Abstract
Zebrafisch haben sich ein leistungsfähiges Werkzeug für die Bewertung der Entwicklung, Regeneration und Krebs. In jüngerer Zeit haben Allograft-Transplantation Protokolle gezeigt, dass die Genehmigung Verpflanzung von normalen und malignen Zellen in bestrahlte syngene und immungeschwächten erwachsenen Zebrafisch entwickelt. Diese Modelle, wenn sie mit optimierten Zelltransplantation Protokolle erlauben die schnelle Beurteilung der Stammzellfunktion, die Regeneration nach Verletzungen und Krebs. Hier präsentieren wir eine Methode zur Zelltransplantation von Zebrafisch Erwachsene Skelettmuskulatur und embryonale Rhabdomyosarkom (ERMS), einer pädiatrischen Sarkomen, die Merkmale teilt mit embryonalen Muskel, in immungeschwächten Erwachsenen Rag2 E450fs homozygot mutierten Zebrafisch. Wichtig ist, fehlt diese Tiere T-Zellen und B-Zell-Funktion haben reduziert, erleichtert Verpflanzung von einer Vielzahl von Geweben, von nicht verwandten Spendertieren. Unsere optimierte Protokolle zeigen, dass fluoreszenzMuskelZelle prepar gekennzeichnettionen von α-Aktin-RFP transgenen Zebrafisch engraft robust, wenn sie in der dorsalen Muskulatur Rag2 homozygot mutierte Fisch implantiert. Wir zeigen auch, Verpflanzung von fluoreszenz transgenen LOSSAR wo Fluoreszenz wird an Zellen basierend auf Differenzierungsstatus beschränkt. Insbesondere LOSSAR wurden in AB-Dehnungs Myf5-GFP erzeugt; mylpfa-mCherry doppelt transgenen Tiere und Tumore in das Peritoneum von erwachsenen Personen mit geschwächtem Immunsystem Fisch injiziert. Die Nützlichkeit dieser Protokolle erstreckt, um die Transplantation von einer Vielzahl von normalen und malignen Donorzellen, die in die Rückenmuskulatur oder Peritoneum von erwachsenen Zebrafisch implantiert werden kann.
Introduction
Zebrafische sind ein hervorragendes Modell für regenerative Studien, weil sie amputierten Flossen, sowie ein beschädigtes Gehirn, Netzhaut, Rückenmark, Herz, Skelettmuskel und andere Gewebe 1 zu regenerieren. Stammzellen und regenerative Studien bei erwachsenen Zebrafisch sind weitgehend auf die Charakterisierung der Regeneration in Reaktion auf eine Verletzung konzentriert, während die Identifizierung von Stamm- und Vorläuferzellen aus verschiedenen Geweben von Zelltransplantation ist erst seit kurzem erforscht 2. Zebrafisch haben sich auch durch die Erzeugung transgener Krebsmodelle, die menschliche Krankheit imitieren 3 für die Untersuchung von Krebs zunehmend gebrauchte - 10.
Bei der Einstellung von Krebs, haben Zelltransplantation Ansätze geworden weithin angenommen und ermöglichen die dynamische Bewertung der wichtigsten Krebsprozesse einschließlich Selbsterneuerung 11, funktionale Heterogenität 12,13, Neovaskularisation 14, Proliferation,Therapieantworten 15, und Invasion 16,17. Allerdings sind eingepflanzt Zellen oft von Empfänger Fisch aufgrund der Immunabwehr, die angreifen und töten das Transplantat 18 Host abgelehnt. Mehrere Verfahren wurden verwendet, um die Abstoßung der transplantierten Zellen zu überwinden. Zum Beispiel können die Empfängertiere Immunsystem kann transient durch niedrige Dosis Gammastrahlung vor der Transplantation 18,19 abgetragen werden. Allerdings wird der Empfänger Immunsystem durch 20 Tage zu erholen nach der Bestrahlung und töten Spenderzellen 18. Alternativ Dexamethason-Behandlung wurde verwendet, um T- und B-Zell-Funktion zu unterdrücken, wodurch längere immunsuppressive Anlage und erleichtert Verpflanzung von einer breiten Palette von humanen Tumoren für bis zu 30 Tage 14. Diese Experimente erfordern ständige Medikamentendosierung und beschränken sich auf solider Tumoren zu untersuchen. Dauerhaftes Anwachsen Assays genetisch identisch syngenen Linien verwendet 20-22, wo der Spender und Empent-Zellen sind Immun abgestimmt. Jedoch erfordern diese Modelle transgenen Linien von Interesse in das syngene Hintergrund für mehr als vier Generationen gekreuzt, um vollständig syngenen Linien erzeugen. Um Fragen der Immunabwehr in den Empfänger Fisch zu vermeiden, hat unsere Gruppe kürzlich entwickelten eine Immun beeinträchtigt Rag2 E450fs homozygote Mutante (ZFIN Allel Bezeichnung Rag2 FB101) Linie, die T- und B-Zell-Funktion reduziert haben und die Verpflanzung von einer breiten Palette von Gewebe 23 zu ermöglichen. Ähnliche immungeschwächten Mausmodelle in großem Umfang für Zelltransplantation von Maus und menschliche Gewebe 24 verwendet.
