Abstract
Bakteriyemi sırasında Streptococcus pneumoniae miyokard içine vasküler endotel boyunca transloke ve ayrık bakteri dolu mikroskobik lezyonlar nedeniyle bağışıklık hücrelerini infiltre yokluğu dikkat çekiyor (microlesions) oluşturabilir. Nedeniyle kardiyotoksik ürünlerin onların serbest bırakılması, S. microlesions içinde pneumoniae sıklıkla erişkinlerde fulminate invazif pnömokok hastalığı sırasında gözlenen kalp yetmezliğine katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Burada 30 saat içinde kalp microlesion oluşumunu tekrarlanabilir neden deneysel fare enfeksiyonu için bir protokol gösterilmiştir. Öğretim Hematoksilin ve lekeli kalp bölümleri ve erken ve geç microlesions arasındaki morfolojik farklılıkları eozin içinde microlesion tanımlama sağlanır vurgulanır. Öğretim S. doğrulanması için bir protokol sağlanır Pnömokok kapsüler polisakkarit ve karşı antikorlar kullanılarak microlesions içinde pneumoniaeimmunofluorescent mikroskopi. Son, enfekte fare ve algılama ve nekahet farelerin kalplerinde skar oluşumu değerlendirilmesi için kurtarır antibiyotik müdahale için bir protokol sağlanır. Birlikte, bu protokoller S. maruz kalma sonucu pnömokok kalp işgali, kardiyomiyosit ölümü, kardiyak remodeling altında yatan moleküler mekanizmaların soruşturma kolaylaştıracaktır pneumoniae ve kalp pneumococci için bağışıklık tepkisi.
Introduction
Toplum kökenli pnömoni (TKP) için yetişkinlerin Yatış mortalite 1-4 katkıda istenmeyen kardiyak olaylar için belgelenmiş bir risk taşır. Corrales-Medine ve ark tarafından yapılan yeni bir çalışmada. Kardiyak komplikasyonlar ve / veya sorumlu pnömoni ile ilişkili ölümlerin 3% 27 için ilişkili bulunmuştur. Streptococcus pneumoniae (pnömokok), TKP'nin ve sepsis 5 en yaygın nedeni, doğrudan başvuran erişkin hastaların 6 gibi birçok 19 olarak% olumsuz kardiyak olaylar ile ilişkili olmuştur. Pnömoni ile ilişkili advers kardiyak olaylar sıklığını 6 azalan yeni veya kötüleşen konjestif kalp yetmezliği, aritmi ve miyokard infarktüsü sayılabilir.
Brown ve arkadaşları tarafından yapılan bir PLoS patojenler makalede., S. pneumoniae myocardiu içine kardiyak vasküler endotelyum, giriş ile translokasyon yeteneğine sahip olduğu bulunmuşturm ve invaziv pnömokokal hastalığın (IPD) 7 sırasında ventrikül bakteri dolu ayrık olmayan pürülan mikroskobik lezyonlar (microlesions) oluşumu. Kardiyak microlesion oluşumunun kanıtı pnömokok enfeksiyonuna yenik olan insan olmayan primatlar ve bireylerden kardiyak örnekleri gözlenmiştir. Benzer şekilde, deneysel olarak enfekte olmuş fareler, yeniden üretilebilir kalp microlesions geliştirdi. Farelerde, microlesion büyüklüğü ve sayısı olumlu süresi ve bakteriyemi, serumlar kardiyak troponin düzeyleri şiddeti ve anormal kalp elektrofizyoloji ile korelasyon. Kalbine bakteriyel translokasyon, kan-beyin engeli ve pnömokok menenjit, bir laminin reseptörü ve Trombosit vasküler endotel hücrelerinin, yani kolin bağlanma proteini A aracılı istilası karşısında pnömokokun translokasyon için sorumlu olan mekanizmalar aracılığıyla meydana geldiği bulunmuştur harekete geçirme faktörü reseptörü bağımlı bir şekilde 8. Microlesiyon oluşumu, kardiyomiyositlerde 7 öldürdüğü bulunmuştur pnömokok gözenek oluşturucu toksin pnömolizin gerekiyor.
