Imagem Ca Published: May 6, 2015 doi: 10.3791/52588

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Manoj Kulkarni^1,2, Timm Schubert^1,3, Tom Baden^1,2,3, Bernd Wissinger^4,5, Thomas Euler^1,2,3, Francois Paquet-Durand¹

¹Institute for Ophthalmic Research, University of Tübingen, ²Graduate School of Cellular & Molecular Neuroscience, University of Tübingen, ³Bernstein Centre for Computational Neuroscience, University of Tübingen, ⁴Molecular Genetics Laboratory, University of Tübingen, ⁵Centre for Ophthalmology, University of Tübingen

Summary

Nós descrevemos um protocolo para acompanhar a dinâmica de Ca2 ⁺ nos terminais do axônio de cones fotorreceptores, utilizando uma preparação fatia ex-vivo da retina mouse. Este protocolo permite que os estudos exaustivos sobre cone Ca ²⁺ sinalização em um importante sistema de modelo de mamífero, o rato.

Abstract

Cones fotorreceptores da retina (cones) servir visão luz do dia e são a base da discriminação de cor. Estão sujeitos a degeneração, conduzindo muitas vezes a cegueira em muitas doenças da retina. O cálcio (Ca ^2+), de um segundo mensageiro chave na sinalização de fotorreceptores e metabolismo, tem sido proposto para ser indirectamente ligada com a degeneração de fotorreceptores em vários modelos animais. Estudar sistematicamente estes aspectos de fisiologia e patofisiologia cone tem sido dificultada pelas dificuldades de gravação electricamente a partir destas pequenas células, em particular no rato onde a retina é dominada por bastonetes. Para contornar este problema, foi estabelecido um protocolo de imagem de dois fótons Ca ²⁺ usando uma linha de rato transgénico que expressa o codificado geneticamente Ca ²⁺ biossensor TN-XL exclusivamente em cones e podem ser cruzados com modelos de ratos para degeneração de fotorreceptores. O protocolo aqui descrito envolve a preparação de secções verticais (R20; fatias ") de retinas de ratos e imageamento óptico de luz muda evocadas por estímulo em cone Ca ²⁺ nível. O protocolo também permite que "medição in-slice" de concentrações absolutas de Ca2 ^+; como as gravações pode ser seguido por calibração. Este protocolo permite estudos em propriedades funcionais de cone e espera-se contribuir para a compreensão do cone de sinalização de Ca2 ^+, bem como o envolvimento potencial de Ca ²⁺ no fotorreceptor morte e degeneração da retina.

Introduction

Visão começa com a activação induzida por luz da cascata de fototransdução em fotorreceptores retinais. Bastonetes permitir a visão em níveis baixos de luz, enquanto cones fotorreceptores mediar cor e alta resolução de visão luz do dia. Muitos genes específicos de fotorreceptoras são susceptíveis a mutações que conduzem à degeneração destas células. Um número de marcadores moleculares associados a perda de fotorreceptores foram identificadas ^1, mas até agora os mecanismos moleculares detalhadas e a sequência de eventos permanecem obscuros. Altered homeostase de Ca2 ⁺ foi especulado para ser um gatilho de morte celular de fotorreceptores, uma hipótese suportada pela sobre-regulação da actividade de proteases dependentes de Ca2 ⁺ do tipo calpaina durante o processo de degeneração ^2,3. No entanto, até à data, esta hipótese não é apoiada por medidas fisiológicas de Ca ^2+. Inconsistências em diversos estudos sobre o efeito de bloqueadores dos canais de Ca ²⁺ em redoenças Tinal desafiou ainda mais o envolvimento dos Ca2 ⁺ na morte celular ^4-6, pedindo métodos para avaliar directamente Ca2 ⁺ em cones fotorreceptores mamíferos.

Anteriormente, a maioria gravação elétrica e estudos de imagem Ca ²⁺ foram realizados em modelos de anfíbios e répteis por causa do acesso mais fácil aos cones ^7-9. No entanto, a fisiologia dos mamíferos de fotorreceptores pode ser diferente do que a do não-mamíferos e, especialmente, ^10, no contexto de degeneração retinal hereditária humana, uma melhor compreensão da fisiologia de mamíferos fotorreceptores é uma chave para o desenvolvimento de tratamentos inovadores. Muitos modelos de ratos que imitam doenças da retina humanos estão disponíveis, mas pouco se sabe sobre a dinâmica de Ca2 ⁺ em cones de rato ^11. Técnicas eléctricas não são adequados para gravações de alto rendimento a partir de cones, em particular, não em ratinhos, em que as hastes (~ 97%) significativamente mais numerosos cones (~ 3%) ¹² + mas não em concentrações intracelulares de Ca2 ⁺ absolutos. Assim, apesar da resolução temporal inferior, imagem latente é o método de escolha no tratamento de questões sobre cone Ca ²⁺ dinâmica. A questão-chave com imagens é como rotular selectivamente os cones com um corante indicador fluorescente Ca ^2+. Compartimentalização adequada e especificidade celular é difícil de alcançar por "a granel-loading" sintética Ca ²⁺ corantes indicadores no tecido. Como conseqüência, cones rotulados, hastes ^13,14, e células gliais de Müller não pode ser confiavelmente distinguidos. Além disso, os corantes sintéticos tendem a vazar para fora das células, impedindo gravações prolongados em condições consistentes. Além disso, o carregamento sintéticos indicadores de Ca2 ⁺ na sua forma de éster AM é problemática, uma vez que requer detergents (por exemplo, DMSO) e gera formaldeído ^15. Para absolutos Ca ²⁺ medidas, os indicadores raciométrica são obrigatórios. No entanto, o melhor indicador raciométrica sintéticos actualmente disponíveis Fura-2 requer a luz de excitação na gama de 700-760 nm (para a excitação de dois fotões), que, em função da sua intensidade, pode, por si só estimular os cones, e, assim, impedir de estudos cone de Ca ²⁺ funcionamento sob condições de iluminação fisiológicas.

