Protocol
Studienzulassung: Die experimentellen Protokolle wurden vom italienischen Ministerium für Gesundheit genehmigt (Rom, Italien) nach dem Decreto legislativo 27 novembre 1992, n. 116 "attuazione della Direttiva n. 86/609 / EWG in materia di Protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici."
1. Gewinnung Hautproben
- Euthanize die Maus durch Genickbruch.
- Ohr:
- Schneiden Sie den unbehaarten Teil der Ohren der Maus aus.
- Separate dorsalen und ventralen Seite durch sie auseinander mit einer Pinzette herausziehen. Entfernen Sie alle verbleibenden Knorpeln durch sanft den inneren Teil der Ohren mit einer Pinzette Schaben.
- Trunk Haut:
- Rasieren Sie die ganze Haut des Tieres sowohl mit einem elektrischen Rasierer und mit zarten Enthaarungslotion.
- Schneiden Sie die gewünschte Hautprobe (von 2 cm 2 bis zur gesamten Tierhaut) aus.
- Wenn die gesamte Rücken abschneidet und ventrale Mäusehaut, einen vertikalen Schnitt in der Mitte der Maus entlang der Grenzen der rasierten Bereichen rund um die Maus Körper zurück geschnitten und dann machen.
- Vorsichtig trennen die Haut aus dem Peritoneum und Rückenmuskulatur, immer noch mit der Pinzette die Hautprobe zu halten, während die Hautprobe mit geschlossenen runden kantigen Spitzen einer chirurgischen Schere oder einem Skalpell trennt.
- Bereiten Sie eine 100 mm Zellkulturplatte mit 10 ml eiskaltem PBS enthält.
- Beseitigen von subkutanem Fett durch Eintauchen der Hautprobe in PBS in der Platte, hergestellt in Schritt 1.3.3 und Abkratzen der Hautprobe mit einer Pinzette.
- Schwanz:
- Schneiden Sie den Schwanz der Maus ab.
- Machen Sie einen vertikalen Schnitt auf den Schwanz mit einer chirurgischen Schere oder chirurgische Skalpell aus der Schwanzbasis beginnt und an der Spitze des Schwanzes zu erreichen.
- Verwenden einer Pinzette, um die Haut vom Schwanz zu lösen. Besorgen Sie sich die Kante des Schnitts an der Basis des Schwanzes und ziehen Sie vorsichtig die Spitze zu, während die HalteKörper des Schwanzes mit einer Pinzette.
- Entfernen Sie überschüssiges Fett durch die Hautprobe sanft kratzen.
- Wegelagerer
- Schneiden Sie die gesamte Maus Fuß mit chirurgischen Schere. Vermeiden jede behaarter Haut zu schneiden.
- Schneiden Sie die Haut des Fußes in Längsrichtung vom Knöchel bis zum Beginn der Ziffern.
- Halten Sie die Knöchel mit einer Pinzette oder mit der Hand, während die Haut mit einer Pinzette greifen und ziehen Sie die Haut in Richtung auf die Ziffern, als ob, die ein Handschuh aus.
2. Verdauung
- Bereiten Sie die Verdauung Cocktail aus der Stammlösung (hergestellt wie in der Materialliste) mit folgendem Rezept: Enzymmischung (siehe Materialliste für Spezifikationen) 300 ug / ml, DNAse1 50 U / ml. Man verdünnt in RPMI 5% FBS.
- Hacken Hautproben mit einer Schere in kleine Stücke in eine 35 mm Petrischale mit 2 ml Digestion Cocktail (Für Stamm Haut: 2 ml Verdauung Cocktail alle 2 cm 2 der Haut, bis zu 3 ml insgesamt).
- für 90 min bei 37 ° C inkubieren. Schütteln Sie die Petrischale 1-2 mal während der Inkubation.
- Gießen verdaute Hautproben auf einem 70 & mgr; m Zellsieb in 66 mm Petrischale mit 1 ml RPMI1640 5% FBS.
- Waschen Sie das Sieb mit 5 ml RPMI 1640 5% FBS.
- Drücken Sie die Probe durch die Zelle Sieb mit einem Spritzenkolben.
- Flush Kolben, Petrischale und Sieb mit 20 ml RPMI1640 5% FBS, Transfer in 50-ml-Tube.
3. Antikörper und Labeling
- Waschen der erhaltenen Suspension zweimal mit 5 ml PBS, das 1% FBS (oder BSA).
- Beschriften Sie die erhaltene Zellsuspension mit den gewünschten Antikörper.
