Protocol
Утверждение исследования: экспериментальные протоколы были одобрены Министерством здравоохранения Италии (Рим, Италия) в соответствии с Decreto Legislativo 27 Gennaio 1992, п. 116 "Attuazione делла Direttiva п 86. / 609 / CEE в Materia ди Protezione дельи animali utilizzati Фини sperimentali о объявления Altri Фини scientifici."
1. Получение образцов кожи
- Эвтаназии мышь путем смещения шейных позвонков.
- Ухо:
- Вырежьте голую часть ушей мыши.
- Отдельный спинной и брюшной стороне, потянув их друг от друга с пинцетом. Удалите все оставшиеся хрящи, аккуратно очищая внутреннюю часть ушей с пинцетом.
- кожа Ствол:
- Бритье всю кожу животного и с электрической бритвы и с тонким депиляции лосьон.
- Отрежьте нужный образец кожи (от 2 см 2 до всей кожи животных).
- Если отрезать весь спинной и ажеТрал кожи мыши, сделайте вертикальный разрез в середине мыши обратно, а затем разрезанной вдоль границ бритыми областей вокруг тела мыши.
- Аккуратно отделить кожу от брюшины и мышц спины, держа образец кожи до сих пор с пинцетом при отделении образца кожи с закрытым круглым обрамленными наконечниками хирургическими ножницами или скальпелем.
- Приготовьте 100 мм для культивирования клеток планшет, содержащий 10 мл охлажденного льдом PBS.
- Устранить подкожного жира погружением пробы кожи в PBS в пластине, приготовленным на стадии 1.3.3 и соскоб образец кожи пинцетом.
- Хвост:
- Отрезать хвост мыши.
- Сделать вертикальный разрез на хвост с хирургическими ножницами или хирургическим скальпелем, начиная от основания хвоста и доходящим до кончика хвоста.
- Используйте пинцет, чтобы отделить кожу от хвоста. Захватите края разреза у основания хвоста и осторожно вытяните в сторону наконечника, удерживаяТело хвоста пинцетом.
- Удалите лишний жир, аккуратно очищая образец кожи.
- разбойник
- Вырежьте всю ногу мыши с хирургическими ножницами. Как избежать резки любой волосатые кожи.
- Разрежьте кожу стопы в продольном направлении от голеностопного сустава до начала цифр.
- Держите кости лодыжки с пинцетом или рукой, захватывая кожу с пинцетом и подтягивает кожу в сторону цифр, как будто снимая перчатки.
2. Переваривание
- Подготовьте переваривания коктейль из исходного раствора (приготовленного, как в списке материалов) со следующим рецептом: смесь энзимов (см список материалов для спецификаций) 300 мкг / мл, DNAse1 50 Ед / мл. Развести в RPMI 5% FBS.
- Нарезать образцы кожи с ножницами на мелкие кусочки в чашку Петри 35 мм с 2 мл Пищеварение Коктейль (для ствола кожи: 2 мл Пищеварение Коктейль каждые 2 см 2 кожи, общая до 3 мл).
- Инкубируют при 37 ° С в течение 90 мин. Осторожно потрясите чашку Петри 1-2 раза во время инкубации.
- Налейте переваривается образцы кожи на 70 мкм клеточный фильтр на 66 мм в чашку Петри, содержащую 1 мл RPMI1640 5% FBS.
- Промыть фильтр грубой очистки с 5 мл RPMI 1640 5% FBS.
- Сожмите пробы через сито клеток с поршень шприца.
- Промывка плунжер, чашку Петри и сетчатый фильтр с 20 мл RPMI 1640 5% FBS, перенесите в 50 мл пробирку.
3. Антитела и этикетирование
- Промыть полученной суспензии дважды 5 мл PBS 1% FBS (или БСА).
- Этикетка полученной суспензии клеток с требуемыми антителами.
- Ресуспендируют образцы в количестве 100 мкл / образец из смеси, содержащей 2 мкг / мл aCD16 / CD32 (клон 2.4G2), разведенного в PBS 1% FBS.
- Инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С для того, чтобы блокировать неспецифическое связывание желаемых антител через рецепторы Fc.
- Добавление антител , указанные в таблице1.
- Готовят смесь разбавляя желаемые антитела в 100 мкл / образец PBS 1% FBS в концентрации 4 мкг / мл.
- Добавьте 100 мкл смеси, полученного на стадии 3.2.3.1 для каждого образца так, что в трубке, будет объемом 200 мкл смеси антител в конечной концентрации 2 мкг / мл.