Ao contrário dos corantes sintéticos, geneticamente codificados indicadores de Ca2 ⁺ pode ser expressa de uma maneira selectiva de células-tipo. Eles não escapam para fora das células, e, por conseguinte, se o branqueamento é evitada, medições raciométrica prolongados e fiáveis ​​são possíveis. Tipo seletivo celular expressão de Ca2 ⁺ biossensores, quando combinado com a microscopia de dois fótons, representa uma poderosa ferramenta para avaliar e estudar subcelular Ca ²⁺ em condições fisiológicas, em grande parte ^13,16,17 2+ dinâmica em um transgênico Ca ²⁺ linha biossensor rato (HR2.1: TN-XL), que expressa a baseada em FRET Ca2 ⁺ biossensor TN-XL ¹⁸ seletivamente em cones, sob a opsina humano vermelho promotor HR2.1 ^19. Para acessar os terminais de cone, uma preparação fatia ex-vivo ²⁰ foi empregado. O protocolo já foi utilizado com sucesso em três estudos sobre a função cone em ratos saudáveis ^{​​10,21,22.} Além disso, o protocolo permite estudar cone de sinalização de Ca2 ⁺ em condições genéticas específicas, por exemplo, cruzando modelos de ratos para a degeneração da retina hereditária com HR2.1: ratos TN-XL.

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram realizados aderindo às diretrizes e leis para protecção dos animais determinados pelo Governo Federal alemão e aprovados pelo comitê de bem-estar animal institucional da Universidade de Tübingen.

1. Modelos Animais

1. HR2.1: TN-XL Ca ²⁺ rato biosensor
   1. Use a HR2.1 transgênico: Linha do mouse TN-XL expressando o Ca ²⁺ biossensor TN-XL seletivamente em cones fotorreceptores ^10. Use 3-6 semanas de idade ratos de ambos os sexos levantado com um 12 horas ritmo dia / noite padrão.

