Abstract
菌血症の間、 肺炎球菌は、心筋に血管内皮間で移行して起因する免疫細胞浸潤が存在しない場合に顕著である離散細菌で満たされた顕微鏡的病変（microlesions）を形成することができる。心臓毒性製品の彼らのリリース、Sに起因するmicrolesions内ニューモニエは、しばしば成人における劇症侵襲性肺炎球菌疾患の間に観察される心不全に寄与すると考えられる。本明細書中に30時間以内に心臓の微細病変形成の再現性につながる実験的マウス感染のためのプロトコルを示している。命令はヘマトキシリン＆エオシン染色心臓切片で微細病変の同定に提供され、初期および後期microlesions間の形態学的な区別が強調表示されます。命令はSの検証のためのプロトコル上に設けられている肺炎球菌莢膜多糖に対する抗体を用いてmicrolesions内ニューモニエ及び免疫蛍光顕微鏡。最後に、感染したマウスの検出および回復期のマウスの心臓における瘢痕形成を評価するために救助抗生物質の介入のためのプロトコルが提供される。一緒に、これらのプロトコルは、Sへの曝露の結果として肺炎球菌心臓侵略、心筋細胞死、心臓リモデリングの基礎となる分子メカニズムの研究を促進する、肺炎 、心臓における肺炎球菌に対する免疫応答。
Introduction
市中肺炎（CAP）のための大人の入院は死亡率1-4に貢献する有害心イベントのために文書化されたリスクを運ぶ。 、心臓の合併症が関連付けられていることが判明、および/ または肺炎に関連した死亡例3の27％を担当した。コラレス·メディナらによる最近の研究では。 肺炎連鎖球菌 （肺炎球菌）、CAPと敗血症5の最も一般的な原因直接入院成人患者6のような多くの19％ほどで有害心イベントと関連していた。肺炎に関連した有害心イベントは、周波数6を減少させるために、新規または悪化うっ血性心不全、不整脈、および心筋梗塞を含む。
Brown らによる最近のPLoSの病原記事で。、肺炎球菌は myocardiuへの参入、心臓の血管内皮を通じて転座が可能であることが判明したmであり、侵襲性肺炎球菌疾患（IPD）7時の心室中の細菌で満たされた離散非化膿性顕微鏡的病変（microlesions）の形成。心臓の微細病変形成の証拠は、肺炎球菌感染症に屈していたヒト以外の霊長類および個人からの心臓の試料で観察された。同様に、実験的に感染させたマウスは、再現性の心臓microlesionsを開発しました。マウスでは、微細病変の大きさと数は積極的に持続し、菌血症、血清中の心筋トロポニンのレベルの重症度、および異常な心臓電気生理学と相関していた。心臓への細菌転移は、血液脳関門および肺炎球菌性髄膜炎の発症、ラミニン受容体および血小板の血管内皮細胞の、すなわち 、コリン結合タンパク質A媒介浸潤横切る肺炎球菌の転座に関与する同じメカニズムを介して起こることが見出された-activating因子受容体依存的に8。 Microlesイオン形成はまた心筋細胞7を殺すことが判明した肺炎球菌孔形成毒素ニューモリシンを必要とした。
肺炎球菌心臓microlesionsは、 黄色ブドウ球菌を含む、他のグラム陽性菌によって引き起こされる化膿性軟部組織および心膿瘍とは区別される。これらは、好中球およびフィブリン沈着9,10により囲まれた細菌の単一の病巣によって特徴付けられる。 S.によって形成されたMicrolesions 肺炎連鎖球菌は 、サイズが小さく、影響を受けた心臓全体に分散、および免疫細胞浸潤を欠いている。感染の初期段階で、microlesionsはS.によって引き起こさ肺炎心筋症の病理学的徴候を彷彿とさせる、損傷または炎症を起こした組織の領域として表示されます。いくつかの単球が、この期間中に観察することができると同時にグラムを継続しながら、しかし、それらの存在は短命であり、病変は急速に外観壊死および細菌で満たさ動物または抗菌介入の死までのサイズでOW。重要なことには、抗生物質の介入の3日以内に、多量の免疫細胞の浸潤は、前者損傷部位で観察され、これは強固なコラーゲン沈着を伴う。同様心臓リモデリングは、心臓機能11-15上の永続的な影響に加えて、以下の梗塞を発生することが報告されています。したがって、microlesionsはIPD中に発生する有害心イベント、おそらく病気のエピソードを生き残った回復期の個体における心臓関連の死亡の発生率の増加のための潜在的な説明である。
ここで、命令は、感染の初期および後期段階でIPD心臓病変形成および心臓microlesionsの可視化の実験的マウスモデルに設けられている。抗菌介入によって保存された動物におけるコラーゲン沈着の検出のためのプロトコルが示されている。この記事の目的は、Fにあるこの重要かつ新規な肺炎球菌病理上の他の研究者の研究をacilitate。