- Инкубировать в течение 30 мин при 4 ° С и покрывают от света.
- Мытье с 1 мл PBS 1% FBS, центрифуги в течение 5 мин при 400 мкг, отбросить супернатант и ресуспендируют в 300 мкл PBS 1% FBS.
- Добавить DAPI в конечной концентрации 2 мкг / мл и инкубируют при 4 ° С, в защищенном от света месте в течение 10 мин.
- Анализ образцов, полученных с помощью FACS.
- Для того чтобы выделить лейкоциты, используйте следующую стратегию стробирования:
- Во-первых устранить любые мертвые клетки с помощью стробирования на население DAPI-.
- Выберите синглеты в FSC-A против FSC W участка , как показано на рисунке 1
- Ворота клетки в зависимости от размера и зернистости, характерной для лейкоцитов, представляющих интерес.
- Выберите CD45 + клеток в FSC-A CD45 участка , как показано на рисунке 1.
- Выделяют различных популяций лейкоцитов по экспрессии поверхностных маркеров следующим образом:
- Определить , как контроллеры домена CD11c + MHC II + клеток. Они могут быть впоследствии проанализированы на экспрессию CD207, чтобы различать клетки Лангерганса и CD207 + Dermal ДК из CD207- Кожное ГЦ.
- Определение Макрофаги, как / 80 + клеток CD64 + F4.
- Определение В-клеток как CD19 + MHCII + клеток.
- Определение Т-клеток, как CD8 + или + клеток CD4.
- Для того чтобы выделить лейкоциты, используйте следующую стратегию стробирования:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Кожа из другой области тела переваривают в соответствии с протоколом, описанным и окрашивают с указанными антителами. Стратегия стробирования изображена на рисунке 1. Сначала выберите живые клетки (DAPI- клетки), то ворота на синглеты (FSC-A против FSC-W) и на клетках с морфологией лимфоцитов (FSC-A по сравнению с SSC-A). Когда указано, CD45 + клетки кроветворной происхождения выбраны.
Контроллеры домена помечены анти-CD11c, -MHCII и -CD45 антитела, макрофаги идентифицированы как F4 / 80 + CD64 + CD45 + клеток, В - клеток как CD19 + CD45 + MHCII + клеток, CD4 + Т - лимфоциты , как CD4 + CD45 + клетки и CD8 + Т - лимфоциты как CD8 + CD45 + клеток (рисунок 2).
Этот метод гуarantees высокую жизнеспособность переваренной населения с более чем 50% от общего количества жизнеспособных клеток (DAPI-) во всех областях кожи , которые анализируются (рис. 3А) Указание числа CD45 + клеток , выход на см 2 изображен на фигуре 3В.
Оценка общего числа контроллеров домена, макрофаги, В - клетки и CD4 + или CD8 + Т - клетки , получаемые из переваривании 1 см 2 кожи мыши показан на фиг.3С.
Рисунок 1. Идентификация клеток кроветворной происхождения в суспензии единичных клеток кожи. Одноклеточные суспензии были окрашивали DAPI и антителом анти-CD45. Среди живых клеток (DAPI-отрицательные), фуфайки (FSC-A против FSC-H) анализируются для выбора ячейки с лейкоците морфология (FSC-A по сравнению с SSC-A). Клетки кроветворной происхождения идентифицированы как CD45 +.
Рисунок 2. Анализ иммунных клеток , присутствующих в коже мышей , полученных из различных областей. Клетки закрытого типа , как показано на рисунке 1. Контроллеры домена определены как CD11c + МНС II + CD45 + клеток , а затем окрашивали CD207 различать клетки Лангерганса и CD207 + кожная контроллеры домена от CD207 -; Макрофаги обозначены как CD64 + F4 / 80 + CD45 + клеток; Т - лимфоциты делятся на CD8 + CD45 + клеток и CD4 + CD45 + клеток; В - клетки идентифицированы как MHCII + CD19 + CD45 + клеток. Проценты по отношению к общему CD45 + клеток.
