Abstract
Während Bakteriämie Streptococcus pneumoniae können über das vaskuläre Endothelium in das Myokard zu translozieren und bilden diskrete Bakterien gefüllte mikroskopische Läsionen (Mikroläsionen), die bemerkenswert sind aufgrund der Abwesenheit von infiltrierenden Immunzellen. Aufgrund ihrer Freisetzung von kardiotoxischen Produkte, S. pneumoniae im Mikroläsionen werden gedacht, um auf die Herzinsuffizienz, die häufig während der Knall invasive Pneumokokken-Erkrankungen bei Erwachsenen beobachtet bei. Hierin ist ein Protokoll zur experimentellen Maus-Infektion, die zu Herz Mikroläsion Bildung innerhalb von 30 Stunden führt reproduzierbar nachgewiesen. Der Unterricht wird auf Mikroläsion Identifikation in Hämatoxylin & Eosin Herzschnitte und die morphologischen Unterschiede zwischen frühen und späten Mikroläsionen zur Verfügung gestellt werden hervorgehoben. Der Unterricht wird über ein Protokoll zur Überprüfung der S. bereitgestellt pneumoniae im Mikroläsionen mit Antikörpern gegen Pneumokokken-Kapselpolysaccharid undImmunfluoreszenzmikroskopie. Zuletzt wurde ein Protokoll für die Antibiotika-Intervention, infizierten Mäusen und für die Erfassung und Beurteilung der Narbenbildung in den Herzen der rekonvaleszenten Mäusen befreit ist. Zusammen werden diese Protokolle die Untersuchung der molekularen Mechanismen Pneumokokken Herz Invasion Kardiomyozyten Tod kardialen Remodeling als Folge der Exposition gegenüber S. erleichtern pneumoniae, und die Immunantwort auf das Pneumokokken im Herzen.
Introduction
Krankenhausaufenthalt von Erwachsenen für ambulant erworbener Pneumonie (CAP) trägt eine dokumentierte Risiko für unerwünschte kardiale Ereignisse, die Sterblichkeit 1-4 beiträgt. In einer aktuellen Studie von Corrales-Medina et al. Herzkomplikationen wurden gefunden, um mit und / oder verantwortlich für 27% der Pneumonie-assoziierten Todesfälle 3 zugeordnet werden. Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken die), die häufigste Ursache der GAP und Sepsis 5, wurde direkt mit unerwünschter kardialer Ereignisse bei nicht weniger als 19% der erwachsenen Patienten zugelassen 6 verbunden. MACE mit Lungenentzündung sind neu oder verschlimmert Herzinsuffizienz, Herzrhythmusstörungen und Herzinfarkt in abnehmender Häufigkeit 6.
In einer aktuellen PLoS Pathogens Artikel von Brown et al., S. pneumoniae wurde gefunden, fähig Translokation durch die Herz Gefäßendothel Eintritt in die myocardium, und die Bildung von diskreten nicht-eitriger mikroskopische Läsionen (Mikroläsionen) mit Bakterien in den Herzkammern während invasive Pneumokokkenerkrankung (IPD) 7 gefüllt. Der Nachweis der Herz Mikroläsion Bildung wurde in der Herzproben von nicht-menschlichen Primaten und Einzelpersonen, die Pneumokokkeninfektion erlegen beobachtet. Ebenso experimentell infizierten Mäusen reproduzierbar kardialen Mikroläsionen entwickelt. Bei Mäusen wurde Mikroläsion Größe und Anzahl positiv mit der Dauer und Schwere der Bakteriämie Ebenen Troponin in Seren und aberrante kardialen Elektro korreliert. Bakterielle Translokation in das Herz wurde gefunden, durch die gleichen Mechanismen für die Translokation des Pneumokokken durch die Blut-Hirn-Schranke und die Entwicklung einer Pneumokokken-Meningitis, dh Cholin-Bindungsprotein A vermittelte Invasion von vaskulären Endothelzellen in einem Laminin-Rezeptor und Platelet verantwortlich auftreten aktivierenden Faktor-Rezeptor-abhängigen Weise 8. MicrolesIonenbildung benötigt auch die Pneumokokken-porenbildende Toxin Pneumolysin, die gefunden wurde, um Kardiomyozyten 7 töten.
