다 많다 (12) 칼슘 농도에 칼슘 2 + 전류의 데이터가 아니라를 제공합니다. 콘 칼슘 역학에 대한 질문을 해결하는 경우 따라서, 낮은 시간 해상도에도 불구하고, 영상은 선택의 방법이다. 이미지와 핵심 문제는 선택적 형광 칼슘 지시 염료와 콘 레이블을하는 방법입니다. 적절한 구획화 및 세포 특이도는 조직으로 "대량로드"합성 칼슘 지표 염료에 의해 달성하기 어렵다. 그 결과, 표시 콘로서, 13, 14 봉, 그리고 뮐러 아교 세포는 확실하게 구별 할 수 없습니다. 또한, 합성 염료는 일관된 조건 하에서 장시간 녹음을 방지 세포 밖으로 누출되는 경향이있다. 이 드 필요로 또한, 자신의 AM-에스테르 형태로 합성 칼슘 지표를로드하는 것은 문제가있다tergents (예를 들어, DMSO)와 포름 알데히드 (15)를 생성합니다. 절대 칼슘 측정을 위해, 비율 계량 지표는 필수입니다. 그러나, 가장 현재 합성 비율 적 표시기의 Fura-2는 그 강도에 따라, 자체 콘을 촉진하고, 따라서 연구를 방해 할 수 760 내지 700의 범위의 여기 광 (이광자 여기 용)를, 필요 콘 칼슘 생리 학적 조명 조건에서 2 + 역학.
합성 염료와는 달리, 유 전적으로 인코딩 된 칼슘 지표는 세포 유형에 선택적으로 표현 될 수있다. 이들은 세포 밖으로 누출되지 않으며, 표백이 회피되는 경우, 따라서, 장기간 안정적인 비율 적 측정이 가능하다. 두 광자 현미경과 결합 될 때 세포 유형 선택적 칼슘 바이오 센서의 발현은 크게 생리적 조건 13,16,17를 아래에 칼슘을 평가하고 세포 내 연구하는 강력한 도구를 나타냅니다 칼슘 바이오 센서 마우스 라인 2+ 역학 : FRET 기반 칼슘 바이오 센서 TN-XL (18)을 표현 (HR2.1 TN-XL) 선택적 콘에서, 인간의 붉은 옵신 프로모터 HR2.1 19에서. 콘 단자에 액세스하기 위해, 생체 외 슬라이스 준비 20을 사용 하였다. 프로토콜은 이미 성공적으로 건강한 쥐 10,21,22 원뿔 함수에 세 연구에 사용 하였다. 또한, 프로토콜은 콘 칼슘 공부 허용 2+ 예 특정 유전 상태, 시그널링, HR2.1 유전성 망막 퇴행 모델 마우스를 교배하여 : TN-XL 쥐.
Protocol
모든 동물의 절차는 독일 연방 정부에 의해 결정과 튀빙겐 대학의 기관 동물 복지위원회에 의해 승인 된 동물 보호를위한 가이드 라인과 법률을 준수 수행 하였다.
1. 동물 모델
- HR2.1 : TN-XL 칼슘 바이오 센서 마우스
- 형질 전환 HR2.1을 사용 TN-XL 마우스 라인은 원뿔 광 수용체 (10)에 선택적으로 칼슘 바이오 센서 TN-XL을 표현. 표준 12 시간 주 / 야간 리듬 제기 중 섹스의 6 주 오래 된 마우스 - 3을 사용합니다.
2. 망막 해부
- 생리 솔루션
- 125 mM의 염화나트륨, 2.5 mM의 KCl을, 1 mM의의 MgCl 2, 1.25 mM의의 NaH 2 PO 4, 26 mM의 NaHCO3를 0.5 mM의 L- 글루타민, 20 mM의 (+) 포도당을 함유 세포 외 용액 갓 2 L를 준비한다. 모든 성분이 용해 될 때까지 섞는다.
- "버블"세포 외 솔루션10 분 - 5 carboxygen (95 % O 2, 5 % CO 2)와. 2 mm의 농도에 도달하기 위해 염화칼슘 (2)를 추가합니다.
- 세포 외 솔루션을 버블 링 한 후, 그 산도를 측정한다. pH는 그렇지 않으면 실수 용액의 제조 동안되었을 가능성이 7.4이어야한다. 상수의 pH를 확인하기 위해 실험을하는 동안 버블 링 속도 및 솔루션 온도를 일정하게 유지.
- 2 플라스크, 망막 박리 다른 하나는 녹화 설정 (관류)에 대한 하나에 주식을 분리합니다.
- 눈의 안구 적출술과 망막의 분리 (5-10 분)
- 핵의 제거를위한 작업 영역에서 희미한 붉은 조명을 유지한다. 해부시 콘의 백화를 방지하는 650 나노 미터 (또는 그 이상)의 피크 파장과 LED를 사용한다.
- 콘 완전히 녹음시 증감되도록 통풍이 잘되는, 차광판 상자에 새장을 넣어 2 시간 동안 마우스를 어두운 적응.
- laborato에서 마우스를 마취기화기 및 표준 마우스 케이지를 보유하고 기밀 용기를 사용하여 이소 플루 란 (5 %)와 공예 후드. 기화기를 다룰 때 조심스럽게 제조자의 지시 사항을 따르십시오. 알레르기 항원에 대한 노출을 줄이기 위해 장갑과 얼굴에 마스크를 사용하십시오.
