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Medicine

Visualização de Published: April 7, 2015 doi: 10.3791/52590

Abstract

Durante a bacteremia Streptococcus pneumoniae pode translocar através do endotélio vascular para o miocárdio e formar bactérias cheios de lesões microscópicas discretas (microlesões) que são notáveis ​​devido à ausência de infiltrado de células imunitárias. Devido a sua liberação de produtos cardiotóxicos, S. pneumoniae dentro microlesões são pensados ​​para contribuir para a insuficiência cardíaca que é freqüentemente observado durante a doença pneumocócica invasiva fulminate em adultos. Nisto é demonstrado um protocolo para a infecção experimental do rato que leva à formação reprodutíveis microlesion cardíaca dentro de 30 horas. Instrução é fornecida na identificação microlesion em hematoxilina & eosina seções coração manchado e as distinções morfológicas entre microlesões precoces e tardias são realçados. Instrução é fornecida em um protocolo de verificação de S. pneumoniae dentro microlesões usando anticorpos contra polissacarídeo capsular e pneumocócicaA microscopia de imunofluorescência. Por último, um protocolo para a intervenção antibiótico que resgata ratinhos infectados e para a detecção e avaliação da formação de cicatriz no coração dos ratos convalescentes é fornecido. Juntos, esses protocolos irá facilitar a investigação dos mecanismos moleculares subjacentes invasão cardíaca pneumocócica, a morte de cardiomiócitos, remodelação cardíaca como resultado da exposição a S. pneumoniae, e a resposta imune para o pneumococos no coração.

Introduction

Internação de adultos para pneumonia adquirida na comunidade (PAC) carrega um risco documentado para eventos cardíacos adversos que contribui para a mortalidade 1-4. Em um estudo recente realizado por Corrales-Medina et al. Complicações cardíacas foram encontrados para ser associado com e / ou responsáveis ​​por 27% dos óbitos associados à pneumonia 3. Streptococcus pneumoniae (pneumococo), a causa mais comum de PAC e sepse 5, foi diretamente associada a eventos cardíacos adversos em tantos como 19% dos pacientes adultos internados 6. Eventos cardíacos adversos associados com pneumonia incluem falha nova ou agravada cardíaca congestiva, arritmias e infarto do miocárdio em ordem decrescente de freqüência de 6.

Num artigo recente PLoS Pathogens por Brown et al., S. pneumoniae foi encontrado para ser capaz de translocação através do endotélio vascular cardíaca, a entrada no myocardium, e formação de lesões microscópicas não purulentos discretos (microlesões) cheios de bactérias nos ventrículos durante a doença pneumocócica invasiva (DPI) 7. Evidência de formação microlesion cardíaca foi observada em amostras cardíacas a partir de primatas não humanos e os indivíduos que tinham sucumbido à infecção pneumocócica. Da mesma forma, camundongos infectados experimentalmente reproducibly desenvolvido microlesões cardíacos. Em camundongos, o tamanho microlesion e número foi positivamente correlacionada com a duração e gravidade de bacteremia, os níveis de troponina cardíaca em soros e eletrofisiologia cardíaca aberrante. A translocação bacteriana para o coração foi observado que ocorre através dos mesmos mecanismos responsáveis ​​pela translocação do pneumococo através da barreira sangue-cérebro e o desenvolvimento de meningite pneumocócica, ou seja, a proteína de ligação a colina A invasão mediada por células endoteliais vasculares em um receptor de laminina e Plaquetas receptor do fator de -activating forma dependente 8. Microlesformação de iões também exigiu a pneumocócica toxina pneumolisina de formação de poros que foi encontrado para matar cardiomiócitos 7.