Pnömokok kalp microlesions Staphylococcus aureus gibi diğer gram pozitif bakterilerin neden olduğu iltihaplı yumuşak doku ve kardiyak abseler farklıdır. Bu, nötrofillerin ve fibrin oluşumu, 9,10 ile çevrili bir bakteri, tek odakları ile karakterize edilir. Microlesions S. tarafından oluşturulan pneumoniae etkilenen bir kalp boyunca dağılmış, boyut olarak daha küçüktür, ve immün hücre infiltrasyonu yoksundur. Enfeksiyonun erken aşamalarında, microlesions S. neden pneumoniae kardiyomiyopati patolojik bulguların anımsatan hasarlı veya iltihaplı doku alanlar olarak görünür. Bazı monositler, ancak kendi varlığını kısa ömürlü ve lezyonlar hızla aynı anda GR devam ederken görünüm nekrotik hale gelir ve bakteri dolu, bu süre içinde görülebilirhayvan veya antimikrobiyal müdahale ölümüne kadar boyutu ow. Önemli bir şekilde, antibiyotik müdahale 3 gün içinde, aşırı bağışık hücre içi filtratı önceki lezyon bölgesinde görülmektedir ve bu sağlam kollajen birikimi eşlik eder. Benzer kalp biçimlenme kardiyak fonksiyon 11-15 sonuçlarını kalıcı birlikte enfarktüsü aşağıdaki meydana bildirilmiştir. Böylece, microlesions hastalık bölüm hayatta nekahet bireylerde kalp-ilişkili mortalite insidansında artış IPD'ye sırasında ve muhtemelen ortaya istenmeyen kardiyak olaylar için potansiyel bir açıklama vardır.
Burada, kullanıcı enfeksiyonun erken ve geç aşamalarında IPD ve kardiyak lezyon oluşumu ve kardiyak microlesions görselleştirme deneysel fare modelinde sağlanır. antimikrobiyal müdahale ile kaydedilmiş olan hayvanlarda kollajen birikimi tespiti için protokol gösterilmiştir. Bu makalenin amacı f olduğunuBu önemli ve yeni pnömokok patoloji diğer araştırmacıların araştırma acilitate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm fare deneyleri gözden ve San Antonio Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi'nde (protokol # 13032-34-01C) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından kabul edildi. Hayvan bakımı ve Kamu Hukuku 89-544 (Hayvan Refahı Yasası) ve değişiklikleri, Halk Sağlığı Hizmetleri kurallar ve Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (Sağlık ve İnsan Hizmetleri Bakanlığı'nın) yapıştırılır deney protokolleri.
1. Enfeksiyon
- Yaş 10-12 haftalık yaş arası her iki cinsiyetten, BALB / c fareleri elde edilir.
NOT: S. pneumoniae serotip 4 suşu TIGR4 16 sıralandı edilmiş bir şiddetli klinik izolat olduğunu. - Optik yoğunluk (OD) 0.5 620 ulaşana kadar% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de, Todd-Hewitt lapası içindeki TIGR4 büyütün (1.0 x 10 8 koloni oluşturan birim [CFU] / ml'ye karşılık gelir). 3 ile 10 dakika boyunca santrifüj ile pnömokokal kültür Pelet500 xg ve bir vakum hattı kullanarak süpernatant kaldırmak. Askıda ve 1.0 x 10 4 CFU / ml'lik bir son konsantrasyona değin steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) ile bakteri seyreltin.
- Bir indüksiyon odasını kullanarak, oksijen% 2.5 buharlaşmış izofluran ile fareler uyutmak. Künt cımbız ile nazik ayak tutam tarafından anestezi durumunu onaylayın.