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Protocol
注：すべてのマウス実験は、サンアントニオ（プロトコル＃の13032-34-01C）でのテキサス大学健康科学センターで施設内動物管理使用委員会によって審査され、承認された。動物のケアと公法89から544（動物福祉法）とその改正、公衆衛生サービスガイドライン、および実験動物の管理と使用に関する指針（ヘルス＆ヒューマンサービスの米国務省）に付着した実験プロトコル。
1.感染
- 生後10〜12週齢の間に男女両方のBALB / cマウスを入手します。
注：S. ·ニューモニエ血清型4株をTIGR4は16を配列決定されている毒性の臨床分離株である。 - 光学密度（OD）0.5の620に達するまで、5％CO 2中37℃でトッド-ヒューイットブロス中TIGR4を成長（1.0×10 8コロニー形成単位[CFU] / mlに相当する）。 3で10分間遠心分離することにより肺炎球菌文化をペレット、500 XG及び真空ラインを用いて上清を除去します。サスペンドおよび1.0×10 4 CFU / mlの最終濃度に滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細菌を希釈する。
- 誘導チャンバーを用いて、酸素中の2.5％イソフルラン気化を有するマウスを麻酔。鈍ピンセットで穏やかな足指のピンチで麻酔状態を確認してください。
- その首筋により麻酔マウスを保持し、片手で直立、Sの100μlの腹腔内（IP）を各マウスを注入ニューモニエ懸濁液 （1.0×10 3 CFUのチャレンジ用量に相当する）27〜30ゲージ針で注射器を使用して。バックそのケージにマウスを置きます。マウスは、通常、注射後30〜40秒を目覚めさせる。
- 感染が少なくとも24（早期）または30（高度な）時間進行させる。
- CO 2窒息によりマウスを安楽死させる。マウスが死亡していることを確認するために頸椎脱臼を行います。安楽死は、さらに除去することによって確認されるステップ1.6で心の。
- アルコール綿棒で尾を消毒2-3 mmのセクションを切り取る。血の2μlのを収集し、連続的に1 U / mlの5回ヘパリンナトリウムを含むPBS中の血液10倍に希釈する。トリプシン大豆血液寒天プレート上にプレート連続希釈し、5％、37℃で一晩インキュベートするコロニーから次の日の外挿2. COは菌血症のレベルをカウントします。
- 外科プラットフォーム上で仰臥位でマウスを固定化。 70％エタノールとパットの乾燥と胸をスプレーしてください。外科用ハサミとピンセットを使用すると、胸腔を開き、胸郭を削除し、心臓や肺を露出するダイアフラムを横断する。ハサミを使用すると、心臓に接続され、血管をカットし、静かにピンセットであざないように注意して心を切り出す。
- PBSで心を洗い流してから冠状切片が組織切片中に得られるであろうような組織検体採取カセットに入れる。パラフィン包埋、ナンプラーのためにCE 10％緩衝ホルマリン液と次の日におけるカセットは、パラフィン包埋のために送る。
- あるいは、ドライアイス上に置かれたクリオモールド内のOCT化合物を用いたフラッシュ凍結。
心臓病変および病変内の肺炎球菌の2可視化
- 心臓の4室はそれぞれの組織切片に表示されているようなパラフィン包埋心臓切片を切り倒し。 5μmの厚さでスライドをカット。
- 標準的な方法17を用いて、ヘマトキシリン＆エオシン（H＆E）を用いて脱パラフィン化し、染色スライド。
- 倍率：ビューH＆Eは、低（100X、200X）と高（400X、1,000倍油浸）で光顕微鏡を用いて心臓の部分を染色した。心筋におけるmicrolesionsの存在を心を特徴づける。ここでは、100X 1.3の開口数を計画-NEOFLUARの目標を装備したツァイスAxioskopを2顕微鏡を用いて、H＆E画像を取得する。
注：初期の段階では、心臓のLesionsは、免疫細胞、単球のように見えるもの（単球および顆粒球）の存在下でそれらの差に着色外観によって、場合によっては区別される。進行した病変、30時間で見られる特にでは、免疫細胞が存在せず、大液胞様病変は、その場所で観察されているされている。これは、心臓の病変発生の初期段階での免疫細胞の流入が起こることができるが、それは必要条件ではないように注意することが重要である。