Microlesões cardíacos pneumocócicas são distintas do soft-tecido purulenta e abcessos cardíacos que são causadas por outras bactérias Gram-positivas, incluindo Staphylococcus aureus. Estes são caracterizados por um único focos das bactérias rodeadas por neutrófilos e a deposição de fibrina 9,10. Microle- formado por S. pneumoniae são menores em tamanho, distribuídos por todo o coração afetado, e carecem de infiltrados de células imunes. Durante as fases iniciais da infecção, microlesões causada por S. pneumoniae aparecem como áreas de tecido danificado ou inflamado reminiscente dos sinais patológicos de cardiomiopatia. Alguns monócitos podem ser observados durante este tempo, no entanto a sua presença é de curta duração e lesões rapidamente tornam-se necróticas na aparência e cheia de bactérias ao mesmo tempo continuar a GRow em tamanho até a morte do animal ou intervenção antimicrobiana. É importante salientar, no prazo de 3 dias de intervenção antibiótico, infiltração de células imunes profusa é observada no antigo local da lesão e isso é acompanhado por deposição de colágeno robusto. Remodelação cardíaca semelhante foi relatado para ocorrer após o infarto, juntamente com consequências duradouras na função cardíaca 11-15. Assim, microlesões são uma possível explicação para os eventos cardíacos adversos que ocorrem durante o IPD e, possivelmente, o aumento da incidência de mortalidade cardíaca relacionada com em indivíduos convalescentes que sobreviveram o episódio da doença.

Nisto, a instrução é fornecido no modelo experimental de rato IPD e a formação da lesão cardíaca e visualização de microlesões cardíacas em estágios precoces e tardios da infecção. O protocolo para detecção de deposição de colágeno nos animais que foram salvos pela intervenção antimicrobiana é demonstrada. O objetivo deste artigo é o de facilitate a pesquisa de outros pesquisadores sobre esta patologia pneumocócica importante e romance.

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Protocol

NOTA: Todas as experiências com camundongos foram revisadas e aprovadas pelo Animal Care Institucional e Comissões de uso na University of Texas Health Science Center em San Antonio (protocolo nº 13032-34-01C). Cuidados com os animais e os protocolos experimentais aderiram ao Direito Público 89-544 (Animal Welfare Act) e suas alterações, as orientações serviços de saúde pública, e no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA).

1. Infecção

  1. Obter ratinhos BALB / c de ambos os sexos com idades entre 10-12 semanas de idade.
    NOTA: S. pneumoniae sorotipo 4 estirpe TIGR4 é um isolado clínico virulenta que foi seqüenciado 16.
  2. Cresça TIGR4 em caldo de Todd-Hewitt a 37 ° C em 5% de CO2 até atingirem uma densidade óptica (DO) 620 de 0,5 (correspondendo a 1,0 x 10 8 unidades formadoras de colónias [] CFU / ml). Agregar a cultura de pneumococos por centrifugação durante 10 min a 3, 500 x g e eliminar o sobrenadante usando uma linha de vácuo. Suspender as bactérias e diluir com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) a uma concentração final de 1,0 x 10 4 CFU / mL.
  3. Utilizando uma câmara de indução, anestesiar ratos com 2,5% de isoflurano vaporizado em oxigênio. Confirme estado de anestesia por pitada toe suave com uma pinça sem corte.
    1. Segurando o rato anestesiado pela sua nuca e na vertical com uma mão, injetar cada rato por via intraperitoneal (ip) com 100 mL da S. pneumoniae suspensão utilizando uma seringa com uma agulha de calibre 27-30 (correspondente a uma dose de desafio de 1,0 x 10 3 CFU). Coloque a parte de trás do mouse em sua gaiola. Ratos normalmente despertar 30-40 seg após a injeção.
  4. Permitir que a infecção para continuar por pelo menos 24 (antecipado) ou 30 (avançado) hr.
    1. Eutanásia dos ratinhos por asfixia com CO 2. Execute deslocamento cervical para garantir rato tem falecido. A eutanásia é ainda confirmada pela remoçãodo coração no passo 1.6.
  5. Desinfetar a cauda com um algodão embebido em álcool e cortar uma seção de 2-3 mm. Recolhe 2 ul de sangue em série e diluir o sangue de 10 vezes em PBS contendo heparina de sódio 1 U / ml de cinco vezes. Diluições em série de placa sobre uma placa de agar tríptico de soja sangue e incubar durante a noite a 37 ° C em 5% de CO 2. O próximo dia de extrapolar colónia conta o nível de bacteremia.
  6. Imobilizar o mouse em decúbito dorsal sobre uma plataforma cirúrgica. Pulverizar o peito com etanol 70% e seque. Usando uma tesoura cirúrgica e uma pinça abrir a cavidade torácica, retire a caixa torácica, e transecto o diafragma para expor o coração e os pulmões. Usando uma tesoura cortar os vasos sanguíneos ligados ao coração e extirpar suavemente o coração com cuidado para evitar contusões com uma pinça.
  7. Lavar o coração com PBS e, em seguida, colocar em cassetes de colheita de amostras de tecidos que tais secções coronais seria obtido durante o corte do tecido. Para inclusão em parafina, place as cassetes em 10% solução tamponada com formalina e no dia seguinte enviar para inclusão em parafina.
    1. Alternativamente congelamento flash usando outubro Composto dentro de um cryomold que foi colocado em gelo seco.

