Protocol
de aprobación del estudio: Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Ministerio de Sanidad italiano (Roma, Italia) de acuerdo con el Decreto Legislativo 27 de Enero de 1992, n. 116 "attuazione della Direttiva n. 86/609 / CEE en materia di protezione degli animali utilizzati un fini sperimentali o ad altri Fini scientifici."
1. Obtención de las muestras de piel
- La eutanasia el ratón por dislocación cervical.
- Oreja:
- Cortar la parte sin pelo de las orejas del ratón.
- dorsal separada y parte ventral mediante tracción con fórceps. Eliminar cualquier resto de cartílagos, raspando suavemente la parte interna de las orejas con fórceps.
- la piel del tronco:
- Afeitarse toda la piel del animal, tanto con una máquina de afeitar eléctrica y con la loción depilatoria delicada.
- Cortar la muestra de piel deseado (de 2 cm 2 hasta toda la piel de los animales).
- Si cortando todo el dorsal y nclusotral de la piel del ratón, haga un corte vertical en el medio del ratón de nuevo y luego se corta a lo largo de las fronteras de las áreas afeitadas de todo el cuerpo del ratón.
- separar suavemente la piel del peritoneo y músculos de la espalda, manteniendo la muestra de piel todavía con el fórceps, mientras que la separación de la muestra de piel con la punta de bordes redondeados cerrado de un tijeras quirúrgicas o un bisturí.
- Preparar una placa de cultivo de 100 mm que contiene 10 ml de PBS frío.
- Eliminar la grasa subcutánea sumergiendo la muestra de piel en PBS en la placa preparada en el paso 1.3.3 y raspando la muestra de piel con pinzas.
- Cola:
- Cortar la cola del ratón.
- Hacer un corte vertical en la cola con unas tijeras quirúrgicas o bisturí quirúrgico, a partir de la base de la cola y que llegan hasta la punta de la cola.
- El uso de fórceps para separar la piel de la cola. Agarrar el borde del corte en la base de la cola y tire suavemente hacia la punta, mientras que la celebración de lacuerpo de la cola con unas pinzas.
- Eliminar cualquier exceso de grasa, raspando suavemente la muestra de piel.
- Alfombra de pies
- Cortar todo el pie ratón con tijeras quirúrgicas. Evitar cortar cualquier piel con pelo.
- Cortar la piel del pie longitudinalmente desde el tobillo hasta el comienzo de los dígitos.
- Mantenga los huesos del tobillo con unas pinzas o con la mano, mientras que agarrar la piel con pinzas y tire de la piel hacia los dígitos como si quitándose un guante.
2. Digestión
- Preparar el cóctel de la digestión de la solución madre (preparado como en la Lista de Materiales) con la siguiente receta: Mezcla de Enzimas (ver Lista de Materiales para las especificaciones) 300 g / ml, Dnase1 50 U / ml. Diluir en RPMI 5% de FBS.
- Picar las muestras de piel con tijeras en trozos pequeños en una placa de Petri de 35 mm con 2 ml de digestión de cóctel (Para la piel del tronco: 2 ml de cóctel Digestión cada 2 cm2 de piel, hasta 3 ml en total).
- Se incuba a 37 ° C durante 90 minutos. Agitar suavemente la placa de Petri 1-2 veces durante la incubación.
- Verter muestras de piel digeridos en un colador de 70 micras de células en 66 mm plato de Petri que contiene 1 ml de RPMI1640 5% de FBS.
- Lavar el filtro con 5 ml de RPMI 1640 5% de FBS.
- Exprimir la muestra a través del filtro de células con un émbolo de la jeringa.
- émbolo de color, placa de Petri y el filtro con 20 ml de RPMI1640 FBS al 5%, la transferencia en un tubo de 50 ml.
3. Los anticuerpos y Etiquetado
- Se lava la suspensión obtenida dos veces con 5 ml de PBS 1% de SFB (o BSA).
- Etiqueta de la suspensión celular obtenida con los anticuerpos deseados.