Pneumokokken Herzmikroläsionen sind verschieden von eitrigen Weichgewebe und Herz Abszessen, die von anderen Gram-positive Bakterien einschließlich Staphylococcus aureus hervorgerufen werden. Diese werden durch einen einzelnen Brennpunkte der Bakterien durch Neutrophile und Fibrinablagerung 9,10 umgeben ist. Mikroläsionen von S. gebildet pneumoniae sind kleiner, im gesamten betroffenen Herz verteilt, und es fehlt Immun Zellinfiltrate. Während der frühen Stadien der Infektion, Mikroläsionen verursacht durch S. pneumoniae erscheinen als Bereiche der beschädigte oder entzündete Gewebe erinnert an die pathologische Anzeichen einer Kardiomyopathie. Einige Monozyten kann während dieser Zeit beobachtet werden, aber ihre Anwesenheit ist von kurzer Dauer und Läsionen schnell nekrotischen Stellen entstehen und bei gleichzeitig weiterhin gr mit Bakterien gefülltow Größe bis zum Tod des Tieres oder antimikrobielle Intervention. Wichtig ist, dass innerhalb 3 Tage der antibiotischen Intervention, starkes Immunzellinfiltration wird am ehemaligen Läsion beobachtet und dies wird durch robuste Kollagenablagerung begleitet. Ähnliche kardialen Remodeling wurde berichtet, kommen folgenden Infarkt mit nachhaltigen Folgen auf die Herzfunktion 11-15. So sind Mikroläsionen eine mögliche Erklärung für die unerwünschten kardialen Ereignissen, die während IPD und möglicherweise die erhöhte Inzidenz von Herz-Mortalität in rekonvaleszenten Menschen, die die Krankheit Folge überlebt haben, auftreten.
Hierin wird Anweisungen auf dem experimentellen Mausmodell der IPD und Herz-Läsion Bildung und Visualisierung von kardialen Mikroläsionen in frühen und späten Stadien der Infektion zur Verfügung gestellt. Das Protokoll für die Erfassung der Kollagenabscheidung in Tieren, die von antimikrobiellen Intervention gespeichert wurden demonstriert. Das Ziel dieses Artikels ist es, facilitate die Forschung von anderen Forschern auf diesem wichtigen und neuartigen Pneumokokken-Pathologie.
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Protocol
HINWEIS: Alle Maus-Experimente wurden überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse an der University of Texas Health Science Center in San Antonio (Protokoll # 13032-34-01C) zugelassen. Tierpflege und experimentelle Protokolle, um öffentliches Recht 89-544 (Tierschutzgesetz) und ihren Anhängen, Public Health Service Richtlinien, und der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (US Department of Health & Human Services) eingehalten werden.
1. Infektion
- Erhalten BALB / c Mäusen beiderlei Geschlechts im Alter von 10 bis 12 Wochen alt sind zwischen.
HINWEIS: S. pneumoniae Serotyp 4 Dehnungs TIGR4 ist ein virulenter klinischen Isolat, das sequenziert wurde 16. - Wachsen TIGR4 in Todd-Hewitt-Brühe bei 37 ° C in 5% CO 2 bis zum Erreichen einer optischen Dichte (OD) 620 0,5 (entsprechend 1,0 x 10 & sup8; koloniebildende Einheiten [CFU] / ml). Pellet die Pneumokokken-Kultur durch Zentrifugation für 10 min bei 3500 · g und Überstand mit einer Vakuumleitung. Auszusetzen und verdünnte Bakterien mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bis zu einer Endkonzentration von 1,0 x 10 4 KbE / ml.