Microlesions内肺炎球菌3.免疫蛍光顕微鏡
- 正に荷電したガラススライド上に5μmのと場所セクションの厚さにミクロトームとcryomoldsのセクション心。凍結された心臓の項では、解凍し、空気乾燥することができます。 10％中性緩衝ホルマリン（25℃でのpHは6.8〜7.2）で10分間のセクションを修正。
- PBS中0.2％トリトンX-100で15分間透過化、5分間、PBS中のスライド（3×）で洗浄し、次にPBSで再び洗浄する。
- ブロック組織secti 1時間、PBS中10％ヤギ血清を含むスライド上に。
- PBSでスライドをすすぎ、カバーと1でウサギ抗血清型4肺炎球菌抗血清を用いて心臓のセクションをインキュベート：PBS中で千37℃で2時間、10％ヤギ血清で。
注：ネガティブコントロールのために研究者らは、ナイーブウサギ抗血清を使用する必要があります - 37℃で30分間、2000：1で、ヤギ抗ウサギFITCコンジュゲート抗体を、10％ヤギ血清をPBSで切片をPBS、カバーで洗浄し、インキュベートした。
- 製造業者の指示に続いて、真核生物の核の可視化のために5mg / mlのDAPI（4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）を使用する。 FluorSaveで組織切片を洗浄し、マウントします。
- 低及び高の両方の倍率で共焦点顕微鏡システムを用いた蛍光画像を取得する。最適な結果を得るために、それに応じて開口数を調整します。ここでは、60X 1.42開口数の対物レンズで共焦点システムを用いた蛍光画像を取得する。
- マウスで始まる以前に、ステップ1で示したようにTIGR4の1.0×10 3 CFU を腹腔に感染。
- 30時間感染後で開始し、100μlの生理食塩水に36時間ごとに12時間を医薬品グレードのアンピシリンIP（80 mg / kg体重）を管理。パラフィン包埋組織、切片のためのステップ1.6で説明したように所望の時点とプロセスでの心を収集します。
5.コラーゲン沈着の検出
- キシレンを使用して、標準的な方法17を使用して、脱イオン水、脱パラフィンおよび水和物組織切片をアルコールでの洗浄を段階的。 5分間、水、0.2％リンモリブデン酸とのセクションを治療し、5分間脱イオン水ですすいでください。
- 室温で2時間、ピクリン酸中の0.1％シリウスレッドによる染色切片。
- 3分間の0.01 N塩酸のセクションを洗浄し、1分間、70％エタノールを用いてすすぐ。
- Dehydra次いで、キシレンを使用して、同一のセクションをteのが、5.1に概説されたものに洗浄の順序を逆にする、エタノールの濃度を増加させ、段階的に、心臓切片を脱水する。
- 顕微鏡的評価のためのマウントソリューションでマウント組織切片。
- コラーゲン沈着の領域を同定するために、光学顕微鏡を用いて、低域と高倍率で深い読み取り染色の領域について染色した組織切片を調べる。赤である心臓の心室内の任意の領域は、コラーゲンが堆積された領域である。この赤い染みのない領域はコラーゲン沈着を欠いている健康な組織のサイトです。本明細書において、Picroシリウスレッドを取得するには、20X 0.5開口数の対物レンズを備えた顕微鏡を用いて画像を染色した。
注：健常組織における赤アトリウムの汚れ。
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Representative Results
H＆EでMicrolesionsの可視化
心臓microlesionsはTIGR4との腹腔内チャレンジ以下IPDを有するマウスからの心臓の切片をH＆E染色の心室で観察された。 図1は、ヘマトキシリンより多くて、24及び30時間感染後（hpiの）との間のこれらの病変の大きさの増加を示している病変内に見える-stained（ すなわち 、紫-青）肺炎球菌。 Microlesionsは液胞様の形態、密度の高いエオシン（赤）病変部位に直接隣接するセル内の心筋細胞の染色、病変内双球菌、および免疫細胞の一般的な欠如によって特徴づけられた。約半分の病変は目に見える血管に隣接していた。 HPI 24〜30 microlesionsはより多数で、実質的に大きくなった。 30 HPIでは細胞外細菌は、多くの場合、細胞間の病変からストリーミング見ることができた。
VisualizatiSの上免疫蛍光顕微鏡を用いて、肺炎