- 해부에 대한 40 배 확대 - 10 쌍안 현미경을 사용합니다.
- 잘린 마취 마우스를 희생.
- 방향은, 방수 펜으로 각각의 눈 (= 지느러미)의 상단을 표시합니다. 왼쪽 또는 오른쪽 눈을 사용할지 여부에 대한 추적합니다.
- 안구 뒤쪽 시신경을 절단하여 신중하게 곡선 가위를 사용하여 눈을 제거합니다. 해부 갓 carboxygenated 세포 외 용액을 함유하는 페트리 접시에 안구 옮긴다. 안구를 전송, 시신경 그루터기를 잡고.
- 날카로운 주사 바늘로 각막과 (오라 참나무에서 예) 공막 사이의 경계를 따라 모든 지점에서 눈을 관통.
- 전자를 잡고부드럽게 포셉 한 쌍의와 공막에 너희가 하나 가위 이전 단계에서 만든 구멍에 블레이드 삽입합니다. 후방 부 (아이 컵)에서 눈 (각막, 렌즈, 유리체)의 앞쪽 부분을 분리 오라 세라 따라 절단. 망막에 지느러미의 위치를 표시 할 수있는 펜 마크의 위치에서 (시신경 유두를 향해) 반경 방향으로 아이 컵을 잘라.
참고 :이 방법을 준비, eyecups은 나중에 사용하기 위해 지속적으로 carboxygenated 용액에서 유지 될 수있다. - 지느러미가 떨어져 자신의 포인트를 삭감하도록 페트리 접시에 아이 컵을 돌립니다. 망막과 공막 사이에 겸자를 삽입하여 팁 왼쪽 집게 각 쌍 세안 컵의 우측 공막을 잡아.
- 부드럽게 아이 컵의 공막 부분을 반전시켜 망막을 분리합니다. 마지막으로, 공막의 망막을 무료로 가위를 해부 마이크로를 사용하여 시신경을 잘라.
참고 :이 중요한 단계입니다. 망막 (예에 의한 손상을 방지감동과) 집게로를 압박. - 집게 한 쌍의 제 2를 사용하여 망막 표면으로부터 부스러기 및 유리체를 제거 부드럽게 포셉 쌍 망막의 가장자리 중 하나를 잡고. 망막 표면이 깨끗하면, 세 개의 추가 단축, 반경 컷 (약마다 90 °)를 만들기 위해 가위를 해부 마이크로를 사용합니다. 이 상처는 하나주의 깊게 광 수용체 측이 페트리 접시 (그림 1A)에서 아래로 향하게하여 망막을 평평하게 할 수 있습니다.
- 슬라이스 준비 (10-15 분)
- 슬라이스를 장착하고, 기록 챔버로 전달하기위한 망막 슬라이싱과 유리 커버 슬립에 대한 미리 니트로 셀룰로스 멤브레인 필터를 준비한다. 가위를 사용하여 약 10 × 5mm 크기의 사각형 조각으로 니트로 셀룰로오스 필터 멤브레인을 잘라. glasscutter를 사용하여 약 10 × 5mm 크기의 사각형 조각으로 된 커버를 잘라.
- 천천히 가까운 세포 외 용액에 유리 슬라이드를 담가조직. 부드럽게, 포셉 한 쌍을 사용하여 매우 가장자리를 잡아 신경절 세포 쪽을 위로해서 유리 슬라이드에 망막을 잡아 당깁니다. 이 과정은 기계적 손상과 조직의 폴딩을 줄일 수 있습니다.
- 각각의 연구 문제와 관련된 망막의 지역을 선택 (또한 토론 참조). 단계 2.2.9에서 만든 긴 컷 등의 망막 반 (그림 1A)를 표시, 기억하십시오. 곡선 메스 블레이드를 사용하여 선택한 망막 지역에서 직사각형, 약 1 × 2mm 크기의 조각을 잘라. 조직 주변의 과잉 솔루션을 닦아.
- 신경절 세포 측이 멤브레인에 부착되도록 망막 조각 위에 여과막을 놓는다. 즉시 단단히 막 조직을 연결하는 막에 세포 외 매체의 드롭을 추가합니다.
- 신선한 세포를 함유하는 용액 슬라이싱 챔버 막 장착 망막 조직을 옮긴다.
- 200 μm의 수직 조각으로 망막을 잘라조직 초퍼 (23)에 부착 된 신선한 면도날을 이용하여 두께 (도 1b). 모든 망막 조각에 대한 블레이드를 변경합니다.
주 : 면도날에 의해 지시 된 바와 같이 전체 박막이 동시에 분할되도록 완벽 슬라이싱 실 바닥면과 정렬 될 필요가 절단시 소리 "클릭"- 그렇지 블레이드 구부릴 수 있으며, 슬라이스를 손상. - 막에 높은 진공 그리스를 적용하여 유리 커버 슬립에 하나의 막에 장착 된 조각을 접착제 만 (그림 1C)를 종료합니다. 그리스에서 무료로 망막 아래의 유리 표면을 유지합니다.