- Mit Hilfe eines Induktionskammer, betäuben Mäuse mit 2,5% Isofluran in Sauerstoff verdampft. Bestätigen narkotisierten Zustand von sanften toe Prise mit stumpfen Pinzette.
- Halten Sie den narkotisierten Maus durch sein Genick und aufrecht mit einer Hand zu injizieren jede Maus intraperitoneal (ip) mit 100 ul des S. pneumoniae Suspension mit einer Spritze mit einer 27-30 Gauge-Nadel (entsprechend einer Provokationsdosis von 1,0 x 10 3 CFU). Platzieren Sie die Maus wieder in seinem Käfig. Mäuse erwachen normalerweise 30-40 sec nach der Injektion.
- Lassen Sie die Infektion zu mindestens 24 (Anfang) oder 30 (erweitert) h fahren.
- Euthanize die Mäuse durch CO 2 Ersticken. Führen Genickbruch an der Maus zu gewährleisten verstorben. Sterbehilfe wird durch Entfernen bestätigtdes Herzens in Schritt 1.6.
- Desinfizieren Sie den Schwanz mit einem Alkoholtupfer und schneiden eine 2-3 mm Abschnitt. Sammel 2 ul Blut und seriell verdünnt das Blut 10-fach in PBS Natriumheparin 1 U / ml fünfmal enthält. Plattenreihenverdünnungen auf einer tryptischer Soja Blutagarplatte und Inkubation über Nacht bei 37 ° C in 5% CO 2. Am nächsten Tag extrapolieren aus Kolonie zählt das Niveau der Bakteriämie.
- Immobilisierung der Maus in Rückenlage auf einer chirurgischen Plattform. Sprühen Sie die Brust mit 70% Ethanol und trocken tupfen. Mit chirurgische Scheren und Zangen öffnen Sie die Brusthöhle, nehmen Sie den Brustkorb und durchschneiden die Membran, um das Herz und die Lunge aus. Mit einer Schere schneiden die Blutgefäße mit dem Herzen verbunden und vorsichtig herausschneiden das Herz mit Sorgfalt zu vermeiden Druck mit einer Pinzette.
- Spülen Sie das Herz mit PBS und dann in Gewebeprobenentnahme Kassetten, so dass Koronalschnitte würde während der Gewebeschneide erhalten zu platzieren. Für Paraffineinbettung, place die Kassetten in 10% gepuffertem Formalin-Lösung und den nächsten Tag zu senden für die Paraffineinbettung.
- Alternativ Flash-Freeze mit OCT-Verbindung innerhalb eines cryomold, die auf Trockeneis platziert wurde.
2. Visualisierung der Herz Läsionen und Pneumokokken innerhalb Läsionen
- Reduzieren Sie in Paraffin eingebetteten Herzen Abschnitte, so dass die vier Kammern des Herzens in jedem Gewebeschnitt zu sehen sind. Geschnitten Folien in einer Dicke von 5 um.
- Entparaffinieren und schmutz Folien mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) mit Standardverfahren 17.
- Ansicht H & E gefärbten Herz Abschnitte mit einem Lichtmikroskop bei niedrigen (100X, 200X) und hoher (Öl-Immersion: 400X, 1,000x) Vergrößerungen. Charakterisieren Herzen auf das Vorhandensein von Mikroläsionen im Myokard. Hier erwerben H & E-Bilder mit einem Zeiss Axioskop 2 Mikroskop mit einer 100X 1.3 numerische Apertur Plan-Neofluar Ziel ausgestattet.
HINWEIS: Bei inszeniert frühen Herz lesions werden von ihren Differential gefärbte Aussehen und in manchen Fällen das Vorhandensein von Immunzellen (Monozyten und Granulozyten), was anscheinend Monocyten diskriminiert. In fortgeschrittenen Läsionen, insbesondere diejenigen, bei 30 Stunden zu sehen, sind die Immunzellen fehlen und große vakuolenartigen Läsionen an ihrer Stelle beobachtet. Es ist wichtig anzumerken, dass, während Immunzellzufluss in den frühen Stadien der Herz Läsionsentwicklung auftreten kann es scheint nicht eine Voraussetzung sein.
