Protocol
approvazione studio: I protocolli sperimentali sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano (Roma, Italia) secondo il Decreto legislativo 27 gennaio 1992, n. 116 "Attuazione della Direttiva n. 86/609 / CEE in materia di Protezione degli Animali utilizzati a Fini Sperimentali o ad Altri Fini scientifici."
1. Ottenere campioni di pelle
- Eutanasia il mouse per dislocazione cervicale.
- Orecchio:
- Tagliare la parte senza peli delle orecchie del mouse.
- dorsali separate e lato ventrale tirandole a pezzi con una pinza. Rimuovere eventuali residui cartilagini raschiando delicatamente la parte interna delle orecchie con una pinza.
- la pelle del tronco:
- Shave tutta la pelle dell'animale, sia con un rasoio elettrico e con delicata crema depilatoria.
- Tagliare il campione di pelle desiderata (da 2 cm 2 fino a tutta la pelle animale).
- Se tagliare l'intera dorsale e ventrale mouse pelle, fare un taglio verticale nel mezzo del mouse avanti e poi tagliare lungo i confini delle zone rasate intorno al corpo del mouse.
- separare delicatamente la pelle dal peritoneo e muscoli della schiena, mantenendo il campione di pelle ancora con le pinze, mentre separa il campione di pelle con la punta bordi arrotondati chiuso di un forbici chirurgiche o un bisturi.
- Preparare una piastra di coltura cellulare 100 millimetri contenente 10 ml di ghiaccio freddo PBS.
- Eliminare il grasso sottocutaneo immergendo il campione di pelle in PBS nel piatto preparato al punto 1.3.3 e raschiando il campione di pelle con una pinza.
- Coda:
- Tagliare la coda del mouse.
- Effettuare un taglio verticale sulla coda con forbici chirurgiche o bisturi chirurgico, a partire dalla base della coda e raggiungendo alla punta della coda.
- Utilizzare pinze per staccare la pelle dalla coda. Afferrare il bordo del taglio alla base della coda e tirare leggermente verso la punta tenendo lacorpo della coda con una pinza.
- Rimuovere il grasso in eccesso raschiando delicatamente il campione di pelle.
- footpad
- Tagliare tutto il piede del mouse con le forbici chirurgiche. Evitando il taglio di qualsiasi pelle pelosa.
- Tagliare la pelle del piede longitudinalmente dalla caviglia fino all'inizio delle cifre.
- Tenere le ossa della caviglia con una pinza oppure a mano mentre afferra la pelle con una pinza e tirare la pelle verso le cifre come se togliersi un guanto.
2. Digestione
- Preparare il cocktail digestione dalla soluzione madre (preparata come in Materials List) con la seguente ricetta: Enzyme mix (vedi Materiali Lista per le specifiche) 300 mg / ml, DNAse1 50 U / ml. Diluire in RPMI 5% FBS.
- Tritare campioni di pelle con le forbici in piccoli pezzi in un piatto 35 millimetri Petri con 2 ml di digestione cocktail (Per la pelle del tronco: 2 ml di digestione cocktail ogni 2 cm 2 di pelle, fino a 3 ml totale).
- Incubare a 37 ° C per 90 min. Agitare delicatamente la piastra di Petri 1-2 volte durante l'incubazione.
- Versare campioni di pelle digeriti su un filtro 70 micron cella 66 millimetri Petri contenenti 1 ml di RPMI1640 5% FBS.
- Lavare il filtro con 5 ml di RPMI 1640 5% FBS.
- Comprimere il campione attraverso il filtro cella con uno stantuffo della siringa.
- stantuffo Flush, capsula di Petri e il filtro con 20 ml di RPMI1640 5% FBS, trasferimento in tubo da 50 ml.
3. Anticorpi ed etichettatura
- Lavare la sospensione ottenuta due volte con 5 ml di PBS 1% FBS (o BSA).
- Etichetta la sospensione cellulare ottenuta con gli anticorpi desiderati.
- Risospendere i campioni in 100 ml / campione di una miscela contenente 2 mg / ml di aCD16 / CD32 (2.4G2 clone) diluito in PBS 1% FBS.
- Incubare per 15 minuti a 4 ° C per bloccare il legame non specifico degli anticorpi desiderati attraverso i recettori Fc.
- Aggiungere gli anticorpi indicati nella tabella1.
- Preparare una miscela diluendo gli anticorpi desiderati in 100 microlitri / campione di PBS 1% FBS ad una concentrazione di 4 mg / ml.
- Aggiungere 100 microlitri della miscela preparata in passaggio 3.2.3.1 per ciascun campione in modo che nel tubo, ci sarà un volume di 200 ml di miscela di anticorpi ad una concentrazione finale di 2 mg / ml.