- Bir yandan ile ense anestezi fare tutarak, dik, S. 100 ul her bir fare karın içinden (ip) enjekte (1.0 x 10 3 CFU yükleme dozuna tekabül eden), 27-30 ölçü iğne ile bir şırınga kullanılarak pneumoniae süspansiyon. Kendi kafeste fare geri yerleştirin. Fareler genellikle enjeksiyondan sonra 30-40 sn uyandırmak.
- Enfeksiyon en az (erken) 24 veya 30 (gelişmiş) saat devam izin verin.
- CO 2 boğularak fareler Euthanize. Fareyi sağlamak için servikal dislokasyon yapın vefat etti. Ötenazi ayrıca uzaklaştırılarak onaylanırAdım 1.6 kalbin.
- Alkollü bir bezle kuyruk dezenfekte ve 2-3 mm'lik bölümü makasla kesme. Kan, 2 ul toplayın ve seri olarak, sodyum heparin, 1 U / mL, beş kez içeren PBS içinde kan 10 kat seyreltilir. Plaka seri bir triptik soya kan agar plakası üzerinde seyreltme ve koloni ertesi gün tahmin etmek bakteremi seviyesini önemli olan CO 2.% 5, 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
- Bir cerrahi platformda bir yatar pozisyonda fare hareketsiz. % 70 etanol ve pat kuru ile göğüs püskürtün. Cerrahi makas ve forseps göğüs boşluğu açmak kullanarak, göğüs kafesini çıkarmak ve kalp ve akciğerler maruz diyaframı transect. Kullanımı makas kalbe bağlı kan damarlarını kesmek ve yavaşça forseps ile morarma önlemek için dikkatle kalp tüketim.
- PBS ile kalp durulayın ve ardından koronal kesitler doku kesit sırasında elde olacağı gibi doku örnek toplama kasetleri içine yerleştirin. Parafin gömme, pla içinparafin gömme için göndermek% 10 tamponlu formalin çözeltisi ve ertesi gün kasetler ce.
- Alternatif kuru buz konulmuş bir cryomold içinde Ekim Bileşik kullanarak flaş dondurma.
Kardiyak Lezyonların ve Lezyonlarının içinde pnömokok 2. Görselleştirme
- Kalbin 4 odaları her doku bölümünde görünür şekilde parafin kalp bölümleri azaltın. 5 mikron kalınlığında slaytlar kesin.
- Standart yöntemler kullanılarak 17 hematoksilen eosin ve (H & E) ile Deparaffinize ve leke slaytlar.
- Büyütme: Görünüm H & E düşük (100X, 200X) ve yüksek (400X, 1,000X yağ daldırma) bir ışık mikroskobu kullanılarak kalp bölümleri boyandı. Miyokardiyumda microlesions varlığı için kalpleri karakterize etmektedir. Burada, bir 100X 1.3 Sayısal açıklık Planı-Neofluar amacı ile donatılmış bir Zeiss Axioskop 2 mikroskop kullanılarak, H & E görüntüleri kazanır.
NOT: En erken kardiyak l aşamalarıesions bağışıklık hücrelerine monositler gibi görünen (monositler ve granülositler) varlığında ayırıcı renkli görünüm ve bazı durumlarda ayrımcılık yapılmaktadır. Özellikle 30 saatte görülen ilerlemiş lezyonlar, ise, bağışıklık hücreleri yok ve büyük vakuol benzeri lezyonlar onların yerine gözlenmektedir vardır. Kalp lezyon gelişiminin erken evrelerinde bağışıklık hücre akını oluşabilir ederken bir gereklilik olarak görünmüyor unutmayın önemlidir.
Microlesions içinde pnömokokki, 3. immünoflüoresan mikroskopi
- Pozitif yüklü cam slaytlar üzerine 5 um ve yer bölümleri bir kalınlığa mikrotom ile cryomolds Bölüm kalp. Dondurulmuş kalp bölümler çözülme ve hava kuru izin ver. (25 ° C'de, pH 6.8-7.2) 10 dakika,% 10 nötr tamponlu formalin için bölümler düzeltildi.
