Abstract
أصبحت الزرد أداة قوية لتقييم التنمية، وتجديد، والسرطان. وفي الآونة الأخيرة، تم وضع بروتوكولات زرع الخلايا المزروع أن engraftment تصريح من الخلايا الطبيعية والخبيثة إلى المشع، مسانج، والمناعي الزرد الكبار. هذه النماذج عندما يقترن مع بروتوكولات زرع الخلايا الأمثل السماح للتقييم السريع من وظيفة الخلايا الجذعية، وتجديد إصابة التالي، والسرطان. هنا، فإننا نقدم وسيلة لزرع الخلايا من الكبار الزرد العضلات والهيكل العظمي والعضلية المخططة الجنينية (ERMS)، وساركوما الأطفال التي تشترك الميزات مع العضلات الجنينية، إلى ضعف المناعة rag2 الكبار E450fs الزرد متحولة متماثل. الأهم من ذلك، هذه الحيوانات تفتقر خلايا T وقد خفضت وظيفة خلايا B، وتسهيل engraftment من مجموعة واسعة من الأنسجة من الحيوانات المانحة غير ذات صلة. بروتوكولات لدينا الأمثل تظهر أن fluorescently المسمى العضلات خلية preparations من الزرد المعدلة وراثيا α-الأكتين-طلب تقديم العروض تدبر بقوة عندما زرعها في عضلات ظهري من rag2 الأسماك متحولة متماثل. نحن أيضا إظهار engraftment من ERMS الفلورسنت المعدلة وراثيا حيث يقتصر مضان إلى خلايا بناء على حالة التمايز. على وجه التحديد، تم إنشاؤها في ERMS AB-سلالة myf5-GFP، mylpfa-mCherry الحيوانات والأورام المعدلة وراثيا مزدوجة حقن في الصفاق من الكبار المناعة الأسماك للخطر. فائدة هذه البروتوكولات تمتد إلى engraftment من مجموعة واسعة من الخلايا المانحة العادية والخبيثة التي يمكن زرعها في عضلات الظهرية أو الغشاء البريتوني من الزرد الكبار.
Introduction
الزرد ونموذجا ممتازا للدراسات التجدد لأنها يمكن تجديد الزعانف بتر، فضلا عن الدماغ التالفة، شبكية العين، والحبل الشوكي، القلب، والعضلات والهيكل العظمي والأنسجة الأخرى 1. الخلايا الجذعية والدراسات التجدد في الزرد الكبار وقد ركزت بشكل كبير على توصيف تجديد ردا على إصابة، في حين تحديد الجذعية والسلف الخلايا من الأنسجة المختلفة عن طريق زرع الخلايا مؤخرا فقط تم استكشاف 2. أصبحت الزرد أيضا تستخدم بشكل متزايد لدراسة السرطان من خلال توليد نماذج السرطان المعدلة وراثيا التي تحاكي الأمراض التي تصيب البشر 3 - 10.
في تحديد السرطان، أصبحت تبنى على نطاق واسع النهج زرع الخلايا وتسمح للتقييم فعالة من العمليات الهامة بما في ذلك السرطان التجديد الذاتي-11، عدم التجانس الوظيفي 12،13، 14 اتساع الأوعية الدموية، والانتشار،ردود العلاج 15، والغزو 16،17. ومع ذلك، غالبا ما يتم رفض الخلايا المغروسة من الأسماك المتلقي المقرر أن تستضيف الدفاعات المناعية التي تهاجم وتقتل الكسب غير المشروع 18. وقد استخدمت عدة طرق للتغلب على رفض الخلايا المغروسة. على سبيل المثال، والحيوانات المستفيدة جهاز المناعة يمكن أن يكون ذاب عابر بواسطة جرعة منخفضة غاما تشعيع قبل الزرع 18،19. ومع ذلك، فإن الجهاز المناعي المتلقي على التعافي من 20 يوما بعد التشعيع وتقتل الخلايا المانحة 18. بدلا من ذلك، تم استخدام العلاج ديكساميثازون لقمع T و B وظيفة الخلية، وتوفير تكييف القمعية يعد المناعة، وتسهيل engraftment من مجموعة واسعة من الأورام البشرية لمدة تصل إلى 30 يوما 14. هذه التجارب تتطلب ثابتة الجرعات المخدرات وتقتصر على دراسة الأورام الصلبة. وقد استخدمت المقايسات engraftment المدى الطويل خطوط مسانج وراثيا متطابقة 20-22، حيث المانحة وrecipiخلايا الأنف والحنجرة ليست محصنة ضد يقابل. ومع ذلك، تتطلب هذه النماذج خطوط المعدلة وراثيا التي تهم يمكن تجاوزه في الخلفية مسانج لأكثر من أربعة أجيال لإنتاج خطوط مسانج بالكامل. لتفادي قضايا الرفض المناعي في الأسماك المستفيدة، وقد وضعت مجموعتنا مؤخرا للخطر rag2 E450fs متحولة متماثل (ZFIN تسمية أليل rag2 fb101) خط التي خفضت T و B وظائف الخلايا والتي تسمح engraftment من مجموعة واسعة من الأنسجة إلى 23 في مأمن. وقد استخدمت ضعف المناعة نماذج مماثلة الماوس على نطاق واسع لزرع الخلايا من الماوس والأنسجة البشرية 24.