視覚化していることを確認するために、S.ニューモニエは、実際に病変内、TIGR4によって産生される血清型4莢膜多糖のための免疫蛍光染色（ 図2）を使用した。取り込まれた画像は、Sの密集した、緻密な凝集体の存在を示した微細病変のサイト内の、肺炎 。
心臓瘢痕の証拠
Picroシリウスレッド染色は、アンピシリンおよび非感染対照でレスキューされたマウスからの心臓の切片上で実施した。抗生物質救出回復期のマウスでは、心室の元病変部位（図3）のように見えるものからストリーミングの帯域を持つPicroシリウスレッド染色の存在と強度の劇的な増加があった。対照的に、制御部における心室コラーゲン沈着は存在しなかったことを示す染色された （図示せず）。
一緒に、これらの結果は、重度のIPDを有するマウスにおける心臓microlesionsを視覚化し、標準的な組織学的手順を使用して、心室において生じた瘢痕形成にアクセスする能力を示す。重要なことは、心臓のmicrolesionsは常にSの高力価にリンクされている彼らの形成を媒介するのに必要な、肺炎と時間。
図1：H＆E染色された心臓のセクションでmicrolesionsの検出 24 HORと30時間後の感染で観察心臓microlesionsの代表的な画像（1,000倍）。。ブラックスケールバーは、10μmに相当する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図2：Sの免疫蛍光検出心臓microlesions内の肺炎 。血清型4莢膜多糖類（緑）に対する抗体を用いた免疫蛍光顕微鏡検査は、Sの存在が確認された心臓microlesions内で、肺炎 。核はDAPIで青染色した。ホワイトスケールバーは20μmに相当する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：回復期マウスの元心臓微細病変部位におけるコラーゲン沈着 Picroシリウスレッドを示す代表的な画像（200X）を5日間でのための抗生物質介入後のマウスの心室に心臓の微細病変を染色侵襲性肺炎球菌疾患。レッドはコラーゲン沈着を示している。ブラックスケールバーは20μmで対応する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
本報告書では、再現性の高い方法は、Sを誘導する肺炎連鎖球菌は、IPD中に、マウスにおける心臓microlesionsを媒介し、その可視化するための技術が実証されている。マウスは、ヒトの敗血症の間に生じ、心筋内に最終的に細菌のトランスロケーションをもたらすものと同様の高品位菌血症に至るクリアランス免疫系の閾値を超えた細菌の投与量で感染させる。まだ未知の理由のために、S。心に、肺炎は、宿主の免疫応答によって阻止されていない複製することができる。これは進行中の調査の対象であり、この公報には、参加するための努力で、他の研究者を容易にすることができる。
H＆E染色は、深い紫色のブルー染色内で心臓microlesionsや細菌のに対し、赤に心筋細胞の染色ピンクので、標準の光学顕微鏡を用いて微細病変の可視化を可能にします。この鋭いコントラストが簡単にdetectiを可能に病変が大きい感染の後期の段階でmicrolesionsの上。 S.の存在を確認するために肺炎連鎖球菌は、心臓microlesions内、TIGR4によって運ばれる血清型4の莢膜多糖類に対する抗血清を用いた免疫蛍光顕微鏡検査を行った。重要なことは、使用されるべき特異的抗莢抗体は、実験的な挑戦のために使用されている肺炎球菌株の血清型に依存します。代替的に、研究者らはまた、ニューモリシンに対するS.の孔形成毒素を市販のモノクローナル抗体を使用することができ肺炎連鎖球菌、または肺炎球菌の細胞壁の検出成分（ すなわち 、TEPC-15）。これらの抗体は、心臓内肺炎球菌を検出しながら、過去の経験は、莢膜多糖に対する抗体が最も説得力のある画像7を提供することを示唆している。
肺炎球菌は、心臓の微細病変の形成はとの相互作用を必要とする仲介セル7,8を介して血管内皮細胞および細菌遊出のための宿主血小板活性化因子受容体を有する細菌細胞壁ホスホリルコリンの相互作用への細菌接着のための宿主タンパク質ラミニン受容体と結合タンパク質A、肺炎球菌アドヘコリン。これは、微細病変形成がしっかりこれらの相互作用の頻度および持続時間を増加させ、開発する細菌複製可視病変のための時間を可能にする感染性負荷と時間にリンクされていることに注意することが重要である。私たちは、以前に決定しているSのIP感染量よりも大きい1.0×10 3 CFUこと肺炎連鎖球菌株 TIGR4は、マウスの急速すぎる死に、結果が悪い病変形成として結果。