Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Imaging Ca Published: May 6, 2015 doi: 10.3791/52588
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2,3, 4,5, 1,2,3, 1
1Institute for Ophthalmic Research, University of Tübingen, 2Graduate School of Cellular & Molecular Neuroscience, University of Tübingen, 3Bernstein Centre for Computational Neuroscience, University of Tübingen, 4Molecular Genetics Laboratory, University of Tübingen, 5Centre for Ophthalmology, University of Tübingen

Summary

Vi beskriver en protokoll for å overvåke Ca 2 + dynamikk i axon terminalene kjegle fotoreseptorer under anvendelse av en ex-vivo skive fremstilling av musen hinnen. Denne protokollen tillater omfattende studier av kjegle Ca 2+ signale i en viktig pattedyr modellsystem, musen.

Abstract

Retinal kjegle fotoreseptorer (koner) tjener dagslys visjon og er grunnlaget for fargediskriminering. De er underlagt degenerasjon, ofte fører til blindhet i mange netthinnesykdommer. Kalsium (Ca 2 +), en nøkkel andre budbringer i fotoreseptoren signalering og metabolisme, har blitt foreslått å være indirekte knyttet til fotoreseptoren degenerasjon i forskjellige dyremodeller. Systematisk å studere disse aspektene av kjegle fysiologi og patofysiologi er blitt hemmet av vanskelighetene med elektrisk innspilling fra disse små celler, spesielt i mus hvor netthinnen er dominert av stangfotoreseptorer. For å omgå dette problemet, etablerte vi en to-foton Ca 2+ bildebehandling protokollen ved hjelp av en transgen mus linje som uttrykker genetisk kodet Ca 2+ biosensor TN-XL utelukkende i kjegler og kan crossbred med musemodeller for fotoreseptoren degenerasjon. Protokollen er beskrevet her innebærer forbereder vertikale seksjoner (R20, skiver ") av netthinner fra mus og optisk avbildning av lys stimulus-fremkalt endringer i kjegle Ca 2+ nivå. Protokollen tillater også "in-skive måling" av absolutte Ca 2+ konsentrasjon; som opptakene kan følges ved kalibrering. Denne protokollen muliggjør studier av funksjonelle egenskaper konus og forventes å bidra til forståelsen av kjeglen Ca 2+ signalering, så vel som potensialet involvering av Ca 2+ i fotoreseptoren død og retinal degenerasjon.

Introduction

Vision begynner med lys-indusert aktivering av fototransduksjonskaskade i netthinnens fotoreseptorer. Rod fotoreseptorene tillate visjon ved lave lysnivåer, mens kjegle fotoreseptorene megle farger og høy oppløsning dagslys visjon. Mange fotoreseptorlidelser-spesifikke gener som er utsatt for mutasjoner som fører til degenerering av disse cellene. En rekke av molekylære markører assosiert med fotoreseptoren tap har blitt identifisert en, men så langt har de detaljerte molekylære mekanismer og hendelsesforløpet er fortsatt uklart. Altered Ca2 + homeostase ble spekulert å være en årsak til fotoreseptoren celledød, en hypotese støttes av opp-regulering av aktiviteten av Ca2 + -avhengige kalpain-type proteaser under degenerasjon prosessen 2,3. Men til dags dato, denne hypotesen ikke er støttet av fysiologiske målinger av Ca 2+. Uoverensstemmelser i flere studier på effekten av Ca 2+ kanalblokkere i retinal sykdommer ytterligere utfordret involvering av Ca 2+ i celledød 4-6, ringer etter metoder for å vurdere direkte Ca 2+ i pattedyr kjegle fotoreseptorer.

Tidligere har de fleste elektriske opptak og Ca 2+ imaging studier utført hos amfibier og krypdyr modeller på grunn av lettere tilgang til kjegler 7-9. Imidlertid kan pattedyrfotoreseptoren fysiologi være forskjellig fra det ikke-pattedyr, 10 og spesielt i sammenheng med menneske arvelig retinal degenerasjon, er en bedre forståelse av pattedyrfotoreseptoren fysiologi en nøkkel til utvikling av nye behandlinger. Mange musemodeller som etterligner menneskenetthinnesykdommer er tilgjengelig, men lite er kjent om Ca 2+ dynamikken i mus kjegler 11. Elektriske teknikker er ikke egnet for high-throughput opptak fra membranene, spesielt ikke i mus, hvor stenger (~ 97%) betydelig tallmessig kjegler (~ 3%) 12 2 + strøm, men ikke på absolutte intracellulære Ca 2 + konsentrasjoner. Derfor, til tross for den lavere tidsmessig oppløsning er avbildning metoden for valg ved adressering spørsmål om kjegle Ca 2 + dynamikk. Det avgjørende med bildebehandling er hvordan du selektivt merke kjegler med et fluorescerende Ca 2+ indikatorfarge. Riktig compartmentalization og celle spesifisitet er vanskelig å oppnå ved "bulk-loading" syntetisk Ca 2 + indikatorfarger i vevet. Som en konsekvens, merkede membranene, stenger 13,14, og Muller gliaceller ikke pålitelig skilles. Også, syntetiske fargestoffer tendens til å lekke ut av cellene, og hindrer langvarig opptakene under konsekvente forhold. Videre legger syntetiske Ca 2+ indikatorer i sine AM-ester form er problematisk, da det krever detergents (f.eks DMSO) og genererer formaldehyd 15. For absolutte Ca 2+ målinger, Proporsjonellekspansjon indikatorer er obligatoriske. Imidlertid krever den beste for tiden tilgjengelig syntetisk ratiometrisk indikator Fura-2 eksitasjonslys i området fra 700-760 nm (for to-foton eksitasjon), som, avhengig av intensiteten, kan i seg selv stimulere kjegler, og således vanskeliggjøre studier av kjegle Ca 2+ dynamikk under fysiologiske belysningsforhold.