هنا، فإننا نقدم طرق لزرع العضلات الهيكلية والعضلية المخططة الجنينية (ERMS)، وساركوما الأطفال التي تشترك الميزات مع العضلات والهيكل العظمي، في rag2 وصف حديثا متماثل الزرد متحولة. إن وجود المناعي الزرد الكباريوسع قدرتنا على إجراء دراسات زرع الخلايا واسعة النطاق لتصور مباشرة وتقييم الخلايا الجذعية التجديد الذاتي داخل الأنسجة الطبيعية والخبيثة. مع هذا الأسلوب، fluorescently المسمى الاستعدادات الخلايا العضلية من الكبار α أكتين RFP-25 الزرد المعدلة وراثيا تدبر بقوة في rag2 الزرد متحولة متماثل بعد الحقن داخل العضلات الظهرية. وعلاوة على ذلك، علينا أن نظهر engraftment وتوسيع -GFP myf5 الابتدائي؛ mylpfa- mCherry ERMS المعدلة وراثيا بعد الحقن داخل الصفاق إلى rag2 E450fs الزرد متحولة متماثل. فائدة هذه البروتوكولات تتجاوز الأمثلة الموضحة ويمكن تطبيقها بسهولة إلى الأنسجة التجدد الزرد إضافية والسرطان.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية ماساتشوستس العام الفرعية مستشفى للبحوث رعاية الحيوان، تحت بروتوكول # 2011N000127.
القسم 1. الهيكل العظمي العضلات زرع الخلايا في rag2 الكبار E450fs متماثل المسخ اسماك الزرد
1. إعداد اسماك الزرد الكبار المانحة خلايا العضلات الهيكلية
- الحصول على الزرد الكبار المعدلة وراثيا التي fluorescently المسمى العضلات. في هذه التجربة، 30 α الأسماك -actin-RFP المانحة 25 استخدمت لزرع 1 × 10 6 خلايا في الأسماك المستفيدة.
- التضحية الزرد المانحة في 1.6 ملغ / مل تريكين methanesulfonate (MS222) لمدة 10 دقيقة أو حتى أي حركة الغطاء الخيشومي هو واضح.
- وضع الأسماك المانحة على منشفة ورقية ماصة والمكوس العضلة الظهرية باستخدام شفرة حلاقة نظيفة. ينبغي خفض بالقرب من فتحة الشرج بزاوية 45 درجة لتعظيم جمع الأنسجة (كما هو موضح في الشكل 1A
- إضافة 500 ميكرولتر عازلة تعليق (0.9x قبل المبردة الفوسفات عازلة المالحة (PBS) تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني (FBS)) إلى الأنسجة تشريح. ما يصل إلى 10 الزرد المانحة يمكن وضعها معا في هذا المجلد.
- تخطر على الأنسجة بشفرة حلاقة> 20 مرات حتى الخلايا في تعليق موحدة. والمتجانس عضلات ظهري بأكملها بما في ذلك الجلد والعظام وزعانف. إضافة 2 مل من العازلة تعليق. باستخدام ماصة 5 مل، يسحن تعليق خلية ≥20 مرات لفصل الخلايا.
- تصفية تعليق الخلية من خلال 40 ميكرون شبكة مصفاة في أنبوب مخروطي 50 مل وضعت على الجليد.
- غسل طبق بيتري مع 2.5 مل إضافية من العازلة تعليق لجمع الأنسجة المتبقية وتصفية من خلال نفس مصفاة وأنبوب مخروطي الشكل، إلى الحجم النهائي من 5 مل (10 السمك المانحة يمكن استخدامها في عزل).
ملاحظة: سيتم استبعاد الجلد والعظام وزعانف التالية الترشيح. إذا كان ذلك ممكنا، والجمع بين الايقاف مماثلة في نفس أنبوب مخروطي الشكل. - عد العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة باستخدام صبغة زرقاء التريبان وعدادة الكريات.
- حجز 500 ميكرولتر لالتدفق الخلوي، وإذا رغبت (اختياري، الخطوة 2).
- تعليق خلية الطرد المركزي في 1،000 x ج، لمدة 10 دقيقة، في 4 درجات مئوية.
- تجاهل الخلايا طاف و resuspend في 3.33 × 10 5 خلية / ميكرولتر (0.9x PBS + 5٪ FBS). في المجموع، وسوف يتم حقنه 3 ميكرولتر في الأسماك المتلقي لما مجموعه 1 × 10 6 خلايا في المتلقي (الخطوة 3).
ملاحظة: يجب زرع أقل من 3 ميكرولتر من تعليق خلية في الأسماك المستفيدة. إذا تم الحد من عدد الخلايا، ما يصل الى 5 × 10 4 خلايا في المتلقي يمكن أن يؤدي إلى engraftment ناجحة (الجدول 1).
2. تحليل تدفق الخلوي من الجهات المانحة الهيكل العظمي العضلات خلية إعداد (اختياري)
- عزل العضلات من النوع البري والأسماك غير المعدلة وراثيا على النحو المبين طن خطوة 1.1. تخدم هذه العينة كما سيطرة سلبية وغير مفيدة لوضع بوابات التدفق الخلوي.
