Protocol
연구 승인 : 실험 프로토콜은 Decreto에 따라 건강의 이탈리아 교육부 (로마, 이탈리아)의 승인을 하였다는 N, 27 gennaio 1992 legislativo. (116) "Attuazione 델라 Direttiva N. 609분의 86 / CEE의 본초 디 protezione 글리 animali utilizzati 피니 sperimentali 오 광고 altri 피니 scientifici."
1. 피부 샘플을 얻기
- 자궁 경부 전위로 마우스를 안락사.
- 귀:
- 마우스의 귀 털이없는 부분을 잘라.
- 집게로 떨어져 당겨 분리 지느러미와 복부 측면. 부드럽게 집게로 귀 안쪽 부분을 긁어로 남아있는 연골을 제거합니다.
- 트렁크 피부 :
- 전기 면도기와 섬세한 제모 로션 두 동물의 전체 피부를 면도.
- (2cm 2의 전체 동물의 피부까지) 원하는 피부 샘플을 잘라.
- 전체 지느러미를 절단하는 경우와 VENTRAL 마우스 피부는 다시 다음 마우스 본체 주변의 면도 영역의 국경을 따라 절단 한 마우스의 중앙에 수직 절단을합니다.
- 조심스럽게 수술 가위 나 메스의 폐쇄 라운드 예리하게 팁을 피부 샘플을 분리하면서 집게로 여전히 피부 샘플을 유지, 복막 다시 근육으로부터 피부를 분리합니다.
- 빙냉 PBS 10 ㎖를 함유하는 100mm 세포 배양 플레이트를 준비한다.
- 단계 1.3.3에서 제조 한 접시에 PBS의 피부 샘플을 침수와 집게로 피부 샘플을 긁어하여 피하 지방을 제거합니다.
- 꼬리:
- 마우스의 꼬리를 잘라.
- 수술 용 가위 외과 메스, 꼬리베이스에서 시작하여 꼬리의 끝 부분에 도달와 꼬리에 수직 절단합니다.
- 꼬리으로부터 피부를 분리 집게를 사용합니다. 꼬리의 기지에서 절단의 가장자리를 잡고하고 채 끝을 향해 조심스럽게 잡아 당겨집게와 꼬리의 몸.
- 부드럽게 피부 샘플을 긁어에 의해 어떤 여분의 지방을 제거합니다.
- 노상 강도
- 수술 가위로 전체 마우스 발을 잘라. 모든 털이 피부를 절단 방지.
- 숫자의 시작 발목에서 길이 방향 다리의 피부를 잘라.
- 집게로 피부를 잡는 동안 집게 또는 손으로 발목 뼈를 잡고 장갑을 벗고 것처럼 자리를 향해 피부를 잡아 당깁니다.
2. 소화
- 효소 믹스 (사양 재료 목록 참조) 300 μg의 / ㎖, DNAse1 50 U / ㎖ 다음 레시피 (재료 목록에서와 같이 제조) 원액에서 소화 칵테일을 준비합니다. RPMI 5 % FBS에 희석.
- (트렁크 피부 : 피부의이 소화 칵테일 ml의 모든 2cm 2, 최대 3 ㎖ 총) 소화 칵테일 2 ㎖와 35mm 페트리 접시에 작은 조각으로 가위로 피부 샘플을 잘라.
- 90 분 동안 37 ° C에서 품어. 조심스럽게 배양시 배양 접시를 1-2 번 흔들어.
- RPMI1640 5 % FBS 1 ㎖를 함유하는 66mm 페트리 접시에서 70 μm의 셀 스트레이너에 소화 된 피부 샘플을 붓는다.
- RPMI 1640 5 % FBS의 5 ㎖로 스트레이너 씻으십시오.
- 주사기 플런저 셀 스트레이너를 통해 샘플을 짠다.
- 세척 플런저, 페트리 접시와 RPMI1640 5 % FBS 20 ㎖와 스트레이너, 50 ㎖ 튜브에 전송할 수 있습니다.
3. 항체 및 라벨링
- PBS 1 % FBS (또는 BSA)을 5 ml로 두 번 얻어진 현탁액을 씻으십시오.
- 원하는 항체 얻어진 세포 현탁액 레이블.