I motsetning til syntetiske fargestoffer, kan genetisk kodede Ca 2 + indikatorer kan uttrykkes i en celletype-selektiv måte. De ikke lekke ut av cellene, og derfor, hvis bleking unngås, langvarig og pålitelige ratiometrisk måling er mulig. Celletype-selektiv ekspresjon av Ca 2 + biosensorer, når kombinert med to-foton mikroskopi, representerer et kraftig verktøy for å vurdere og studere subcellulær Ca 2+ i henhold til stort sett fysiologiske betingelser 13,16,17 2+ dynamikk i en transgen Ca 2+ biosensor muselinje (HR2.1: TN-XL), som uttrykker FRET baserte Ca 2+ biosensor TN-XL 18 selektivt i kjegler, under menneskelig rødt opsin promoter HR2.1 19. Du får tilgang til kjegle terminaler, ble en ex-vivo slice forberedelse 20 sysselsatte. Protokollen ble allerede brukt i tre studier på kjegle funksjon hos friske mus 10,21,22. Videre tillater protokollen studere membran Ca 2+ signalering i spesifikke genetiske forhold, for eksempel ved kryssing musemodeller for arvelig retinal degenerasjon med HR2.1: TN-XL mus.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble utført følger de retningslinjer og lover for dyrevern bestemmes av tyske føderale myndigheter og godkjent av institusjonelle dyrevelferd komité ved Universitetet i Tübingen.

1. dyremodeller

  1. HR2.1: TN-XL Ca 2+ biosensor mus
    1. Bruk den transgene HR2.1: TN-XL muse linje uttrykker Ca 2+ biosensor TN-XL selektivt i kjegle fotoreseptorene 10. Bruk 3-6 uker gamle mus av begge kjønn hevet med en standard 12 timer dag / natt rytme.