- Resuspender las muestras en 100 l / muestra de una mezcla que contiene 2 mg / ml de aCD16 / CD32 (clon 2.4G2) diluido en PBS 1% de FBS.
- Incubar durante 15 min a 4 ° C con el fin de bloquear la unión no específica de los anticuerpos deseados a través de receptores de Fc.
- Añadir los anticuerpos indicados en la tabla1.
- Preparar una mezcla de diluir los anticuerpos deseados en 100 l / muestra de PBS 1% de FBS a una concentración de 4 mg / ml.
- Añadir 100 ml de la mezcla preparada en la etapa 3.2.3.1 a cada muestra de manera que en el tubo, habrá un volumen de 200 l de mezcla de anticuerpos a una concentración final de 2 mg / ml.
- Incubar durante 30 minutos a 4 ° C y la cubierta de la luz.
- Lavar con 1 ml de PBS 1% de FBS, de centrifugación durante 5 min a 400 xg, descartar el sobrenadante y resuspender en 300 l de PBS 1% de FBS.
- Añadir DAPI a una concentración final de 2 mg / ml y se incuba a 4 ° C, protegido de la luz durante 10 minutos.
- Analizar las muestras obtenidas por FACS.
- Con el fin de aislar los leucocitos, utilizar la siguiente estrategia gating:
- En primer lugar eliminar las células muertas, colocando puertas en la población DAPI-.
- Seleccione singletes en el FSC-A vs. parcela FSC W como se indica en la Figura 1
- Puerta de las células en función del tamaño y la granularidad típico de los leucocitos de interés.
- Seleccionar CD45 + células en el FSC-A parcela CD45 como se indica en la Figura 1.
- Distinguir las diferentes poblaciones de leucocitos por la expresión de marcadores de superficie como sigue:
- Identificar los países en desarrollo como células CD11c + II + MHC. Estos pueden ser analizados después para la expresión de CD207 para distinguir las células de Langerhans y CD207 + dérmica DCs de CD207- dérmica DCs.
- Identificar los macrófagos como células CD64 + F4 / 80 +.
- Identificar las células B como las células CD19 + MHCII +.
- Identificar las células T como CD8 + o células CD4 +.
- Con el fin de aislar los leucocitos, utilizar la siguiente estrategia gating:
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Representative Results
La piel de diferente región del cuerpo se digirió de acuerdo con el protocolo descrito y se tiñeron con los anticuerpos indicados. La estrategia gating se representa en la Figura 1. En primer lugar seleccionar células vivas (células DAPI-), entonces la puerta en singletes (FSC-A vs. FSC-W) y en células con morfología de linfocitos (FSC frente a SSC-A-A). Cuando esté indicado, se seleccionan las células CD45 + de origen hematopoyético.
DCs están etiquetados con anti-CD11c, -MHCII, y -CD45 anticuerpos, los macrófagos se identifican como F4 / 80 + CD64 + CD45 + células, células B como CD19 + CD45 + MHCII + células, los linfocitos T CD4 + como CD4 + CD45 + células, y los linfocitos T CD8 + como las células CD8 + CD45 + (Figura 2).
Este método guarantees alta viabilidad de la población digerido con más de 50% de células viables totales (DAPI-) en todas las regiones de la piel que son analizados (Figura 3A). Una indicación de la cantidad de células CD45 + rendimiento por cm 2 se representa en la Figura 3B.
Una estimación del número total de DCs, los macrófagos, las células B y las células CD4 + o células T CD8 + obtenible a partir de la digestión de 1 cm 2 de piel de ratón se indica en la Figura 3C.
Figura 1. Identificación de células de origen hematopoyético en la piel suspensiones de una sola célula. Suspensiones unicelulares han sido teñidas con DAPI y el anticuerpo anti-CD45. Entre las células vivas (DAPI-negativo), singletes (FSC-A frente a FSC-H) se analizan para seleccionar células con leucocitos morfología (FSC frente a SSC-A-A). Las células de origen hematopoyético se identifican como CD45 +.