2. Retinal Dissection

1. Solução fisiológica
   1. Preparar de fresco de 2 L de solução extracelular, contendo NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, _MgCl2 1 mM, 1,25 mM NaH ₂ PO _4, NaHCO ₃ 26 mM, 0,5 mM de L-glutamina, e 20 mM de (+) glicose. Misturar até dissolver todos os ingredientes.
   2. Solução extracelular "Bubble"com carboxygen (95% _{de O2,} 5% _CO2) durante 5-10 min. Adicionar _CaCl2 para atingir uma concentração de 2 mM.
   3. Depois borbulhando a solução extracelular, medir o seu pH. O pH deve ser 7,4, de outra forma, é provável que foram cometidos erros durante a preparação da solução. Mantenha a taxa de borbulhamento e temperatura constante durante todo solução experimento para assegurar o pH constante.
   4. Separe o estoque em dois frascos, um para dissecção retina e um para a configuração de gravação (perfusão).
2. Enucleação do olho e isolamento de retina (5-10 min)
   1. Manter uma iluminação vermelha fraca na área de trabalho para enucleação. Use LEDs com um comprimento de onda máximo de 650 nm (ou mais) para evitar o branqueamento de cones durante a dissecção.
   2. Dark-se adaptar o mouse durante 2 horas, colocando sua gaiola em um local bem ventilado, caixa à prova de luz para garantir que os cones são totalmente sensibilizado em vez de gravações.
   3. Anestesiar o mouse sob um laboratóry capa com isoflurano (5%), utilizando um vaporizador e um recipiente estanque ao gás que contém uma gaiola de rato padrão. Siga cuidadosamente as instruções do fabricante ao manusear o vaporizador. Use luvas e máscara facial para reduzir a exposição aos alérgenos.
   4. Use um microscópio binocular com um 10 - aumento de 40 vezes para dissecção.
   5. Sacrifique o rato anestesiado por decapitação.
   6. Para orientação, marcar a parte superior de cada olho (= dorsal) com uma caneta à prova d'água. Mantenha o controle sobre se usando olho esquerdo ou direito.
   7. Remover o olho usando cuidadosamente tesoura curva, cortando o nervo óptico por trás do globo ocular. Para dissecção, transferir o globo ocular de uma placa de Petri contendo solução extracelular recém carboxygenated. Para transferir o globo ocular, segure-o pela coto do nervo óptico.
   8. Perfurar o olho em qualquer ponto ao longo da fronteira entre a córnea e a esclerótica (isto é, na ora serrata) com uma agulha de injecção afiada.
   9. Segure o eYE na esclerótica com um par de pinças e suavemente inserir uma lâmina tesoura no furo feito na etapa anterior. Corte ao longo da ora serrata para separar a parte anterior do olho (córnea, cristalino, humor vítreo) a partir da parte posterior (ocular). Cortar a ocular radialmente (em relação ao disco óptico) com a posição da marca de caneta para indicar a posição dorsal sobre a retina.
      Nota: Preparado dessa forma, as viseiras podem ser mantidos em solução constantemente carboxygenated para uso posterior.
   10. Gire a ocular na placa de Petri de tal forma que o dorsal cortar pontos longe de si mesmo. Agarrar a esclerótica no lado esquerdo e o lado direito da ocular com um par de pinças, inserindo cada uma das pontas fórceps entre retina e esclera.
   11. Descolar a retina, invertendo suavemente a parte escleral da ocular. Finalmente, o corte do nervo óptico utilizando micro tesouras de dissecação para libertar a retina a partir da esclera.
       Nota: Esta é uma etapa crítica. Evitar danos na retina (por exemplo, pelatocar e apertando-o com fórceps).
   12. Segurar uma das bordas da retina com um par de pinças e suavemente remover detritos e do corpo vítreo a partir da superfície da retina, através de um segundo par de fórceps. Quando a superfície da retina é limpo, use micro dissecação tesoura para fazer três mais curtos, cortes radiais adicionais (aproximadamente a cada 90 °). Estes cortes permitem achatar cuidadosamente a retina com o lado voltado para baixo de fotorreceptores na caixa de Petri (Figura 1A).
3. Preparação fatia (10 - 15 min)
   1. Prepare de antemão membranas filtrantes de nitrocelulose para retinianas de corte e de vidro capa-deslizes para a montagem fatias e transferi-las para a câmara de gravação. Corte membrana de filtro de nitrocelulose em aproximadamente 10 x 5 milímetros pedaços retangulares de tamanho usando uma tesoura. Cortar lamelas em pedaços rectangulares de aproximadamente 10 x 5 milímetros de tamanho, utilizando uma glasscutter.
   2. Lentamente, mergulhe uma lâmina de vidro na solução extracelular pertotecido. Gentilmente, puxar a retina para a lâmina de vidro com o lado da célula ganglionar-se, agarrando-o bem na borda usando um par de fórceps. Este processo reduz danos mecânicos e dobragem de tecido.
   3. Escolha da região da retina que está relacionada com a respectiva questão de pesquisa (ver também a discussão). Lembre-se, a longo corte feito na etapa 2.2.9 marca a metade da retina dorsal (Figura 1A). Cortar uma, cerca de 1 x 2 milímetros pedaço rectangular de tamanho para fora da região da retina seleccionada usando uma lâmina de bisturi curvo. Limpe o excesso de solução em torno do tecido.
   4. Coloque a membrana de filtro na parte superior da peça de retina de modo a que o lado das células do gânglio adere à membrana. Imediatamente, adicionar uma gota de meio extracelular na membrana para prender firmemente o tecido para a membrana.
   5. Transferir o tecido da retina montada na membrana para a câmara de corte contendo solução extracelular fresco.
   6. Cortar retina em fatias verticais de 200 uMespessura (Figura 1B), utilizando uma lâmina de barbear fresco ligada a um cortador de tecido ^23. Mudar lâmina para cada peça da retina.
      Nota: A lâmina tem de ser perfeitamente alinhado com a superfície do fundo da câmara de corte de tal modo que toda a membrana divide simultaneamente, tal como indicado por um "clique" som ao cortar - caso contrário a lâmina pode dobrar e danificar a fatia.
   7. Cole uma fatia montado na membrana única em uma tampa de deslizamento de vidro através da aplicação de alta graxa de vácuo para a membrana só termina (Figura 1C). Mantenha a superfície de vidro abaixo da retina sem gordura.
   8. Mantenha-fatias montado lamela cobertos por uma gota de solução extracelular na câmara de retenção - um recipiente fechado e à prova de luz, por exemplo, um prato de Petri com a tampa coberta com folha de alumínio - sob uma atmosfera de carboxygen à TA. Introduzir carboxygen borbulhando um pequeno reservatório de água para manter a atmosfera na exploraçãocâmara úmida; isto evita que as fatias de secar.
   9. Permitir fatias para descansar na câmara de retenção de 10 - 15 minutos antes de movê-los (um a um), para a câmara de registo. As fatias podem ser mantidas até 4-5 horas na câmara de retenção à TA (~ 21 ° C).