2. Retinal Dissection

  1. Fysiologisk løsning
    1. Forbered ferskt 2 L av ekstracellulær løsning, inneholdende 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,25 mM NaH 2PO 4, 26 mM NaHCO3, 0,5 mM L-glutamin og 20 mM (+) glukose. Bland til alle ingrediensene oppløses.
    2. "Bubble" ekstracellulært løsningmed carboxygen (95% O 2, 5% CO2) i 5 - 10 min. Legg CaCl2 for å oppnå en konsentrasjon på 2 mM.
    3. Etter å boble ekstracellulære løsningen, måle pH. PH-verdien bør være 7,4, ellers er det sannsynlig at feil er blitt gjort under fremstillingen av oppløsningen. Hold bobling hastighet og oppløsning temperatur konstant gjennom hele forsøket for å sikre konstant pH.
    4. Separer aksjen i to kolber, en for retina disseksjon og en for innspillingen setup (perfusjon).
  2. Eye enucleation og isolering av netthinnen (5 - 10 min)
    1. Opprettholde et svakt rødt lys i arbeidsområdet for enucleation. Bruk lysdioder med en topp bølgelengde på 650 nm (eller lenger) for å unngå bleking av kjegler under disseksjon.
    2. Mørk-tilpasse musen for to timer ved å sette buret inn i et godt ventilert, lystett boks for å sikre at kjeglene er fullt sensibilisert på tidspunktet for opptak.
    3. Bedøver musen under et laboratoriumry hette med isofluran (5%) ved anvendelse av en fordamper og en gasstett beholder som inneholder en standard muse bur. Følg produsentens anvisninger instruksjonene nøye når du håndterer fordamper. Bruk hansker og munnbind for å redusere eksponering for allergener.
    4. Bruk en kikkert mikroskop med en 10 - 40X forstørrelse for disseksjon.
    5. Ofre bedøvet musen ved halshogging.
    6. For orientering, markerer toppen av hvert øye (= rygg) med en vannfast penn. Hold styr på enten du bruker venstre eller høyre øye.
    7. Fjern øyet forsiktig med buede saks ved å kutte synsnerven bak øyeeplet. For disseksjon, overføre øyeeplet til en petriskål inneholder fersk carboxygenated ekstracellulært løsning. For overføring av øyeeplet, hold det synsnerven stubben.
    8. Pierce øye på noe punkt langs grensen mellom hornhinnen og sclera (dvs. ved ora serrata) med en skarp kanyle.
    9. Hold eye ved sclera med en pinsett og forsiktig inn en saks blad inn i hullet laget i det foregående trinn. Skjær langs ora serrata å skille fremre delen av øyet (hornhinnen, linsen, glasslegeme) fra bakre del (eyecup). Kutt eyecup radialt (mot den optiske plate) ved posisjonen av pennen merke for å indikere dorsal posisjon på netthinnen.
      Merk: Forberedt på denne måten, de eyecups kan holdes i konstant carboxygenated løsning for senere bruk.
    10. Vri øyemusling i petriskålen slik at rygg kuttet poeng unna seg selv. Grab sclera på venstre og høyre side av øyemusling med en pinsett hver ved å sette tang tips mellom netthinnen og sclera.
    11. Ta av netthinnen ved å forsiktig snu scleral del av eyecup. Endelig kutte synsnerven ved hjelp av mikro dissekere saks for å frigjøre netthinnen fra sclera.
      Merk: Dette er et kritisk punkt. Unngå skader på netthinnen (for eksempel vedrørende og klemme den med tang).
    12. Holder en av kantene på netthinnen med en pinsett og forsiktig fjerne rusk og glasslegeme fra retinal overflaten ved hjelp av et andre par tenger. Når retinal overflaten er ren, bruker micro dissekere saks for å lage ytterligere tre kortere, radial kutt (ca hver 90 °). Disse kuttene tillater en å nøye flate netthinnen med fotoreseptoren siden ned i petriskål (figur 1A).
  3. Slice forberedelse (10 - 15 min)
    1. Forberede seg på forhånd nitrocellulosen filtermembraner for retinal slicing og glass cover-slips for montering skiver og overføre dem til opptakskammeret. Skjær nitrocellulosefilter membranen inn ca 10 x 5 mm store rektangulære stykker med saks. Skjær Dekk inn ca 10 x 5 mm store rektangulære stykker ved hjelp av en glasscutter.
    2. Sakte fordype et glass lysbilde i ekstracellulære løsningen nærvev. Forsiktig, trekker netthinnen på glasset lysbilde med ganglion celle siden opp ved å ta tak i det i ytterkanten ved hjelp av en pinsett. Denne prosessen reduserer mekaniske skader og folding av vev.
    3. Velg det område av netthinnen som er relatert til den respektive problemstillingen (se også diskusjon). Husk at langt kutt gjort i trinn 2.2.9 markerer ryggnetthinnehalvparten (figur 1A). Skjær et rektangulært, ca 1 x 2 mm størrelse stykke ut av den valgte retinal regionen ved hjelp av en buet skalpell blad. Tørk av overflødig løsning rundt vevet.
    4. Plasser filteret membran på toppen av den del av netthinnen slik at ganglion cellen side fester seg til membranen. Umiddelbart, legg en dråpe ekstracellulært medium på membranen til fast feste vevet til membranen.
    5. Overfør den membran montert netthinnevev til kutting kammeret som inneholder frisk ekstracellulær løsning.
    6. Skjær retina i vertikale skiver av 200 mikrometertykkelse (figur 1B) ved å bruke en frisk barberblad festet til et vev chopper 23. Endre blad for hver retinal stykke.
      Merk: barberblad må være helt i flukt med overflaten av kutting kammerets bunn, slik at hele membranen deler samtidig, som angitt med en "klikke" lyd når kutte - ellers bladet kan bøyes og skade skive.
    7. Lim en enkelt membran montert skive til et glass cover-slip ved å bruke høyt vakuum fett på membranen ender bare (figur 1C). Hold glassoverflaten under netthinnen fritt for fett.
    8. Hold dekkmonterte skiver dekket av en dråpe ekstracellulært løsning i holdekammeret - et lukket og lystett beholder, f.eks en petriskål med lokk dekket med aluminiumsfolie - under en carboxygen atmosfære på RT. Introduser carboxygen ved bobling et lite vannreservoar for å holde stemningen i beholdningkammer fuktet; Dette hindrer skiver tørker ut.
    9. Tillat skiver liggende i holdekammeret i 10 - 15 min før flytter dem (en etter en) til opptakskammeret. Skiver kan opprettholdes opp til 4-5 timer i holdekammeret ved romtemperatur (~ 21 ° C).