- Resuspendieren der Proben in 100 ul / Probe einer Mischung enthaltend 2 & mgr; g / ml aCD16 / CD32 (Klon 2.4G2), verdünnt in PBS 1% FBS.
- 15 min Inkubieren bei 4 ° C, um nicht-spezifische Bindung der gewünschten Antikörper via Fc-Rezeptoren zu blockieren.
- Fügen Sie die angegebenen Antikörper in der Tabelle1.
- Bereiten einer Mischung die gewünschten Antikörper in 100 & mgr; l / Probe von PBS 1% FBS in einer Konzentration von 4 ug / ml verdünnt.
- Füge 100 & mgr; l des in Schritt hergestellten Mischung 3.2.3.1 zu jeder Probe, so dass in dem Rohr, wird es in einer Endkonzentration von 2 & mgr; g / ml mit einem Volumen von 200 & mgr; l der Antikörpermischung sein.
- Inkubieren für 30 min bei 4 ° C und die Abdeckung von Licht.
- Waschen mit 1 ml PBS, das 1% FBS, Zentrifuge für 5 Minuten bei 400 · g, den Überstand verwerfen und resuspendieren in 300 ul PBS, das 1% FBS.
- Hinzufügen DAPI in einer Endkonzentration von 2 & mgr; g / ml und Inkubation bei 4 ° C, geschützt vor Licht für 10 min.
- Analysieren Sie die Proben durch FACS erhalten.
- Um Leukozyten zu isolieren, verwenden Sie die folgende Gating-Strategie:
- Zuerst beseitigen alle toten Zellen durch auf der DAPI- Bevölkerung Gating.
- Wählen Sie Singuletts im FSC-A gegen FSC W Plot , wie in Abbildung 1 angegeben
- Tor die darauf basierenden Zellen nach Größe und Granularität typisch für die Leukozyten von Interesse.
- Wählen Sie CD45 + Zellen in der FSC-A CD45 Plot wie in Abbildung 1 dargestellt.
- Unterscheiden die verschiedenen Populationen von Leukozyten durch die Expression von Oberflächenmarkern, wie folgt:
- Identifizieren DCs als CD11c + MHC II + Zellen. Diese können später für die Expression von CD207 analysiert werden, um zu unterscheiden, Langerhans'schen Zellen und CD207 + Dermal DCs von CD207- Dermal DCs.
- Identifizieren Makrophagen als CD64 + F4 / 80 + Zellen.
- Identifizieren B-Zellen als CD19 + MHCII + Zellen.
- Identifizieren T-Zellen als CD8 + oder CD4 + Zellen.
- Um Leukozyten zu isolieren, verwenden Sie die folgende Gating-Strategie:
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Representative Results
Haut von anderen Bereich des Körpers wurde gemäß dem Protokoll, verdaut mit den angegebenen Antikörpern beschrieben und fleckig. Die Gating - Strategie ist in Abbildung 1. Wählen Sie zuerst lebende Zellen (DAPI- Zellen), dann Tor auf Singuletts (FSC-A gegen FSC-W) und auf Zellen mit Lymphozytenmorphologie (FSC-A vs. SSC-A) dargestellt. Wenn angegeben, werden CD45 + Zellen aus hämatopoetischen Ursprungs ausgewählt.
DCs sind , markiert mit anti-CD11c, -MHCII und -CD45 - Antikörpern sind Makrophagen identifiziert als F4 / 80 + CD64 + CD45 + -Zellen, B - Zellen als CD19 + CD45 + MHCII + Zellen, CD4 + T - Lymphozyten , wie CD4 + CD45 + Zellen und CD8 + T - Lymphozyten als CD8 + CD45 + Zellen (Abbildung 2).
Diese Methode guarantees hohe Lebensfähigkeit der verdauten Population mit mehr als 50% der gesamten lebensfähigen Zellen (DAPI-) in allen Regionen der Haut , die (3A) analysiert. Ein Hinweis auf die Anzahl der CD45 + Zellen ergeben pro cm 2 ist in 3B dargestellt.
Eine Schätzung der Gesamtzahl der DCs, Makrophagen, B - Zellen und CD4 + oder CD8 + T - Zellen , die aus der Verdauung von 1 cm 2 der Haut von Mäusen ist in 3C dargestellt.
Abbildung 1. Identifizierung von Zellen hämatopoetischen Ursprungs in der Hauteinzelzellsuspensionen. Einzelzellsuspensionen wurden mit DAPI und dem Anti-CD45 - Antikörper wurden gefärbt. Unter lebenden Zellen (DAPI-negativ), Unter (FSC-A gegen FSC-H) analysiert Zellen mit Leukozyten zu wählen Morphologie (FSC-A vs. SSC-A). Zellen hämatopoetischen Ursprungs als CD45 + gekennzeichnet.