2. A visualização das lesões cardíacas e pneumococos dentro das lesões

  1. Reduzir secções de coração embebidos em parafina de tal forma que os quatro câmaras do coração são visíveis na secção de cada tecido. Cortar as lâminas com uma espessura de 5 mm.
  2. Desparafinar e mancha slides com hematoxilina e eosina (H & E) usando métodos padrão 17.
  3. Ver H & E manchada seções cardíacos usando um microscópio de luz em baixa (100X, 200X) e alta (imersão em óleo: 400X, 1000X) ampliações. Caracterizar os corações para a presença de microlesões no miocárdio. Aqui, adquirir H & E imagens usando um microscópio Zeiss Axioskop 2 equipado com um 100X 1,3 numérica objetivo abertura Plan-Neofluar.
    NOTA: Em fases iniciais l cardíacaesions são discriminados pela sua aparência colorida diferencial e, em alguns casos, a presença de células imunes (monócitos e granulócitos) que parecem ser monócitos. Nas lesões avançadas, particularmente aqueles observados em 30 horas, as células imunológicas são lesões vacuole-como ausentes e grandes são observados em seu lugar. É importante notar que, enquanto o influxo de células imunitárias durante as fases iniciais do desenvolvimento da lesão cardíaca pode ocorrer não parece ser um requisito.

3. Immunofluorescent Microscopia para pneumococos dentro Microle-

  1. Seção coração em cryomolds com microtome a uma espessura de 5 seções um e colocar em lâminas de vidro com carga positiva. Permitir secções cardíacas congelados para descongelar e ar seco. Fix secções durante 10 minutos em 10% de formalina tamponada neutra (pH 6,8-7,2 a 25 ° C).
  2. Lavagem das lâminas (3x) em PBS durante 5 min, para permeabilizar 15 min em 0,2% de Triton X-100 em PBS, em seguida, lavar novamente em PBS.
  3. Secti tecido Bloco em em lâminas com 10% de soro de cabra em PBS durante 1 hora.
  4. Lavar as lâminas com PBS, e incubar tampa com secções cardíacos de coelho anti-pneumococos do serotipo 4 anti-soro a 1: 1000 em PBS com 10% de soro de cabra durante 2 horas a 37 ° C.
    NOTA: Para os controles negativos investigadores devem usar ingênuo anti-soro de coelho
  5. Após lavagem com PBS, a tampa e incubar secções com 10% de soro de cabra-PBS com cabra anti-coelho FITC anticorpo conjugado a 1: 2000 durante 30 min a 37 ° C.
  6. Seguindo as instruções do fabricante, usar DAPI (4 ', 6- diamidino-2-fenilindolo) em 5 mg / ml para a visualização de núcleos eucarióticos. Lave e montar secções de tecido com FluorSave.
  7. Adquirir imagens fluorescentes utilizando um sistema de microscópio confocal tanto a baixa como alta ampliação. Ajustar a abertura numérica em conformidade para se obter resultados óptimos. Aqui, adquirir imagens fluorescentes usando um sistema confocal com um objetivo abertura numérica 60X 1,42.
"> 4. Salvamento Antibiótico de fossa séptica Mice