3. To-foton Ca 2+ Imaging

  1. To-foton mikroskopi
    1. Bruk en Movable Mål Microscope (MOM) -type to-foton mikroskop. Både mor design og bildebehandling prosedyrer ble beskrevet tidligere 24, for mer informasjon se også 10,21,25 (etter kilder og selskaper, se tabell 1).
      Merk: Enhver oppreist to-foton mikroskop som oppfyller følgende minimale krav kan brukes: Det må være utstyrt med (a) en pulset laser avstembart til ~ 860 nm, (b) minst to samtidig ervervet fluorescens kanaler, (c ) filtrerer for eCFP og citrine fluorescens, (d)et lys stimulator (for mulige design, se 24,26), og (e) programvare som gjør at opptaket tidsbortfalt bildesekvenser på en bildefrekvens tilstrekkelig til å løse Ca 2 + signaler av interesse.
    2. Start to-foton bildesystem som angitt av produsenten. Strengt følge anleggets retningslinjer laser verne. Start laser og tune den til ~ 860 nm.
    3. Overfør et stykke fra holdekammeret til innspillingen kammeret og umiddelbart begynne perfusert med carboxygenated ekstracellulært løsning. Opprettholde en perfusjon strømningshastighet på 2 ml / min og en temperatur på 37 ° C i opptakskammeret.
    4. Bruk en 20X 0.95 NA nedsenking i vann objektiv. Hvis tilgjengelig, kan du bruke en CCD-kamera i kombinasjon med en infrarød LED under innspillingen kammer for å finne retinal skive (figur 2). Ellers finner skive med to-foton imaging (se 3.1.5).
    5. Bytt til to-foton bildebehandling for å vise biosensor uttrykk. Slå påde to deteksjons kanaler for fluorescens avbildning av eCFP og citrine.
    6. Bruke bildet oppkjøpet programvaren som styrer to-foton mikroskop for å skanne og velge en rad med membran terminaler for opptak (figur 3A). Set image oppkjøpet til 128 x 16 piksler (31,25 Hz) eller en lignende konfigurasjon. Begrense skannet område å kjegle terminaler for å unngå bleking av photopigments i ytre segmenter.
      Merk: For TN-XL kalsium sensor (τ = ~ 0,6 sek for Ca 2+ bindende, τ = ~ 0,2 sek for Ca 2+ uforpliktende, se 16) et minimum bildefrekvens på ~ 8 Hz anbefales.
  2. Lys stimulering og opptak
    1. Bruk en sub-trinns full feltet lys stimulator som beskrevet andre steder 10,21,26 å utføre følgende trinn.
      Merk: En enkel løsning for en full-feltet lys stimulator er å bruke to band-pass-filtrerte LEDs (for eksempel "blå": 360 BP 12, "grønn": 578 BP 10)som samsvarer med bølgelengde følsomheten til mus kjegler, men på samme tid ikke overlapper med filtrene som brukes for fluorescens deteksjon (jf. 3.2.4). Lyset fra lampene blir fokusert av kondensatoren gjennom bunnen av opptakskammeret (figur 2). For detaljer om dette stimulator design, sin kalibrering, lysintensitetene brukt og fremkalt kjegle foto isomeriseringsforhold priser, se 10,21,26.
    2. Slå på laseren og la kjegler til å tilpasse seg scanning laser og stimulans bakgrunnslys (20 - 30 sek, se også potensielle fallgruvene) før presentere lys stimuli (se 3.2.3) eller bruke farmakologiske midler.
    3. Begynn presentasjon av vilkårlige stimuli (f.eks lysglimt, slik som vist i figur 3B, C). I tilfelle av stimulatoren beskrevet i trinn 3.2.1, genererer stimuli ved modulering av intensiteten til de to lysdiodene over tid ved hjelp av en mikroprosessor brett styres av tilpasset programvare (fordetaljer, se 10,21,26).
    4. Start opptak de to fluorescens kanaler (for eksempel ved 483 nm for "blå" FRET-donor eCFP og ved 535 nm for "gul" FRET-akseptor,. For specs se tabell 1) samtidig med respektive image oppkjøpet programvare (se også 3.1 0,6). For eksempel, i tilfelle av lys blinker (figur 3B, C), ta opp minst 8-10 stimulans presentasjoner (forsøk).
  3. "In-slice" Ca 2+ kalibrering
    1. Record Ca 2+ signaler i kjegle terminalene (som beskrevet i 3.1.6 og 3.2.4) og avtrekksreferanse Ca 2+ nivå i et sett av kjegler (som beskrevet i 3.4).
    2. Bryteren til "Ca2 + fri" ekstracellulært medium med 5 uM ionomycin (oppløst i DMSO), og 10 mM EGTA (eller, alternativt, BAPTA) tilsatt. Record kjegle terminaler igjen hver 5 min for å bestemme den minimale fluorescens-forholdet (R min), <em> dvs. forholdet i (nær) fravær av intracellulær Ca 2+. Dette kan ta fra 15 til 30 min.
      Merk: En perfusjon system er nødvendig som gjør at du bytter mellom forskjellige reservoarer.
    3. Bytt til ekstracellulære medium med 5 mikrometer ionomycin (oppløst i DMSO) og 2,5 mM Ca 2+. Etter en inkubasjonstid på 5 min, ta opp kjegler igjen hvert 5. min for å måle maksimal fluorescens-forholdet (R max), dvs. forholdet i nærvær av mettende konsentrasjoner av intracellulær Ca2 +. Etter ionomycin søknad, kan det ta mellom 3-15 min for Ca 2+ forholdet til å bli stabil.
      Merk: eksponere skiver til høye Ca 2+ og ionomycin i en lengre periode vil til slutt ødelegge cellene. Omfatter bare celler i analysen som beholder sin normal morfologi. Konsentrasjoner (dvs. EGTA, ionomycin) kanskje må tilpasses. For mer informasjon om Ca 2+ kalibreringprotokollen, se 13,17.
  4. Dataanalyse
    Merk: Bruk et bildebehandlings og dataanalyse programvarepakke kompatibel med de respektive mikroskop programvare og i stand til å kjøre egendefinerte analyse skript.
    1. Legge en avbildning datafil og tegne regioner av interesse (Rois) rundt hver kjegle terminal (figur 3A). For hver ramme, gjennomsnittlig fluorescens intensitet innenfor ROI og trekke bakgrunnen fluorescens, før beregning av forholdet (R) mellom FRET-akseptor (citrin) og donor (eCFP) fluorescens (R = F A / F D; 3B, C). Dette forholdet er vanligvis brukt som en proxy for relativ intracellulær Ca 2+ konsentrasjon, men etter kalibrering (se 3.3), også absolutte konsentrasjoner kan anslås (se 3.4.3).
      Merk: pedicles kan bli gjenkjent av sin beliggenhet i ytre plexiform lag og deres morfologi (litt flat "blobs" mindre enn kjeglensomata, som ligger ved enden av kjeglen axon).
    2. Gjennomsnittlig stimulanse studier (Figur 4A). Ekstraher responsparametre fra gjennomsnittlige spor (figur 4B), som for eksempel Ca2 + basalnivået (R basen) før lys stimulering, toppamplitude (R amp), og arealet under kurven (Ra) som tiltak for reaksjon størrelse. Også, trekke responskinetikk fra gjennomsnittlige spor, slik som respons stige (t stige) og nedbrytningstiden (t decay) (= respektive tidsintervaller mellom 20% og 80% av R amp, se illustrasjonen i figur 4B). For mer informasjon om hvordan du finner disse parametrene, se 10.
    3. Beregne et estimat for absolutt membran Ca 2+ konsentrasjon basert på målingene fra trinn 3.3.1-3.3.3. Bruk forholdstall for minimal og maksimal Ca 2+ konsentrasjon, R og R max min, henholdsvis, den giver fluorescens i Ca 2+ D, Ca-bundet) og -unbound (F D, Ca-fri) tilstand, så vel som in vivo dissosiasjonskonstant (Kd = 0.77, se 16) for TN-XL med den følge ligning (analog til 27):