3. Dois fótons Ca ²⁺ Imagiologia

1. Microscopia de dois fótons
   1. Use um microscópio Objetivo Movable (MOM) -tipo de dois fótons microscópio. Ambos os procedimentos de projeto e de imagem MOM foram descritos anteriormente ^24, para mais detalhes veja também ^10,21,25 (por fontes e empresas, ver Tabela ^1).
      Nota: Qualquer microscópio de dois fotões vertical que cumpre os seguintes requisitos mínimos podem ser usados: Tem que ser equipada com (a) um laser pulsado ajustável para ~ 860 nm, (b) um mínimo de dois canais de fluorescência adquiridos em simultâneo, (c ) Filtros para ECFP e citrino fluorescência, (d)um estimulador de luz (para possíveis projetos, ver ^24,26), e (e) um software que permite gravar seqüências de imagens em tempo decorrido em uma taxa de quadros suficientes para resolver o Ca ²⁺ sinais de interesse.
   2. Iniciar o sistema de imagem de dois fotões, tal como indicado pelo fabricante. Siga rigorosamente as diretrizes de segurança a laser da instalação. Comece a laser e ajustá-lo para ~ 860 nm.
   3. Transferir uma fatia da câmara de retenção para a câmara de gravação e começar imediatamente a perfusão com solução extracelular carboxygenated. Manter uma taxa de fluxo de perfusão de 2 ml / min e uma temperatura de 37 ° C na câmara de gravação.
   4. Use uma NA objetivo de imersão em água 20X 0,95. Se disponíveis, utilizar uma câmara de CCD, em combinação com uma câmara de registo abaixo LED infra-vermelho para localizar a fatia da retina (Figura 2). Caso contrário localizar fatia usando a imagem latente de dois fótons (ver 3.1.5).
   5. Mudar para a imagem de dois fótons para ver expressão biossensor. Ligaros dois canais de detecção de imagens de fluorescência de ECFP e citrino.
   6. Use o software de aquisição de imagem que controla o microscópio de dois fótons para digitalizar e selecionar uma linha de terminais de cone para a gravação (Figura 3A). Conjunto de aquisição de imagem a 128 x 16 imagens de pixel (31,25 Hz) ou uma configuração similar. Restringir a área digitalizada para terminais de cone para evitar o branqueamento de photopigments em segmentos externos.
      Nota: Para o sensor TN-XL cálcio (τ = ~ 0,6 seg para Ca ²⁺ vinculativo, τ = ~ 0,2 seg para Ca ²⁺ unbinding, ver ¹⁶⁾ a taxa de quadros mínima de 8 ~ Hz é recomendado.
2. Estimulação luminosa e gravação
   1. Use um sub-stage-campo cheio de luz estimulador como descrito em outros lugares ^10,21,26 para executar as seguintes etapas.
      Nota: Uma solução simples para um estimulador luz de campo total é usar dois LEDs band-pass-filtradas (por exemplo, "azul": 360 BP 12, "verde": 578 BP 10)que corresponde as sensibilidades de comprimento de onda de cones de ratinho, mas ao mesmo tempo não se sobrepõem com os filtros utilizados para a detecção de fluorescência (cf 3.2.4.). A luz proveniente dos LED é focada pelo condensador através da parte inferior da câmara de registo (Figura 2). Para mais detalhes sobre este projeto estimulador, a sua calibração, as intensidades de luz utilizada e as taxas de cone de foto-isomerização evocadas, ver ^10,21,26.
   2. Ligue o laser e permitem cones para adaptar-se ao varrimento a laser e a luz de estímulo fundo (20 - 30 segundos, ver também Armadilhas Potenciais) antes de apresentar estímulos luminosos (ver 3.2.3) ou a aplicação de agentes farmacológicos.
   3. Iniciar a apresentação de estímulos arbitrários (por exemplo, ondas de luz, como mostrado na Figura 3B, C). No caso de o estimulador descrito no passo 3.2.1, gerar os estímulos através da modulação da intensidade dos dois LEDs ao longo do tempo usando uma placa de microprocessador controlado por software personalizado (pordetalhes, ver ^10,21,26).
   4. Comece a gravar os dois canais de fluorescência (por exemplo, em 483 nm para "blue" FRET-doador ECFP e a 535 nm para "amarelo" FRET-receptor;. Para especificações ver Tabela 1), simultaneamente utilizando o respectivo software de aquisição de imagem (ver também 3.1 0,6). Por exemplo, no caso de flashes de luz (Figura 3B, C), ficha de pelo menos 8 - 10 apresentações de estímulo (ensaios).
3. Ca ²⁺ calibração "In-slice"
   1. Ficha de Ca2 ⁺ sinais nos terminais de cone (como descrito em 3.1.6 e 3.2.4) e extrair a linha de base do nível de Ca2 ⁺ em um conjunto de cones (como descrito em 3.4).
   2. Mudar para "Ca ²⁺ livre" meio extracelular com 5 ionomicina? M (dissolvido em DMSO) e EGTA 10 mM (ou, alternativamente, BAPTA) acrescentou. Terminais da ficha cone de novo a cada 5 minutos para determinar a proporção de fluorescência mínima (R _min), <em> isto é, o ratio no (próximo) ausência de Ca2 ⁺ intracelular. Isso pode demorar entre 15-30 min.
      Nota: Um sistema de perfusão é necessário que permite a comutação entre diferentes reservatórios.
   3. Mudar para meio extracelular com 5 ionomicina? M (dissolvido em DMSO) e Ca ²⁺ 2,5 mM. Após um tempo de incubação de 5 min, cones de ficha de novo a cada 5 minutos para medir a proporção de fluorescência máxima (R _máx), ou seja, a proporção, na presença de concentrações saturantes de Ca2 ⁺ intracelular. Após a aplicação ionomicina, pode demorar entre 3 - 15 min para a relação Ca ²⁺ para se tornar estável.
      Nota: Expor as fatias de alta Ca ²⁺ e ionomicina durante um período mais longo, eventualmente danificar as células. Inclua apenas as células na análise que mantêm a sua morfologia normal. Concentrações (ou seja, EGTA, ionomicina) pode precisar de ser adaptado. Para mais detalhes sobre a calibragem Ca ²⁺protocolo, consulte ^13,17.
4. Análise de dados
   Nota: Use um pacote de software de processamento de imagem e análise de dados compatível com o respectivo software microscópio e capaz de executar scripts de análise personalizadas.
   1. Carregar um ficheiro de dados de imagem e desenhar regiões de interesse (ROI) em torno de cada terminal de cone (Figura 3A). Para cada trama, a intensidade média de fluorescência dentro da ROI e subtrair a fluorescência de fundo, antes de calcular a relação (r) entre aceitador FRET (citrino) e do dador (ECFP) fluorescência (R = F _A / _D M; Figura 3B, C). Este rácio é normalmente usado como um proxy para o parente concentração intracelular de Ca2 ^+, mas após a calibração (ver 3.3), também concentrações absolutas pode ser estimado (ver 3.4.3).
      Nota: Os pedículos pode ser reconhecido pela sua localização na camada plexiforme externa e a sua morfologia (um tanto achatada "bolhas" menor do que o conesomata, localizado na extremidade do cone axonal).
   2. Média de ensaios de estímulo (Figura 4A). Extrair parâmetros de resposta a partir de vestígios médios (Figura 4B), tais como Ca ²⁺ nível da linha de base _{(base de} P) antes da estimulação com luz, a amplitude de pico _(Ampr), e área sob a curva (R _A) tal como medidas de tamanho de resposta. Além disso, extrai-se a cinética de resposta a partir de vestígios em média, tais como aumento de resposta (t _origem) e tempo de decaimento (t _decaimento) (= respectivos intervalos de tempo entre 20% e 80% de R _amp; ver ilustração na Figura 4B). Para mais detalhes sobre como determinar esses parâmetros, consulte ^10.
   3. Calcular uma estimativa do cone absoluta concentração de Ca2 ⁺ com base nas medições de passos 3.3.1-3.3.3. Use as proporções para mínima e máxima concentração de Ca2 ^+, R _min e _Rmax, respectivamente, a fluorescência do dador no Ca ²⁺ D, Ca-ligado) e -unbound (F _{D, Ca-livre)} estado, bem como in vivo a constante de dissociação (K _d = 0,77, ver ¹⁶⁾ para TN-XL com a seguinte equação (analógico a ^27):