  1. Comece com ratinhos infectados ip com 1,0 x 10 3 CFU de TIGR4 como anteriormente indicado na etapa 1.
  2. Começando às 30 horas pós-infecção, administrar farmacêutica ampicilina grau ip (80 mg / kg de peso corporal) em 100 ul de solução salina a cada 12 h durante 36 h. Recolha corações no ponto de tempo desejado e processo tal como descrito no passo 1.6 para inclusão em parafina e tecido, o seccionamento.

5. Collagen Detection Deposition

  1. Usando xileno e lavagens álcool graduado com água, Desparafinar e tecidos hidrato seções deionizada usando métodos padrão 17. Tratar secções com ácido fosfomolíbdico aquosa a 0,2% durante 5 minutos e lavar com água desionizada durante 5 minutos.
  2. Secções mancha com 0,1% de vermelho Sirius em ácido pícrico de 2 h à temperatura ambiente.
  3. Lave os cortes em ácido clorídrico 0,01 N durante 3 min e enxaguar utilizando etanol a 70% durante 1 min.
  4. Desidrataçãote as seções usando o idêntico, mas a fim de lavagens ao indicado na 5.1 reverter, desidratar seções cardíacas no aumento e classificados concentrações de etanol, em seguida, xileno.
  5. Cortes de tecido Mount com uma solução de montagem para avaliação microscópica.
  6. Para identificar as regiões de deposição de colágeno, examinar secções de tecido manchado por áreas de coloração leitura profunda com baixa e alta ampliação usando um microscópio de luz. Qualquer área dentro dos ventrículos do coração, que é o vermelho é uma área onde o colágeno tem sido depositado. Áreas sem essa mancha vermelha são locais de tecido saudável falta deposição de colágeno. Aqui, adquirir Picro Sirius Red imagens coradas utilizando um microscópio equipado com um objetivo abertura numérica 20X 0,5.
    NOTA: As manchas vermelhas no átrio tecidos saudáveis.

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Representative Results

Visualização de microlesões por H & E

Microlesões cardíacas foram observadas nos ventrículos de H & E coradas secções cardíacas de ratos com IPD seguintes seu desafio ip com TIGR4. A Figura 1 demonstra o aumento no tamanho das lesões entre 24 e 30 horas pós-infecção (hpi), com maior número de hematoxilina -stained (ie, azul-púrpura) pneumococos visível no interior da lesão. Microle- foram caracterizadas por uma morfologia semelhante vacúolo, mais denso eosina (vermelho) de cardiomiócitos coloração nas células imediatamente adjacentes ao local da lesão, diplococos no interior das lesões, e uma ausência generalizada de células imunes. Aproximadamente metade das lesões foram ao lado vasos sanguíneos visíveis. Entre 24 e 30 hpi microlesões vez mais numerosos e substancialmente maior. Em 30 hpi bactérias extracelulares poderia ser visto de streaming de uma lesão entre as células.

Visualizatino de S. pneumoniae Usando Immunofluorescent Microscopia

Para visualizar e confirmar que S. pneumoniae foram efectivamente dentro das lesões, foi utilizado para coloração de imunofluorescência serotipo 4 polissacarídeo capsular que é produzido por TIGR4 (Figura 2). Imagens capturadas mostrou a presença de agregados hermeticamente embalados e densas de S. pneumoniae dentro de sites microlesion.

Evidência de cicatriz Cardiac

Coloração Picro Sirius Red feita em cortes cardíacas de ratos que tinham sido resgatados com ampicilina e controles não infectados. Em antibióticos resgatado de animais convalescentes, houve um aumento dramático na presença e intensidade da mancha Picro Sirius Red com bandas de streaming a partir do que parece ser antigos locais de lesão nos ventrículos (Figura 3). Em contraste, os ventrículos em seções de controle foram unstained indicando que a deposição de colágeno estava ausente (Não mostrado).