Ligning 1

Representative Results

Ved å kombinere vertikale skiver (figur 1) fremstilt fra HR2.1: TN-XL muse retina med to-foton imaging (figur 2), var vi i stand til å utføre Proporsjonellekspansjon målinger av lys stimulans-fremkalt Ca 2+ signaler i kjegle fotoreseptorlidelser axon terminaler . Denne tilnærmingen representerer en betydelig bedring i tilgang til og visualisere muse kjegler over eksisterende optiske avbildningsmetoder med syntetiske Ca 2+ indikatorer. For eksempel, den kjegle-spesifikke ekspresjon av den genetisk kodede ratiometrisk Ca 2+ biosensor TN-XL mye lettere identifisering av kjeglen axon klemmene (se ROIs i figur 3A). Derfor eliminerer vår protokoll risikoen for opptak signaler om uklar opprinnelse, som for eksempel "blandede" signaler med bidrag fra både kjegle og stang axon terminaler.

Vår tilnærming tillater å løse enkeltprøve responser på nivået av den indidual cone axon terminalen. Lys-fremkalt ekstrudering av Ca2 + fra kjeglen terminalen er merket med en økning og en reduksjon i donor og akseptor-fluorescens, respektivt (figur 3B). Nedgang i fluorescens-forholdet (R) svarer til ekstrudering av Ca2 + fra kjeglen terminal (figur 3C), forårsaket av lys-induserte hyperpolarisering av membranen og etterfølgende lukking av spenningsstyrte Ca2 + kanaler. Fordi flere kjegle axon terminaler kan overvåkes samtidig (figur 3A), er meget effektiv datainnsamling og hundrevis av kjeglen Ca 2 + responser kan bli samlet i et enkelt eksperiment. Ved å vurdere disse reaksjonene kvantitativt (figur 4), kan kjegle Ca 2 + signalene bli sammenlignet og undersøkt i en rekke (se diskusjon).

Det er ofte tilstrekkelig til å bruke forholdet mellom FRET-akseptor (citrin) og -donor (eCFP) fluorescens(F A / S D, for detaljer, se 3.4) som et relativt mål på den intracellulære Ca2 + nivå. Likevel, når det er nødvendig, kan forholdet være kalibrert for å oppnå absolutt intracellulære Ca2 + konsentrasjoner ([Ca2 +]) (figur 5). På bakgrunn belysning brukes i denne protokollen (for detaljer, se 10 og figur 3 legende), kalibrering ga et estimat for absolutt hvile [Ca 2+] i "wild-type" HR2.1: TN-XL mus kjegle terminalene 243 ± 159 nM (gjennomsnitt ± SD), som er innenfor området for mus rapportert i litteraturen 11.