- 유지 챔버 내의 세포 외 용액의 방울에 의해 덮여 커버 슬립 장착 슬라이스 유지 - 예 닫히고 광성 용기, 알루미늄 호일로 덮여 뚜껑 페트리 접시 - RT에서 carboxygen 대기하에. 유지에 분위기를 유지하기 위해 작은 물 탱크 버블 링에 의해 carboxygen 소개챔버는 가습; 이 마르지 슬라이스를 방지 할 수 있습니다.
- 기록 챔버에 (하나 하나)으로 이동하기 전에 15 분 - 슬라이스 10 홀딩 챔버 휴식을 허용. 조각 실온에서 유지 실에 4 ~ 5 시간까지 유지 될 수있다 (~ 21 ° C).
3. 두 광자 칼슘 이미징
- 이광자 현미경
- 가동 목표 현미경 (MOM) 타입 두 광자 현미경을 사용합니다. 세부 항목 모두 MOM 디자인 및 이미징 절차는, 이전 24 설명했다 10,21,25 (소스와 기업, 표 1 참조).
참고 : 사용할 수 다음 최소 요구 사항을 만족 상관 직립 이광자 현미경 : 그것은 ~ 860 nm의 조정 가능한 (a) 펄스 레이저, (b)는 두 개의 동시 취득한 형광 채널의 최소, (c 구비되어야 )) eCFP과 황수정 형광, (D 필터광 자극기 (가능한 설계를 위해 24, 26 참조), 충분한 프레임 속도로 시간 경과 이미지 시퀀스를 기록 허용 (E) 소프트웨어 칼슘에게 관심 2+ 신호를 해결한다. - 제조자에 의해 지시 된 바와 같이 두 광자 이미징 시스템을 시작합니다. 엄밀히 시설의 레이저 안전 지침을 따르십시오. ~ 860 nm의 레이저 및 조정을 시작합니다.
- 기록 챔버로 유지 실에서 슬라이스를 전송하고 즉시 carboxygenated 세포 외 용액으로 관류 시작. 2 ml / 분의 관류 유량 기록 챔버 37 ° C의 온도를 유지한다.
- 20X 0.95 NA 침수 목표를 사용합니다. 가능한 경우, 망막 슬라이스 (도 2)의 위치를 기록 챔버 아래 LED 적외선과 결합 된 CCD 카메라를 사용한다. 그렇지 않으면 두 광자 이미징 (3.1.5 참조)을 사용하여 슬라이스를 찾습니다.
- 바이오 센서의 표현을 볼 두 광자 영상으로 전환합니다. 켜다eCFP과 황수정의 형광 이미징을위한 두 개의 감지 채널.
- 스캔하고 (도 3a)를 기록하기위한 콘 단자의 행을 선택하는 이광자 현미경을 제어하는 화상 취득 소프트웨어를 사용한다. 128 × 16 픽셀 이미지 (31.25 Hz에서) 또는 유사한 구성으로 설정 이미지 수집. 외부 세그먼트에서 photopigments의 표백을 방지하기 위해 콘 단자에 스캔 영역을 제한합니다.
참고 : (칼슘 바인딩 해제 2 + 바인딩 CA의 τ = ~ 0.6 초 2+, τ = ~ 0.2 초 16 참조) TN-XL 칼슘 센서 ~ 8 Hz의 최소 프레임 속도를 권장합니다.
- 가동 목표 현미경 (MOM) 타입 두 광자 현미경을 사용합니다. 세부 항목 모두 MOM 디자인 및 이미징 절차는, 이전 24 설명했다 10,21,25 (소스와 기업, 표 1 참조).
- 빛 자극 기록
- 다른 10,21,26 바와 같이 다음과 같은 단계들을 수행하도록 보조 스테이지 전체 장광 자극기를 사용한다.
참고 : 전체 필드 광 자극에 대한 간단한 솔루션은 두 밴드 필터링 패스 LED를 (: 360 BP (12), "녹색": 578 BP (10) 예를 들어, "파란색")를 사용하는 것입니다즉, 마우스의 콘 파장 감도 일치하지만, 동시에 형광 검출에 사용되는 필터와 오버랩하지 않는 (CF. 3.2.4). 의 LED로부터 광 기록 챔버 (도 2)의 저부를 통해 응축기에 의해 집광된다. 이 자극기 디자인, 그것의 교정에 대한 자세한 내용은 빛의 강도는 사용 유발 된 콘 사진 이성체의 비율은, 10,21,26를 참조하십시오. - 빛의 자극을 (3.2.3 참조) 제시 또는 약리 에이전트를 적용하기 전에 - (또한 잠재적 인 함정을 참조, 30 초 20) 레이저를 켜고 콘 스캐닝 레이저 자극 배경 빛에 적응 할 수 있습니다.
- (그림 3B, C와 같이 빛의 예를 들면, 플래시,) 임의의 자극의 프레 젠 테이션을 시작합니다. 단계 3.2.1에서 설명 자극기의 경우에, 사용자 정의 된 소프트웨어에 의해 제어되는 마이크로 프로세서 보드 (대를 사용하여 시간에 걸쳐 두 개의 LED의 세기를 변조함으로써 생성 자극자세한 내용은) 10,21,26를 참조하십시오.