- 100 μL에 재현 탁 샘플 / PBS 1 % FBS에 희석 aCD16 / CD32 (클론 2.4G2) 2 ㎍ / ml를 함유하는 혼합물의 샘플.
- Fc 수용체를 통해 원하는 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위해 4 ℃에서 15 분 동안 인큐베이션.
- 표에 표시된 항체를 추가1.
- 4 μg / ml의 농도 PBS, 1 % FBS 100 ㎕ / 샘플의 원하는 항체를 희석 혼합하여 준비한다.
- 튜브에서 2 μg / ML의 최종 농도로 항체 혼합물의 200 μL의 부피가되도록 각 시료에 3.2.3.1 단계에서 제조 된 혼합물 100 ㎕를 추가한다.
- 4 ° C에서 30 분 동안 품어 빛에서 다룹니다.
- 400 XG에서 5 분 동안 PBS 1 % FBS 1 ㎖, 원심 분리로 세척 PBS 1 % FBS 300 μL의 상층 액과에 resuspend 폐기합니다.
- 2 μg / ML의 최종 농도에서 DAPI를 추가하고 10 분 동안 빛으로부터 보호, 4 ° C에서 배양한다.
- FACS에 의해 얻어진 샘플을 분석 할 수 있습니다.
- 백혈구를 분리하기 위해, 다음 게이팅 전략을 사용
- 먼저 DAPI- 인구에 게이팅에 의해 죽은 세포를 제거한다.
- 그림 1에 나타낸 바와 같이, FSC의 W 플롯 대 FSC-A에서 선택 단봉
- 게이트 주목 백혈구의 전형적인 크기와 입도에 기초하여 상기 셀.
- 그림 1에 나타낸 바와 같이 FSC-A CD45 플롯에서 CD45 + 세포를 선택합니다.
- 다음과 같이 표면 마커의 발현에 의해 백혈구의 다양한 인구를 구별 :
- 중 CD11c + MHC II + 세포로 수지상 세포를 식별합니다. 이들은 나중에 CD207- 피부 수지상에서 랑게르한스 세포 및 피부 CD207 + 수지상 세포를 구별하는 CD207의 발현에 대해 분석 할 수있다.
- CD64 + F4 / 80 + 세포로서 대 식세포를 식별합니다.
- CD19 + MHCII + 세포와 같은 B 세포를 식별합니다.
- CD8 + 또는 CD4 + 세포와 같은 T 세포를 식별합니다.
- 백혈구를 분리하기 위해, 다음 게이팅 전략을 사용
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Representative Results
신체의 다른 부위에서 피부 표시된 항체와 설명 및 스테인드 프로토콜에 따라 소화했다. 게이팅 전략은 먼저 단봉 (FSC-W 대 FSC-A)와 림프구의 형태 (SSC-A 대 FSC-A)와 세포에서 방송 한 다음 세포 (DAPI- 세포), 게이트를 선택 그림 1에 도시되어있다. 표시 할 때, 조혈 원점에서 CD45 + 세포가 선택됩니다.
DC가이 항 중 CD11c, -MHCII 및 -CD45 항체로 표시되어, 대 식세포가로 식별됩니다 F4 / 80 + CD64 + CD45 + 세포, CD19 + CD45 + MHCII + 세포와 같은 B 세포, CD4 + CD45와 같은 CD4 + T 림프구 + 세포와 CD8 + CD45 + 세포와 같은 CD8 + T 림프구 (그림 2).
이 방법은 구arantees 분석 피부 (그림 3A)의 모든 지역에 총 가능한 세포 (DAPI-)의 50 % 이상으로 소화 인구의 높은 생존 능력. CD45 + 세포 수의 표시는도 3b에 도시되어 cm 당 2 얻었다.
마우스 피부 1 ㎠, 소화로부터 얻어지는 수지상 세포, 대 식세포, B 세포 및 CD4 + 또는 CD8 + T 세포의 총 수의 추정은도 3c에 나타낸다.
피부 단세포 현탁액 조혈 기원의 세포도 1 식별. 단일 세포 현탁액은 DAPI와 항 CD45 항체로 염색 하였다. 살아있는 세포 중 (음성 DAPI)는 단봉 (FSC-H 대 FSC-A)는 백혈구와 셀을 선택하는 분석 형태 (SSC-A 대 FSC-A). 조혈 기원의 세포는 CD45 +로 식별됩니다.