Representative Results

Ao combinar fatias verticais (Figura 1) preparada a partir de HR2.1: TN-XL do mouse retina com a imagem de dois fótons (Figura 2), fomos capazes de realizar medições raciométrica de luz Ca2 ⁺ sinais evocadas por estímulo em terminais do axônio cone fotorreceptoras . Esta abordagem representa uma melhoria significativa no acesso e visualização de cones do mouse sobre os métodos de imagem óptica pré-existentes com sintéticos de Ca2 ⁺ indicadores. Por exemplo, a expressão específica de cone do Ca raciométrica geneticamente codificado ²⁺ biossensor TN-XL facilitou grandemente a identificação de terminais de axónios cone (ROIs ver na Figura 3A). Portanto, o nosso protocolo elimina o risco de sinais de gravação de origem obscura, como por exemplo sinais "mistos", com contribuições de ambos os cone e rod axônio terminais.

Nossa abordagem permite resolver as respostas de um único julgamento no nível do indiviterminal de duplo cone axônio. Extrusão claro evocada de Ca2 ⁺ a partir do terminal do cone é marcado por um aumento e uma diminuição da fluorescência de dador e aceitador, respectivamente (Figura 3B). Diminuição da taxa de fluorescência (I) corresponde a extrusão de Ca2 ⁺ a partir do terminal do cone (Figura 3C), causada pela hiperpolarização induzida pela luz do cone e subsequente fecho de canais de Ca2 ⁺ dependentes da voltagem. Porque vários terminais cone axônio pode ser monitorada simultaneamente (Figura 3A), aquisição de dados é muito eficiente e centenas de respostas cone de Ca ²⁺ pode ser recolhida em um único experimento. Ao avaliar quantitativamente estas respostas (Figura 4), ​​do cone de Ca2 ⁺ sinais podem ser comparados e avaliados numa gama de condições (ver discussão).