- 두 형광 채널을 녹화 시작 (. 예를 들어, "블루"무서워 - 기증자 eCFP에 대한 483 nm에서와 "노란색"무서워 - 수용체에 대한 535 nm에서, 사양은 표 1 참조)를 동시에 각각의 이미지 수집 소프트웨어를 사용하여 (또한 3.1 참조 .6). 예를 들어, 표시등이 깜박입니다 (그림 3B, C), 기록 최소 8의 경우 - 10 자극 프리젠 테이션 (시험).
- 다른 10,21,26 바와 같이 다음과 같은 단계들을 수행하도록 보조 스테이지 전체 장광 자극기를 사용한다.
- "에서 슬라이스"칼슘 교정
- 기록 칼슘 (3.4에서 설명) (3.1.6과 3.2.4에 설명 된대로)와 콘 세트의 기본 칼슘 수준을 추출 콘 단자에 2 + 신호.
- 5 μm의의 (DMSO에 용해) 이오 노마 이신과 10 mM의 EGTA와 "칼슘 2 + 무료"세포 외 매체로 전환 (또는, 대안 BAPTA)을 첨가. 녹음 콘 단자는 다시 매 5 분 최소 형광 비율 (R 최소)을 결정, <할EM> 즉, 세포 내 칼슘의 (근처) 부재의 비율 2+. 30 분 -이 어디 (15) 사이에 걸릴 수 있습니다.
참고 : 관류 시스템은 다른 저수지 사이를 전환 할 수 있도록 할 필요가있다. - (DMSO에 용해) 5 μM의 이오 노마 이신 2.5 mM의 칼슘과 세포 외 매체로 전환합니다. 5 분의 배양 시간 후에 기록 콘은 다시 5 분마다, 즉 최대 형광 비율 (R 최대), 내 Ca 2 + 농도의 포화의 존재 비율을 측정 하였다. 안정되고 칼슘 비율 15 분 - 이오 노마 이신 응용 프로그램에 따라, 그것은 3 사이에 걸릴 수 있습니다.
참고 : 2 + 높은 칼슘에 조각을 노출하고 결국 세포가 손상 될 수 긴 기간 동안 이오 노마 이신. 정상적인 형태를 유지 분석 만 셀을 포함합니다. 농도 (즉, EGTA, 이오 노마 이신)를 적용 할 필요가있다. 칼슘 교정에 대한 자세한 내용은프로토콜, 13, 17을 참조하십시오.
- 데이터 분석
주 : 각 현미경 소프트웨어와 호환 커스텀 분석 스크립트를 실행할 수있는 화상 처리 및 데이터 분석 소프트웨어 패키지를 사용한다.- 영상 데이터 파일을로드하고 각 콘 단자 (그림 3A) 주변의 관심 (로아)의 영역을 그립니다. ROI 내의 각각의 프레임의 평균 형광 강도 및 FRET - 억 셉터 (황)와 도너 (ECFP)로 이루어지는 군으로부터 선택 형광 (R = F / F D;도 3B, C) 사이의 비율 (R)을 계산하기 전에, 배경 형광을 뺄. 이 비율은 일반적으로 상대 세포 내 칼슘 농도에 대한 프록시로서 사용되지만, 교정 (3.3) 후에, 또한 절대 농도 (3.4.3 참조)를 추정 할 수있다.
주 : 척추 경이 얼기 외측 층에서의 위치를 인식 할 수 있고, 그 형태는 (약간 작은 원뿔보다 "블롭을"평탄화인 somata) 콘 축삭의 끝 부분에 위치. - 평균 자극 시험 (그림 4A). 응답 크기에 대한 대책과 곡선 (R)에서 빛 자극, 피크 진폭 (R 앰프) 및 지역 이전 등 칼슘 기준 레벨 (R 기준)으로 평균 흔적 (그림 4B)에서 응답 매개 변수를 추출합니다. 또한, 이러한 응답 상승 (T 상승)과 감쇠 시간 (T 붕괴)로 평균 추적에서 반응 속도론을 추출 (20 % 및 R 앰프의 80 % 사이 = 각각의 시간 간격도 4B 그림 참조). 이러한 매개 변수를 확인하는 방법에 대한 자세한 내용은 10를 참조하십시오.
- 3.3.1-3.3.3 단계에서 측정에 기초하여 절대 콘 칼슘 농도의 추정을 계산한다. 최소 및 최대 칼슘 이온 농도, R 최소 및 R 최대 캘리포니아, 각각 기증자 형광의 비율을 사용 2+ D, 칼슘이 결합 된) 및 -unbound까지 (F D, 칼슘이없는) 상태뿐만 아니라 생체 내 해리 상수는 다음과 TN-XL에 대한 (K D는 = 0.77, 16 참조) 식 (27 아날로그) :
- 영상 데이터 파일을로드하고 각 콘 단자 (그림 3A) 주변의 관심 (로아)의 영역을 그립니다. ROI 내의 각각의 프레임의 평균 형광 강도 및 FRET - 억 셉터 (황)와 도너 (ECFP)로 이루어지는 군으로부터 선택 형광 (R = F / F D;도 3B, C) 사이의 비율 (R)을 계산하기 전에, 배경 형광을 뺄. 이 비율은 일반적으로 상대 세포 내 칼슘 농도에 대한 프록시로서 사용되지만, 교정 (3.3) 후에, 또한 절대 농도 (3.4.3 참조)를 추정 할 수있다.