この感染用量自発的なクリアランスは、いくつかのマウスにおいて、他に生じる未満に重篤な疾患の発症の遅延が観察される。しかし、24と36時間の間TIGR4の1.0×10 3 CFUでチャレンジしたマウスのために、病変は急速に数に蓄積し、マウスが瀕死になるまで継続的にサイズが大きくなる。このため、感染株の感染量は瀕死の状態は下回らない30 HPIでの開発と疾患の同様の状態を複製するために滴定する必要があります。重要なことは、我々が繰り返しTIGR4の1.0×10 5 CFUで気管内に1.0×10 7 CFUで鼻腔内感染とされたマウスの心臓病変の形成を観察した。重症疾患のこれらの課題経路の開発に続いて、後の時点で起こった。また、Sの他の毒性株で微細病変の形成を観察した·ニューモニエ 、そのような血清型2分離株D39として、異なる周波数ではあるが。このように、病変はTIGR4 にIP感染経路または特定の結果ではないが、代わりに病気のエピソードの期間および重症度に結びつい。 】ここで我々はこの挑戦ルートが再現性の最高度を提供していますので、マウスの腹腔内に感染させるために助言する。 diffの場合、S.のerent株研究者らは、少なくとも24時間の血液> 10 5 CFU mlのレベルで、菌血症を目指すべき、 肺炎連鎖球菌が使用されるか、または別の感染経路が望まれている。
抗菌介入は、集中治療室の設定で人間をモデル、回復期中に発生するイベントの研究を可能にする。それはしないすべてのマウスは抗菌処理にもかかわらず、生き残るためには、細菌のクリアランスを確認したことは注目に値する。調べで50〜60％の間や動物の損失に対処するためにそれに応じて、コホートサイズを調整する必要があるなどの生存率を期待するべきである。 24時間後の動物の定期的なモニタリングを強く機関が動物のプロトコルを承認したの遵守を確保することをお勧めします。 Picroシリウスレッド染色は、コラーゲン沈着を可視化するために使用される単純な標準的な技術である。本明細書では、この汚れは外傷infectiou後の心臓の心室における心臓リモデリングを調べるために使用できる方法を実証するsのエピソード。 Picroシリウスレッドがあるため、それが堆積コラーゲンと周囲の組織との間で提供さの鮮明なコントラストのため、そのような「マッソントリクローム染色」として、コラーゲン沈着を可視化するために、他の一般的に使用される技術の上に選ばれました。これは、ImageJのようなソフトウェアを用いて定量的に抗生物質後の心筋コラーゲン沈着の程度を評価する際に大いに有用であることが証明されている。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Neogen | 7161A | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| anti-serotype 4 pneumococcus antiserum | Statens Serum Institut | 16747 | |
| goat anti-rabbit FITC conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluorsave | Millipore | 345789 | |
| Permount | Fisher Scientific | S70104 | |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | |
| phosphomolybdic acid 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
| 0.1% Sirius Red in picric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
| 0.01 N hydrochloric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
| Tissue Tack Microscope Slides | Polysciences, Inc | 24216 | |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | unspeciified | Standard |
References
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