- Daha sonra PBS içinde tekrar yıkama, PBS içinde% 0.2 Triton X-100 içinde, 15 dakika boyunca geçirgenliği, 5 dakika boyunca PBS içinde slaytlar (3x) yıkanır.
- Blok doku secti 1 saat boyunca PBS içinde% 10 keçi serumu ile slaytlar üzerine.
- PBS, kapaklı slaytlar durulayın ve 1 tavşan anti-serotip 4 pnömokok antiserumu ile kardiyak bölümleri inkübe: 1000 PBS içerisinde% 10 keçi serumu ile 2 st için 37 ° C 'de.
NOT: Negatif kontroller için araştırmacılar naif tavşan antiserumunu kullanmanız gerekir - 37 ° C'de 30 dakika süre ile 2000: 1 bir keçi anti-tavşan FITC ile konjüge edilmiş antikor ile% 10 keçi serumu-PBS ile bölümlere PBS, kapak ile yıkanıp inkübe sonra.
- Üreticinin talimatlarına sonra ökaryotik çekirdeklerin görünüm için, 5 mg / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) kullanın. Yıkayın ve FluorSave ile doku bölümleri monte edin.
- Düşük ve yüksek hem büyütmede bir konfokal mikroskop sistemi kullanılarak floresan görüntü elde. En iyi sonuçları elde etmek için buna göre sayısal diyafram ayarlayın. Burada, bir 60X 1.42 sayısal diyafram amacı ile bir konfokal sistemi kullanılarak floresan görüntüler elde.
- Daha önce 1. adımda belirtildiği gibi TIGR4 1.0 x 10 3 CFU ile fareler enfekte ip ile başlayın.
- 30 saat sonra enfeksiyondan itibaren, 36 saat süre ile 100 ul tuzlu su içinde her 12 saat farmasötik dereceli ampisilin ip (80 mg / kg vücut ağırlığı) uygulamaktadır. Parafine ve doku, kesit olarak, adım 1.6 de tarif edildiği gibi arzu edilen bir zaman noktasında ve süreç kalpleri toplayın.
5. Kollajen Biriktirme Algılama
- Standart yöntemler kullanılarak 17 deiyonize su, deparaffinize ve hidrat doku bölümleri ile ksilen ve kademeli alkol yıkar kullanma. 5 dakika boyunca, sulu% 0.2 fosfomolibdik asit ile bölümleri tedavi ve 5 dakika boyunca iyonu giderilmiş su ile durulama.
- Oda sıcaklığında 2 saat süre ile pikrik asit içinde% 0.1 Sirius Kırmızı leke bölümleri.
- 3 dakika boyunca 0.01 N hidroklorik asit bölümleri yıkayın ve 1 dakika boyunca% 70 etanol ile yıkayın.
- Dehydraaynı kullanarak bölümleri te ancak 5.1 de tarif edilene yıkama sırasını tersine çevirmek, ksilen artan kardiyak bölümleri kurutmak ve daha sonra etanol konsantrasyonlarını kademeli.
- Mikroskopik değerlendirme için bir montaj çözümü Mount doku bölümleri.
- Kollajen birikimi bölgeleri belirlemek için, bir ışık mikroskobu kullanılarak düşük ve yüksek büyütme altında derin okuma boyama alanlarında lekeli doku bölümleri inceleyin. Kırmızı kalp ventriküller içinde herhangi bir alan kollajen tevdi edilmiş bir alandır. Bu kırmızı leke olmadan Alanları kollajen birikimi eksik sağlıklı doku sitelerdir. Burada, bir 20X 0.5 sayısal diyafram objektif ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak Picro Sirius Kırmızı lekeli görüntüler elde.