Representative Results
수직 조각을 HR2.1에서 준비 (그림 1) 결합하여 두 개의 광자 이미징 (그림 2)와 TN-XL 마우스 망막을, 우리는 콘 광 수용체 축삭 터미널에서 빛 자극 유발 칼슘 신호의 비율 계량 측정을 수행 할 수 있었다 . 이러한 접근법은 액세스 및 합성 칼슘 지표 기존 광학 이미징 방법보다 마우스 콘 시각화에 상당한 개선을 나타낸다. 예를 들면, 유 전적으로 인코딩 된 칼슘의 비율 적 원추 특이 적 발현 2+ 바이오 TN-XL 크게 콘 축삭 단말기 식별 (도 3a에 ROI를 참조)을 용이. 따라서, 우리의 프로토콜은 모두 콘로드 축삭 터미널의 기여와 예 "혼합"신호로, 불분명 한 출처의 기록 신호의 위험을 제거합니다.
우리의 접근은 INDIVI의 레벨에서 단일 시험 반응을 해결있게듀얼 콘 축삭 터미널. 콘 터미널에서 칼슘의 빛 유발 압출 증가와 기증자 및 수용체 형광, 각각 (그림 3B)의 감소로 표시됩니다. 형광 비 (R)의 감소는 콘 전압 게이트 된 칼슘 채널의 후속 폐쇄 과분극 광 - 유도에 의한 콘 단자 (도 3c)에서의 Ca 2+ 압출에 대응한다. 여러 콘 축삭 단자 (도 3A)을 동시에 모니터링 할 수 있기 때문에, 데이터 수집은 매우 효율적이고 콘 칼슘 응답 수백 번의 실험에서 수집 될 수있다. (그림 4) 정량적으로 이러한 반응을 평가하여, 콘 칼슘 신호는 비교 될 수 및 조건 (토론 참조)의 범위에서 평가.
그것은 FRET - 억 셉터 (황)와 -donor (ECFP)로 이루어지는 군으로부터 선택 형광의 비율을 사용하는 것이 충분세포 내 칼슘 수준의 상대적 척도로 (F / F D는 자세한 내용은 3.4 참조). 그러나, 필요할 때마다, 비 절대적인 세포 내 칼슘 농도 ([칼슘]) (도 5)를 얻기 위해 교정 될 수있다. 이 프로토콜에 사용되는 배경 조명에서 (자세한 내용은 (10)을보고 그림 3 전설), 교정 [칼슘 2 +]에서 "야생형"HR2.1 휴식 절대에 대한 견적 산출 :의 TN-XL 마우스 콘 단자를 243 159 ± 11 쥐 문헌보고 nM의 범위 내 (평균 ± SD).
수직 망막 조각 1. 준비 그림. 망막의 (A) 절연 및 망막 슬라이스 준비를 평평. (B) 사각형 조각 (들슬라이스 한 후 필터 종이 막 (어두운 회색)에 장착)에 빨간색 상자 EE. (C) 그리스를 사용하여 유리 커버 슬립에 고정 막에 장착 된 망막 조각의 상위 뷰입니다. (D) 망막 조각의 일부의 개략도 (C에 빨간색 상자 참조). 콘 광 수용체는 녹색으로 표시됩니다. V, 복부; D, 지느러미; N, 코; T, 시간; OS, 외부 세그먼트; ONL, 바깥 핵 층; OPL, 바깥 얼기 층; INL, 내부 핵 층; IPL, 내부 얼기 층; GCL, 신경절 세포 층. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
망막 조각 그림 2. 두 광자 이미징 : 기록 구성의 그림 맨 :. 물 침수 대물 렌즈가 초점이 될주사 망막 레이저 (적색 하향 화살표), 및 형광 방출 (위쪽 화살표)를 수집하고있다. 렌즈는 CCD 카메라를 사용하여 슬라이스를 묘화 할 때 응축기 아래에 장착 된 조명 LED로부터의 적외선 광을 투과 모은 센터 :.. 세포 외 용액으로 기록 챔버에 장착 및 관류 망막 슬라이스 히프 : 집광 렌즈는 자극의 LED로부터의 광을 포커싱 (CCD 카메라와 촬상 용 적외선 LED) 망막 조직으로 기록 챔버의 바닥을 통하여 투명. IR LED, 적외선 발광 다이오드; CCD, 전하 결합 소자; BP, 대역 통과가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 빛 연상마우스 콘 광 수용체의 축삭 터미널에서 D 칼슘 응답. (A) 왼쪽 : 녹음 망막 조각에 콘 광 수용체 (녹색)의 시냅스 터미널 (빨간색 상자)에 초점을 맞추고 오른쪽 :. 예를 녹화 지역의 7 개별 단자. 형광이 두 채널 사용하여 기록 하였다. (; 535 BP 50 위)과 FRET - 기증자 eCFP 하나 (아래 480 BP 32) FRET - 수용체 황수정 하나를 (B) 황수정의 빛 유발 변경 (F) 및 eCFP (F D) 형광이 하나의 투자 수익 (ROI)에 기록. (C) 칼슘 2 + 응답 5 초 간격으로 1 초 밝은 빛이 깜박의 일련의 콘 단자의 (비 F / F D 등). 