- إضافة صبغة الجدوى المناسب. على سبيل المثال، إضافة 5 ميكرولتر من محلول المخزون دابي (500 نانوغرام / ميكرولتر) إلى 500 ميكرولتر من إعداد العضلات. دوامة السابقة قليلا إلى التحليل. الحصول على 5 × 03 حتي 01 أكتوبر × 10 4 الأحداث. تحليل عينات نوع السيطرة البرية أول من وضع بوابات تليها تحليل خلايا العضلات المعزولة من الأسماك المعدلة وراثيا.
عادة ما يتم إجراء تحليل التدفق الخلوي في حدود 1 ساعة بعد تشريح الأنسجة العضلية، وهي الفترة التي الخلايا تشريح تحتفظ أكثر من 60٪ حيوية (الشكل 2): ملاحظة. يجب أن تبقى الخلايا على الجليد في جميع الأوقات. مجموع بقاء الخلية يمكن إعادة تقييم قبل الزرع باستخدام صبغة زرقاء التريبان وعدادة الكريات.
3. العضلي زرع خلايا العضلات الهيكلية في rag2 الكبار متماثل المسخ اسماك الزرد
- تنظيف 10 μ؛ ل 26S G الصغرى حقنة عن طريق رسم في وطرد 10٪ من محلول التبييض (5 مرات)، تليها الايثانول 70٪ (5 مرات)، ثم تليها عازلة تعليق (0.9x PBS + 5٪ FBS، 10 مرات).
- تخدير متماثل الأسماك متحولة rag2 2-4 الشهر القديمة أو البرية الأسماك نوع المتلقي (كما الضوابط) وذلك بإضافة قطرات واحدة من methanesulfonate تريكين (MS222، 4 ملغ / مل حل الأسهم) في طبق بتري تحتوي الأسماك في المياه النظام حتى حركات بطيئة الغطاء الخيشومي والأسماك لا تزال.
ملاحظة: سوف جرعة التخدير تريكين تعتمد على العمر وحجم الزرد المتلقي. - وضع الزرد المتلقي تخدير على منشفة ورقية رطبة أو اسفنجة، مع الجانب الأيسر مواجهة.
- إدراج إبرة حقنة داخل العضلات latero الظهري (يرجى الرجوع إلى الشكل 1A). تأكد من أن الحقن يتم تنفيذ بزاوية 45 درجة. ضخ 3 ميكرولتر من تعليق خلية (المعد في الخطوة 1.12) في الأسماك لما مجموعه 1 × 10 6 خلايا في المتلقي.
- نقل بعناية الزرد حقنه في خزان نظيف باستخدام ملعقة بلاستيكية للتعافي.
- تقييم الزرد المتلقية لمعدلات engraftment في 10 و 20 و 30 يوما بعد زرع عن طريق التصوير الأسماك تخدير تحت حقل مشرق والمجهر epifluorescence.
القسم 2. الجنينية العضلية المخططة (ERMS) زرع في الكبار متماثل rag2 المسخ اسماك الزرد
4. DNA Microinjection من اسماك الزرد الأجنة
- خطي البلازميد rag2-kRASG12D 7 من هضم 10 ميكروغرام من الحمض النووي مع XhoI، عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات أو O / N.
- تنقية الحمض النووي عن طريق الفينول القياسية: استخراج الكلوروفورم ويعجل مع الإيثانول. resuspend في 20 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات (بدلا من ذلك، والأعمدة تنقية جزء DNA التجارية يمكن استخدام).
- تشغيل DNA عسر الهضم وهضمها على 1٪ هلام الاغاروز وتحديد تركيز الحمض النووي بذ القراءة مطياف. بدلا من ذلك، تشغيل عينات في 1: 1، 1: 5، و01:10 التخفيفات على 1٪ هلام الاغاروز وتحديد مقارنة سلم DNA.
- إعداد مزيج حقن بتركيز نهائي 15 نانوغرام / ميكرولتر من هضمها DNA rag2-kRASG12D في 0.1 M بوكل و0.5X تريس، EDTA. سوف كمية DNA النهائي حقن في 2 NL حجم الحقن يكون 30 ص.
ملاحظة: ما يصل إلى ثلاثة يبني DNA مختلفة يمكن أن يكون شارك في حقن بكفاءة في مدة أقصاها 60 خريج من الحمض النووي في الجنين. هذه الجينات المحورة تصبح دمجها في الجينوم وأعرب المشارك ضمن الورم النامي 26. - حقن خطي rag2-kRASG12D في خلية واحدة الأجنة مرحلة الأساس كما هو موضح 27 الى سلالة الزرد من الفائدة (الشكل 1B). يجب أن يتم تنفيذ الحقن في الخلية وليس في صفار البيض لأعلى كفاءة. في هذه التجربة، وهو ضعف المعدل وراثيا AB-السلالة، myf5-GFP، كان يستخدم mylpfa-mCherry. رفع الزرد باستخدام معيار تربية صrotocols 28.