Figure 2. Analyse von Immunzellen , die in der Maushaut aus verschiedenen Regionen abgeleitet. Die Zellen werden gated wie in Figur 1 angedeutet ist . DCs als CD11c + MHC II + CD45 + Zellen und später gefärbt mit CD207 identifiziert Langerhans'schen Zellen und CD207 + unterscheiden dermale DCs von CD207 -; Makrophagen werden als CD64 + F4 / 80 + CD45 + Zellen identifiziert; T - Lymphozyten werden in CD8 + CD45 + Zellen und CD4 + CD45 + Zellen unterteilt; B - Zellen werden als MHCII + CD19 + CD45 + Zellen identifiziert. Prozentangaben sind auf die gesamten CD45 + Zellen bezeichnet.
Abbildung 3. Quantitative Analyse der Immun Zellen , die in der Maushaut aus verschiedenen Regionen (A) Prozentsatz der lebensfähig. (DAPI -) Zellen stammen aus den angegebenen Bereichen der Mäusehaut. (B) Absolute Zahlen CD45 + Zellen in den verschiedenen Regionen des Mäusehaut ausgedrückt in Anzahl der Zellen pro cm 2 der Haut. (C) Schätzung Anzahl von DCs, M & PHgr, B - Zellen und CD4 + oder CD8 + T - Zellen abgeleitet von 1 cm 2 der Haut von den angegebenen Regionen der Mäusehaut.
| Antikörper | Die Färbung | Konzentration | Zeit | Temperatur |
| DCsMischen | ||||
| CD11c | PE-Cy7 | 2 & mgr; g / ml | 30 Minuten | 4 ° C |
| MHC II | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD207 | APC | " | " | " |
| makrophagen Mix | ||||
| F4 / 80 | APC-Cy7 | 2 & mgr; g / ml | 30 Minuten | 4 ° C |
| MHC II | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD64 | PE-Cy7 | " | " | " |
| T und B-Zellen mischen | PE | 2 & mgr; g / ml | 30 Minuten | 4 ° C |
| CD4 | APC-Cy7 | " | " | " |
| CD19 | APC | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
Tabelle 1 Indikationen für die Färbung der verschiedenen Populationen von Immunzellen bevölkern die Haut. Drei Mischungen angegeben sind für die Färbung von DCs, Makrophagen und Lymphozyten.
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Discussion
Wir haben ein Verfahren zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus verschiedenen Maushautregionen beschrieben. Verfahren nach Verdauung wir angenommen haben, verursacht nicht nur hohe Ausbeuten, sondern bewahrt auch die Expression von Oberflächenmarkern, die für die nachfolgende FACS-Analyse von grundlegender Bedeutung ist.
Die Verwendung eines Cocktails von Kollagenase I und II und Thermolysin, garantiert minimale Charge zu Charge unterschiedliche Enzymaktivität macht dieses Verfahren sehr gut reproduzierbar. Andere veröffentlichte Methoden beruhen auf verschiedenen Enzymcocktails aber in unseren Händen geben sie niedrigere Erträge und, was noch wichtiger ist, sind weniger reproduzierbar. Unser Verfahren wird jedoch nicht zwischen Zellen bevölkern die Epidermis und die Dermis Zellen füllen. Da in vielen Fällen könnte es nützlich sein , zwischen diesen beiden verschiedenen Kompartimenten zu unterscheiden, richten wir den Leser auf diesen früheren Arbeiten , die solche Verfahren verwenden. 15
Nach unserer Erfahrung Hautprobes aus dem Ohr und Schwanz sind leichter auf den Stamm Haut verdauen, als wo die subkutane Fettschicht, um gründlich abgekratzt werden muss, die Dermis zugänglich für die Enzym-Cocktail zu machen. Die Entfettung Schritt, obwohl sowie das Schneiden sollte schnell und sanft ausgeführt werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen aufrecht zu erhalten. Eine verlängerte oder zu gründlich Entfettungsschritt kann zu Schäden an der Immunzellen mit Wohnsitz in der Haut führen und daher in viel geringeren Ausbeute führen und verminderte Lebensfähigkeit der gewonnenen Zellen.