É muitas vezes suficiente usar a razão entre aceitador FRET (citrino) e -donor (ECFP) fluorescência(F _A / F _D; para detalhes, ver 3.4) como uma medida relativa do nível intracelular de Ca2 ^+. No entanto, sempre que necessário, a proporção pode ser calibrado para obter concentrações intracelulares de Ca2 ⁺ absolutas ([Ca ^2+]) (Figura 5). Na iluminação de fundo usado neste protocolo (para detalhes, ver ¹⁰ e Figura 3 lenda), calibração produziu uma estimativa para o descanso absoluto [Ca ^2+] em "wild-type" HR2.1: TN-XL terminais rato cone de 243 ± 159 nM (média ± DP), que está dentro do intervalo referido para os ratos na literatura ^11.

Figura 1. Preparação de fatias verticais da retina. (A) isolado e achatados retina preparado para cortar. (B) pedaço retangular de retina (see caixa vermelha em A) montado na membrana de papel de filtro (cinza escuro) após o corte. (C) Vista de cima da fatia da retina montado na membrana fixos em uma lamela de vidro com massa. (D) Desenho esquemático de uma parte de uma fatia da retina (ver caixa vermelha C). Cones fotorreceptores são indicados em verde. V ventral; D, dorsal; N, nasal; T, temporais; OS, segmento exterior; ONL, camada nuclear exterior; OPL, camada plexiforme externa; INL, camada nuclear interna; IPL, camada plexiforme interna; GCL, camada de células ganglionares. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Dois fótons de imagem de fatias da retina: Ilustração da configuração de gravação Top:. Água-imersão lente objetiva focar a seram do laser de varredura (seta para baixo vermelho) na retina, e recolher a fluorescência emitida (setas para cima). A lente também recolhe a luz infravermelha transmitida a partir de um diodo emissor de luz montado por baixo do condensador na obtenção de imagens da fatia utilizando uma câmara CCD Centro:.. Fatia da retina montada na câmara de gravação e perfundidos com solução extracelular inferior: Condensador lente de focagem a luz proveniente dos LED de estimulação (eo LED infravermelho para geração de imagens da câmera CCD) através do fundo transparente da câmara de gravação para o tecido da retina. LED IR, infravermelho diodo emissor de luz; CCD, um dispositivo de acoplamento de carga; BP, passa-banda. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Light-de evocarrespostas d Ca ²⁺ em terminais do axônio de fotorreceptores rato cone. (A) Esquerda: Recordings focados em terminais sinápticos (caixa vermelha) de cones fotorreceptores (verde) em fatias da retina direita:. Exemplo para uma região gravada com sete terminais individuais. A fluorescência foi registada usando dois canais:. Um para o citrino FRET-receptor (parte superior; 535 BP 50) e um para o doador FRET-ECFP (inferior; 480 BP 32) (B) mudanças de luz evocada em citrino (F _A) ECFP e (F _D) fluorescência registados num único ROI. respostas (C) de Ca ²⁺ (como razão F _A / _D F) de um terminal de cone para uma série de 1 seg flashes de luz brilhante na intervalos de 5 seg. ROI, região de interesse; BP, filtro passa-banda; F, a intensidade de fluorescência; au, unidades arbitrárias; FRET, Förster transferência de energia de ressonância; ECFP, reforçada proteína fluorescente ciano. Intensidade do estímulo (como ptaxa hoto-isomerização em 10 ³ · P · s ^-1 por cone):. 13,0 e 12,8 por M e S-opsinas, respectivamente, adicionando em um nível de fundo (= LEDs fora, varredura a laser de excitação) de ~ 10 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. análise quantitativa Exemplar de cone de luz evocada Ca ²⁺ respostas (A) Luz evocadas Ca ²⁺ respostas (como ΔR) de um único terminal de cone (ensaios individuais: traços de cinza, n = 16; média:. Traço preto ) (b) Parâmetros determinado para a média de Ca ²⁺ resposta:. de descanso nível de Ca2 ⁺ _(base R) que representa a linha de base antes da estimulação luz, tamanho de resposta como AREA-sob-a-curva _(RA) e amplitude de pico _(Ampr), cinética de aparecimento de resposta (t _origem, intervalo de tempo de 20% a 80% de R _AMP) e deslocamento (t _decaimento, intervalo de tempo de 80% a 20% dos R _amp). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Estimativa de absoluta concentração de Ca2 ^+. Descansar concentração de Ca2 ⁺ ([Ca2 ^+], como a relação F _A / _D F) registrado em terminais do axônio 8 cone em um mouse TN-XL (círculos, com média ± SD) para soluções extracelulares diferentes: duas vezes em meio extracelular padrão Ctrl (1 e 2), em seguida, com o mínimo ("zero") [Ca2 ^+] (10 mM de EGTA) umd com alta [Ca ^2+] (2,5 mM), as duas últimas condições, na presença de 5 mM ionomicina para equilibrar Ca ²⁺ extracelular e intracelular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Protocolos pré-existentes usando gravações unicelulares eletrofisiológicos ou Ca ²⁺ imagem com indicadores sintéticos fluorescentes lutam para gravar as Ca2 ⁺ dinâmica no rato cones fotorreceptores para um número de razões técnicas (ver Introdução). O protocolo aqui descrito permite a medição de sinais de Ca2 ⁺ e até absolutos níveis de Ca ²⁺ em terminais, identificadas rato cone individuais de uma forma eficiente e relativamente simples.