Hier präsentieren wir Methoden zur Transplantation von Skelettmuskulatur und embryonale Rhabdomyosarkom (ERMS), einer pädiatrischen Sarkomen, die Merkmale teilt mit Skelettmuskel, in den neu beschriebenen Rag2 homozygot mutierten Zebrafisch. Die Verfügbarkeit eines immungeschwächten erwachsenen Zebrafischerweitert unsere Fähigkeit, große Zelltransplantation Studien durchführen, um direkt zu visualisieren und zu bewerten Stammzellenselbsterneuerung in normalen und malignen Geweben. Mit diesem Verfahren fluoreszenz aus adulten α-Actin-RFP 25 transgene Zebrafisch robust in Rag2 engraft markierten Muskelzellpräparate homozygot mutierten Zebrafisch nach der Injektion in die dorsale Muskulatur. Darüber hinaus zeigen wir, Transplantation und Erweiterung der Grund Myf5 -GFP; mylpfa- mCherry transgenen ERMS nach intraperitonealer Injektion in Rag2 E450fs homozygot mutierten Zebrafisch. Die Nützlichkeit dieser Protokolle geht über die gezeigten Beispiele und können leicht zusätzliche Zebrabärbling regenerative Geweben und Krebsarten angewendet werden.
Protocol
Alle tierischen Verfahren wurden von Massachusetts General Hospital Unterausschuss für Forschung Tierpflege, unter Protokoll # 2011N000127 zugelassen.
Abschnitt 1. Skelettmuskel Cell Transplantation in Adult Rag2 E450fs Homozygote Mutanten Zebrafisch
1. Vorbereitung der erwachsenen Zebrafisch Spenderskelettmuskelzellen
- Erhalten transgener erwachsenen Zebrafisch, der fluoreszenzMuskel beschriftet haben. In diesem Experiment wurden 30 α-Actin-RFP Spenderfische 25 genutzt, um zu trans 1 x 10 6 Zellen pro Empfänger Fisch.
- Sacrifice Spenderzebrafisch in 1,6 mg / ml methansulfonat (MS222) für 10 Minuten oder bis kein Operculum Bewegung ist offensichtlich Tricaine.
- Zeigen Spender Fisch auf ein saugfähiges Papiertuch und Verbrauchsteuern die Rückenmuskel mit einem sauberen Rasierklinge. Der Schnitt sollte in der Nähe des Anus in einem 45 ° Winkel, um Gewebesammlung (zu maximieren, wie in 1A angemerkt
- Gib 500 ul Suspensionspuffer (vorgekühltem 0,9x Phosphate Buffer Saline (PBS) mit 5% fötalem Rinderserum (FBS)) an die sezierten Gewebe. Bis zu 10 Spenderzebrafisch kann in diesem Band zusammengestellt werden.
- Hackfleisch das Gewebe mit einer Rasierklinge> 20 Mal, bis die Zellen sind in einem gleichmäßigen Suspension. Die gesamte Rückenmuskulatur homogenisiert einschließlich Haut, Knochen und Rippen. 2 ml Suspensionspuffer. Mit einem 5 ml-Pipette, verreiben Sie die Zellsuspension ≥20 mal zu den Zellen zu trennen.
- Filtern der Zellsuspension durch ein 40 um Mesh Sieb in einem 50 ml konischen Röhrchen auf Eis gestellt.
- Wasche die Petrischale mit zusätzlichen 2,5 ml Suspensionspuffer auf verbleibende Gewebe zu sammeln und zu filtern durch die gleiche Sieb und konischen Rohr, zu einem Endvolumen von 5 ml (10 Spenderfische pro Isolat verwendet werden).
HINWEIS: Haut, Knochen und Flossen wird nach der Filtration ausgeschlossen. Gegebenenfalls verbinden ähnliche Suspensionen in den gleichen konischen Rohr. - Die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen unter Verwendung von Trypanblau-Farbstoff und einem Hämocytometer.
- Reservieren 500 ul für die Durchflusszytometrie, falls gewünscht (optional, Schritt 2).