3. Immunfluoreszenz-Mikroskopie für Pneumokokken innerhalb von Mikroläsionen
- Abschnitt Herz in cryomolds mit Mikrotom bis zu einer Dicke von 5 um und Ort Schnitte auf positiv geladene Objektträger aus Glas. Lassen Sie gefrorene Herz-Abschnitte zu tauen und der Luft trocknen. Fix Sektionen für 10 min in 10% neutral gepuffertem Formalin (pH 6,8-7,2 bei 25 ° C).
- Waschen Folien (3x) in PBS für 5 min, 15 min permeabilisiert in 0,2% Triton X-100 in PBS, dann einmal in PBS gewaschen.
- Block Gewebe Abschnit auf auf Objektträger mit 10% Ziegenserum in PBS für 1 Stunde.
- Spülen Folien mit PBS, Deckel und inkubieren Herzschnitte mit Kaninchen-Anti-Serotyp 4 Pneumokokken-Antiserum bei 1: 1000 in PBS mit 10% Ziegenserum für 2 Stunden bei 37 ° C.
HINWEIS: Für negative Kontrollen sollten Ermittler naive Kaninchen-Antiserum verwenden - Nach dem Waschen mit PBS, Deckel und inkubieren Abschnitte mit 10% Ziegenserum-PBS mit Ziegen-Anti-Kaninchen-FITC-konjugiertem Antikörper bei 1: 2.000 für 30 Minuten bei 37 ° C.
- Nach den Anweisungen des Herstellers, verwendet DAPI (4 ', 6- Diamidino-2-Phenylindol) bei 5 mg / ml für die Visualisierung von eukaryotischen Kernen. Waschen und montieren Gewebeschnitte mit FluorSave.
- Erwerben Fluoreszenzbilder mit einem konfokalen Mikroskopsystem bei niedrigen und hohen Vergrößerung. Stellen Sie die numerische Apertur entsprechend optimale Ergebnisse zu erhalten. Hier erwerben Fluoreszenzbilder mit einem konfokalen System mit einem 60X 1,42 numerischer Apertur Ziel.
- Beginnen mit Mäusen infiziert ip mit 1,0 x 10 3 CFU von TIGR4 wie zuvor in Schritt 1 angezeigt.
- Beginnend bei 30 Stunden nach der Infektion zu verwalten pharmazeutischer Qualität ip Ampicillin (80 mg / kg Körpergewicht) in 100 ul Kochsalzlösung alle 12 Stunden 36 Stunden. Sammeln Herzen am gewünschten Zeitpunkt und Verfahren, wie in Schritt 1.6 für Paraffineinbettung und Gewebe, Schnitt beschrieben.
5. Kollagenablagerung Erkennung
- Mit Xylol und abgestufte Alkoholschlichten mit VE-Wasser, entparaffinieren und Hydrat Gewebeschnitte mit Standardverfahren 17. Gönnen Abschnitte mit einer wässrigen 0,2% Phosphormolybdänsäure für 5 Minuten einwirken lassen und mit VE-Wasser für 5 min.
- Fleckenabschnitte mit 0,1% Sirius Rot in Pikrinsäure für 2 h bei Raumtemperatur.
- Auswaschbereiche in 0,01 N Salzsäure für 3 min und Spülen mit 70% Ethanol für 1 min.
- Dehydrate die Abschnitte mit dem identisch, aber in umgekehrter Reihenfolge der Waschgänge wie in 5.1 dargelegt, dehydrieren Herz Abschnitte bei der Steigerung und abgestuften Konzentrationen von Ethanol dann Xylol.
- Berg Gewebeschnitte mit einem Befestigungslösung für mikroskopische Auswertung.