Este protocolo já foi utilizado com sucesso em três estudos abordando diferentes aspectos da função cone na retina saudável mouse. No primeiro estudo ^10, o HR2.1: rato TN-XL foi caracterizado usando imuno-histoquímica, registos de ERG, dois fotões Ca ²⁺ de imagem, e farmacologia, que mostra que a expressão específica de cone do Ca ²⁺ biossensor não entrave cone anatomia e função. No segundo estudo, ^21, cromáticoe propriedades de resposta acromáticas de cones de rato foram mapeados em toda a retina, demonstrando diferenças marcantes em função de cone entre a dorsal "verde" dominado pelos opsina eo "azul" ventral retina do rato-dominado opsina. Estas diferenças regionais nas propriedades cone combinando a distribuição do contraste diferencial no ambiente natural (isto é, contra o céu do solo), o que sugere que os diferentes tipos de cones espectrais do rato para proporcionar (próximo) de amostragem óptima de contrastes acromáticos e, assim, podem oferecer um vantagem evolutiva. No terceiro estudo ²² o feedback recíproco que os terminais de axónios cone receber a partir de células horizontais foi investigada. Como todos os mecanismos de feedback célula horizontal propostas agir em voltagem dependentes canais de Ca2 ⁺ nos terminais cone axônio ^28, terminal de cone de Ca ²⁺ pode servir como um proxy em interações horizontais célula-cone. O estudo de Kemmler e colaboradores ²² apoiosa visão de que células horizontais utilizar um sistema de feedback complexo constituído por vários mecanismos para controlar a liberação de glutamato fotorreceptor.

Esses estudos ilustram a versatilidade do protocolo descrito e mostram que pode ser adaptada a uma vasta gama de questões relacionadas função dos cones e dos seus circuitos sinápticos. Além disso, o protocolo permite estudar locais de sinalização de Ca2 ⁺ nos diferentes compartimentos de cone, para uma melhor compreensão da fisiologia cone. Tal conhecimento é importante para compreender os processos fisiopatológicos em cones degeneração, para, eventualmente, permitir o desenvolvimento racional de potenciais abordagens terapêuticas, em especial para doenças degenerativas que afetam cones.

No HR2.1: linha rato TN-XL, o Ca ²⁺ biossensor é expressa ao longo do cone, com a excepção de o segmento exterior. Isso fornece uma oportunidade para avaliação direta e ratiometric de Ca ²⁺ dinâmicas em diferentes compartimentos do cone. Dado que alterações no Ca2 ⁺ correntes no segmento exterior são reflectidas em terminais via o potencial de membrana e a resultante activação de canais de Ca2 ⁺ dependentes da voltagem, os processos no segmento exterior pode ser observada indirectamente.

Armadilhas potenciais:

A dissecção da retina é uma etapa crítica: No rato, a retina se separa da ocular geralmente entre segmentos externos de fotorreceptores e epitélio pigmentado. Portanto, os fotorreceptores sensível à luz segmentos exteriores da retina isolada estão expostos e extremamente sensível a danos mecânicos. Grande cuidado deve ser tomado para não danificar tocando lado do fotorreceptor com ferramentas ou movendo o tecido de lado sobre uma superfície adesiva (por exemplo, uma membrana de filtro).

Fatias da retina de alta qualidade pode ser reconhecido sob o microscópio por sua superfície de corte limpo epor uma camada de fotorreceptores bem organizado, com segmentos externos claramente definidos. A avaliação funcional de qualidade fatia pode ser feita rapidamente através do escoamento estímulos luminosos brilhantes e determinando a percentagem de cones responsivos (por exemplo, em um campo de visão com 10 - 20 cones). Aqui, a qualidade da resposta deve ser avaliado por meio do cálculo da razão sinal-para-ruído (S / N) (amplitude do ruído de linha de base antes do estímulo de luz versus amplitude da resposta de luz); A S / N de 2-3 deve ser considerado como o limite mínimo. Normalmente, descartamos fatias com menos de 50% cones responsivos. Também corta com cones que exibem comportamento spiking espontânea excessiva (ver Figura 4 em ¹⁰⁾ deve ser descartada.