ملاحظة: البقاء على قيد الحياة حقن غالبا ما يعتمد على سلالة الزرد المستخدمة. في المتوسط، فإن 30٪ من الأجنة المحقونة تطوير ERMS. وينبغي حقن 300-600 الأجنة في التجربة من أجل ضمان أن يتم إنشاء ما يكفي من GFP إيجابية وmCherry إيجابية الأورام الأولية للزرع والتحليل.
5. فحص لERMS الابتدائية في الزرد اليرقات
- مراقبة الزرد حقنه 10-30 يوما حقن آخر لظهور ERMS الأولية مرئية من الخارج.
- في 30 أيام بعد الحقن، تخدير الزرد المتلقي وذلك بإضافة قطرات واحدة من methanesulfonate تريكين (MS222 4 ملغ / مل حل الأسهم) في طبق بتري تحتوي على نظام أسماك المياه حتى حركات بطيئة الغطاء الخيشومي والأسماك لا تزال.
ملاحظة: سوف جرعة التخدير تريكين تعتمد على العمر وحجم الزرد المتلقي. الزرد الحاملة للورم الأولية تتطلب جرعات أقل من تريكين. - اختر الأساسي ERMS الحاملةالأسماك التي هي myf5-GFP -positive وmylpfa-mCherry -positive، وذلك باستخدام المجهر epifluorescence.
6. ERMS ورم إعداد
- تضحية الأساسي الزرد ERMS الحاملة مختارة في 1.6 ملغ / مل تريكين methanesulfonate (MS222) لمدة 10 دقيقة أو حتى أي حركة الغطاء الخيشومي هو واضح.
- معالجة كل الزرد الحاملة للورم على حدة. ضع السمك في طبق بيتري نظيفة وتشريح حول الورم باستخدام شفرة حلاقة وملقط غرامة (كما هو موضح في الشكل 1B). نقل أنسجة الورم تشريح على طبق بيتري نظيفة.
- إضافة 100 ميكرولتر من 0.9x قبل المبردة الفوسفات عازلة المالحة (PBS) تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني (FBS). اللحم المفروم الأنسجة بشفرة حلاقة نظيفة> 20 مرات حتى الخلايا في تعليق موحدة.
- إضافة 900 ميكرولتر من المخزن نفسه (0.9x PBS + 5٪ FBS)، ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لفصل الخلايا باستخدام 1000 ميكرولتر تصفيتها ماصة. تصفية من خلال 40 &# 956؛ م شبكة مصفاة في المقابلة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تخزين على الجليد.
- غسل طبق بيتري مع إضافي 2-4 مل من العازلة، ويمر عبر نفس شبكة مصفاة وإلى أنبوب مخروطي الشكل المقابل.
- الطرد المركزي في 1،000 x ج، لمدة 10 دقيقة، في 4 درجات مئوية.
- تجاهل وطاف resuspend في 100 ميكرولتر من العازلة.
- عد العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة باستخدام صبغة زرقاء التريبان وعدادة الكريات.
- تمييع الخلايا لتركيز المطلوب في نفس عازلة (0.9x PBS + 5٪ FBS). يجب أن تضعف الخلايا ل5 × 10 3 خلية / ميكرولتر لزرع 5 ميكرولتر في الزرد المتلقي في ما مجموعه 2.5 × 10 4 خلايا في المتلقي.
- يمكن أيضا إجراء تحليل التدفق الخلوي مع كمية صغيرة من تعليق من الخطوة 6.5 إلى ثبت قيمة النسب النسبية الخلايا الفلورسنت داخل العينة.
ملاحظة: تعيين جانبا 100 ميكرولتر من تعليق خلية (بعد التصفية في الخطوة 3.5) وتمييع مع 400 ميكرولترمن 0.9x PBS + 5٪ FBS تعليق عازلة للتحليل التدفق الخلوي. لضمان النابضة السليم، وإجراء تحليل إضافي باستخدام واحدة نسيج الورم المعدلة وراثيا أو عضلة معزولة من النوع البري البالغين، myf5-GFP والأسماك mylpfa-mCherry. أداء التدفق الخلوي أساسا كما هو موضح في الخطوة 2 من القسم 1.
7. زرع ERMS إلى الكبار rag2 متماثل المسخ اسماك الزرد
- تنظيف 10 ميكرولتر 26S G الصغرى حقنة عن طريق رسم في وطرد 10٪ من محلول التبييض (5 مرات)، تليها الايثانول 70٪ (5 مرات)، ثم تليها عازلة تعليق (0.9x PBS + 5٪ FBS، 10 مرات ).
- تخدير المتلقي متماثل الأسماك متحولة rag2 بإضافة قطرات واحدة من methanesulfonate تريكين (MS222 4 ملغ / مل حل الأسهم) في طبق بتري تحتوي الأسماك في المياه النظام حتى الحركات الغطاء الخيشومي بطيئة والأسماك لا تزال.
- وضع الزرد المتلقي تخدير على منشفة ورقية مبللة أو مكتب التخطيط الاستراتيجينجى، مع الجانب البطني مواجهة.
- حقن 5 ميكرولتر من تعليق خلية في التجويف البريتوني (2.5 × 10 4 خلايا لكل المتلقي).
ملاحظة: يجب تنظيف إبرة الحقن بين حقن أورام مختلفة كما هو موضح في الخطوة 4.1. من 5 إلى 10 ميكرولتر يمكن زرعها بكفاءة داخل الصفاق، وهذا يتوقف على المتلقي حجم الأسماك. ورم engraftment يمكن أن يتحقق عن طريق حقن 1 × 04-05 أكتوبر × 10 5 خلايا لم يتم فرزها في الأسماك المستفيدة (الجدول 1). - وضع بعناية الزرد المتلقي في خزان نظيف مع ملعقة بلاستيكية.
- تقييم الزرد المتلقية لمعدلات engraftment في 10 و 20 و 30 يوما بعد زرع عن طريق التصوير الأسماك تخدير تحت حقل مشرق والمجهر epifluorescence.
- استخدام الأسماك المغروسة لتطبيقات المصب بما في ذلك الإسفار المنشط خلية الفرز (FACS) لتقييم حالة التمايز (الشكل 3H)، analy النسيجي القياسيةجهاز الأمن والمخابرات (الشكل 3F)، والاستجابات العلاج التصوير 15، و / أو زرع التسلسلي النهج بما في ذلك الحد من تحليل التخفيف 11.
Representative Results
إجراء لإعداد وزرع خلايا العضلات والهيكل العظمي من المانحين المعدلة وراثيا α-الأكتين-طلب تقديم العروض في مأمن خطر متماثل الزرد متحولة rag2 وقد تجلى (القسم بروتوكول 1، الشكل 1A) والشكل (2). تم إعداد الأنسجة العضلية الهيكلية من المانحين المعدلة وراثيا α-الأكتين-طلب تقديم العروض وما ينتج عنها من تعليق خلية واحدة يتضمن خلايا قابلة للحياة 84.3٪ وفقا لتقييم دابي الإقصاء بعد تحليل التدفق الخلوي (الشكل 2B). شكلت خلايا RFP إيجابية 35.3٪ من هذا تعليق خلية واحدة (الشكل 2C). زرع الخلايا في الهيكل العظمي والعضلات الظهرية من rag2 متماثل الأسماك المتلقي متحولة أدى إلى engraftment ثابت وقوي وفقا لتقييم تمايز الخلايا واحدة إلى ألياف متعددة النوى (1 × 10 6 حقن الخلايا في الأسماك، الجدول 1، الشكل 2D-I). وايلد نوعمستلم فشلت الأسماك لتدبر ألياف العضلات خلال التجربة لمدة 30 يوما (ن = 13). قبل 10 أيام آخر زرع، 9 من أصل 14 rag2 متماثل الزرد متحولة الواردة ألياف العضلات RFP إيجابي بالقرب من موقع الحقن (64.3٪، الشكل 2E، F). الأهم من ذلك، استمرت المغروسة العضلات RFP إيجابي إلى 30 يوما بعد الزرع (الشكل 2G-I)، مع مجموعة فرعية من الحيوانات يجري اتباعها ل115 يوما بعد engraftment واظهار engraftment العضلات قوي ومستمر (لا تظهر البيانات). هذه النتائج مشابهة لتلك التي ذكرت سابقا من قبل مجموعتنا 23 باستخدام نفس البروتوكول (الجدول 1).
لقد قدمنا أيضا طريقة للجيل، وإعداد وزرع الخلايا السرطانية ERMS في التجويف البريتوني من الأسماك متحولة متماثلة اللواقح rag2 المتلقي (القسم بروتوكول 2، الشكل 1B والشكل 3). ERMS تم إنشاؤها في عزل مزدوه المعدلة وراثيا myf5-GFP، والأسماك mylpfa-mCherry التي ثبت للسماح التصور من عدم التجانس داخل ورمي والتحليل الوظيفي المجموعات السكانية الفرعية الخلايا السرطانية بعد زرع 11. ومع ذلك، المزيد من التوصيف الجزيئي لكل حيوانية صعب لأن الأسماك الصغيرة عندما تعمل على تطوير ERMS بين 10 إلى 30 يوما من الحياة وعدد من الخلايا السرطانية تحد لتطبيقات المصب. حل واحد هو توسيع أعداد الخلايا السرطانية التي كتبها engrafting ERMS في الزرد المتلقي الكبار. حتى الآن، وقد تم الانتهاء من تجارب مماثلة باستخدام CG1 سلالة الأسماك مسانج ويتطلب ما يزيد على 4 أجيال من backcrossing لتطوير خطوط مسانج التي كانت المعدلة وراثيا لmyf5-GFP. mylpfa-mCherry. للتحايل على هذه القضايا، أثبتنا فائدة المناعة rag2 خطر متماثل الزرد المتلقي متحولة إلى تدبر ERMS الأولية من الزرد AB-السلالة. جميع ERMS الأولية المغروسة في را G2 الحيوانات متحولة متماثلة اللواقح، وتسهيل توسع الورم (الجدول 1). تم الإبلاغ عن نتائج مماثلة في الآونة الأخيرة حيث 24 من 27 rag2 الزرد متحولة متماثل ERMS المغروسة في حين المغروسة 0 من 7 أشقاء نوع البرية المرض 23. ويرد مثال ممثل لERMS المغروسة في 30 يوما بعد زرع في الشكل 3E. المغروسة ERMS مشاركة ميزات النسيجية من العضلية المخططة الجنينية، مماثلة لتلك التي وجدت في الورم الرئيسي (الشكل 3B و3F). وأكد تحليل FACS أن ERMS الواردة ظيفيا الورم متميزة نشر الخلايا وخلايا متباينة التي تعبر عن myf5-GFP و / أو mylpfa-mCherry. وكانت معدلات البقاء على قيد الحياة بعد إجراء الحقن داخل الصفاق ما يزيد على 95٪. المتلقي الزرد فريسة عادة من عبء الورم بعد 30 يوما بعد زرع نقطة زمنية.
س: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
بروتوكول 1. الشكل التخطيطي ل(A) وضعها الطبيعي و(B) الخبيث الهيكل العظمي زرع الخلايا العضلية في rag2 متحولة متماثل الزرد. يتم وضع علامة خطوات اختيارية مع (*).
الشكل 2. engraftment الهيكل العظمي العضلات في rag2 متماثل الزرد متحولة. (A) α-الأكتين-طلب تقديم العروض المعدلة وراثيا الزرد المانحة. (ب) الجدوى خلية معزولة تعليق الخلايا العضلية وفقا لتقييم دابي صبغ الإقصاء والتدفق الخلوي. (C) نسبة الخلايا RFP إيجابي وجدت داخل تعليق الخلية العضلية من الجهات المانحة α-الأكتين-RFP (الحمراء)، مقارنة السيطرة نوع البرية(الرمادي). (DE) مدموجة الحقل مشرق والصور فلوري من الحيوانات البرية نوع (D) أو rag2 الأسماك متحولة متماثلة اللواقح (E) في 30 يوما بعد الزرع. معدلات (F) Engraftment مع مرور الوقت. الأحمر يدل على عدد الحيوانات المغروسة في حين يظهر اللون الرمادي الأسماك غير المغروسة. وأشار عدد من الحيوانات تحليلها في كل نقطة زمنية. (GI) وصور عالية التكبير من المنطقة محاصر في لوحة E يظهر في 10 (G)، 20 (H) و 30 (I) يوما بعد الزرع، والتي تبين الإبقاء على ألياف العضلات متباينة مع مرور الوقت (السهام). الحانات على نطاق وتساوي 2 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. زرع myf5-GFP، mylpfa-mCherry ERMS إلى متحولة متماثل rag2 . الزرد (AD) rag2-kRASG12D ERMS الأولية التي يسببها الناشئة في AB-سلالة myf5-GFP. الزرد mylpfa-mCherry في 30 يوما من الحياة. (EH) rag2 الزرد متحولة متماثل المغروسة مع ERMS وتحليلها في 30 يوما بعد الزرع. (A، E) مدموجة الحقل مشرق والصور فلوري من ERMS الابتدائية وزرعها. ويرد منطقة الورم ورأس السهم يشير موقع الحقن في E. (B، F) Hematoxylin- وأقسام الملطخة يوزين البارافين من الابتدائي (B) وERMS المغروسة (F) تبين مجالات زيادة الخلوية المرتبطة بالسرطان. (C،G) بقاء الخلية وفقا لتقييم دابي صبغ الإقصاء والتدفق الخلوي. (D، H) الفلورسنت الخلايا السرطانية السكان الفرعية، وفقا لتقييم التدفق الخلوي. الحانات على نطاق وتساوي 2 مم (A، E) و 50 ميكرومتر (B، F). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1. النتائج Engraftment لالعضلات وزرع الخلايا ERMS. (*) يدل ذكرت سابقا البيانات باستخدام نفس الأساليب 23. وأعيد طبعه البيانات بإذن من طرق الطبيعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.
Discussion
وقد حققت engraftment فعال وقوي من البالغين الظهرية العضلات والهيكل العظمي مع طريقة إعداد الخلية بسيط جدا تليها حقن الخلايا في العضلات الظهرية من rag2 الأسماك متحولة متماثل. بشكل عام، كانت الإجراءات حقن في العضل قوية جدا، مع بعض الوفيات المرتبطة التالية مباشرة إجراء الزرع، تتراوح ما بين 10٪ إلى 35٪ اعتمادا على التجربة. سوف الأمثل الإضافي المحتمل تركز على استخدام الإبر قياس أصغر للحقن وتطوير جهاز حقن ثابتة باستخدام المجهر ومياداة مجهرية، مما يسهل سهولة زرع الخلايا. تستخدم نهجنا أيضا خلايا العضلات التي لم يتم فرزها من الحيوانات المانحة ويتضمن فقط ما يقرب من 30٪ الخلايا الاصلية العضلات. استخدام خطوط مراسل المعدلة وراثيا أن تسمية الخلايا الجذعية وFACS العزلة من المرجح تقديم تعليق خلية المخصب التي تؤدي إلى زيادة engraftment في الأسماك المستفيدة. العضلات والهيكل العظمي جells ويمكن أيضا أن أثرى ومثقف قبل الزرع، كما هو موضح سابقا (29). بشكل ملحوظ، نتائجنا تشير أيضا إلى أن خطوات إنشاء المتخصصة والتفريق بين الأنسجة العضلية المانحة تحدث قبل 10 آخر أيام زرع، وإنشاء هذا النموذج بمثابة منصة تجريبية قوية وسريعة لتقييم engraftment العضلات والتجدد. وعلاوة على ذلك، هذه التجارب يتباين بشكل صارخ مع تلك التي أنجزت في الفئران، حيث مطلوب قبل الإصابة من العضلات مع cardiotoxin أو الباريوم كلوريد يومين قبل engraftment 30،31. ومن المرجح أن إصابة إبرة تنتج أثناء إجراء زرع يقوي engraftment من خلال تحفيز إنتاج بيئة التجدد داخل الحيوان المتلقي 32،33. نحن نتصور أيضا أن أسلوبنا سيتم تكييفها بسهولة إلى زرع أنسجة العضلات والهيكل العظمي من الزرد الأصغر سنا، مما يتيح تقييم الطفرات الوراثية التي تؤثر على التنمية العضلات والهيكل العظمي في وقت مبكرولكن تؤدي إلى الفتك في مراحل اليرقات.
قدمنا أيضا على بروتوكول مفصل لengraftment من ERMS الزرد عن طريق الحقن داخل الصفاق إلى، rag2 الأسماك متحولة غير مكيفة متماثل. وكان هذا النهج مفيدا للتوسع من الأورام الأولية المعدلة وراثيا مزدوجة دون الحاجة لتوليد أورام داخل خط المعدلة وراثيا مسانج. وقد أظهرت عملنا مؤخرا أن النهج زرع الخلايا وتوفر نماذج تجريبية جديدة لتقييم حساسية العقاقير ERMS في الجسم الحي، حيث يمكن توسيع ورم واحد إلى الآلاف من الحيوانات وتقييم للآثار على النمو والتجديد الذاتي، واتساع الأوعية الدموية 15. وعلاوة على ذلك، قمنا المغروسة بنجاح مجموعة واسعة من الأورام في rag2 الأسماك متحولة متماثلة اللواقح بما في ذلك الخلايا T سرطان الدم الحاد الليمفاوي، سرطان الجلد، وERMS 23. تتطلع نحو المستقبل، ونحن نتصور أن هذه السطور أن تكون مفيدة لتقييم الخصائص الفنية الهامة للسرطان فيفيفو بما في ذلك تقييم عدم التجانس داخل ورمي، والغزو، ورم خبيث، الأوعية الدموية، ومقاومة العلاج. وعلاوة على ذلك، فإن جيل من rag2 الأسماك متحولة متماثلة اللواقح في واضحة بصريا كاسبر سلالة الزرد 34 المرجح تسهيل التصوير المباشر للعديد من هذه السمات المميزة لمرض السرطان.
في المجموع، ونحن نقدم بروتوكولات مفصلة لengraftment ناجحة من العضلات والهيكل العظمي fluorescently المسمى الطبيعي والخبيثة في البالغين لrag2 متماثل في مأمن متحولة للخطر الزرد.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من عصير الليمون اليكس الوقوف مؤسسة (DML)، والجمعية الأمريكية للسرطان (DML)، وهوارد غودمان زمالة MGH (DML)، والولايات المتحدة المعاهد الوطنية للصحة منح R24OD016761 و1R01CA154923 (DML). CNY التدفق الخلوي الأساسية وتحليل تدفق صورة، والأجهزة المشتركة رقم منحة 1S10RR023440-01A1. ويتم تمويل IMT من قبل الزمالة من مؤسسة البرتغالية للعلوم والتكنولوجيا (فندجاو الفقرة على Ciência البريد TECNOLOGIA - FCT). ويتم تمويل QT من قبل مجلس المنح الدراسية الصين. نشكر أنجيلا Volorio لها تعليقات ونصائح مفيدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-EDTA buffer solution 1x | Sigma-Aldrich | 93283-100ML | Microinjection. Injection mix. |
| Potassium Chloride | Fisher Science Education | S77375-1 | Microinjection. Injection mix. |
| XhoI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0146S | Microinjection. Plasmid linearization. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 (50) or 28106 (250) | Microinjection. For purification of linearized plasmid up to 10 kb. |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | BP1753I-100 | Microinjection. For purification of linearized plasmid. |
| UltraPure Agarose, 500 g | Invitrogen | 16500-500 | Microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx | Microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | flow cytometry/FACS |
| 5 ml polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352058 | flow cytometry collection tube |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | FACS |
| 5 ml polypropylene round bottom tube | BD Falcon | 352063 | FACS collection tube |
| BD LSR II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | flow cytometry |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010-023 | transplantation |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-01 | transplantation |
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Western Chemical Inc. | http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html | Transplantation. Anesthetic. Caution: Irritant. Irritating to eyes, respiratory system, and skin. |
| VWR Absorbent Bench Underpads | VWR | 56616-018 | Transplantation. Regular paper towels or sponge can be used as an alternative. |
| Singe Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | transplantation |
| Petri Dish, Polystryrene Disposable Sterile | VWR | 25384-302 | transplantation |
| Cell Strainer, 40 µm Nylon | Falcon-Corning Incorporated | 352340 | transplantation |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430828 | transplantation |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | transplantation |
| Hemacytometer Set | Hausser Scientific | 1483 | transplantation |
| Hamilton syringe, fixed needle, volume 10 µl, needle size 26s ga (bevel tip) | Hamilton | 80366 | transplantation |
| Austin's A-1 Bleach, Commercial | James Austin Company | Transplantation. Any commercial solution can be used. | |
| Ethanol 190 Proof | Decon Labs, Inc. | DSP-MD.43 | Microinjection (linearized plasmid purification) and transplantation. Any commercial solution can be used. |
| High Speed Microcentrifuge, 300D Digital Microcentrifuge | Denville Scientific Inc. | C0265-24 | transplantation |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | 75004539 | Transplantation. Catalog number for 120 V, 60 Hz (US). |
| 5 ml serological pipets | BD Falcon | 357529 | transplantation |
| Corning Stripettor Plus Pipetting Controller | Corning Incorporated | 4090 | Transplantation. Any automatic pipetting controller can be used. |
| Powder free examination gloves | All steps. Any commercial brand can be used. | ||
| Filter pipet tips and micropipettes | All steps. Any commercial brand can be used. | ||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11205-20 | transplantation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | Scoring. Any appropriate fluorescent stereomicroscope can be used. |
| Olympus DP72 microscope digital camera | Olympus | DP72 | Scoring. Multiple adequate cameras for the selected imaging system can be used. |
References
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29 (11), (2013).
- Boatman, S., Barrett, F., Satishchandran, S., Jing, L., Shestopalov, I., Zon, L. I. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood cells, molecule., & diseases. 51 (4), 271-276 (2013).
- Langenau, D. M., Traver, D., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Yang, H. W., Kutok, J. L., et al. Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish. Cancer Research. , 7256-7262 (2004).
- Patton, E. E., Widlund, H. R., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current Biology. 15 (3), 249-254 (2005).
- Sabaawy, H. E., Azuma, M., Embree, L. J., Tsai, H. -J., Starost, M. F., Hickstein, D. D. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (41), 15166-15171 (2006).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Gene. 21 (11), 1382-1395 (2007).
- Le, X., Langenau, D. M., Keefe, M. D., Kutok, J. L., Neuberg, D. S., Zon, L. I. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
- Park, S. W., Davison, J. M., Rhee, J., Hruban, R. H., Maitra, A., Leach, S. D. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Zhuravleva, J., Paggetti, J., et al. MOZ/TIF2-induced acute myeloid leukaemia in transgenic fish. British journal of haematology. 143 (3), 378-382 (2008).
- Ignatius, M. S., Chen, E. Y., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Suppl Data. Cancer cell. 21 (5), 680-693 (2012).
- Blackburn, J. S., Liu, S., et al. Clonal Evolution Enhances Leukemia-Propagating Cell Frequency. Cancer cell. 25 (3), 366-378 (2014).
- Blackburn, J. S., Langenau, D. M. Zebrafish as a model to assess cancer heterogeneity, progression and relapse. Disease model. 7 (7), 755-762 (2014).
- Zhao, C., Wang, X., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS one. 6 (7), e21768 (2011).
- Chen, E. Y., DeRan, M. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 inhibitors induce the canonical WNT/β-catenin pathway to suppress growth and self-renewal in embryonal rhabdomyosarcoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5349-5354 (2014).
- Yang, X. -J., Cui, W., et al. A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion. PloS one. 8 (4), e61801 (2013).
- Chapman, A., Fernandez del Ama, L., Ferguson, J., Kamarashev, J., Wellbrock, C., Hurlstone, A. Heterogeneous Tumor Subpopulations Cooperate to Drive Invasion. Cell Reports. 8 (8), 1-8 (2014).
- Smith, A. C. H., Raimondi, A. R., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Iyengar, S., Houvras, Y., Ceol, C. J. Screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model. Journal of visualized experiments JoVE. (69), e50086 (2012).
- Mizgireuv, I., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2790 (2011).
- Tang, Q., Abdelfattah, N. S., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature methods. 11, 821-824 (2014).
- Zhou, Q., Facciponte, J., Jin, M., Shen, Q., Lin, Q. Humanized NOD-SCID IL2rg–/– mice as a preclinical model for cancer research and its potential use for individualized cancer therapies. Cancer letters. 344 (1), 13-19 (2014).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental biology. 192 (2), 289-299 (1997).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D. D. D., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), 1-5 (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon PRess. Eugene, OR. (2000).
- Alexander, M. S., Kawahara, G., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors). Muscl, & nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of visualized experiments JoVE. (86), 1-7 (2014).
- Gerli, M. F. M., Maffioletti, S. M., Millet, Q., Tedesco, F. S. Transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration. J Vis Exp. (83), e50532 (2014).
- Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell. The FEBS journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).
- Rowlerson, a, Radaelli, G., Mascarello, F., Veggetti, Regeneration of skeletal muscle in two teleost fish: Sparus aurata and Brachydanio rerio. Cell Tissue Res. 289 (2), 311-322 (1997).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell stem cell. 2 (2), 183-189 (2008).