Figura 2. Análisis de células inmunes presentes en la piel de ratón derivados de diferentes regiones. Las células se cerrada como se indica en la Figura 1. DCs se identifican como CD11c + células MHC II + CD45 + y luego se tiñó con CD207 para distinguir las células de Langerhans y CD207 + dérmica países en desarrollo de CD207 -; Los macrófagos son identificados como CD64 + 80 + CD45 + células / F4; Los linfocitos T se dividen en CD8 + CD45 + células CD4 + y CD45 + en las células; Las células B se identifican como células MHCII + CD19 + CD45 +. Los porcentajes se refieren al total de células CD45 +.
Figura 3. Análisis cuantitativo de las células inmunes presentes en la piel de ratón de diferentes regiones (A) Porcentaje de viable. (DAPI -) células derivadas de las regiones indicadas de la piel del ratón. (B) Los números absolutos de células CD45 + en las diferentes regiones de la piel del ratón expresan en número de células por cm2 de piel. (C) Número estimado de DCs, MΦ, las células B y las células CD4 + o células T CD8 + derivados de 1 cm 2 de la piel de las regiones indicadas de la piel del ratón.
| Anticuerpo | tinción | Concentración | Hora | Temperatura |
| DCMezcla | ||||
| CD11c | PE-Cy7 | 2 g / ml | 30 minutos | 4 ° C |
| MHC II | EDUCACIÓN FÍSICA | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD207 | APC | " | " | " |
| Los macrófagos Mix | ||||
| F4 / 80 | APC-Cy7 | 2 g / ml | 30 minutos | 4 ° C |
| MHC II | EDUCACIÓN FÍSICA | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD64 | PE-Cy7 | " | " | " |
| Mezclar las células T y B | EDUCACIÓN FÍSICA | 2 g / ml | 30 minutos | 4 ° C |
| CD4 | APC-Cy7 | " | " | " |
| CD19 | APC | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
Tabla 1. Indicaciones para la tinción de las diferentes poblaciones de células inmunes que pueblan la piel. Tres mezclas se indican para la tinción de las DC, macrófagos y linfocitos.
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Discussion
Hemos descrito un método para la preparación de suspensiones de una sola célula a partir de diferentes regiones de la piel del ratón. El método de la digestión hemos adoptado, no sólo da altos rendimientos sino que también conserva la expresión de marcadores de superficie, que es fundamental para el posterior análisis de FACS.
El uso de un cóctel de colagenasa I y II y termolisina, garantiza lote mínimo a las diferencias de lote en la actividad enzimática haciendo de este método altamente reproducible. Otros métodos publicados se basan en diferentes cócteles de enzimas, pero en nuestras manos que dan rendimientos más bajos y, más importante aún, son menos reproducibles. Nuestro método, sin embargo, no discrimina entre las células que pueblan la epidermis y las células que pueblan la dermis. Dado que en muchos casos podría ser útil distinguir entre estos dos compartimentos diferentes, nos dirigimos al lector a estos trabajos previos que utilizan tales métodos. 15
En nuestra muestra la experiencia de la piels de la oreja y la cola son más fáciles de digerir que la piel del tronco, donde la capa de grasa subcutánea tiene que ser raspado a fondo a fin de que la dermis accesible para el cóctel de enzimas. El paso-de engrase, sin embargo, así como el corte debe realizarse de forma rápida y suavemente a fin de mantener la viabilidad celular. Una etapa de desengrasado prolongada o demasiado a fondo puede provocar daños en el residente células inmunes en la piel y por lo tanto resultar en un rendimiento mucho más bajo y la disminución de la viabilidad de las células recuperadas.
También hay que señalar que para preservar la integridad de los marcadores de superficie, la digestión se debe realizar en un medio carente de agentes tales como β-mercaptoetanol reductor. Para evitar daños no deseado a los marcadores de superficie, el tiempo de incubación debe mantenerse lo más corto posible y, en cualquier caso, no prolonga durante más de 90 min.