+ 그림 1에 표시된 바와 같이 서로 다른 영역에서 파생 된 마우스 피부에 존재하는 면역 세포의 그림 2. 분석. 세포. 게이트하는 수지상이 중 CD11c + MHC II + CD45는 + 세포로 확인하고 나중에 랑게르한스 세포와 CD207를 구별하기 위해 CD207 염색 CD207에서 피부 수지상 -; 대 식세포는 CD64 + F4 / 80 + CD45 + 세포로 식별됩니다; T 림프구는 CD8 + CD45 + 세포와 CD4 + CD45 + 세포에서 분할된다; B 세포는 MHCII + CD19 + CD45 + 세포로 식별됩니다. 백분율은 총 CD45 + 세포라고합니다.
상이한 영역에서 마우스의 피부에 존재하는 면역 세포도 3의 정량 분석 가능한 (A) 백분율. (DAPI -) 마우스의 피부의 표시 영역에서 유래 세포. 마우스 피부의 다른 지역에서 (B) 절대 숫자 CD45 + 세포는 피부의 cm 2 당 세포의 숫자로 표현. 수지상, MΦ, B 세포 및 CD4 + 또는 마우스 피부의 표시 영역에서 피부 1cm 2 유래의 CD8 + T 세포 (C)를 추정 번호.
| 항독소 | 더럽히는 것 | 집중 | 시각 | 온도 |
| DC가혼합 | ||||
| 중 CD11c | PE-Cy7 | 2 μg의 / ㎖ | 30 분 | 4 ° C |
| MHC II | 체육 | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD207 | APC | " | " | " |
| 대 식세포 믹스 | ||||
| F4 / 80 | APC-Cy7 | 2 μg의 / ㎖ | 30 분 | 4 ° C |
| MHC II | 체육 | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD64 | PE-Cy7 | " | " | " |
| T 및 B 세포를 혼합 | 체육 | 2 μg의 / ㎖ | 30 분 | 4 ° C |
| CD4 | APC-Cy7 | " | " | " |
| CD19 | APC | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
표 피부를 채우는 면역 세포의 다양한 인구의 염색 1. 표시. 세 믹스는 DC가, 대 식세포와 림프구의 염색에 대해 표시됩니다.
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Discussion
우리는 다른 마우스 피부 영역에서 단일 세포 현탁액을 제조하는 방법을 설명 하였다. 우리가 채택 소화 방법은 높은 수율을 제공하지만, 또한 다음 FACS 분석을 위해 근본적인 표면 마커의 발현을 유지 아닙니다.
콜라게나 제 I 및 II와 써모의 칵테일의 사용은,이 방법은 재현성이 높은 만드는 효소 활성의 배치의 차이에 최소 배치를 보장합니다. 다른 공개 방법은 다른 효소 칵테일에 의존하지만, 우리 손에 그들은, 더 중요한 것은, 적은 재현 낮은 금리를 제공합니다. 우리의 방법은, 그러나, 표피를 채우는 세포 진피를 채우는 세포를 구별하지 않는다. 많은 경우에이 두 개의 서로 다른 구획을 구분하는 것이 유용 할 수 있기 때문에, 우리는 방법을 사용하여 이러한 이전 작품에 독자를 지시. (15)
우리의 경험 피부 샘플에서귀와 꼬리들 피하 기름 층이 완전히 효소 칵테일로 진피에 액세스 할 수 있도록하기 위해 스크랩되어야하는 트렁크 피부보다 소화가 더 쉽다. 디 탈지 공정뿐만 아니라, 절삭 세포 생존을 유지하기 위해 신속하고 부드럽게 수행되어야하지만. 장기화 또는 너무 철저하게 탈지 단계는 피부에있는 면역 세포의 거주자가 손상 때문에 훨씬 낮은 수율 발생 및 복구 세포의 생존 능력을 감소 할 수 있습니다.
그것은 또한 표면 마커의 무결성을 유지하는 것을 주목해야한다 소화는 β 머 캅토 에탄올과 같은 환원제의 결여 배지에서 수행한다. 마커 표면 원치 않는 손상을 방지하기 위해, 배양 시간은 어떤 경우에는, 가능한 한 짧게하고 유지해야 이상 90 분 동안 연장되지 않음.