투자 수익 (ROI), 관심의 영역; BP, 대역 통과 필터; F, 형광 강도; 임의 단위, AU; FRET, 포스터 공명 에너지 전달; eCFP는, 시안 형광 단백질을 향상. 자극 강도 (P로. 13.0과 배경 레벨에 추가 각각 M-및 S-opsins, 12.8, (의 ~ 10 = LED가 꺼져, 여기 레이저 스캐닝) : 10 세 · P · S-1) 콘 당에서 hoto 이성화 속도 를 클릭하십시오 여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
빛을 유발 콘 칼슘 응답의 그림 4. 실시 정량 분석 (A) 하나의 콘 터미널에서 (ΔR)을 빛 유발 칼슘 2 + 응답 (단일 시험 : 회색 흔적, N = 16, 평균 :. 검은 추적 ) (B) 매개 변수가 평균 칼슘 2 + 응답을 결정 :. 이전에 빛 자극에 대한 기준을 나타냄) 칼슘 레벨 (R 기반을 쉬고, 응답 크기 AR로EA 언더 곡선 80 %에서 (R) 및 최대 진폭 (R 증폭기), 응답 발병 속도론 (t 상승 R 증폭기의 20 % 내지 80 %에서의 시간 간격) 및 오프셋 (t 붕괴, 시간 구간 R 앰프의 20 %)에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 절대 칼슘 농도를 추정. 휴식 칼슘 농도 ([칼슘 2 +], 비율 F / F D 등) TN-XL 마우스에 8 콘 축삭 터미널에 기록 (원, ± 표준 편차, 평균) 다른 세포 외 솔루션 : 두 번 표준 외 매체 (Ctrl 키 1, 2), 다음 최소한의 ( "제로") [칼슘 2 +] (10 mM의 EGTA)와높은 [칼슘 2 +] (2.5 mM의)와 D, 세포와 세포 내 칼슘을 2 + 평형 이오 노마 이신 5 μM의 존재 후자의 두 가지 조건. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
전기 생리 단일 셀 녹음 또는 합성 형광 지표와 칼슘 이미징을 사용하여 기존의 프로토콜은 기술적 인 이유 (소개를 참조하십시오)의 번호를 마우스 콘 광 수용체의 칼슘 역학을 기록하는 투쟁. 여기에 설명 된 프로토콜은 칼슘 신호 효율적이고 비교적 간단한 방법으로 개인 식별 마우스 콘 단자 심지어 절대 칼슘 농도의 측정을 허용한다.
이 프로토콜은 이미 성공적으로 건강한 마우스 망막 원뿔 함수의 다양한 측면 어드레스 세 연구에 사용되었다. 첫 번째 연구 10 년, HR2.1 : TN-XL 마우스는 칼슘 바이오 센서의 콘 - 특이 적 발현이 저해하지 않는 것을 보여주는, 면역 조직 화학, 르 녹음, 두 광자 칼슘 이미징 및 약리학을 사용하여 분석되었다 콘 해부학과 기능. 두 번째 연구 (21), 색마우스 콘의 무채색 응답 특성은 "녹색"옵신 지배 지느러미와 "블루"옵신 지배 복부 마우스 망막 사이의 콘 기능에 눈에 띄는 차이를 보여, 망막에 걸쳐 매핑되었다. 콘 특성이 지역적 차이가 마우스 콘의 다양한 스펙트럼 유형 따라서, 무채색 대조 (근처) 최적의 샘플링을 제공 할 것을 제안, 자연 환경에서 차동 명암 분포를 (즉, 접지 대 하늘) 일치,를 제공 할 수 있습니다 진화 적 이점. 콘 축삭 터미널 수평 세포에서받을 수있는 세 번째 연구 (22)의 상호 피드백을 조사 하였다. 모든 제안 된 수평 세포 피드백 메커니즘이 콘 축삭 단자 (28)의 전압 - 문이 칼슘 채널에 작용하는 것처럼, 콘 단말기 칼슘은 수평 세포에 콘의 상호 작용에 대한 프록시 역할을 할 수 있습니다. Kemmler에 의해 연구는 22 지원을 동료가로보기 세포 감광체 글루타메이트 방출을 제어하기위한 여러 가지 메커니즘을 포함하는 복잡한 피드백 시스템을 사용하는 것이.
이러한 연구들은 설명 프로토콜의 다양성을 설명하고는 콘 기능과 시냅스 회로에 관한 질문 폭넓게 적용될 수 있음을 보여준다. 또한, 프로토콜은 콘 생리학의 더 나은 이해를 향해, 다른 콘 구획 현지 칼슘 신호 전달을 연구 할 수 있습니다. 이러한 지식은 결국 콘에 영향을 미치는 퇴행성 질환 특히, 잠재적 인 치료 접근 방법의 합리적인 개발을 허용, 퇴화 콘의 병태 생리 학적 과정을 이해하는 것이 중요합니다.