- Incubare per 30 minuti a 4 ° C e coprire dalla luce.
- Lavare con 1 ml di PBS 1% FBS, centrifugare per 5 minuti a 400 xg, scartare il surnatante e risospendere in 300 ml di PBS 1% FBS.
- Aggiungere DAPI ad una concentrazione finale di 2 mg / ml e incubare a 4 ° C, al riparo dalla luce per 10 min.
- Analizzare i campioni ottenuti da FACS.
- Per isolare leucociti, utilizzare la seguente strategia di gating:
- In primo luogo eliminare eventuali cellule morte dalla gating sulla popolazione DAPI-.
- Selezionare le canottiere nel FSC-A vs plot FSC W come indicato in figura 1
- Porta le cellule in base alle dimensioni e la granularità tipica dei leucociti di interesse.
- Selezionare CD45 + cellule nel-A FSC plot CD45 come indicato in Figura 1.
- Distinguere le differenti popolazioni di leucociti mediante l'espressione di marcatori di superficie come segue:
- Identificare DC come II cellule + CD11c + MHC. Questi possono essere successivamente analizzati per l'espressione del CD207 di distinguere le cellule di Langerhans e CD207 + Dermal DC da CD207- Dermal DC.
- Identificare macrofagi come / 80 + cellule CD64 + F4.
- Identificare le cellule B come cellule CD19 + MHCII +.
- Identificare le cellule T CD8 + come o cellule CD4 +.
- Per isolare leucociti, utilizzare la seguente strategia di gating:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pelle dalla diversa regione del corpo è stato digerito secondo il protocollo descritto e colorati con gli anticorpi indicati. La strategia di gating è rappresentato nella Figura 1. In primo luogo selezionare cellule vive (cellule DAPI-), poi porta il canottiere (FSC-A vs FSC-W) e su cellule con linfociti morfologia (FSC-A vs SSC-A). Quando indicato, vengono selezionate le cellule CD45 + di origine ematopoietiche.
DC sono etichettati con anti-CD11c, -MHCII, e -CD45 anticorpi, I macrofagi sono identificati come F4 / 80 + CD64 + CD45 + cellule, cellule B come cellule CD19 + CD45 + MHCII +, CD4 + T linfociti CD4 + CD45 + cellule e linfociti T CD8 + da cellule CD8 + CD45 + (Figura 2).
Questo metodo guarantees alta vitalità della popolazione digerito con più del 50% di cellule vitali totali (DAPI-) in tutte le regioni della pelle che sono analizzati (Figura 3A). Una indicazione del numero di cellule CD45 + resa per cm 2 è raffigurato nella Figura 3B.
Una stima del numero totale di cellule dendritiche, macrofagi, cellule B e CD4 + o cellule T CD8 ottenibile dalla digestione di 1 cm 2 di pelle di topo è indicato nella figura 3C.
Figura 1. Identificazione delle cellule di origine ematopoietiche in cella singola sospensioni della pelle. Cella singola sospensioni sono state macchiate con DAPI e l'anticorpo anti-CD45. Tra le cellule vive (DAPI-negativo), canottiere (FSC-A vs FSC-H) sono analizzati per selezionare le celle con leucociti morfologia (FSC-A e SSC-A). Cellule di origine ematopoietiche sono identificati come CD45 +.
Figura 2. Analisi di cellule immunitarie presenti nella pelle del mouse derivate da diverse regioni. Le cellule sono gated come indicato in figura 1. DC sono identificati come cellule MHC II + CD45 + CD11c + e successivamente trattata con CD207 distinguere cellule di Langerhans e CD207 + cutanea DC da CD207 -; I macrofagi sono identificati come cellule CD64 + 80 / + F4 CD45 +; Linfociti T si dividono in CD8 + CD45 + cellule CD4 + CD45 + cellule; Cellule B vengono identificate come cellule MHCII + CD19 + CD45 +. Le percentuali si riferiscono al totale delle cellule CD45 +.