Es sollte auch beachtet werden, dass die Integrität der Oberflächenmarker zu erhalten, sollte die Verdauung von Reduktionsmittel wie β-Mercaptoethanol in einem Medium frei durchgeführt werden. Um unerwünschte Schäden zu vermeiden Marker zur Oberfläche, sollte die Inkubationszeit kürzer als wie möglich gehalten werden, in jedem Fall nicht länger als 90 min verlängert.
Besondere Sorgfalt sollte auch werden, genommen, wenn die verdaute Hautproben in die Zelle GießenSieb. Es ist wichtig, gründlich verdaut Haut, um waschen die befreiten Zellen vor der Zerschlagung der verdauten Probe mit dem Spritzenkolben weg zu waschen. Mit diesem Schritt wird die Hautprobe aus den befreiten Immunzellen gewaschen, die dann nicht mehr körperlicher Belastung unterziehen. Die Zerschlagung sollte auch vorsichtig erfolgen, um keine Zellen und sowohl die Zelle Sieb und der Spritzenkolben zu töten sollte gründlich in der nachfolgenden Waschschritt gewaschen werden.
Haut Verdauung kann auch in einem 50 ml Falcon in einem Wasserbad bei 37 ° C durchgeführt werden. In diesem Fall kann die Haut vorher gehackt werden und dann in den Falcon-Röhrchen. Beachten Sie, dass die Hautproben immer in Verdauungspuffer während der Inkubation und dass Hörmuscheln halten Sie sich an den Seiten des Falcon-Röhrchen getaucht werden sollte. Wenn Falcon-Röhrchen verwenden, daher sicherstellen, dass die Stücke gehackte Haut Aufenthalt in der Digestionsmedium untergetaucht.
Dieses Verfahren kann in ma nützlich seinny verschiedenen experimentellen Bedingungen, vor allem, wenn nicht-entzündete Haut studieren. Während einer Entzündung, Vasodilatation und Gewebeschwellung lösen die Struktur des Gewebes und Immunzellen aus dem Blut massiv auf die Haut rekrutiert werden. Die Effizienz der Zellgewinnung ist somit viel höher. In homöostatischen Bedingungen ein effektiver Weg, den tight Kollagenmatrix der Dermis ist, in der Tat erforderlich, um zu verdauen, um die Immunzelle bildet das komplexe Netzwerk Bestücken der Haut wiederherzustellen.
Der Leser könnte auch in einer umfassenden Überprüfung interessiert sein, die den Ursprung und Phänotyp verschiedener dendritische Zellen und Makrophagen bevölkern die Haut in den beiden homeostatic und entzündlichen Erkrankungen abdeckt. 16
In verschiedenen Versuchseinstellungen können verschiedene Abschnitte der Mäusehaut behandelt werden. Zum Beispiel in Hauttransplantationsmodellen könnte ein Teil des Schwanzes auf dem Kofferraum eines Aufnahme Tier transplantiert werden; wenn studying Ödembildung oder Immunisierungsverfahren, Stimuli werden häufig auf den Fußballen von Mäusen injiziert, während das Ohr häufig T-Zellenspeicher mit DTH-Tests zur Beurteilung verwendet wird. Mit unserer Methode können wir effizient Haut resident Immunzellen von verschiedenen Standorten aus, dass unser Verfahren nützlich für die experimentelle Einstellung der Wahl extrahieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Supplemented RPMI 1640 medium | RPMI1640 supplemented w/ L-glu, pen-strep w/o beta mercapto ethanol | ||
| PBS | |||
| FBS | |||
| Liberase TM (Enzyme Mix) | Roche | 5401119001 | resuspend [2.5 mg/ml] in dH2O; store aliquots at -20 °C |
| Dnase I | Sigma | D4263-1VL | resuspend in RPMI 1640 w/o serum [1,000 U/ml] |
| Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forceps | |||
| Surgical Scalpel | |||
| 35 mm Petri dishes | |||
| 66 mm Petri dishes | |||
| 100 mm Petri dishes | |||
| 70 µm Cell Strainers | BD | 352350 | |
| Digestion cocktail | Dilute in RPMI 5% FBS | ||
| LIberase TM | 300 µg/ml | ||
| DNAse1 | 50 U/ml | ||
| Antibodies | |||
| Name | Company | Clone | Label |
| aCD45.2 | 104 | PE-Cy5.5 | |
| aCD11c | N418 | PE-Cy7 | |
| CD11b | M1/70 | FITC | |
| F4/80 | A 3-1 | APC-Cy7 | |
| aCD4 | Gk1.5 | APC-Cy7 | |
| aCD8 | 53-6.7 | PE | |
| aCD64 | X54-5/7.1 | PE-Cy7 | |
| aCD207 | 4C7 | APC | |
References
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