Figur 1
Figur 1. Utarbeidelse av vertikale retinal skiver. (A) Isolert og flatet retina forberedt for slicing. (B) Rectangular stykke retina (see rød boks i A) montert på filterpapir membran (mørk grå) etter kutting. (C) sett ovenfra av membranmonterte retinal skive festet på et glass dekkglass med fett. (D) Skjematisk tegning av en del av en retinal skive (se rød boks i C). Cone fotoreseptorene er angitt i grønt. V, ventral; D, rygg; N, nasal; T, tidsmessig; OS, ytre segment; Onl, ytre kjernefysisk lag; OPL, ytre plexiform laget; INL, indre kjerne laget; IPL, indre plexiform laget; GCL, ganglion celle laget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. To-foton avbildning av netthinnens skiver: Illustrasjon av opptaket konfigurasjon Top:. Vann-nedsenking objektiv fokusere væreer av den avsøkende laser (rød pil nedover) i netthinnen, og oppsamling av den utsendte fluorescensen (oppadrettede piler). Linsen innsamler også overført infrarødt lys fra en LED-belysnings montert under kondensatoren Ved avbildning stykket ved hjelp av et CCD-kamera Center:.. Retinal skive montert i opptakskammeret og perfusert med ekstracellulær løsning Bunn: Kondensator linse som fokuserer lyset fra stimulerings lysdioder (og den infrarøde lysdioden for CCD-kamera imaging) gjennom det gjennomsiktige bunnen av opptakskammeret og inn i netthinnevev. IR LED, infrarød lysdiode; CCD, CCD; BP, band-pass. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Lys-Evoked Ca 2+ svar i axon terminaler av mus kjegle fotoreseptorene. (A) Venstre: Recordings fokusert på synaptiske terminaler (rød boks) av kjegle fotoreseptorer (grønn) i netthinnens skiver Høyre:. Eksempel på en innspilt region med 7 individuelle terminaler. Fluorescens ble registrert ved hjelp av to kanaler:. En for FRET-akseptor Citrin (topp, 535 BP 50) og en for FRET-donor eCFP (nederst; 480 BP 32) (B) Lys-fremkalt endringer i Citrin (F A) og eCFP (F D) fluorescens registreres i en enkelt ROI. (C) Ca 2+ responser (som forholdet F A / S D) av en kjegle terminal til en serie av 1 sek sterkt lys blinker i 5 sek intervaller. ROI, region av interesse; BP, band-pass filter; F, fluorescens intensitet; au, vilkårlige enheter; FRET, Förster resonans energi overføring; eCFP, forbedret cyan fluorescens protein. Stimulus intensitet (som poto-isomeriseringen rente i 10 3 · P · s -1 per kjegle). 13.0 og 12.8 for M- og S-opsins, henholdsvis, og legger inn et bakgrunnsnivå (= LED off, eksitasjon laser scanning) av ~ 10 Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Eksempler kvantitativ analyse av lys-fremkalt membran Ca 2+ svar (A) Lys-fremkalt Ca 2+ svar (som AR) fra en enkelt membran terminal (enkelt forsøk: grå spor, n = 16; gjennomsnittet. Sort spor ) (B) Parametere som er bestemt for midlere Ca 2+ reaksjon:. Hvile Ca 2+ nivå (R base) som representerer grunnlinjen før lys stimulering, respons størrelse som arEA-under-kurven (Ra) og maksimal amplitude (R amp), kinetikken til responsen utbruddet (t stige, tidsintervallet fra 20% til 80% av R amp) og forskyvning (t forråtnelse, tidsintervallet fra 80% 20% av R amp). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Estimering absolutt Ca 2+ konsentrasjon. Resting Ca 2+ konsentrasjon ([Ca 2+], som forholdet F A / F D) spilt inn i åtte kjegle axon terminaler i et TN-XL mus (sirkler, med gjennomsnitt ± SD) for forskjellige ekstracellulære løsninger: to ganger i standard ekstracellulær medium (Ctrl 1 og 2), deretter med minimal ("null") [Ca2 +] (10 mM EGTA) etd med høy [Ca 2+] (2,5 mm), de to sistnevnte forholdene i nærvær av fem mikrometer ionomycin ekvilibrere ekstracellulære og intracellulære Ca 2+. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Pre-eksisterende protokoller ved hjelp av elektrofysiologiske encellede opptak eller Ca 2+ bildebehandling med syntetiske fluorescerende indikatorer sliter med å registrere Ca 2+ dynamikken i muse kjegle fotoreseptorene for en rekke tekniske årsaker (se Innledning). Protokollen er beskrevet her gjør det mulig for måling av Ca 2 + signaler til og med absolutt Ca 2 + nivåer i individuelle, identifiserte musekjegle terminaler på en effektiv og relativt enkel måte.

Denne protokollen har allerede blitt brukt i tre studier adressering ulike aspekter av kjegle funksjon hos friske mus hinnen. I den første studien 10, den HR2.1: ble TN-XL mus karakterisert ved anvendelse av immunohistokjemi, ERG opptak, to-foton Ca 2+ avbildning, og farmakologi, som viser at den kjegle spesifikk ekspresjon av Ca 2+ biosensor ikke hemme kjegle anatomi og funksjon. I den andre studien 21, kromatiskog akromatiske responsegenskaper av mus kjegler ble kartlagt over netthinnen, viser slående forskjeller i kjegle funksjon mellom den "grønne" opsin dominerte dorsal og "blå" opsin dominerte ventral musen netthinnen. Disse regionale forskjeller i kjegle egenskaper matchet fordelingen differensial kontrast i naturen (dvs. himmel vs. bakken), noe som tyder på at de ulike spektrale typer mus kjegler forsørge (nær) optimal prøvetaking av akromatiske kontraster, og dermed kan tilby en evolusjonær fordel. I den tredje studien 22 gjensidige tilbakemeldinger som kjegle axon terminaler mottar fra horisontale celler ble undersøkt. Som alle foreslåtte horisontal celle tilbakekoblingsmekanismer handle på spenningsstyrte Ca 2+ kanaler i kjegle axon terminaler 28, kan kjegle terminal Ca 2+ tjene som en proxy for horisontale celle-til-cone interaksjoner. Studien av Kemmler og kolleger 22 støtterden oppfatning at horisontale celler bruker et komplekst tilbakemeldingssystem som består av flere mekanismer for kontroll av fotoreseptoren glutamat release.

Disse studiene viser allsidigheten av den beskrevne protokoll, og viser at det kan tilpasses til en lang rekke spørsmål om kjegle funksjon og dens synaptiske kretser. I tillegg muliggjør protokollen studere lokale Ca 2+ signalisering i de ulike kjegle avdelinger, mot en bedre forståelse av kjegle fysiologi. Slik kunnskap er viktig å forstå patofysiologiske prosesser i degenereres kjegler, for til slutt å muliggjøre en rasjonell utnyttelse av den potensielle terapeutiske tilnærminger, særlig for degenerative sykdommer som påvirker kjegler.