NOT: Sağlıklı dokularda kırmızı atrium lekeleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
H & E ile Microlesions görselleştirme
Kardiyak microlesions Şekil 1. TIGR4 ile ip meydan aşağıdaki İPH farelerin kalp bölümleri lekeli H & E ventrikül gözlenen hematoksilen daha fazla sayıda 24 ve 30 saat sonrası enfeksiyon (hpi) arasındaki bu lezyonların boyutunda artış gösteriyor edildi lezyon içinde görünür -stained (yani, mor-mavi) pnömokok. Microlesions bir vakuol-benzeri morfolojisi, daha yoğun eosin (kırmızı), lezyon bölgesinde hemen bitişik hücrelerde kardiyomiyositlerin boyama lezyonlarında diplokoklar ve bağışıklık hücrelerinin genel olmaması ile karakterize edilmiştir. Yaklaşık yarım lezyonlar görülebilir kan damarları bitişik idi. Hpi 24 ile 30 arasında microlesions daha çok ve önemli ölçüde daha büyük oldu. 30 HPI at dışı bakteriler genellikle hücreler arasında bir lezyon akarsu görülebilirdi.
VisualizatiS. üzerine pneumoniae immünoflüoresan mikroskopi kullanılarak
Görselleştirmek ve doğrulamak için S. pneumoniae lezyonlarında gerçekten edildi, TIGR4 tarafından üretilen 4 serotipi kapsüler polisakkarit (Şekil 2) için immünofloresan boyama kullanıldı. Yakalanan Görüntüler S. sıkıca paketlenmiş ve yoğun agrega varlığını gösterdi microlesion siteleri içinde pneumoniae.
Kardiyak skar Kanıt
Picro Sirius Kırmızı boyama ampisilin ve enfekte edilmemiş kontrol ile kurtarılan edilmiş farelerden kardiyak bölümlerinde gerçekleştirilmiştir. Antibiyotik kurtarıldı nekahat farelerde, ventrikül (Şekil 3) eski lezyon siteleri gibi görünen ne akarsu bantları ile Picro Sirius Kırmızı leke varlığında ve yoğunluğu dramatik bir artış oldu. Bunun aksine, kontrol bölümlerinde ventriküller kollajen depozisyon mevcut olduğunu belirten boyanmadan edildi (Gösterilmemiş).
Birlikte bu sonuçlar ciddi İPH farelerde kalp microlesions görselleştirmek ve standart histolojik yöntemler kullanılarak ventrikül sonuçtaki skar oluşumunu erişmek için yeteneğini göstermek. Önemli bir şekilde, kalp microlesions değişmez S. yüksek titrelerinin bağlantılıdır pneumoniae ve zaman onların oluşumunu aracılık etmek gerekiyordu.
Şekil 1: H & E lekeli kalp bölümlerde microlesions tespiti 24 hor ve 30 saat sonrası enfeksiyon gözlenen kardiyak microlesions Temsilcisi görüntüleri (1,000X).. Siyah ölçekli çubuklar 10 mikron karşılık gelmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
dosya / ftp_upload / 52.590 / 52590fig2.jpg "/>
Şekil 2: S. Immunofluorescent tespiti Kalp microlesions içinde pneumoniae. serotip 4 kapsüler polisakkarit (yeşil) karşı antikor kullanarak immünofloresan mikroskopi S. varlığını doğruladı Kalp microlesions içinde pneumoniae. çekirdekler DAPI mavi boyandı. Beyaz ölçek çubuğu 20 mikron karşılık gelmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Bir nekahet fare eski bir kalp microlesion yerinde Kollajen çökelme Temsilcisi görüntü (200X), bir Picro Sirius Kırmızı 5 gün içinde antibiyotik müdahalesi sonrasında bir fare ventrikül kalp microlesion lekeli gösteren.invazif pnömokok hastalığı. Kırmızı kollajen birikimini gösterir. Siyah Ölçek çubuğu 20 mikron karşılık gelmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu raporda, son derece tekrarlanabilir bir yöntem S. ikna etmek pneumoniae IPD sırasında farelerde kalp microlesions aracılı ve görselleştirme teknikleri gösterilmiştir. Fareler, insan sepsiste oluşur ve miyokarda nihai bakteriyel translokasyon neden benzer yüksek dereceli bakteremi, yol temizlenmesi için bağışıklık sisteminin eşiği aşması bakterilerin bir dozu ile enfekte edilir. S., henüz bilinmeyen nedenlerden dolayı merkezinde pneumoniae vücut bağışıklığı tepkisi ile kararlı çoğaltmak edebilmektedir. Bu devam eden soruşturma konusu olan ve bu yayın katılmak çabalarında diğer araştırmacılara kolaylaştırabilir.