Figura 3. L'analisi quantitativa delle cellule immunitarie presenti nella pelle del mouse da diverse regioni (a) percentuale di vitali. (DAPI -), le cellule derivate da regioni indicate di pelle del mouse. (B) numeri assoluti CD45 + cellule nelle diverse regioni del mouse pelle espressi in numero di celle per cm 2 di pelle. (C) Numero Stima dei PVS, MΦ, le cellule B e CD4 + o cellule T CD8 + derivate da 1 cm 2 di pelle dalle regioni indicate di pelle del mouse.
| Anticorpo | colorazione | Concentrazione | Tempo | Temperatura |
| DCMescolare | ||||
| CD11c | PE-Cy7 | 2 ug / ml | 30 minuti | 4 ° C |
| MHC II | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD207 | APC | " | " | " |
| I macrofagi Mix | ||||
| F4 / 80 | APC-Cy7 | 2 ug / ml | 30 minuti | 4 ° C |
| MHC II | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD64 | PE-Cy7 | " | " | " |
| le cellule T e B Mix | PE | 2 ug / ml | 30 minuti | 4 ° C |
| CD4 | APC-Cy7 | " | " | " |
| CD19 | APC | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
Tabella 1. Indicazioni per la colorazione delle diverse popolazioni di cellule immunitarie che popolano la pelle. Tre miscele sono indicati per la colorazione delle cellule dendritiche, macrofagi e linfociti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Abbiamo descritto un metodo per la preparazione di sospensioni monocellulari da diverse regioni cutanee mouse. Il metodo della digestione abbiamo adottato, non solo dà alte rese, ma conserva anche l'espressione dei marcatori di superficie, che è fondamentale per la successiva analisi FACS.
L'uso di un cocktail di collagenasi I e II e termolisina, garantisce lotto minima per differenze lotti nell'attività enzimatica rendendo questo metodo altamente riproducibile. Altri metodi pubblicati si basano su diversi cocktail di enzimi, ma nelle nostre mani che danno rendimenti più bassi e, cosa ancora più importante, sono meno riproducibile. Il nostro metodo, tuttavia, non discrimina tra cellule che popolano l'epidermide e il derma cellule popolano. Dato che in molti casi può essere utile per distinguere tra questi due compartimenti differenti, abbiamo diretto il lettore a questi lavori precedenti che utilizzano tali metodi. 15
Nel nostro campione esperienza pelles dall'orecchio e coda sono più facili da digerire rispetto alla pelle tronco in cui lo strato di grasso sottocutaneo deve essere accuratamente raschiato per rendere il derma accessibile al cocktail di enzimi. Il passo sgrassante, anche se, come pure il taglio deve essere eseguita rapidamente e delicatamente per mantenere la vitalità cellulare. Un passo sgrassaggio prolungato o troppo profonda può provocare danni alle cellule immunitarie residenti nella pelle e quindi provocare resa molto più basso e diminuita vitalità delle cellule recuperate.
Va inoltre osservato che per preservare l'integrità dei marcatori di superficie, la digestione deve essere eseguita in un mezzo privo di agenti come β-mercaptoetanolo riducente. Per evitare danni indesiderati alla superficie marcatori, il tempo di incubazione deve essere il più breve possibile e, in ogni caso, non prolungato per più di 90 min.
Particolare attenzione deve essere, altresì, preso quando si versa i campioni di pelle digeriti nella cellafiltro. È importante lavare a fondo la pelle digerito per lavare via le cellule liberate prima distruggendo il campione digerito con lo stantuffo della siringa. Con questo passaggio il campione di pelle è lavato dalle cellule immunitarie liberate che poi non sono sottoposti ad alcuna sollecitazione più fisico. La frantumazione deve essere eseguita delicatamente per non uccidere le cellule e sia il filtro cellulare e lo stantuffo della siringa devono essere accuratamente lavati in fase di lavaggio.
digestione pelle può essere eseguita anche in un falcon 50 ml in un bagno d'acqua a 37 ° C. In questo caso la pelle può essere tagliato in anticipo e poi posta in un tubo Falcon. Si noti che i campioni di pelle devono sempre essere immerso in tampone di digestione durante l'incubazione e che astine attaccano ai lati dei tubi falcon. Quando si utilizzano tubi Falcon, quindi, assicurarsi che i pezzi di permanenza pelle tritato sommersi nel mezzo di digestione.
Questo metodo può essere utile in mAny diverse impostazioni sperimentali, in particolare quando si studia la pelle non infiammata. Durante l'infiammazione, la vasodilatazione e gonfiore dei tessuti allentare la struttura del tessuto e le cellule immunitarie dal sangue sono massicciamente reclutato per la pelle. L'efficienza di recupero delle cellule è, dunque, molto più elevato. In condizioni di omeostasi, un modo efficace per digerire la matrice di collagene stretto del derma è, infatti, necessaria per recuperare la cellula immunitaria che costituisce la rete complessa popolare la pelle.