Juntos, esses resultados demonstram a capacidade de visualizar microlesões cardíacos em ratos com grave IPD e para acessar a formação de cicatriz resultante nos ventrículos usando procedimentos histológicos padrão. Importante, microlesões cardíacas são invariavelmente associada a elevados títulos de S. pneumoniae e do tempo necessário para mediar a sua formação.

Figura 1
Figura 1: Detecção de microlesões nas seções cardíacos H & E manchadas Imagens representativas (1000X) de microlesões cardíaca observados às 24 hor e 30 horas após a infecção.. Barras de escala preto correspondem a 10 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: A detecção de imunofluorescência de S. pneumoniae dentro microlesões cardíacas. microscopia de imunofluorescência utilizando anticorpos contra o serotipo de polissacárido capsular 4 (verde) confirmou a presença de S. pneumoniae dentro microlesões cardíacas. Os núcleos foram coradas azul com DAPI. Bar escala Branco correspondem a 20 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: A deposição de colágeno de um antigo sítio microlesion cardíaca em um mouse de convalescença imagem Representante (200X) mostrando um Picro Sirius Red manchado microlesion cardíaco no ventrículo de um rato 5 dias após a intervenção antibiótico para dentro.doença pneumocócica invasiva. O vermelho indica a deposição de colágeno. Bar escala preto correspondem a 20 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste relatório, um método altamente reprodutível para induzir S. pneumoniae mediada microlesões cardíacos em ratos durante IPD e as técnicas para a sua visualização é demonstrada. Os ratinhos são infectados com uma dose de bactérias que ultrapassa o limiar do sistema imunitário para a depuração, que conduz a bacteremia de alto grau, semelhante ao que ocorre durante a sepsia humano, e leva a uma eventual translocação bacteriana no miocárdio. Por razões ainda desconhecidas, S. pneumoniae no coração é capaz de se replicar abala com a resposta imune do hospedeiro. Este é o tema de investigação em curso e esta publicação pode facilitar outros pesquisadores em seus esforços para participar.

H & E coloração permite a visualização microlesion usando microscopia de luz padrão desde rosa cardiomiócitos mancha vermelha, enquanto microlesões cardíacas e as bactérias dentro da mancha azul para Deep Purple. Este forte contraste permite fácil DETECTIon das microlesões em fases posteriores da infecção quando as lesões são maiores. A fim de verificar a presença de S. pneumoniae dentro as microlesões cardíacas, microscopia de imunofluorescência usando o anti-soro contra o serotipo 4 polissacarídeo capsular que é transportado pelo TIGR4 foi realizada. É importante notar que o anticorpo anti-capsulares específicos que devem ser utilizadas depende do serotipo da estirpe de pneumococos que é utilizado para o desafio experimental. Alternativamente, os investigadores também pode utilizar anticorpos monoclonais comercialmente disponíveis contra pneumolisina, a toxina de formação de poros de S. pneumoniae, que detectam ou componentes da parede da célula pneumocócica (isto é, TEPC-15). Enquanto estes anticorpos detectar pneumococos dentro do coração, a experiência passada sugere que os anticorpos contra polissacarídeo capsular fornecer as imagens de obrigação 7.