H & E boyama kalp microlesions ve derin mor leke mavi içindeki bakteriler ise, kardiyomiyositler leke pembe beri kırmızı standart ışık mikroskobu kullanılarak microlesion görselleştirme sağlar. Bu keskin kontrast kolay Detecti sağlarenfeksiyon ileriki aşamalarında microlesions on lezyonlar daha zaman. S. varlığını doğrulamak için pneumoniae kalp microlesions içinde TIGR4 tarafından taşınan 4 serotipi kapsüler polisakkaritine karşı antiserum kullanarak immünofloresan mikroskopi uygulandı. Önemli bir şekilde, kullanılan spesifik bir anti-kapsüler antikor deney meydan okuma için kullanılan pnömokok soyun serotip bağlıdır. Alternatif olarak, buluş sahipleri ayrıca, pnömolizine karşı S. gözenek oluşturucu toksin, piyasada bulunan monoklonal antikor kullanabilir pneumoniae veya pnömokoksik hücre duvarı olduğunu tespit bileşenlerinin (yani, TEPC-15). Bu antikorlar kalp içinde pnömokok tespit ederken, geçmiş deneyim kapsüler polisakkarit karşı antikorlar en zorlayıcı görüntüleri 7 sağlamak olduğunu göstermektedir.
S. pneumoniae aracılı kardiyak microlesion oluşumu etkileşimini gerektirirhücre 7,8 ile vasküler endotel hücreleri ve bakteri göçüne host Platelet-aktive edici faktör reseptörü ile bakterilerin hücre duvarı fosforilkolin etkileşimi bakteriyel yapışma konak protein laminin reseptörünün protein bağlama A pnömokok adhesin Kolin. Bu microlesion oluşumu sıkıca bu etkileşimlerin sıklığını ve süresini arttırır ve geliştirmek bakteri çoğaltmak ve görünür lezyonlar için zaman tanır bulaşıcı yükü ve zaman, bağlantılı olduğunu not etmek önemlidir. Biz önceden belirlenmiş olan S. bir ip bulaşıcı doz fazla 1.0 x 10 3 CFU ki pneumoniae streyn TIGR4 fare çok hızlı ölüm ve sonuç olarak kötü bir lezyon formasyonu ile sonuçlanır. Bu bulaşıcı dozu kendiliğinden açıklık bazı farelerde ve diğer meydana Aşağıda şiddetli hastalık geç başlangıçlı görülmektedir. Yine 24 arasında TIGR4 1.0 x 10 3 CFU ve 36 saat ile mücadeleye davet edilen fareler için,lezyonlar hızla sayıda birikir ve fare can çekişen hale gelinceye kadar sürekli boyutu büyür. Böylece enfekte eden soyun enfeksiyöz doz, bir can çekişme durumu en az 30 HPI gelişmekte olan bir hastalığın içindeki durumunu taklit etmek için titre edilmesi gereklidir. Daha da önemlisi, biz defalarca TIGR4 1.0 x 10 5 CFU ile trakea içine 1.0 x 10 7 CFU ile intranazal enfekte edilmiş ve farelerde kalp lezyon oluşumunu gözlemledik. Ciddi hastalık bu meydan yolları geliştirme ardından daha sonraki zaman noktalarında meydana geldi. Ayrıca S. diğer virülan türlerinin ile microlesion oluşumu gözlenmiştir pneumoniae serotip 2 izolat D39 olarak, farklı frekanslarda olsa. Böylece, lezyonlar TIGR4 ip enfeksiyon rota veya belirli bir sonucu değil, fakat bunun yerine hastalık bölüm süresi ve şiddeti bağlı. Bu yazıda bu meydan rota tekrarlanabilirliği yüksek derecesi beri fareler ip bulaştırmak için tavsiye. Bir diff EğerS. Erent suşu Araştırmacılar, en az 24 saat süreyle kan> 10 5 CFU ml seviyelerinde bakteriyemi için hedeflemelidir, pneumoniae kullanılan veya farklı bir bulaşıcı yol arzu edilir.