Рисунок 3. Количественный анализ иммунных клеток , присутствующих в коже мышей из различных областей (А) Процент жизнеспособных. (DAPI -) клетки , полученные из указанных областей кожи мыши. (B) Абсолютное число CD45 + клеток в различных областях кожи мыши выражается в количестве клеток на см2 кожи. (С) Оценить количество контроллеров домена, & phiv, В - клетки и CD4 + или CD8 + Т - клеток , полученных из 1 см 2 кожи из указанных областей кожи мыши.
| антитело | Окрашивание | концентрация | Время | температура |
| контроллеры доменаСмешивание | ||||
| CD11c | PE-Cy7 | 2 мкг / мл | 30 минут | 4 ° C |
| ГКГ | ЧП | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD207 | APC | " | " | " |
| Макрофаги Mix | ||||
| F4 / 80 | APC-Cy7 | 2 мкг / мл | 30 минут | 4 ° C |
| ГКГ | ЧП | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD64 | PE-Cy7 | " | " | " |
| Т- и В-клетки Смешать | ЧП | 2 мкг / мл | 30 минут | 4 ° C |
| CD4 | APC-Cy7 | " | " | " |
| CD19 | APC | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
Таблица 1. Показания для окрашивания различных популяций иммунных клеток , населяющих кожу. Три смеси указаны для окрашивания РСУ, макрофаги и лимфоциты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали способ получения одноклеточных суспензий из различных областей кожи мыши. Метод пищеварения мы приняли, не только дает высокие урожаи, но и сохраняет экспрессию поверхностных маркеров, что является фундаментальным для последующего анализа FACS.
Использование коктейля коллагеназы I и II и термолизином, гарантирует минимальную партии к партии различий в активности фермента делает этот метод высокой воспроизводимостью. Другие опубликованные методы опираются на различные коктейли ферментов, но в наших руках, они дают более низкие урожаи и, что более важно, являются менее воспроизводимым. Наш метод, однако, не делает различий между клетками, населяющих эпидермис и клеток, населяющих дермы. Так как во многих случаях это может быть полезно провести различие между этими двумя различными отсеками, заинтересованный читатель может обратиться к этим предыдущим работам , которые используют такие методы. 15
В нашем примере опыт кожиs из уха и хвост легче усваивается, чем кожа ствол, где подкожный слой жира должен быть тщательно соскабливают с тем чтобы сделать дермы доступным для ферментный коктейль. Обезжиривание шаг, хотя и режущая следует проводить быстро и аккуратно, чтобы поддерживать жизнеспособность клеток. Удлинение или слишком тщательный шаг обезжиривание может привести к повреждению резидента иммунных клеток в коже и, следовательно, приводит к гораздо более низким выходом и снижение жизнеспособности восстановленных клеток.
Следует также отметить, что для сохранения целостности поверхностных маркеров, переваривание должна выполняться в среде, лишенной восстанавливающих агентов, таких как бета-меркаптоэтанол. Для того, чтобы избежать нежелательного повреждения поверхностных маркеров, время инкубации должны быть максимально короче, насколько это возможно, и в любом случае, не продлевается в течение более 90 мин.
Особое внимание следует также, взятые при заливке переваренных образцы кожи в клеткусетчатый фильтр. Важно тщательно промыть переваренной кожу для того, чтобы смыть освобожденные клетки перед тем как ударять переваренной образец с поршень шприца. С помощью этого шага образец кожи вымывается из освобожденных иммунных клеток, которые затем не претерпевают более физический стресс. Разгром также следует проводить осторожно, чтобы не убить любые клетки и как сетчатый фильтр клеток и поршень шприца должен быть тщательно промыты в последующей стадии промывки.
Переваривание кожи может быть также выполнена в 50 мл сокола на водяной бане при 37 ° С. В этом случае кожа может быть нарезанной заранее, а затем помещают в трубки сокола. Следует отметить, что образцы кожи всегда должен быть погружен в пищеварении буфера во время инкубации, и что ушные кусочки прилипают к бокам пробирки Фалкон. При использовании пробирки Фалкон, поэтому убедитесь, что куски нарезанной пребывания кожи погруженные в переваривании среде.
Этот метод может быть полезным в маюбые различные экспериментальные установки, особенно при изучении не-воспаленной кожи. Во время воспаления, расширение кровеносных сосудов и отек тканей ослабить структуру ткани и иммунных клеток из крови массово набраны на кожу. Эффективность восстановления клеток, таким образом, значительно выше. В условиях гомеостаза, эффективный способ, чтобы переварить плотную коллагеновую матрицу дермы, по сути, необходимы для того, чтобы восстановить иммунную клетку, составляющих сложную сеть, населяющих кожу.