- Um festzustellen, Regionen Kollagenablagerung, untersuchen Buntgewebeschnitten für Bereiche der tiefen Lese Färbung bei geringer und hoher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop. Jeder Bereich, in den Kammern des Herzens, die rot ist, ist ein Bereich, wo Kollagen abgeschieden wurde. Bereiche ohne diese roten Flecken sind Websites von gesundem Gewebe fehlt Kollagenablagerung. Hier erwerben picro Sirius Red Bunt Bilder mit Hilfe eines Mikroskops mit einem 20X 0,5 numerische Apertur Ziel ausgestattet.
HINWEIS: Die Atrium Flecken rot in gesunden Geweben.
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Representative Results
Visualisierung von Mikroläsionen von H & E
Herzmikroläsionen wurden in den Ventrikeln des H & E gefärbten Herzschnitten von Mäusen mit IPD nach ihrer ip Herausforderung TIGR4 beobachtet. Figur 1 veranschaulicht die Zunahme der Größe dieser Läsionen zwischen 24 und 30 h nach der Infektion (hpi), mit einer größeren Anzahl von Hämatoxylin färbten (dh, lila-blau) Pneumokokken innerhalb der Läsion sichtbar. Mikroläsionen wurden durch eine vakuolenartigen Morphologie dichtere Eosin (rot) Färbung von Kardiomyozyten in den Zellen unmittelbar benachbart zu der Läsionsstelle, Diplokokken innerhalb der Läsionen und eine allgemeine Fehlen von Immunzellen sind. Etwa die Hälfte der Läsionen wurden neben sichtbaren Blutgefäße. Zwischen 24 und 30 hpi Mikroläsionen zahlreicher wurden und wesentlich größer. Bei 30 hpi extrazellulären Bakterien konnte oft gesehen Streaming von einer Läsion zwischen den Zellen werden.
Visualizatiauf S. pneumoniae Mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie
Zu visualisieren und zu bestätigen, dass S. pneumoniae waren in der Tat in Läsionen, wurde Immunfluoreszenzfärbung für Serotyp 4 Kapsel-Polysaccharid, das von TIGR4 produziert wird (Abbildung 2) verwendet. Aufgenommene Bilder zeigten das Vorhandensein von eng gepackten und dichte Aggregate von S. pneumoniae in Mikroläsion Webseiten.
Der Nachweis der Herz Narben
Picro Sirius Rot-Färbung wurde auf die Herzschnitte von Mäusen, die mit Ampicillin und infizierten Kontrollen gerettet worden war durchgeführt. In Antibiotika gerettet Genesungs Mäusen gab es einen dramatischen Anstieg in der Gegenwart und der Intensität der picro Sirius Red Fleck mit Bändern Streaming von scheinbar ehemaligen Läsionsstellen in den Ventrikeln (Abbildung 3). Im Gegensatz dazu wurden die Ventrikel in Steuerabschnitte unbefleckt darauf hinweist, dass die Kollagenablagerung fehlte (Nicht gezeigt).
Zusammen zeigen diese Ergebnisse die Fähigkeit, Herzmikroläsionen in Mäusen mit schwerer IPD visualisieren und um resultierende Narbenbildung in den Kammern mit histologischen Standardverfahren zuzugreifen. Wichtig ist, dass Herzmikroläsionen unweigerlich zu hohen Titern von S. verbunden pneumoniae und Zeit benötigt, um ihre Bildung zu vermitteln.