HR2.1에서 : TN-XL 마우스 선, 칼슘, 바이오 센서는 외부 세그먼트를 제외하고, 콘 걸쳐 발현된다. 이것은 칼슘 동적의 직접 비율 계량 평가를위한 기회를 제공다른 콘 구획에서의. CA의 변화 때문에 외측 세그먼트 2+ 전류는 막 전위와 전압 관문 칼슘 채널을 통해 생성 된 활성 단말기들에 반영되어, 외측 세그먼트 프로세스 간접적 관찰 될 수있다.
잠재적 인 함정 :
망막의 해부는 중요한 단계입니다 : 마우스에서 망막 광 수용체는 일반적으로 외부 세그먼트와 색소 상피 세포 사이의 아이 컵에서 분리합니다. 따라서, 망막의 절연 감광 감광체 외부 세그먼트는 노출 및 기계적 손상에 매우 민감. 각별한주의 도구 감광체 측을 접촉하여 또는 접착면에 옆으로 (예를 들면, 여과막)을 이동시킴으로써 조직을 손상시키지 않도록주의해야한다.
고품질 망막 슬라이스가 깨끗 절삭면에 의해 현미경으로 인식 될 수 있고명확하게 정의 된 외부 세그먼트와 잘 조직 된 광 수용체 층으로. 슬라이스 품질의 기능 평가는 신속하게 (- 20 콘 10보기의 분야에서, 예를 들어) 밝은 빛의 자극을 깜박하고 반응 콘의 비율을 결정하여 수행 할 수 있습니다. 여기서, 응답 성이 신호 대 잡음비 (S / N) (광 응답의 진폭 대 광 자극 전에 기저선 노이즈의 진폭)을 산출하여 평가하여야한다; S / N (2) - (3)는 최소 임계 값으로 간주되어야한다. 일반적으로, 우리는 50 % 미만의 반응 콘 슬라이스 버린다. 또한 과도한 자연 스파이크 동작 (10 그림 4 참조) 폐기해야 표시 콘 조각.
상기 해부학 적 및 기능적 기준을 충족 녹화 실에서 조각 1에 대한 일관된 반응을 보여 - 2 시간 (응답의 일관성에 대한 자세한 내용을, 10 참조). 슬라이스 시간 동안 생존하기 때문에유지 실에서 우리의 성공적인 실험은 6 시간까지 지속될 수 있습니다. 그것은 슬라이스는 필연적으로 망막 네트워크에서 측면 연결을 끊고로 콘 및 수평 세포 사이의 장기에 이르기까지 공간의 상호 작용을 연구에 대한 몇 가지 제한 사항이 있다는 것을 주목할 필요가있다. 그러나, 300 ㎛, 망막 슬라이스의 두께를 증가 시키면이 문제를 개선한다 (22).
수직 망막 조각의 사용은 크게 (10,21 참조, 광범위한 토론) 옵신 표백을 방지하여, 여기 레이저에 의해 빛에 민감한 콘 외부 세그먼트의 스캔을 방지합니다. 그럼에도 불구하고, 기록 칼슘 신호뿐만 아니라, 광 자극에 의존 할뿐만 아니라, 주사 여기 레이저에 의해 생성 된 배경 조명 성분에 의해 영향을받을. 사실, 이러한 두 광자 이미징 실험에서 효과적인 배경 조명은 레이저 광 산란, 기록 CE에 의해 방출 된 형광의 조합 인LLS, 및 LED 자극 배경 요소. 녹음하기 전에 (온 빛 자극의 배경 구성 요소) 레이저 스캐닝에 30 초 - 따라서, 콘 적어도 20 적응할 수 있어야합니다.
장점 및 응용 프로그램 :
콘에서 신호 전달 경로 2 + 칼슘의 유효성을 검사 할 수있다 콘 칼슘 이미징과 함께 약리 연구를 할 수있는이 콘 칼슘 -imaging 프로토콜에 대한 일부 응용 프로그램은 10,21,22 설명되었지만, 다른 응용 프로그램을 구상 할 수있다 효능 및 CA에 다른 선수를 대상으로 약물의 효능을 테스트하는 데 사용 2+ 10 -signaling. 그러나, 주요 응용 프로그램은 콘 기능에 영향을 미치는 질병을 연구 할 수있다. 인간의 질병을 흉내 낸 많은 망막 변성 마우스 모델을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 콘 감광체 손실 1 (CPFL 1) 마우스 차 변성 콘 모델은 고통Pde6c 돌연변이 29. 반대로,로드 변성 1 (RD 1) 마우스 Pde6b 돌연변이에서 겪고있다. 이는 주로드 감광체 변성 30 1 1 RD로드 손실이 완료되면 이차 변성 원뿔 세트를 발생하는 동안. HR2.1 이러한 동물을 교배 : TN-XL 라인이 공부하고 모두 기본 및 보조 콘 변성에 칼슘 역학을 비교 허용 원뿔 세포 사멸 중 칼슘의 역할에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 가능성이 있습니다. 또한, 약리학 콘 변성을 유도 - 인스턴스 PDE6 선택적 억제제의 사용 - 콘 변성 10,29,31의 하류 메카니즘을 식별하는 역할을 할 수있다.