- Zentrifuge Zellsuspension bei 1.000 xg für 10 min bei 4 ° C.
- Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen bei 3,33 x 10 5 Zellen / & mgr; l (0,9 x PBS + 5% FBS). Insgesamt werden 3 ul pro Empfänger Fisch für eine Gesamtzahl von 1 x 10 6 Zellen pro Empfänger (Schritt 3) eingespritzt werden.
HINWEIS: Weniger als 3 & mgr; l der Zellsuspension sollte in den Empfänger Fisch transplantiert werden. Wenn die Zellzahl ist die Begrenzung, kann so niedrig wie 5 x 10 4 Zellen pro Empfänger eine erfolgreiche Transplantation (Tabelle 1) zu führen.
2. Durchflusszytometrie Analyse der Spenderskelettmuskelzellpräparation (Optional)
- Isolieren Muskel aus einem Wildtyp, nicht-transgene Fische wie skizziert iSchritt n 1.1. Diese Probe dient als Negativkontrolle und ist nützlich für die Einstellung Durchflusszytometrie Tore.
- Setzen Sie einen pass Lebensfähigkeit Farbstoff. Fügen Sie beispielsweise 5 ul Lager DAPI-Lösung (500 ng / ul) zu 500 ul des Muskel-Präparat. Vortex geringfügig vor der Analyse. Erwerben 5 x 03-1 Oktober x 10 4 Ereignissen. Analysieren Wildtyp-Kontrollproben erste Toren gefolgt von einer Analyse der Muskelzellen von transgenen Fischen isoliert zu platzieren.
HINWEIS: Die Durchflusszytometrie-Analyse wird in der Regel innerhalb von 1 h nach Muskelgewebe Dissektion, während welcher Zeit die seziert Zellen mehr als 60% Lebensfähigkeit (Abbildung 2) zu halten geführt. Die Zellen sollten auf Eis zu allen Zeiten gehalten werden. Insgesamt Lebensfähigkeit der Zellen können neu bewertet werden vor der Transplantation mit Trypanblau und einer Zählkammer.
3. Die intramuskuläre Transplantation von Skelettmuskelzellen in Adult Rag2 Homozygote Mutanten Zebrafisch
- Reinigen Sie eine 10 μ; L G 26S Mikrospritze durch Einziehen und Ausstoßen von 10% Chlorbleichlauge (5 mal), gefolgt von 70% Ethanol (5 mal), und dann mit Suspensionspuffer (0,9 x PBS + 5% FBS, 10 mal) gefolgt.
- Anesthetize 2-4 Monate alten homozygot Rag2 mutierte Fisch oder Wildtyp-Empfänger Fisch (als Kontrolle), indem einzelne Tropfen Tricaine methansulfonat (MS222, 4 mg / ml Stammlösung) in eine Petrischale die Fische im System Wasser mit bis Operculum Bewegungen langsam und Fisch immer noch.
HINWEIS: Die Dosis von Tricaine Anästhesie wird nach Alter und Größe des Empfängers Zebrafisch ab. - Zeigen betäubt Empfänger Zebrafisch auf einem feuchten Papiertuch oder Schwamm, mit der linken Seite nach oben.
- Führen Sie die Spritzennadel in die latero-Rückenmuskulatur (siehe 1A). Sicherzustellen, dass Injektionen werden in einem Winkel von 45º durchgeführt. Injizieren 3 ul der Zellsuspension (in einem Schritt 1.12) hergestellten pro Fisch für insgesamt 1 × 10 6 Zellen pro Empfänger.
- Injizierten Zebrafisch vorsichtig in einen sauberen Behälter zu übertragen mit einem Plastiklöffel zu erholen.
- Beurteilen Empfänger Zebrafisch zur Transplantation bei 10, 20, 30 Tage nach der Transplantation durch Bild narkotisierten Fisch unter Hellfeld und Epifluoreszenzmikroskopie.
Abschnitt 2. Embryonal Rhabdomyosarcoma (ERMS) Transplantation in Adult Homozygote Rag2 Mutant Zebrafisch
4. DNA-Mikroinjektion von Zebrafischembryonen
- Linearisieren des Rag2-kRASG12D Plasmid 7 durch Verdauen 10 ug DNA mit XhoI, bei 37 ° C für 6 Stunden oder O / N.
- Reinige DNA durch Standard Phenol: Chloroform-Extraktion und Ausfällung mit Ethanol. Resuspendieren in 20 & mgr; l entionisiertem Wasser (alternativ kommerziellen DNA-Fragment Reinigungssäulen verwendet werden kann).