Debe prestarse especial atención, también, tomada al verter las muestras de piel digeridos en la célulacolador. Es importante lavar a fondo la piel digerido con el fin de lavar las células liberadas antes de romper la muestra digerida con el émbolo de la jeringa. Con este paso, la muestra de piel se ha limpiado de las células inmunes liberados luego de que no se someten a ningún tipo de estrés más físico. El aplastamiento se debe también realizar con cuidado a fin de no destruir cualquier célula y tanto el filtro de células y el émbolo de la jeringa se deben lavar a fondo en la etapa de lavado posterior.
la digestión de la piel también se puede realizar en un Falcon de 50 ml en un baño de agua a 37 ° C. En este caso la piel puede ser cortado de antemano y se coloca en el tubo Falcon. Tenga en cuenta que las muestras de piel siempre deben ser sumergidos en tampón de digestión durante la incubación y que oído-piezas se adhieren a los lados de tubos Falcon. Al utilizar tubos Falcon, por lo tanto, asegúrese de que las piezas de piel picada estancia sumergidos en el medio de la digestión.
Este método puede ser útil en many diferentes parámetros experimentales, en particular cuando se estudia la piel no inflamado. Durante la inflamación, la vasodilatación y la hinchazón de los tejidos a aflojar la estructura del tejido y las células inmunes de la sangre son reclutados masivamente a la piel. La eficiencia de recuperación de células es, por lo tanto, mucho más alto. En condiciones homeostáticas, una manera eficaz para digerir la matriz de colágeno apretado de la dermis es, de hecho, necesario con el fin de recuperar la célula inmune que constituye la compleja red poblar la piel.
El lector también podría estar interesado en una revisión exhaustiva que abarca el origen y el fenotipo de las diferentes células dendríticas y macrófagos pueblan la piel en ambas condiciones homeostáticas e inflamatorias. 16
En diferentes parámetros experimentales, diferentes porciones de piel de ratón se pueden tratar. Por ejemplo, en modelos de trasplante de piel, una porción de la cola podría ser trasplantado en el tronco de un animal que recibe; cuando studying formación de edema o procedimientos de inmunización, los estímulos son a menudo inyectaron en la almohadilla de la pata de los ratones, mientras que el oído se utiliza con frecuencia para evaluar la memoria de las células T con los ensayos de DTH. Con nuestro método podemos extraer eficazmente las células inmunes residentes de la piel de diferentes lugares haciendo nuestro método útil para el establecimiento experimental de elección.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Supplemented RPMI 1640 medium | RPMI1640 supplemented w/ L-glu, pen-strep w/o beta mercapto ethanol | ||
| PBS | |||
| FBS | |||
| Liberase TM (Enzyme Mix) | Roche | 5401119001 | resuspend [2.5 mg/ml] in dH2O; store aliquots at -20 °C |
| Dnase I | Sigma | D4263-1VL | resuspend in RPMI 1640 w/o serum [1,000 U/ml] |
| Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forceps | |||
| Surgical Scalpel | |||
| 35 mm Petri dishes | |||
| 66 mm Petri dishes | |||
| 100 mm Petri dishes | |||
| 70 µm Cell Strainers | BD | 352350 | |
| Digestion cocktail | Dilute in RPMI 5% FBS | ||
| LIberase TM | 300 µg/ml | ||
| DNAse1 | 50 U/ml | ||
| Antibodies | |||
| Name | Company | Clone | Label |
| aCD45.2 | 104 | PE-Cy5.5 | |
| aCD11c | N418 | PE-Cy7 | |
| CD11b | M1/70 | FITC | |
| F4/80 | A 3-1 | APC-Cy7 | |
| aCD4 | Gk1.5 | APC-Cy7 | |
| aCD8 | 53-6.7 | PE | |
| aCD64 | X54-5/7.1 | PE-Cy7 | |
| aCD207 | 4C7 | APC | |
References
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