요약하면, 프로토콜은 여기에 마우스 콘 광 수용체의 세포 내 구획에 칼슘을 측정 할 수 있으며 넓은 범위에서 콘 생리를 발견하는 좋은 기회를 제공 기술생리 학적 및 병태 생리 학적 조건. 또한,이 프로토콜은 원뿔 칼슘 -signaling 방해함으로써 콘 질환에 대한 새로운 치료법을 확립 할 수 있도록 설계되는 약물의 스크리닝에 사용될 수있다.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High vacuum grease | Dow Corning | 1018817 | http://www.dowcorning.com |
| Cover slips | R. Langenbrinck | 24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com | |
| Glass slides | R. Langenbrinck | 76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com | |
| Blades for tissue chopper | MARTOR KG | ARGENTAX No. 1044 | 0.25 mm; http://www.martor.de |
| Tissue chopper | Custom-build | Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert | |
| Nitrocellulose filter membrane gridded | Merck Millipore | AABG01300 | Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com |
| Isoflurane CP | CP pharma | AP/DRUGS/220/96 | http://www.cp-pharma.de |
| UV/green LED-based full-field stimulator | Custom-build | for details, see10 | |
| Open source microprocessor board | Arduino | http://www.arduino.cc | |
| Imaging software CfNT | Custom-written | developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany | |
| IgorPro | Wavemetrics | http://www.wavemetrics.com | |
| VC3-4 System focal perfusion system | ALA Scientific Instrument | with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/ | |
| Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser) | Newport Spectra-Physics | http://www.spectra-physics.com | |
| Movable objective microscope (MOM), Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany |
Sutter Instruments | http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XLUMPlanFL 20X/0.95w objective | Olympus | http://www.olympusamerica.com | |
| Vaporizer 100 series | Surgivet | http://www.surgivet.com | |
| Ionomycin, Calcium salt | Life technologies | I24222 | http://www.lifetechnologies.com |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | https://www.sigmaaldrich.com |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 101191250 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Leica MZ95 | leica microsystems | http://www.leica-microsystems.com/ |
References
- Trifunovic, D., et al. Neuroprotective strategies for the treatment of inherited photoreceptor degeneration. Current Molecular Medicine. 12, 598-612 (2012).
- Paquet-Durand, F., et al. Calpain is activated in degenerating photoreceptors in the rd1 mouse. Journal of Neurochemistry. 96, 802-814 (2006).
- Paquet-Durand, F., et al. A key role for cyclic nucleotide gated (CNG) channels in cGMP-related retinitis pigmentosa. Human Molecular Genetics. 20, 941-947 (2011).
- Frasson, M., et al. Retinitis pigmentosa: rod photoreceptor rescue by a calcium-channel blocker in the rd mouse. Nature Medicine. 5, 1183-1187 (1999).
- Bush, R. A., Kononen, L., Machida, S., Sieving, P. A. The effect of calcium channel blocker diltiazem on photoreceptor degeneration in the rhodopsin Pro213His rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 2697-2701 (2000).
- Pawlyk, B. S., Li, T., Scimeca, M. S., Sandberg, M. A., Berson, E. L. Absence of photoreceptor rescue with D-cis-diltiazem in the rd mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 1912-1915 (2002).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors. The Journal of General Physiology. 113, 267-277 (1999).
- Choi, S. Y., et al. Encoding light intensity by the cone photoreceptor synapse. Neuron. 48, 555-562 (2005).
- Krizaj, D. Calcium stores in vertebrate photoreceptors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 873-889 (2012).
- Wei, T., et al. Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 32, 6981-6994 (2012).
- Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Molecular Vision. 13, 887-919 (2007).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18, 8936-8946 (1998).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nature Protocols. 1, 1057-1065 (2006).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46, 143-151 (2008).
- Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290, 527-528 (1981).
- Hendel, T., et al. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro. The Journal of Neuroscience. 28, 7399-7411 (2008).
- Dreosti, E., Odermatt, B., Dorostkar, M. M., Lagnado, L. A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo. Nature Methods. 6, 883-889 (2009).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90, 1790-1796 (2006).
- Wang, Y., et al. A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes. Neuron. 9, 429-440 (1992).
- Connaughton, V. P. Zebrafish retinal slice preparation. Methods in Cell Science. 25, 49-58 (2003).
- Baden, T., et al. A tale of two retinal domains: near-optimal sampling of achromatic contrasts in natural scenes through asymmetric photoreceptor distribution. Neuron. 80, 1206-1217 (2013).
- Kemmler, R., Schultz, k, Dedek, K., Euler, T., Schubert, T. Differential regulation of cone calcium signals by different horizontal cell feedback mechanisms in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 34, 11826-11843 (2014).
- Werblin, F. S. Transmission along and between rods in the tiger salamander retina. The Journal of Physiology. 280, 449-470 (1978).
- Euler, T., et al. Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 457, 1393-1414 (2009).
- Baden, T., Berens, P., Bethge, M., Euler, T. Spikes in mammalian bipolar cells support temporal layering of the inner retina. Current Biology. 23, 48-52 (2013).
- Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).
- Thoreson, W. B., Mangel, S. C. Lateral interactions in the outer retina. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).
- Trifunovic, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).
- Sahaboglu, A., et al. Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms. Cell Death & Disease. 4, e488 (2013).
- Sahaboglu, A., et al. PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function. PloS One. 5, e15495 (2010).