Читатель также может быть заинтересован в проведении всеобъемлющего обзора , который охватывает происхождение и фенотип различных дендритных клеток и макрофагов , населяющих кожу в обоих гомеостаза и воспалительных состояниях. 16
В различных экспериментальных условиях, различные части кожи мыши можно лечить. Например, в модели трансплантации кожи, часть хвоста может быть пересажен на стволе принимающего животного; когда studyinобразование отека г или процедуры иммунизации, стимулы часто вводят на подушечку мышей, в то время как ухо часто используется для оценки памяти Т-клеток с DTH анализов. С помощью нашего метода мы могли эффективно извлекать иммунные клетки кожи резидентов из разных мест, что делает наш метод полезен для экспериментальной установки выбора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Supplemented RPMI 1640 medium | RPMI1640 supplemented w/ L-glu, pen-strep w/o beta mercapto ethanol | ||
| PBS | |||
| FBS | |||
| Liberase TM (Enzyme Mix) | Roche | 5401119001 | resuspend [2.5 mg/ml] in dH2O; store aliquots at -20 °C |
| Dnase I | Sigma | D4263-1VL | resuspend in RPMI 1640 w/o serum [1,000 U/ml] |
| Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forceps | |||
| Surgical Scalpel | |||
| 35 mm Petri dishes | |||
| 66 mm Petri dishes | |||
| 100 mm Petri dishes | |||
| 70 µm Cell Strainers | BD | 352350 | |
| Digestion cocktail | Dilute in RPMI 5% FBS | ||
| LIberase TM | 300 µg/ml | ||
| DNAse1 | 50 U/ml | ||
| Antibodies | |||
| Name | Company | Clone | Label |
| aCD45.2 | 104 | PE-Cy5.5 | |
| aCD11c | N418 | PE-Cy7 | |
| CD11b | M1/70 | FITC | |
| F4/80 | A 3-1 | APC-Cy7 | |
| aCD4 | Gk1.5 | APC-Cy7 | |
| aCD8 | 53-6.7 | PE | |
| aCD64 | X54-5/7.1 | PE-Cy7 | |
| aCD207 | 4C7 | APC | |
References
- Streilein, W. J. Circuits and signals of the skin-associated lymphoid tissues (SALT). Journal of Investigative Dermatology. 85 (1 Suppl), 10s-13s (1985).
- Tay, S. S., Roediger, B., Tong, P. L., Tikoo, S., Weninger, W. The Skin-Resident Immune Network. Current dermatology reports. 3, 13-22 (2014).
- Shen, W., et al. Adaptive immunity to murine skin commensals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2977-E2986 (2014).
- Broggi, A., Zanoni, I., Granucci, F. Migratory conventional dendritic cells in the induction of peripheral T cell tolerance. Journal of leukocyte biology. 94 (5), 903-911 (2013).
- Pan, J., et al. DCs metabolize sunlight-induced vitamin D3 to'program'T cell attraction to the epidermal chemokine CCL27. Nature Immunology. 8 (3), 285-293 (2007).
- Vitali, C., et al. Migratory, and not lymphoid-resident, dendritic cells maintain peripheral self-tolerance and prevent autoimmunity via induction of iTreg cells. Blood. 120 (6), 1237-1245 (2012).
- Azukizawa, H., et al. Steady state migratory RelB+ langerin+ dermal dendritic cells mediate peripheral induction of antigen-specific CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells. European journal of immunology. 41 (5), 1420-1434 (2011).
- Idoyaga, J., et al. Specialized role of migratory dendritic cells in peripheral tolerance induction. The Journal of clinical investigation. 123 (2), 844-854 (2013).
- Boyman, O., Conrad, C., Tonel, G., Gilliet, M., Nestle, F. O. The pathogenic role of tissue-resident immune cells in psoriasis. Trends in immunology. 28 (2), 51-57 (2007).
- Di Meglio, P., Perera, G. K., Nestle, F. O. The multitasking organ: recent insights into skin immune function. Immunity. 35 (6), 857-869 (2011).
- Rosenblum, M. D., et al. Response to self antigen imprints regulatory memory in tissues. Nature. 480 (7378), 538-542 (2011).
- Rosenblum, M. D., Truong, H. A., Abbas, A. K., Gratz, I. K. 177: Maintenance of memory regulatory T cells in peripheral tissues. Cytokine. 63 (3), 284-285 (2013).
- Kim, B. S., et al. TSLP elicits IL-33-independent innate lymphoid cell responses to promote skin inflammation. Science translational medicine. 5 (170), (2013).
- Gopinathan, K. M. New insights into skin structure: scratching the surface. Advanced drug delivery reviews. 54 (Suppl 1), S3-S17 (2002).
- Sandrine, H., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. The Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 189-206 (2010).
- Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin. Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).