Abbildung 1: Nachweis von Mikroläsionen in H & E gefärbten Herz Abschnitte Vertreter Bilder (1,000x) von 24 hor und 30 Stunden nach der Infektion beobachtet kardialen Mikroläsionen.. Schwarz Maßstabsbalken entsprechen 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Abbildung 2: Immunerkennung von S. pneumoniae im Herzmikroläsionen. Immunfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von Antikörper gegen Serotyp 4 Kapselpolysaccharid (grün) bestätigte die Anwesenheit von S. pneumoniae in kardialen Mikroläsionen. Die Zellkerne wurden mit DAPI blau gefärbt. Weiß Maßstabsbalken entsprechen 20 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3: Collagen Abscheidung bei einer früheren Herz Mikroläsion Website in einem Genesungs Maus Vertreter Bild (200X), die ein picro Sirius Rot gefärbt Herz Mikroläsion im Ventrikel einer Maus 5 Tage nach der Antibiotika-Intervention in.invasive Pneumokokken-Erkrankungen. Rot bedeutet, Kollagenablagerung. Schwarz Maßstab entsprechen bis 20 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
In diesem Bericht wird eine hohe Reproduzierbarkeit der Methode, S. induzieren pneumoniae vermittelten kardialen Mikroläsionen bei Mäusen während IPD und die Techniken für die Visualisierung demonstriert. Mäuse werden mit einer Dosis von Bakterien, die Schwelle des Immunsystems für die Abfertigung übertrifft, was zu einer hochgradigen Bakteriämie, ähnlich der, die bei der menschlichen Sepsis auftritt, und führt zu möglichen bakteriellen Translokation in den Herzmuskel infiziert. Für noch unbekannten Gründen S. pneumoniae im Herzen der Lage ist, von der Immunantwort des Wirts zu replizieren undeterred. Dies ist Gegenstand laufender Untersuchungen und dieser Publikation darf andere Forscher bei ihren Bemühungen um Teilnahme zu erleichtern.
H & E Färbung ermöglicht Mikroläsion Visualisierung mit Standard-Lichtmikroskopie seit Kardiomyozyten Fleck rosa bis rot, während kardiale Mikroläsionen und die Bakterien im blauen Fleck zu Deep Purple. Diese scharfen Kontrast ermöglicht eine einfache DetektiveAuf der Mikroläsionen in späteren Stadien der Infektion, wenn die Läsionen größer. Um die Anwesenheit von S. verifizieren pneumoniae innerhalb der Herzmikroläsionen, Immunofluoreszenz-Mikroskopie mit Antiserum gegen Serotyp 4 Kapselpolysaccharid, das durch TIGR4 geführt wird durchgeführt. Wichtig ist, dass der spezifische Anti-Kapsel-Antikörpers, der verwendet werden sollte, hängt von dem Serotyp des Pneumokokken-Stamm, der zu Versuchs Herausforderung verwendet. Alternativ kann der Untersucher auch im Handel erhältlichen monoklonalen Antikörper gegen Pneumolysin zu verwenden, das porenbildende Toxin von S. pneumoniae oder dass Bestandteile der Pneumokokken-Zellwand zu erkennen (dh TEPC-15). Während diese Antikörper nachzuweisen Pneumokokken innerhalb des Herzens, Erfahrungen aus der Vergangenheit zeigt, dass Antikörper gegen Kapselpolysaccharid bieten die unwiderstehlichsten Bilder 7.