Fatias na câmara de gravação que atendem aos critérios anatômicos e funcionais acima mencionados apresentam respostas consistentes para 1-2 hr (para obter detalhes sobre a consistência de resposta, consulte ^10). Porque fatias sobreviver por hnosso na câmara de retenção, uma experiência bem sucedida pode durar até 6 horas. Vale ressaltar que existem algumas restrições no que diz respeito ao estudo de longo-variando interações espaciais entre cones e células horizontais, como cortar inevitavelmente rompe conexões laterais em redes de retina. No entanto, o aumento da espessura das fatias da retina a 300 um melhora esta questão ^22.

O uso de fatias verticais da retina evita a sintonização dos segmentos exteriores do cone sensível à luz por o laser de excitação e, assim, em grande parte, evita branqueamento opsina (para discussão extensa, ver ^10,21). No entanto, os sinais gravados de Ca2 ⁺ não só dependem dos estímulos de luz, mas também ficar afectado por um componente de iluminação de fundo gerado pelo laser de excitação digitalização. Na verdade, a iluminação de fundo eficaz em tais experiências de imagiologia de dois fótons é uma combinação de luz laser dispersa, de luz fluorescente emitida pelo ce gravadolls, e qualquer componente de fundo LED estímulo. Portanto, cones devem ser autorizados a se adaptar por pelo menos 20 - 30 s para varrimento a laser (com o componente de fundo do estímulo de luz ligada) antes da gravação.

Vantagens e aplicações:

Enquanto algumas aplicações para este cone Ca ²⁺ protocolo -Imaging foram descritos acima ^10,21,22, outras aplicações podem ser imaginado: estudos farmacológicos em combinação com cone de Ca ²⁺ de imagem pode validar Ca ²⁺ vias de sinalização em cones e poderia ser usado para testar a eficácia ea potência dos fármacos dirigidos a diferentes jogadores em Ca ²⁺ -signaling ^10. No entanto, um aplicativo pode ser chave para estudar doenças que afetam a função cone. Muitos modelos da retina degeneração do rato que imitam doenças humanas estão disponíveis. Por exemplo, a perda de fotorreceptores cone 1 (CPFL 1) mouse é um cone principal modelo de degeneração sofrimentoa partir de uma mutação Pde6c ^29. Por outro lado, a haste de rato degeneração 1 (rd 1) sofre uma mutação Pde6b. Enquanto isso faz com que haste principal degeneração de fotorreceptores ^30, uma vez rd uma perda haste é concluída, conjuntos de cone degeneração secundária em ^1. O cruzamento desses animais com o HR2.1: Linha TN-XL permitirá estudar e comparar Ca2 ⁺ dinâmica, tanto primária e secundária cone degeneração e é susceptível de proporcionar insights valiosos sobre o papel dos Ca2 ⁺ durante a morte celular cone. Além disso, farmacologicamente induzido degeneração cone - por exemplo, o uso de inibidores seletivos EFD6 - pode servir para identificar os mecanismos a jusante do cone degeneração ^10,29,31.

Em resumo, o protocolo descrito aqui permite medir Ca ²⁺ em compartimentos subcelulares de fotorreceptores rato cone e apresenta grandes oportunidades para descobrir cone fisiologia sob uma ampla gamadas condições fisiológicas e fisiopatológicas. Além disso, este protocolo pode ser utilizado para o rastreio de agentes farmacológicos desenvolvidos para interferir com cone Ca ²⁺ -signaling e, assim, ajudar a estabelecer novas terapias para doenças cone.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High vacuum grease	Dow Corning	1018817	http://www.dowcorning.com
Cover slips	R. Langenbrinck		24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
Glass slides	R. Langenbrinck		76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Blades for tissue chopper	MARTOR KG	ARGENTAX No. 1044	0.25 mm; http://www.martor.de
Tissue chopper	Custom-build		Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert
Nitrocellulose filter membrane gridded	Merck Millipore	AABG01300	Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com
Isoflurane CP	CP pharma	AP/DRUGS/220/96	http://www.cp-pharma.de
UV/green LED-based full-field stimulator	Custom-build		for details, see10
Open source microprocessor board	Arduino		http://www.arduino.cc
Imaging software CfNT	Custom-written		developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany
IgorPro	Wavemetrics		http://www.wavemetrics.com
VC3-4 System focal perfusion system	ALA Scientific Instrument		with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)	Newport Spectra-Physics		http://www.spectra-physics.com
Movable objective microscope (MOM), Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany	Sutter Instruments		http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html

Name	Company	Catalog Number	Comments
XLUMPlanFL 20X/0.95w objective	Olympus		http://www.olympusamerica.com
Vaporizer 100 series	Surgivet		http://www.surgivet.com
Ionomycin, Calcium salt	Life technologies	I24222	http://www.lifetechnologies.com
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	https://www.sigmaaldrich.com
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	101191250	http://www.sigmaaldrich.com
Leica MZ95	leica microsystems		http://www.leica-microsystems.com/