S. pneumoniae formação microlesion cardíaca mediada requer a interacção dea colina de pneumococos adesina de ligação de proteína A com o receptor de laminina proteína do hospedeiro para a adesão bacteriana às células endoteliais vasculares e interacção de células de bactérias com fosforilcolina parede de acolhimento de activação de plaquetas do receptor do factor de transmigração através da célula bacteriana 7,8. Por conseguinte, é importante notar que a formação microlesion é ligada firmemente a carga infecciosa e tempo, o que aumenta a frequência e duração destas interacções e permite que o tempo para as bactérias para replicar e lesões visíveis a desenvolver. Temos anteriormente determinado que uma dose infecciosa ip maior do que 1,0 x 10 3 CFU de S. pneumoniae estirpe TIGR4 resulta em morte rápida demais do mouse e, como a formação da lesão mau resultado. Abaixo desta dose infecciosa eliminação espontânea ocorre em alguns ratinhos e em outros atraso no aparecimento de doença severa é observada. No entanto, para camundongos desafiados com 1,0 x 10 3 UFC de TIGR4 entre 24 e 36 horas,lesões acumular rapidamente em número e crescer em tamanho até que o mouse se torna moribunda continuamente. Assim, a dose infecciosa da cepa infectante deve ser titulada para replicar um estado semelhante da doença com um estado moribundo desenvolvimento em nada menos do que 30 hpi. Importante, observou-se repetidamente a formação da lesão cardíaca em ratos que foram infectados intranasal com 1,0 x 10 7 UFC e intratraquealmente com 1,0 x 10 5 CFU de TIGR4. Seguindo estes desafio rotas desenvolvimento de doença grave ocorreu em momentos posteriores. Observou-se também a formação de microlesion com outras estirpes virulentas de S. pneumoniae, tais como sorotipo 2 isolado D39, embora com diferentes frequências. Assim, as lesões não são um resultado da via de infecção ip ou específica para TIGR4, mas em vez disso ligada a duração e severidade do episódio de doença. Aqui aconselhamos para infectar camundongos ip uma vez que esta rota desafio oferece o mais alto grau de reprodutibilidade. Se um different cepa de S. pneumoniae é usado ou uma rota diferente infecciosa é desejada, os investigadores devem apontar para bacteremia em níveis> 10 5 UFC ml de sangue por pelo menos 24 horas.

Intervenção Antimicrobial permite o estudo de eventos que ocorrem durante a convalescença, modelando um ser humano no ambiente Unidade de Terapia Intensiva. Vale a pena notar que nem todos os ratos sobreviver apesar do tratamento antimicrobiano e confirmou a eliminação bacteriana. Os investigadores devem esperar que as taxas de sobrevivência entre 50-60% e, como tal, deve ajustar o tamanho da coorte de acordo para lidar com a perda de animais. O acompanhamento regular dos animais após 24 horas é altamente recomendado para garantir o cumprimento Institucional aprovado protocolos animais. Coloração Picro Sirius Red é uma técnica simples e padrão usado para visualizar a deposição de colágeno. Aqui, demonstra-se como esta mancha pode ser utilizado para examinar a remodelação cardíaca nos ventrículos do coração após uma infecciosa traumáticos episódio. Picro Sirius Red foi escolhido em detrimento de outras técnicas comumente utilizadas para visualizar a deposição de colágeno, como "o tricrômico de Masson", por causa da forte contraste é oferecido entre o colágeno depositado e tecido circundante. Isto tem provado ser extremamente útil quando se avaliar a extensão da deposição de colágeno do miocárdio após antibiótico de forma quantitativa utilizando softwares como o ImageJ.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Todd-Hewitt broth  Neogen 7161A
O.C.T Compound  Tissue-Tek (Sakura Finetek)  4583
Triton X-100  Fisher Scientific (Acros) 9002-93-1
Normal Goat Serum Abcam ab7481
anti-serotype 4 pneumococcus antiserum  Statens Serum Institut 16747
goat anti-rabbit FITC conjugated antibody  Jackson ImmunoResearch 111-096-144
DAPI Invitrogen D1306
Fluorsave Millipore 345789
Permount Fisher Scientific S70104
Ampicillin Sigma A9393
phosphomolybdic acid 0.2%  Electron Microscopy Sciences 26357-01
0.1% Sirius Red in picric acid  Electron Microscopy Sciences 26357-02
0.01 N hydrochloric acid  Electron Microscopy Sciences 26357-03
Tissue Tack Microscope Slides Polysciences, Inc 24216
Paralube Vet Ointment Dechra 12920060
Hematoxylin and Eosin Staining Kit unspeciified  Standard

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References

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Brown, A. O., Orihuela, C. J. Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling. J. Vis. Exp. (98), e52590, doi:10.3791/52590 (2015).

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