S. pneumoniae vermittelte Herz Mikroläsion Bildung erfordert das Zusammenspiel vonPneumokokken Adhäsin cholinbindende Protein A mit dem Wirtsprotein Laminin Rezeptor für bakterielle Adhäsion an vaskulären Endothelzellen und die Interaktion der Bakterienzellwand Phosphorylcholin mit Host Plättchenaktivierungsfaktor-Rezeptor für bakterielle Transmigration durch die Zelle 7,8. Es ist daher wichtig zu beachten, dass Mikroläsion Bildung fest an Infektionsbelastung und die Zeit, die die Frequenz und die Dauer dieser Wechselwirkungen erhöht und ermöglicht Zeit für die Bakterien zu replizieren und sichtbaren Läsionen entwickeln verbunden. Wir haben bereits festgestellt, dass eine IP-infektiöse Dosis von mehr als 1,0 × 10 3 CFU von S. pneumoniae Stamm TIGR4 führt zu schnellen Tod der Maus und im Ergebnis schlecht Läsionsbildung. Darunter infektiöse Dosis spontanen Clearance bei einigen Mäusen und in anderen tritt verzögerten Beginn der schweren Befall beobachtet wird. Noch für Mäuse mit 1,0 × 10 3 CFU von TIGR4 zwischen 24 und 36 h in Frage,Läsionen schnell Zahl ansammeln und in der Größe wachsen kontinuierlich, bis die Maus wird moribunden. Somit ist die Infektionsdosis des infizierenden Stammes muss titriert, um einen ähnlichen Zustand der Krankheit mit einem sterbenden Staat die Entwicklung in nicht weniger als 30 hpi zu replizieren. Wichtig ist, dass wir immer wieder Herz Läsion Bildung bei Mäusen, die mit 1,0 x 10 7 CFU mit 1,0 x 10 5 KBE TIGR4 infiziert wurden intranasal und intratracheal beobachtet. Im Anschluss an diese Herausforderung Routen Entwicklung einer schweren Krankheit aufgetreten zu späteren Zeitpunkten. Wir beobachteten auch Mikroläsion Bildung mit anderen virulenten Stämmen von S. pneumoniae, wie Serotyp 2 Isolat D39, wenn auch auf unterschiedlichen Frequenzen. Somit sind Läsionen nicht ein Ergebnis der IP Infektionsweg oder spezifisch TIGR4, sondern auf die Dauer und Schwere der Erkrankung Folge gebunden. Hier empfehlen wir den Mäusen ip infizieren, da diese Herausforderung Route bietet den höchsten Grad an Reproduzierbarkeit. Wenn ein diffErent Stamm von S. pneumoniae verwendet wird oder eine andere Infektionsroute gewünscht Ermittler sollte Bakteriämie bei Werten> 10 5 CFU ml Blut Ziel für mindestens 24 Stunden.
Antimikrobielle Intervention ermöglicht die Untersuchung von Ereignissen, die in der Rekonvaleszenz auftreten, Modellierung eines menschlichen in der Intensivstation Einstellung. Es ist erwähnenswert, dass nicht alle Mäuse überleben trotz antimikrobielle Behandlung und bestätigte bakterielle Clearance. Die Forscher sollten die Überlebensraten zwischen 50-60% und sollte die Kohorte Größe entsprechend anpassen, um mit dem Verlust von Tieren befassen erwarten. Eine regelmäßige Überwachung der Tiere nach 24 Stunden wird dringend empfohlen, die Einhaltung zu gewährleisten mit Institutional genehmigten Tier Protokolle. Picro Sirius-Rot-Färbung ist eine einfache und Standardverfahren verwendet werden, um die Kollagenablagerung zu visualisieren. Hierin wird gezeigt, wie dieser Flecken kann zur kardialen Remodeling in den Ventrikeln des Herzens untersucht nach einem traumatischen infectiou werdens Folge. Picro Siriusrot wurde über andere üblicherweise verwendete Techniken ausgewählt, um Kollagenablagerung zu visualisieren, wie "Masson-Trichrom-Färbung", wegen der scharfen Kontrast es zwischen der abgelagerten Kollagens und des umgebenden Gewebes an. Dies hat sich als enorm hilfreich bei der Beurteilung des Ausmaßes der myokardialen Kollagenablagerung folgenden Antibiotika und quantitativ mit einer Software wie ImageJ.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Neogen | 7161A | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| anti-serotype 4 pneumococcus antiserum | Statens Serum Institut | 16747 | |
| goat anti-rabbit FITC conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluorsave | Millipore | 345789 | |
| Permount | Fisher Scientific | S70104 | |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | |
| phosphomolybdic acid 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
| 0.1% Sirius Red in picric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
| 0.01 N hydrochloric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
| Tissue Tack Microscope Slides | Polysciences, Inc | 24216 | |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | unspeciified | Standard |
References
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