셀에 소화 피부 샘플을 주입 할 때 특별한주의는 또한주의해야한다거르는 사람. 철저하게 주사기 플런저와 소화 샘플을 스매싱 전에 해방 세포를 씻어하기 위해 소화 피부를 세척하는 것이 중요합니다. 이 단계를 통해 피부 샘플은 더 이상 물리적 인 스트레스를받지 않는 해방 된 면역 세포에서 세척한다. 전술을 다시 한번 점검은 모든 세포를 죽일 셀 스트레이너 및 주사기 플런저 모두 철저하게 후속 세척 단계에서 세척해야하지 않기 위해 조심스럽게 수행해야합니다.
스킨 분해는 37 ℃ 수욕에서 50 ㎖ 팔콘 수행 될 수있다. 이 경우 피부가 사전에 다진 될 수 있으며, 다음 팔콘 튜브에 넣어. 피부 샘플이 항상 배양 동안 소화 버퍼에 빠져들해야하고 귀 조각 팔콘 튜브의 측면에 충실합니다. 팔콘 튜브를 사용하는 경우, 따라서 소화 매체에 잠긴 다진 피부 숙박 조각해야합니다.
이 방법은 엄마 유용 할 수 있습니다뉴욕 다른 실험 설정, 비 염증이 피부를 공부하고 특히. 염증 반응 동안, 혈관 확장 및 조직 부종은 조직 및 혈액에서 면역 세포의 구조는 대규모 피부 모집 느슨하게. 세포 회수의 효율은, 따라서 더 크다. 항상성 상태에서는 진피의 꽉 콜라겐 매트릭스를 소화하는 효과적인 방법이, 실제로, 피부를 채우는 복잡한 네트워크를 구성하는 면역 세포를 회수하기 위해 필요하다.
독자는 또한 기원과 다른 수지상 세포 모두 항상성 및 염증 상태의 피부를 채우는 대식 세포의 표현형을 커버하는 종합적인 검토에 관심이있을 수 있습니다. (16)
다른 실험 설정에서 마우스 피부의 상이한 부분이 처리 될 수있다. 예를 들어, 피부 이식 모델에서 꼬리 부분은받은 동물의 줄기에 이식 될 수있다; 나머지 공부 할 때귀 자주 DTH 분석과 T 세포의 기억을 평가하기 위해 사용된다 g 부종 형성 또는 예방 접종 절차는, 자극은 종종 마우스 발바닥에 주입된다. 우리의 방법으로 우리는 효율적으로 선택의 실험 설정에 대한 우리의 방법이 유용하게 다른 위치에서 피부 상주 면역 세포를 추출 할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Supplemented RPMI 1640 medium | RPMI1640 supplemented w/ L-glu, pen-strep w/o beta mercapto ethanol | ||
| PBS | |||
| FBS | |||
| Liberase TM (Enzyme Mix) | Roche | 5401119001 | resuspend [2.5 mg/ml] in dH2O; store aliquots at -20 °C |
| Dnase I | Sigma | D4263-1VL | resuspend in RPMI 1640 w/o serum [1,000 U/ml] |
| Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forceps | |||
| Surgical Scalpel | |||
| 35 mm Petri dishes | |||
| 66 mm Petri dishes | |||
| 100 mm Petri dishes | |||
| 70 µm Cell Strainers | BD | 352350 | |
| Digestion cocktail | Dilute in RPMI 5% FBS | ||
| LIberase TM | 300 µg/ml | ||
| DNAse1 | 50 U/ml | ||
| Antibodies | |||
| Name | Company | Clone | Label |
| aCD45.2 | 104 | PE-Cy5.5 | |
| aCD11c | N418 | PE-Cy7 | |
| CD11b | M1/70 | FITC | |
| F4/80 | A 3-1 | APC-Cy7 | |
| aCD4 | Gk1.5 | APC-Cy7 | |
| aCD8 | 53-6.7 | PE | |
| aCD64 | X54-5/7.1 | PE-Cy7 | |
| aCD207 | 4C7 | APC | |
References
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