I HR2.1: TN-XL mus linje, er Ca 2+ biosensor uttrykt i hele kjeglen, med unntak av det ytre segment. Dette gir en mulighet for direkte og ratiometrisk vurdering av Ca 2+ dynamisks i forskjellige kjegle avdelinger. Siden endringer i Ca 2 + strømninger i det ytre segment er reflektert i terminalene via membranpotensialet og den resulterende aktivering av spenningsstyrte Ca2 + kanaler, kan prosessene i det ytre segment observeres indirekte.

Potensielle fallgruvene:

Disseksjon av netthinnen er et kritisk punkt: I mus, skiller netthinnen fra eyecup vanligvis mellom fotoreseptorlidelser yttersegmentene og pigment epitel. Derfor er det lysfølsomme fotoreseptoren ytre segmenter av det isolerte retina eksponert og ekstremt følsom for mekanisk skade. Stor forsiktighet må tas for ikke å skade ved å berøre fotoreseptoren side med verktøy eller ved å flytte vev sidelengs på en selvklebende overflate (f.eks et filter membran).

Høykvalitets retinal skiver kan gjenkjennes under mikroskopet ved sin rene skjæreflaten ogav en godt organisert fotoreseptoren lag med klart definerte ytre segmenter. Funksjonell vurdering av kvaliteten skive kan raskt utføres ved å blinke med sterkt lys stimuli og bestemme prosentandelen av responderende kjegler (for eksempel i et synsfelt med 10 - 20 kjegler). Her bør responsen kvalitet evalueres ved å beregne signal-til-støy-forholdet (S / N) (amplitude av utgangsverdien støy før lyset stimulus vs. amplitude av lyset respons); en S / N av 2 - 3 skal betraktes som minimum terskel. Vanligvis kaster vi skiver med mindre enn 50% responsive kjegler. Også skiver med kjegler som viser overdreven spontan spiking atferd (se Figur 4 av 10) skal kastes.

Slices i innspillingen kammer som oppfyller de nevnte anatomiske og funksjonelle kriterier viser konsistente svar på 1 - 2 timer (for detaljer om svar konsistens, se 10). Fordi skiver overleve hvår i holdekammeret, kan et vellykket eksperiment vare opptil seks timer. Det er bemerkelsesverdig at det er noen begrensninger med hensyn til å studere lang spenner romlige interaksjoner mellom kjegler og horisontale celler, som slicing uunngåelig kutter sidetilkoblinger i netthinnens nettverk. Men å øke tykkelsen av netthinnens skiver til 300 mikrometer lindrer dette problemet 22.

Bruken av vertikale skiver retinale unngår skanning av lysfølsomme koniske ytre segmenter ved eksitasjon laser og således i stor grad hindrer opsin bleking (for omfattende diskusjon, se 10,21). Likevel, de registrerte Ca 2+ signaler ikke bare avhengig av lys stimuli, men også bli berørt av en bakgrunnsbelysning komponent som genereres av scanning eksitasjon laser. Faktisk, er den effektive bakgrunnsbelysning i slike to-foton bildebehandling eksperimenter en kombinasjon av spredt laserlys, fluorescerende lys emittert ved den registrerte cells, og noen LED stimulans bakgrunn komponent. Derfor bør kjegler få lov til å tilpasse seg i minst 20 - 30 s til laser scanning (med bakgrunnen komponent av lyset stimulus slått på) før opptaket.

Fordeler og bruksområder:

Mens noen bruksområder for denne kjegle Ca 2+ -imaging protokollen er beskrevet ovenfor 10,21,22, kan andre anvendelser tenkes: Farmakologiske studier i kombinasjon med kjegle Ca 2+ avbildning kan validere Ca 2+ signalveier i kjegler og kan bli brukes til å teste effekt og styrke av legemidler rettet mot ulike aktører i Ca 2+ -signaling 10. Imidlertid kan en nøkkel søknad være å studere sykdommer som påvirker kjegle funksjon. Mange retinal degenerasjon musemodeller etterligne menneskelige sykdommer er tilgjengelig. For eksempel er den kjegle fotoreseptoren tap 1 (CPFL 1) muse en primær kjegle degenerasjon modell lidelsefra en Pde6c mutasjon 29. Omvendt, lider stangen degenerasjon 1 (rd 1) mus fra et Pde6b mutasjon. Selv om dette fører til primær stang fotoreseptoren degenerasjon 30. gang rd 1 stang tapet er fullført, videregående kjegle degenerasjon sett i en. Crossbreeding disse dyrene med HR2.1: TN-XL linjen vil tillate å studere og sammenligne Ca 2+ dynamikk i både primær- og sekundær kjegle degenerasjon og vil trolig gi verdifull innsikt i rollen Ca 2+ under kjegle celledød. Også farmakologisk indusert kjegle degenerasjon - for eksempel ved bruk av selektive PDE6 hemmere - kan bidra til å identifisere nedstrøms mekanismer kjegle degenerasjon 10,29,31.