Il lettore potrebbe anche essere interessato a una revisione globale che copre l'origine e il fenotipo di diverse cellule dendritiche e macrofagi che popolano la pelle sia in condizioni omeostatiche e infiammatorie. 16
In diverse impostazioni sperimentali, diverse porzioni di pelle del mouse possono essere trattati. Per esempio, in modelli di trapianto di pelle, una porzione della coda potrà essere trapiantato sul tronco di un animale ricevente; quando studying formazione di edema o di procedure di immunizzazione, gli stimoli sono spesso iniettati sulla zampa dei topi, mentre l'orecchio viene spesso utilizzato per valutare la memoria delle cellule T con saggi DTH. Con il nostro metodo si potrebbe efficacemente estrarre le cellule immunitarie della pelle residenti da diverse posizioni rendendo il nostro metodo utile per l'impostazione sperimentale di scelta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Supplemented RPMI 1640 medium | RPMI1640 supplemented w/ L-glu, pen-strep w/o beta mercapto ethanol | ||
| PBS | |||
| FBS | |||
| Liberase TM (Enzyme Mix) | Roche | 5401119001 | resuspend [2.5 mg/ml] in dH2O; store aliquots at -20 °C |
| Dnase I | Sigma | D4263-1VL | resuspend in RPMI 1640 w/o serum [1,000 U/ml] |
| Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forceps | |||
| Surgical Scalpel | |||
| 35 mm Petri dishes | |||
| 66 mm Petri dishes | |||
| 100 mm Petri dishes | |||
| 70 µm Cell Strainers | BD | 352350 | |
| Digestion cocktail | Dilute in RPMI 5% FBS | ||
| LIberase TM | 300 µg/ml | ||
| DNAse1 | 50 U/ml | ||
| Antibodies | |||
| Name | Company | Clone | Label |
| aCD45.2 | 104 | PE-Cy5.5 | |
| aCD11c | N418 | PE-Cy7 | |
| CD11b | M1/70 | FITC | |
| F4/80 | A 3-1 | APC-Cy7 | |
| aCD4 | Gk1.5 | APC-Cy7 | |
| aCD8 | 53-6.7 | PE | |
| aCD64 | X54-5/7.1 | PE-Cy7 | |
| aCD207 | 4C7 | APC | |
References
- Streilein, W. J. Circuits and signals of the skin-associated lymphoid tissues (SALT). Journal of Investigative Dermatology. 85 (1 Suppl), 10s-13s (1985).
- Tay, S. S., Roediger, B., Tong, P. L., Tikoo, S., Weninger, W. The Skin-Resident Immune Network. Current dermatology reports. 3, 13-22 (2014).
- Shen, W., et al. Adaptive immunity to murine skin commensals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2977-E2986 (2014).
- Broggi, A., Zanoni, I., Granucci, F. Migratory conventional dendritic cells in the induction of peripheral T cell tolerance. Journal of leukocyte biology. 94 (5), 903-911 (2013).
- Pan, J., et al. DCs metabolize sunlight-induced vitamin D3 to'program'T cell attraction to the epidermal chemokine CCL27. Nature Immunology. 8 (3), 285-293 (2007).
- Vitali, C., et al. Migratory, and not lymphoid-resident, dendritic cells maintain peripheral self-tolerance and prevent autoimmunity via induction of iTreg cells. Blood. 120 (6), 1237-1245 (2012).
- Azukizawa, H., et al. Steady state migratory RelB+ langerin+ dermal dendritic cells mediate peripheral induction of antigen-specific CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells. European journal of immunology. 41 (5), 1420-1434 (2011).
- Idoyaga, J., et al. Specialized role of migratory dendritic cells in peripheral tolerance induction. The Journal of clinical investigation. 123 (2), 844-854 (2013).
- Boyman, O., Conrad, C., Tonel, G., Gilliet, M., Nestle, F. O. The pathogenic role of tissue-resident immune cells in psoriasis. Trends in immunology. 28 (2), 51-57 (2007).
- Di Meglio, P., Perera, G. K., Nestle, F. O. The multitasking organ: recent insights into skin immune function. Immunity. 35 (6), 857-869 (2011).
- Rosenblum, M. D., et al. Response to self antigen imprints regulatory memory in tissues. Nature. 480 (7378), 538-542 (2011).
- Rosenblum, M. D., Truong, H. A., Abbas, A. K., Gratz, I. K. 177: Maintenance of memory regulatory T cells in peripheral tissues. Cytokine. 63 (3), 284-285 (2013).
- Kim, B. S., et al. TSLP elicits IL-33-independent innate lymphoid cell responses to promote skin inflammation. Science translational medicine. 5 (170), (2013).
- Gopinathan, K. M. New insights into skin structure: scratching the surface. Advanced drug delivery reviews. 54 (Suppl 1), S3-S17 (2002).
- Sandrine, H., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. The Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 189-206 (2010).
- Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin. Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).