Antimikrobiyal müdahale Yoğun Bakım Ünitesi ayarında bir insan modelleme iyileşme sırasında meydana gelen olayların, çalışma sağlar. O değil tüm fareler antimikrobiyal tedaviye rağmen hayatta ve bakteriyel boşluk doğruladı dikkati çekiyor. Müfettişler% 50-60 arasında ve hayvanların kaybı ile başa çıkmak için buna göre kohort boyutunu ayarlamak gerekir gibi sağkalım oranları beklemesin. 24 saat sonra hayvanların düzenli olarak izlenmesi son derece Kurumsal hayvan protokolleri onayladı ile uyum sağlamak için tavsiye edilir. Picro Sirius Kırmızı boyama kollajen birikimi görselleştirmek için kullanılan basit ve standart bir tekniktir. Burada, bu leke travmatik infectiou aşağıdaki kalp kapakçıklarında kardiyak yeniden incelemek için nasıl kullanılabileceğini ortaya konmuşturs bölüm. Picro Sirius Kırmızı çünkü tevdi kolajen ve çevresindeki doku arasında sunulan keskin kontrast, örneğin "Masson Trikrom Lekesi" olarak, kollajen birikimi görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan diğer tekniklerin üzerinde seçildi. Bu miyokard kolajen birikiminin kapsamını değerlendirmek, ImageJ gibi yazılım kullanılarak nicel bir şekilde, antibiyotik, aşağıdaki zaman son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Neogen | 7161A | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| anti-serotype 4 pneumococcus antiserum | Statens Serum Institut | 16747 | |
| goat anti-rabbit FITC conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluorsave | Millipore | 345789 | |
| Permount | Fisher Scientific | S70104 | |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | |
| phosphomolybdic acid 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
| 0.1% Sirius Red in picric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
| 0.01 N hydrochloric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
| Tissue Tack Microscope Slides | Polysciences, Inc | 24216 | |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | unspeciified | Standard |
References
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality. Circulation. 125, 773-781 (2012).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes. Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: a systematic review and meta-analysis of observational studies. PLoS Med. 8, e1001048 (2011).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Risk stratification for cardiac complications in patients hospitalized for community-acquired pneumonia. Mayo Clin. Proc. 89, 60-68 (2014).
- Kumar, S., et al. Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection. Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).
- Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. M. The association between pneumococcal pneumonia and acute cardiac events. Clin Infect Dis. 45, 158-165 (2007).
- Brown, A. O., et al. Streptococcus pneumoniae translocates into the myocardium and forms unique microlesions that disrupt cardiac function. PLoS Pathogens. In press, (2014).
- Orihuela, C. J., et al. Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models. The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).
- Flick, M. J., et al. Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia. Blood. 121, 1783-1794 (2013).
- Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19, 225-232 (2011).
- Arenal, A., et al. Do the spatial characteristics of myocardial scar tissue determine the risk of ventricular arrhythmias. Cardiovasc Res. 94, 324-332 (2012).
- Deneke, T., et al. Human histopathology of electroanatomic mapping after cooled-tip radiofrequency ablation to treat ventricular tachycardia in remote myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 1246-1251 (2005).
- Bakker, J. M., et al. Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation. Circulation. 77, 589-606 (1988).
- Verma, A., et al. Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).
- Wu, K. C. Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI. Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).
- Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293, 498-506 (2001).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