Oppsummert protokollen beskrevet her kan måle Ca 2+ i subcellulære avdelinger av mus kjegle fotoreseptorene og gir store muligheter til å avdekke kjegle fysiologi under et bredt spekterav fysiologiske og patofysiologiske betingelser. I tillegg kan denne protokoll benyttes for screening av farmakologiske midler er utformet for å gripe inn med konusen Ca 2+ -signaling og derved bidra til å etablere nye behandlinger for kjegle sykdommer.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High vacuum grease Dow Corning 1018817 http://www.dowcorning.com
Cover slips R. Langenbrinck 24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
Glass slides R. Langenbrinck 76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Blades for tissue chopper MARTOR KG ARGENTAX No. 1044 0.25 mm; http://www.martor.de
Tissue chopper Custom-build Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert
Nitrocellulose filter membrane gridded Merck Millipore AABG01300 Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com
Isoflurane CP CP pharma AP/DRUGS/220/96 http://www.cp-pharma.de
UV/green LED-based full-field stimulator Custom-build for details, see10
Open source microprocessor board Arduino http://www.arduino.cc
Imaging software CfNT Custom-written developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany
IgorPro Wavemetrics http://www.wavemetrics.com
VC3-4 System focal perfusion system ALA Scientific Instrument with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser) Newport Spectra-Physics http://www.spectra-physics.com
Movable objective microscope (MOM),
Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany		 Sutter Instruments http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
Name Company Catalog Number Comments
XLUMPlanFL 20X/0.95w objective Olympus http://www.olympusamerica.com
Vaporizer 100 series Surgivet http://www.surgivet.com
Ionomycin, Calcium salt Life technologies I24222 http://www.lifetechnologies.com
EGTA Sigma-Aldrich E3889 https://www.sigmaaldrich.com
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 101191250 http://www.sigmaaldrich.com
Leica MZ95 leica microsystems http://www.leica-microsystems.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trifunovic, D., et al. Neuroprotective strategies for the treatment of inherited photoreceptor degeneration. Current Molecular Medicine. 12, 598-612 (2012).
  2. Paquet-Durand, F., et al. Calpain is activated in degenerating photoreceptors in the rd1 mouse. Journal of Neurochemistry. 96, 802-814 (2006).
  3. Paquet-Durand, F., et al. A key role for cyclic nucleotide gated (CNG) channels in cGMP-related retinitis pigmentosa. Human Molecular Genetics. 20, 941-947 (2011).
  4. Frasson, M., et al. Retinitis pigmentosa: rod photoreceptor rescue by a calcium-channel blocker in the rd mouse. Nature Medicine. 5, 1183-1187 (1999).
  5. Bush, R. A., Kononen, L., Machida, S., Sieving, P. A. The effect of calcium channel blocker diltiazem on photoreceptor degeneration in the rhodopsin Pro213His rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 2697-2701 (2000).
  6. Pawlyk, B. S., Li, T., Scimeca, M. S., Sandberg, M. A., Berson, E. L. Absence of photoreceptor rescue with D-cis-diltiazem in the rd mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 1912-1915 (2002).
  7. Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors. The Journal of General Physiology. 113, 267-277 (1999).
  8. Choi, S. Y., et al. Encoding light intensity by the cone photoreceptor synapse. Neuron. 48, 555-562 (2005).
  9. Krizaj, D. Calcium stores in vertebrate photoreceptors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 873-889 (2012).
  10. Wei, T., et al. Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 32, 6981-6994 (2012).
  11. Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Molecular Vision. 13, 887-919 (2007).
  12. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18, 8936-8946 (1998).
  13. Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nature Protocols. 1, 1057-1065 (2006).
  14. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46, 143-151 (2008).
  15. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290, 527-528 (1981).
  16. Hendel, T., et al. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro. The Journal of Neuroscience. 28, 7399-7411 (2008).
  17. Dreosti, E., Odermatt, B., Dorostkar, M. M., Lagnado, L. A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo. Nature Methods. 6, 883-889 (2009).
  18. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90, 1790-1796 (2006).
  19. Wang, Y., et al. A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes. Neuron. 9, 429-440 (1992).
  20. Connaughton, V. P. Zebrafish retinal slice preparation. Methods in Cell Science. 25, 49-58 (2003).
  21. Baden, T., et al. A tale of two retinal domains: near-optimal sampling of achromatic contrasts in natural scenes through asymmetric photoreceptor distribution. Neuron. 80, 1206-1217 (2013).
  22. Kemmler, R., Schultz, k, Dedek, K., Euler, T., Schubert, T. Differential regulation of cone calcium signals by different horizontal cell feedback mechanisms in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 34, 11826-11843 (2014).
  23. Werblin, F. S. Transmission along and between rods in the tiger salamander retina. The Journal of Physiology. 280, 449-470 (1978).
  24. Euler, T., et al. Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 457, 1393-1414 (2009).
  25. Baden, T., Berens, P., Bethge, M., Euler, T. Spikes in mammalian bipolar cells support temporal layering of the inner retina. Current Biology. 23, 48-52 (2013).
  26. Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).
  27. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).
  28. Thoreson, W. B., Mangel, S. C. Lateral interactions in the outer retina. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).
  29. Trifunovic, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).
  30. Sahaboglu, A., et al. Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms. Cell Death & Disease. 4, e488 (2013).
  31. Sahaboglu, A., et al. PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function. PloS One. 5, e15495 (2010).

Tags

Neuroscience Ca to-foton Ca celledød retinal slice forberedelse retinal degenerasjon
Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics i Cone fotoreseptor Axon terminaler Mouse Retina
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kulkarni, M., Schubert, T., Baden,… More

Kulkarni, M., Schubert, T., Baden, T., Wissinger, B., Euler, T., Paquet-Durand, F. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), e52588, doi:10.3791/52588 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter