Abstract
Zebrafisk er blevet et stærkt værktøj til vurdering af udvikling, regenerering, og kræft. Mere for nylig er allograft celletransplantation protokoller blevet udviklet, som tillader inkorporering af normale og maligne celler i bestrålede syngene og immunsvækkede voksen zebrafisk. Disse modeller når kombineret med optimerede celletransplantationstjenester protokoller giver mulighed for hurtig vurdering af stamceller funktion, regenerering efter skade, og kræft. Her præsenterer vi en metode til celle transplantation af zebrafisk voksen skeletmuskulatur og embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), en pædiatrisk sarkom, der deler træk med embryonale muskel, i immun kompromitteret voksen rag2 E450fs homozygot mutant zebrafisk. Det er vigtigt, disse dyr mangler T-celler og har reduceret B-celle funktion, lette indpodning af en lang række af væv fra uafhængige donordyr. Vores optimerede protokoller viser, at fluorescens-mærket muskelceller prepartioner fra α-actin-RFP transgene zebrafisk indpode håndfast når implanteret i den dorsale muskulaturen rag2 homozygot mutant fisk. Vi demonstrerer også indpodning af fluorescerende-transgene ERMS hvor fluorescens er begrænset til celler baseret på differentiering status. Specifikt blev ERMS oprettet i AB-stammen myf5-GFP, mylpfa-mCherry dobbelt transgene dyr og tumorer injiceret i bughinden af voksne immunsvækkede fisk. Anvendeligheden af disse protokoller omfatter indpodning af en lang række af normale og maligne donorceller, som kan implanteres i dorsal muskulatur eller peritoneum voksen zebrafisk.
Introduction
Zebrafisk er en fremragende model til regenerativ undersøgelser, fordi de kan regenerere amputeret finner, samt en beskadiget hjerne, retina, rygmarv, hjerte, skeletmuskel og andre væv 1. Stamcelle og regenererende studier i voksne zebrafisk har i vid udstrækning fokuseret på karakterisering af regenerering som reaktion på skade, mens identifikation af stamceller og stamceller fra forskellige væv ved celle transplantation er først for nylig blevet udforsket 2. Zebrafisk er også blevet mere og mere brugt til studiet af kræft ved produktion af transgene kræftmodeller der efterligner menneskelig sygdom 3-10.
Ved fastsættelsen af kræft, har celletransplantationstjenester tilgange bliver udbredt og tillade dynamisk vurdering af vigtige cancer processer, herunder selvfornyelse 11, funktionel heterogenitet 12,13, neovaskularisering 14, spredning,terapi svar 15 og invasion 16,17. Imidlertid er indpodede celler ofte afvist fra modtageren fisk på grund vært immunforsvar, der angriber og dræber implantatet 18. Adskillige fremgangsmåder er blevet anvendt til at overvinde afvisning af indpodede celler. For eksempel kan modtageren dyr immunsystemet være forbigående ablateres af lavdosis gamma-bestråling før transplantation 18,19. Dog vil modtageren immunsystem komme med 20 dage efter bestråling og dræbe donorceller 18. Alternativt er dexamethasonbehandling blevet brugt til at undertrykke T og B-celle-funktion, hvilket giver længere immunundertrykkende konditionering og lette indpodning af en lang række humane tumorer i op til 30 dage 14. Disse eksperimenter kræver konstant lægemiddeldosering og er begrænset til at undersøge af faste tumorer. Engraftment på lang sigt assays har brugt genetisk identiske syngene linjer 20-22, hvor donor og recipiskellige celler er immune matchet. Disse modeller kræver dog, transgene linjer af interesse, der skal krydses ind i syngene baggrund for mere end fire generationer til at producere fuldt syngene linjer. For at undgå problemer med immunafstødning i modtageren fisk har vores gruppe for nylig udviklet en immunkompromitteret rag2 E450fs homozygot mutant (ZFIN allelbetegnelse rag2 fb101) linje, der har reduceret T- og B-celle funktion, og som tillader inkorporering af en lang række af væv 23. Lignende immun kompromitteret musemodeller har været brugt i udstrakt grad til celle transplantation af mus og humane væv 24.
Her præsenterer vi metoder til transplantation af skeletmuskulatur og embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), en pædiatrisk sarkom, der deler træk med skeletmuskulatur, i den nyligt beskrevne rag2 homozygot mutant zebrafisk. Tilgængeligheden af en immun kompromitteret voksen zebrafiskudvider vores evne til at udføre store celletransplantationstjenester undersøgelser direkte visualisere og vurdere stamcelle selvfornyelse inden for normale og maligne væv. Med denne metode, fluorescensmærket muskel cellepræparater fra voksne α-actin-RFP 25 transgene zebrafisk robust indpode i rag2 homozygot mutant zebrafisk efter injektion i den dorsale muskulatur. Desuden har vi demonstrere engraftment og udvidelse af primær myf5 -GFP; mylpfa- mCherry transgene ERMS efter intraperitoneal injektion i rag2 E450fs homozygot mutant zebrafisk. Nytten af disse protokoller går ud over de viste eksempler og kan nemt påføres yderligere zebrafisk regenerative væv og kræft.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Massachusetts General Hospital Underudvalget om Research Animal Care, under protokol # 2011N000127.
§ 1. Skeletmuskelprocent Cell Transplantation i Adult rag2 E450fs Homozygot Mutant Zebrafisk
1. Fremstilling af Voksen Zebrafisk Donor skeletmuskelceller
- Skabe transgene voksne zebrafisk, der har fluorescensmærket muskel. I dette eksperiment blev 30 α-actin-RFP donor fisk 25 anvendes til transplantation 1 x 10 6 celler pr modtager fisk.
- Sacrifice donor zebrafisk i 1,6 mg / ml tricaine methansulfonat (MS222) i 10 minutter eller indtil der ikke operculum bevægelse er indlysende.
- Placer donor fisk på et absorberende køkkenrulle og punktafgifter den rygmuskel med en ren barberblad. Snittet skal foretages i nærheden af anus i en 45 ° vinkel for at maksimere væv samling (som anført i figur 1A
- Tilføj 500 pi suspension buffer (præ-kølet 0,9x Phosphate Buffer Saline (PBS) suppleret med 5% kalvefosterserum (FBS)) til det dissekerede væv. Kan placeres op til 10 donor zebrafisk sammen i dette bind.
- Hak vævet med et barberblad> 20 gange, indtil cellerne er i en ensartet suspension. Hele dorsale muskulaturen homogeniseres herunder hud, ben og finner. Der tilsættes 2 ml suspension buffer. Anvendelse af en 5 ml pipette, udriv cellesuspensionen ≥20 gange for at dissociere cellerne.
- Filtreres cellesuspensionen gennem en 40 um mesh si i en 50 ml konisk rør anbragt på is.
- Vask petriskålen med yderligere 2,5 ml suspension buffer at indsamle resterende væv og filtreres gennem den samme si og konisk rør, til et endeligt volumen på 5 ml (10 donor fisk kan anvendes per isolat).
BEMÆRK: Hud, knogler og finner vil blive udelukket efter filtrering. Hvis det er relevant, kombinere lignende suspensioner i den samme koniske rør. - Tæl antallet af levedygtige celler ved hjælp af trypanblåt farvestof og et hæmocytometer.
- Reserve 500 pi for flowcytometri, hvis det ønskes (valgfri, trin 2).
- Centrifuge cellesuspension ved 1.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Supernatanten kasseres, og resuspender cellerne ved 3,33 x 10 5 celler / pl (0,9x PBS + 5% FBS). I alt vil 3 pi blive injiceret pr modtager fisk til en total på 1 x 10 6 celler pr modtager (trin 3).
BEMÆRK: Mindre end 3 pi cellesuspension skal transplanteres til modtageren fisk. Hvis celletal er begrænsende, kan så lave som 5 x 10 4 celler pr modtager føre til vellykket transplantation (tabel 1).
2. Flowcytometrianalyse af Donor Skeletmuskel Cell Forberedelse (valgfri)
- Isoler muskel fra en vildtype, ikke-transgene fisk som beskrevet in trin 1.1. Denne prøve tjener som negativ kontrol og er nyttigt til indstilling af flowcytometri porte.
- Tilføj en passende rentabilitet farvestof. For eksempel tilsættes 5 pi lager DAPI opløsning (500 ng / pl) til 500 pi muskel forberedelse. Vortex lidt før analyse. Erhverve 5 x 03 til 01 oktober x 10 4 begivenheder. Analyser vilde typen kontrolprøver først at sætte porte efterfulgt af analyse af muskelceller isoleret fra transgene fisk.
BEMÆRK: Flow cytometri analyse udføres sædvanligvis inden for 1 time efter muskelvæv dissektion, i hvilket tidsrum de dissekerede celler bevarer mere end 60% levedygtighed (figur 2). Celler bør holdes på is på alle tidspunkter. Samlet cellelevedygtighed kan revurderes før transplantation hjælp trypanblåt farvestof og et hæmocytometer.
3. Intramuskulær transplantation af skeletmuskelceller i Adult rag2 Homozygot Mutant Zebrafisk
- Rengør en 10 μL 26S G mikro-sprøjten ved at trække i og udstøde 10% blegeopløsning (5 gange), efterfulgt af 70% ethanol (5 gange), og derefter efterfulgt af suspension buffer (0,9x PBS + 5% FBS, 10 gange).
- Bedøver 2-4 måneder gammel homozygot rag2 mutant fisk eller vildtype modtager fisk (som kontroller) ved at tilføje enkelte dråber tricaine methansulfonat (MS222, 4 mg / ml stamopløsning) i en petriskål, der indeholder fisk i systemet vand, indtil Laag bevægelser langsomme og fisk er stadig.
BEMÆRK: Dosis af tricaine anæstesi afhænger af alder og størrelse af modtagerens zebrafisk. - Placer bedøvet modtager zebrafisk på en fugtig papirserviet eller svamp, med venstre side opad.
- Stik kanylen ind i den latero-dorsale muskulatur (se Figur 1A). Sørg for, at injektioner udføres i en 45 ° vinkel. Indsprøjtes 3 pi af cellesuspensionen (fremstillet i trin 1.12) per fisk til i alt 1 x 10 6 celler pr modtager.
- Overføre omhyggeligt injiceres zebrafisk i en ren beholder ved hjælp af en plastikske at komme sig.
- Vurdere modtager zebrafisk for engraftment priser på 10, 20, 30 dage efter transplantation af imaging bedøvet fisk under lyse felt og epifluorescens mikroskopi.
§ 2. embryonale rhabdomyosarcoma (ERMS) Transplantation i Adult Homozygot rag2 Mutant Zebrafisk
4. DNA mikroinjektion af zebrafisk embryoer
- Linearisere rag2-kRASG12D plasmid 7 ved at fordøje 10 ug DNA med XhoI ved 37 ° C i 6 timer eller O / N.
- Rens DNA ved standard phenol: chloroform ekstraktion og udfældes med ethanol. Resuspender i 20 pi deioniseret vand (alternativt kan der anvendes kommercielle DNA-fragment oprensningssøjlerne).
- Kør den nedbrudte og fordøjede DNA på en 1% agarosegel og bestemme koncentrationen af DNA By spektrometer læsning. Alternativt køre prøver på 1: 1, 1: 5, og 1:10 fortyndinger på en 1% agarosegel og kvantificere i forhold til en DNA-stige.
- Forbered en injektion blanding ved en endelig koncentration på 15 ng / pi fordøjet rag2-kRASG12D DNA i 0,1 M KCI og 0,5x Tris-EDTA. Det endelige DNA beløb injiceres i 2 nl af injektionsvolumen vil være 30 s.
BEMÆRK: Op til tre forskellige DNA-konstruktioner kan være effektivt co-injiceret i højst 60 pg af DNA pr embryo. Disse transgener bliver integreret i genomet og co-udtryk i udviklingen tumor 26. - Injicer lineariseret rag2-kRASG12D i én-celle embryoer væsentlige som beskrevet 27 i en zebrafisk stamme af interesse (figur 1B). Injektioner bør udføres i cellen og ikke i blommen for højere effektivitet. I dette eksperiment blev en dobbelt transgen AB-stamme; myf5-GFP blev mylpfa-mCherry anvendes. Hæv zebrafisk hjælp standard opdræt protocols 28.
BEMÆRK: Injection overlevelse er ofte afhængig af zebrafisk stamme. I gennemsnit vil 30% af injicerede embryoner udvikle ERMS. 300-600 embryoner skal injiceres pr eksperiment med henblik på at sikre, at tilstrækkeligt GFP-positive og mCherry positive primære tumorer genereres for transplantation og analyse.
5. Screening for Primære ERMS i zebrafisk Larver
- Overhold injiceret zebrafisk fra 10 til 30 dage efter injektion for fremkomsten af udvendigt synlige primære ERMS.
- Ved 30 dage efter injektion, bedøver modtager zebrafisk ved tilsætning enkelte dråber tricaine methansulfonat (MS222 4 mg / ml stamopløsning) i en petriskål indeholdende fisk systemet vand, indtil operculum bevægelser langsom og fisk er stadig.
BEMÆRK: Dosis af tricaine anæstesi vil afhænge af alder og størrelse af modtagerens zebrafisk. Primær tumor-bærende zebrafisk kræver lavere doser af tricaine. - Vælg primær ERMS-bærendefisk, der er myf5-GFP -positiv og mylpfa-mCherry -positiv, under anvendelse af et epifluorescensmikroskop.
6. ERMS Tumor Forberedelse
- Sacrifice valgte primære ERMS bærende zebrafisk i 1,6 mg / ml tricaine methansulfonat (MS222) i 10 minutter eller indtil der ikke operculum bevægelse er indlysende.
- Proces hver tumor-bærende zebrafisk separat. Placer fisk i en ren petriskål og dissekere omkring tumoren ved hjælp af et barberblad og fine tænger (som vist i figur 1B). Overfør det dissekerede tumorvæv til en ren petriskål.
- Tilsæt 100 pi præ-kølet 0,9x Phosphate Buffer Saline (PBS) suppleret med 5% kalvefosterserum (FBS). Hakkekød væv med en ren barberblad> 20 gange, indtil cellerne er i en ensartet suspension.
- Tilføj 900 pi af den samme buffer (0,9x PBS + 5% FBS), pipette op og ned flere gange for at dissociere celler under anvendelse af en 1000 pi filtrerede pipettespids. Der filtreres gennem en 40 &# 956 m mesh si til den tilsvarende 50 ml konisk rør. Opbevar på is.
- Vask petriskålen med yderligere 2-4 ml buffer, og passerer gennem samme mesh si og i det tilsvarende konisk rør.
- Der centrifugeres ved 1.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Supernatanten kasseres, og resuspender i 100 pi buffer.
- Tæl antallet af levedygtige celler ved hjælp af trypanblåt farvestof og et hæmocytometer.
- Fortynd celler til den ønskede koncentration i den samme buffer (0,9x PBS + 5% FBS). Celler bør fortyndes til 5 x 10 3 celler / pi til omplantning 5 pi per modtager zebrafisk i alt 2,5 x 10 4 celler pr modtager.
- Flowcytometrianalyse kan også udføres med en lille mængde af suspensionen fra trin 6.5 at kvantisere den relative mængde af fluorescerende celler i prøven.
BEMÆRK: Braklægning 100 pi cellesuspension (efter filtrering i trin 3.5) og fortyndes med 400 piaf 0,9x PBS + 5% FBS suspension buffer for flowcytometrianalyse. For at sikre korrekt gating, udføre yderligere analyse anvendes enkelt transgene tumorvæv eller muskel isoleret fra voksne vildtype, myf5-GFP og mylpfa-mCherry fisk. Udfør flowcytometri væsentlige som beskrevet i trin 2 i afdeling 1.
7. transplantation af ERMS i Adult rag2 Homozygot Mutant Zebrafisk
- Rens en 10 pi 26S G mikro-sprøjten ved at trække i og udstøde 10% blegeopløsning (5 gange), efterfulgt af 70% ethanol (5 gange), og derefter efterfulgt af suspension buffer (0,9x PBS + 5% FBS, 10 gange ).
- Bedøver modtager homozygote rag2 mutant fisk ved tilsætning enkelte dråber tricaine methansulfonat (MS222 4 mg / ml stamopløsning) i en petriskål indeholdende fisk i systemet vand, indtil operculum bevægelser er langsomme og fisk er stadig.
- Placer bedøvet modtager zebrafisk på en våd køkkenrulle eller spoNSÆ med den ventrale side opad.
- Indsprøjtes 5 pi af cellesuspensionen i bughulen (2,5 x 10 4 celler pr modtager).
BEMÆRK: Injektionskanylen skal rengøres mellem injektioner af forskellige tumorer som beskrevet i trin 4.1. 5 til 10 pi effektivt kan transplanteres intraperitonealt, afhængigt af modtageren fiskenes størrelse. Tumor transplantation kan opnås ved at injicere 1 x 04-5 oktober x 10 5 usorterede celler pr modtager fisk (tabel 1). - Placer forsigtigt modtager zebrafisk i en ren beholder med en plastikske.
- Vurdere modtager zebrafisk for engraftment priser på 10, 20, 30 dage efter transplantation af imaging bedøvet fisk under lyse felt og epifluorescens mikroskopi.
- Udnyt indpodet fisk til downstream-applikationer, herunder fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) for at vurdere differentiering status (figur 3H), standard histologisk ANALYsis (figur 3F), reaktioner imaging terapi 15, og / eller seriel transplantation tilgange, herunder begrænsende fortynding analyse 11.
Representative Results
En procedure for udarbejdelse og omplantning skeletmuskelceller fra α-actin-RFP transgene donorer i immun kompromitteret homozygot rag2 mutant zebrafisk er blevet påvist (protokol afsnit 1, figur 1A og figur 2). Skeletmuskelvæv blev fremstillet ud fra α-actin-RFP transgene donorer og den resulterende enkelt cellesuspension indeholdt 84,3% levedygtige celler som vurderet ved DAPI udelukkelse efter flowcytometrianalyse (figur 2B). RFP-positive celler omfattede 35,3% denne enkelt cellesuspension (figur 2C) af. Transplantation af celler i den dorsale skeletmuskel rag2 homozygot mutant modtager fisk førte fast og stærk indpodning som vurderet ved differentiering af enkelte celler i flerkernede fibre (1 x 10 6 celler injiceret pr fisk, tabel 1, figur 2D-I). Wild typenmodtager fisk ikke indpode muskelfibre over 30-dages forsøg (n = 13). Med 10 dage efter transplantation, 9 ud af 14 rag2 homozygot mutant zebrafisk indeholdt RFP-positive muskelfibre nær injektionsstedet (64,3%, figur 2E, F). Det er vigtigt, indpodet RFP-positive muskel varede 30 dage efter transplantation (figur 2G-I), med en delmængde af dyr, der følges i 115 dage efter engraftment og udviser robust og vedvarende muskel engraftment (data ikke vist). Disse resultater svarer til de tidligere rapporteret af vores gruppe 23 samt under anvendelse af den samme protokol (tabel 1).
Vi har også præsenteret en metode til produktion, forberedelse og transplantation af ESDH tumorceller i bughulen af rag2 homozygot mutant modtager fisk (protokoltjenesten 2, figur 1B og figur 3). ERMS blev genereret i dobbe transgene myf5-GFP; mylpfa-mCherry fisk, der har vist sig at tillade visualisering af intratumoral heterogenitet og funktionel analyse af tumor cellesubpopulationer efter transplantation 11. Er imidlertid vanskeligt yderligere molekylær karakterisering af hver delpopulation, fordi fiskene er små, når de udvikler ERMS mellem 10 til 30 dage af livet, og antallet af tumorceller er begrænsende for efterfølgende anvendelser. En løsning er at udvide tumor celletal ved leverindføjede ERMS i voksen modtager zebrafisk. Hidtil har lignende forsøg er gennemført på CG1-stammen syngene fisk og krævede i over 4 generationer af tilbagekrydsning at udvikle syngene linjer, der var transgene for myf5-GFP; mylpfa-mCherry. For at omgå disse problemer, vi demonstrerede anvendeligheden af immun kompromitteret rag2 homozygot mutant modtager zebrafisk at indpode primære ERMS fra en AB-stamme zebrafisk. Alle primære ERMS indpodet i rag2 homozygote mutante dyr, letter udvidelse af tumoren (tabel 1). Lignende resultater blev for nylig rapporteret, hvor 24 af 27 rag2 homozygot mutant zebrafisk indpodede ERMS, mens 0 af 7 vildtype søskende indpodet sygdom 23. Et repræsentativt eksempel på en indpodet ERMS er vist 30 dage efter transplantation i figur 3E. Indpodede ERMS deler histologiske træk embryonal rhabdomyosarcoma, svarende til den, der findes i den primære tumor (figur 3B og 3F). FACS analyse bekræftede, at Erms indeholdt funktionelt distinkt tumor formerings celler og differentierede celler, der udtrykker myf5-GFP og / eller mylpfa-mCherry. Overlevelsesrater efter intraperitoneal injektion procedure var på over 95%. Modtager zebrafisk almindeligvis bukke fra tumorbyrde efter de 30 dage efter transplantation tidspunkt.
Figur 1. Protokol skematiske for (A) normal og (B) malign skeletmuskulatur celletransplantation i rag2 homozygot mutant zebrafisk. er valgfrie trin markeret med (*).
Figur 2. Skeletmuskel indpodning i rag2 homozygot mutant zebrafisk. (A) α-actin-RFP transgene donor zebrafisk. (B) Cellelevedygtighed af isoleret muskel cellesuspension som vurderet ved DAPI farveeksklusion og flowcytometri. (C) Andel af RFP-positive celler fundet i muskel cellesuspension fra α-actin-RFP donor (rød), sammenlignet med en vildtype-kontrol(Grå). (DE) Flettede lyse felt og fluorescerende billeder af vildtype dyr (D) eller rag2 homozygote mutant fisk (E) 30 dage efter transplantationen. (F) indpodning satser over tid. Red betegner antallet af indpodede dyr, mens grå viser ikke-indpodet fisk. Antal dyr analyseret ved hvert tidspunkt er vist. (GI) stor forstørrelse billeder af boxed region i panelet E vist ved 10 (G), 20 (H) og 30 (I) dage efter transplantationen, viser tilbageholdelse af differentierede muskelfibre over tid (pilespidser). Scale barer lig 2 mm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Transplantation af myf5-GFP, mylpfa-mCherry ERMS i rag2 homozygot mutant . zebrafisk (AD) rag2-kRASG12D inducerede primære ERMS opstår i AB-stammen myf5-GFP; mylpfa-mCherry zebrafisk efter 30 dage af livet. (EH) rag2 homozygot mutant zebrafisk indpodet med ERMS og analyseret efter 30 dage efter transplantationen. (A, E) Flettede lyse felt og fluorescerende billeder af primære og transplanterede ERMS. Tumor område er skitseret og pilespids angiver injektionsstedet i E. (B, F) Hematoxylin- og eosin-farvede paraffinsnit af primær (B) og indpodede ERMS (F) viser områder med forøget cellularitet associeret med cancer. (C,G) Cellelevedygtighed vurderet ved DAPI farveeksklusion og flowcytometri. (D, H) Fluorescerende tumor celle subpopulationer, som vurderet ved flowcytometri. Scale barer lig 2 mm (A, E) og 50 um (B, F). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Tabel 1. indpodning resultater for muskler og ERMS celle transplantation. (*) Angiver tidligere rapporteret data ved hjælp af de samme teknikker 23. Data genoptrykt med tilladelse fra Nature Methods. Klik her for at se en større version af denne tabel.
Discussion
Effektiv og robust indpodning af voksne dorsale skeletmuskulatur blev opnået med en meget enkel cellepræparation metode efterfulgt af injektion af celler i dorsale muskulaturen rag2 homozygot mutant fisk. Generelt intramuskulær injektion procedurer var meget robust, med nogle tilhørende død umiddelbart efter implantation procedure, der spænder fra 10% til 35% afhængig af eksperimentet. Yderligere optimering vil sandsynligvis koncentrere sig om udnyttelse af mindre gauge nåle til injektion og udvikling af apparatur stationære injektion ved mikroskopi og mikromanipulator, hvilket vil lette nem implantere celler. Vores tilgang også brugt usorterede muskelceller fra donordyr og kun indeholdt ca. 30% muskel stamceller. Anvendelse af transgene reporter linier, som mærker stamceller og FACS isolation vil sandsynligvis give berigede cellesuspensioner, der fører til øget indpodning i modtageren fisk. Skeletmuskel calen kan også beriges og dyrkes før transplantation, som tidligere beskrevet 29. Bemærkelsesværdigt, vores resultater viser også, at de trin niche etablering og differentiering af donor muskelvæv ske før 10 dage efter transplantationen, oprettelse denne model som en robust og hurtig eksperimentel platform til at vurdere muskel engraftment og regeneration. Desuden disse eksperimenter skarp kontrast til dem, afsluttet i mus, hvor pre-skade muskler med cardiotoxin eller bariumchlorid kræves to dage forud for transplantation 30,31. Det er sandsynligt, at nålen er produceret under transplantation procedure potenserer indpodning ved at stimulere produktionen af en regenerativ miljø i den modtagende dyr 32,33. Vi forestiller også, at vores metode vil let tilpasses til transplantation af skeletmuskulatur væv fra yngre zebrafisk, hvilket man kan vurdere genetiske mutationer, der påvirker tidlige skeletmuskulatur udviklingmen fører til dødelighed hos larvestadier.
Vi har også givet en detaljeret protokol for indpodning af zebrafisk ERMS ved intraperitoneal injektion i ikke-condition, rag2 homozygot mutant fisk. Denne fremgangsmåde er nyttig til ekspansion af dobbelt transgene primære tumorer uden behov for at frembringe tumorer i en syngen transgen linje. Vores seneste arbejde har vist, at celletransplantationstjenester tilgange tilvejebringe nye eksperimentelle modeller til vurdering ERMS lægemiddelfølsomhed in vivo, hvor en enkelt tumor kan udvides i tusindvis af dyr og vurderet for virkningerne på vækst, selv-fornyelse, og neovaskularisering 15. Endvidere har vi med succes indpodet en bred vifte af tumorer i rag2 homozygot mutant fisk, herunder T-celle akut lymfoblastisk leukæmi, melanom, og ERMS 23. Ser mod fremtiden, vi forestiller disse linjer vil være nyttige for vurderingen af vigtige funktionelle egenskaber af kræft ivivo, herunder vurdering intratumoral heterogenitet, invasion, metastase, angiogenese og modstand terapi. Desuden vil genereringen af rag2 homozygot mutant fisk i optisk klare Casper stamme zebrafisk 34 sandsynligvis lette den direkte billeddannelse af mange af disse kendetegnende for kræft.
I alt giver vi detaljerede protokoller for en vellykket transplantation af fluorescens-mærkede normal og malign skeletmuskel i til voksne rag2 homozygot mutant immun kompromitteret zebrafisk.
Acknowledgments
Dette arbejde understøttes af Alex 'Lemonade Stand Foundation (DML), American Cancer Society (DML), MGH Howard Goodman Fellowship (DML), og amerikanske National Institutes of Health giver R24OD016761 og 1R01CA154923 (DML). CNY flowcytometri Core og Flow billedanalyse, fælles instrumentering tilskud nummer 1S10RR023440-01A1. IMT er finansieret af et stipendium fra det portugisiske Foundation for Videnskab og Teknologi (Fundação para a Ciência e Tecnologia - FCT). QT er finansieret af Kina Scholarship Rådet. Vi takker Angela Volorio for hendes nyttige kommentarer og råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-EDTA buffer solution 1x | Sigma-Aldrich | 93283-100ML | Microinjection. Injection mix. |
| Potassium Chloride | Fisher Science Education | S77375-1 | Microinjection. Injection mix. |
| XhoI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0146S | Microinjection. Plasmid linearization. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 (50) or 28106 (250) | Microinjection. For purification of linearized plasmid up to 10 kb. |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | BP1753I-100 | Microinjection. For purification of linearized plasmid. |
| UltraPure Agarose, 500 g | Invitrogen | 16500-500 | Microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx | Microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | flow cytometry/FACS |
| 5 ml polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352058 | flow cytometry collection tube |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | FACS |
| 5 ml polypropylene round bottom tube | BD Falcon | 352063 | FACS collection tube |
| BD LSR II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | flow cytometry |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010-023 | transplantation |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-01 | transplantation |
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Western Chemical Inc. | http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html | Transplantation. Anesthetic. Caution: Irritant. Irritating to eyes, respiratory system, and skin. |
| VWR Absorbent Bench Underpads | VWR | 56616-018 | Transplantation. Regular paper towels or sponge can be used as an alternative. |
| Singe Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | transplantation |
| Petri Dish, Polystryrene Disposable Sterile | VWR | 25384-302 | transplantation |
| Cell Strainer, 40 µm Nylon | Falcon-Corning Incorporated | 352340 | transplantation |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430828 | transplantation |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | transplantation |
| Hemacytometer Set | Hausser Scientific | 1483 | transplantation |
| Hamilton syringe, fixed needle, volume 10 µl, needle size 26s ga (bevel tip) | Hamilton | 80366 | transplantation |
| Austin's A-1 Bleach, Commercial | James Austin Company | Transplantation. Any commercial solution can be used. | |
| Ethanol 190 Proof | Decon Labs, Inc. | DSP-MD.43 | Microinjection (linearized plasmid purification) and transplantation. Any commercial solution can be used. |
| High Speed Microcentrifuge, 300D Digital Microcentrifuge | Denville Scientific Inc. | C0265-24 | transplantation |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | 75004539 | Transplantation. Catalog number for 120 V, 60 Hz (US). |
| 5 ml serological pipets | BD Falcon | 357529 | transplantation |
| Corning Stripettor Plus Pipetting Controller | Corning Incorporated | 4090 | Transplantation. Any automatic pipetting controller can be used. |
| Powder free examination gloves | All steps. Any commercial brand can be used. | ||
| Filter pipet tips and micropipettes | All steps. Any commercial brand can be used. | ||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11205-20 | transplantation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | Scoring. Any appropriate fluorescent stereomicroscope can be used. |
| Olympus DP72 microscope digital camera | Olympus | DP72 | Scoring. Multiple adequate cameras for the selected imaging system can be used. |
References
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29 (11), (2013).
- Boatman, S., Barrett, F., Satishchandran, S., Jing, L., Shestopalov, I., Zon, L. I. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood cells, molecule., & diseases. 51 (4), 271-276 (2013).
- Langenau, D. M., Traver, D., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Yang, H. W., Kutok, J. L., et al. Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish. Cancer Research. , 7256-7262 (2004).
- Patton, E. E., Widlund, H. R., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current Biology. 15 (3), 249-254 (2005).
- Sabaawy, H. E., Azuma, M., Embree, L. J., Tsai, H. -J., Starost, M. F., Hickstein, D. D. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (41), 15166-15171 (2006).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Gene. 21 (11), 1382-1395 (2007).
- Le, X., Langenau, D. M., Keefe, M. D., Kutok, J. L., Neuberg, D. S., Zon, L. I. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
- Park, S. W., Davison, J. M., Rhee, J., Hruban, R. H., Maitra, A., Leach, S. D. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Zhuravleva, J., Paggetti, J., et al. MOZ/TIF2-induced acute myeloid leukaemia in transgenic fish. British journal of haematology. 143 (3), 378-382 (2008).
- Ignatius, M. S., Chen, E. Y., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Suppl Data. Cancer cell. 21 (5), 680-693 (2012).
- Blackburn, J. S., Liu, S., et al. Clonal Evolution Enhances Leukemia-Propagating Cell Frequency. Cancer cell. 25 (3), 366-378 (2014).
- Blackburn, J. S., Langenau, D. M. Zebrafish as a model to assess cancer heterogeneity, progression and relapse. Disease model. 7 (7), 755-762 (2014).
- Zhao, C., Wang, X., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS one. 6 (7), e21768 (2011).
- Chen, E. Y., DeRan, M. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 inhibitors induce the canonical WNT/β-catenin pathway to suppress growth and self-renewal in embryonal rhabdomyosarcoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5349-5354 (2014).
- Yang, X. -J., Cui, W., et al. A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion. PloS one. 8 (4), e61801 (2013).
- Chapman, A., Fernandez del Ama, L., Ferguson, J., Kamarashev, J., Wellbrock, C., Hurlstone, A. Heterogeneous Tumor Subpopulations Cooperate to Drive Invasion. Cell Reports. 8 (8), 1-8 (2014).
- Smith, A. C. H., Raimondi, A. R., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Iyengar, S., Houvras, Y., Ceol, C. J. Screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model. Journal of visualized experiments JoVE. (69), e50086 (2012).
- Mizgireuv, I., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2790 (2011).
- Tang, Q., Abdelfattah, N. S., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature methods. 11, 821-824 (2014).
- Zhou, Q., Facciponte, J., Jin, M., Shen, Q., Lin, Q. Humanized NOD-SCID IL2rg–/– mice as a preclinical model for cancer research and its potential use for individualized cancer therapies. Cancer letters. 344 (1), 13-19 (2014).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental biology. 192 (2), 289-299 (1997).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D. D. D., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), 1-5 (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon PRess. Eugene, OR. (2000).
- Alexander, M. S., Kawahara, G., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors). Muscl, & nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of visualized experiments JoVE. (86), 1-7 (2014).
- Gerli, M. F. M., Maffioletti, S. M., Millet, Q., Tedesco, F. S. Transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration. J Vis Exp. (83), e50532 (2014).
- Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell. The FEBS journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).
- Rowlerson, a, Radaelli, G., Mascarello, F., Veggetti, Regeneration of skeletal muscle in two teleost fish: Sparus aurata and Brachydanio rerio. Cell Tissue Res. 289 (2), 311-322 (1997).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell stem cell. 2 (2), 183-189 (2008).