- Ausführen des unverdauten und verdauten DNA auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt und bestimmen die Konzentration des DNA by-Spektrometer Lesen. Alternativ laufen Proben bei 1: 1, 1: 5, und 1:10 Verdünnungen auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt und im Vergleich zu einer DNA-Leiter zu quantifizieren.
- Vorbereiten einer Injektionsmischung bis zu einer Endkonzentration von 15 ng / & mgr; l verdaut Rag2-kRASG12D DNA in 0,1 M KCl und 0,5 × Tris-EDTA. Die endgültige DNA-Menge in 2 nl der Einspritzmenge eingespritzt wird 30 pg.
HINWEIS: Bis zu drei verschiedenen DNA-Konstrukte können effizient koinjiziert in einem Maximum von 60 pg DNA pro Embryo sein. Diese Transgene in das Genom integriert und innerhalb der Entwicklungstumor 26 coexprimiert. - Injizieren linearisierte Rag2-kRASG12D in eine Zellstadium Embryonen im Wesentlichen wie beschrieben 27 in eine Zebrafisch-Stamm von Interesse (1B). Die Injektionen sind in der Zelle und nicht in dem Eigelb zu höherer Effizienz durchgeführt werden. In diesem Experiment wurde ein doppelt transgenen AB-Stamm; Myf5-GFP, mylpfa-mCherry verwendet. Heben Zebrafisch mit Standard-Aufzucht protocols 28.
HINWEIS: Injection Überleben ist oft abhängig von der Zebrafisch-Stamm. Im Durchschnitt werden 30% der injizierten Embryonen ERMS zu entwickeln. 300 bis 600 Embryonen pro Experiment, um zu gewährleisten, dass genügend GFP-positive und mCherry-positive Primärtumoren zur Transplantation und Analyse erzeugt injiziert werden.
5. Screening für primäre ERMS in Zebrafisch-Larven
- Beachten Sie injizierten Zebrafisch von 10 bis 30 Tage nach der Injektion für die Entstehung von äußerlich sichtbaren primären ERMS.
- Bei 30 Tage nach der Injektion, betäuben Empfänger Zebrafisch, indem einzelne Tropfen Tricaine methansulfonat (MS222 4 mg / ml Stammlösung) in eine Petrischale mit Fisch System Wasser bis Operculum Bewegungen langsam und Fisch sind immer noch.
HINWEIS: Dosis von Tricaine Anästhesie hängt vom Alter und der Größe des Empfängers Zebrabärbling abhängen. Primäre tumortragenden Zebrafisch geringere Dosen von Tricaine. - Wählen primären ERMS-LagerFische, die Myf5-GFP-positiven und mylpfa-mCherry -positiven sind, mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop.
6. ERMS Tumor Vorbereitung
- Sacrifice ausgewählten primären ERMS-Lagerzebrafisch in 1,6 mg / ml Tricaine methansulfonat (MS222) für 10 Minuten oder bis kein Operculum Bewegung ist offensichtlich.
- Verarbeiten jedes tumortragenden Zebrafisch getrennt. Platzieren Fisch in eine saubere Petrischale und sezieren um den Tumor mit einer Rasierklinge und einer feinen Pinzette (wie in 1B gezeigt). Übertragen Sie die seziert Tumorgewebe zu einer sauberen Petrischale.
- Füge 100 & mgr; l vorgekühltem 0,9x Phosphate Buffer Saline (PBS) mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt. Mince Gewebe mit einer sauberen Rasierklinge> 20 mal, bis die Zellen sich in einer gleichförmigen Suspension.
- Hinzufügen 900 ul des gleichen Puffers (0.9x PBS + 5% FBS) und Abpipettieren mehrmals an Zellen mit dem 1000 ul filtriert Pipettierspitze dissoziieren. Man filtriert durch ein 40 &# 956; m mesh Sieb in die entsprechende 50 ml konischen Röhrchen. Lagerung auf Eis.
- Mit einer zusätzlichen 2-4 ml Puffer Waschen Sie die Petrischale, und durch die gleiche Masche Sieb und in die entsprechenden konischen Rohr.
- Zentrifuge bei 1.000 xg für 10 min bei 4 ° C.
- Überstand verwerfen und resuspendieren in 100 ul Puffer.
- Die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen unter Verwendung von Trypanblau-Farbstoff und einem Hämocytometer.
- Verdünnte Zellen bis zur gewünschten Konzentration im gleichen Puffer (0,9 x PBS + 5% FBS). Zellen werden 5 x 10 3 Zellen / & mgr; l für die Transplantation 5 ul pro Empfänger Zebrafisch in einem Gesamtvolumen von 2,5 x 10 4 Zellen pro Empfänger verdünnt werden.
- Durchflusszytometrie-Analyse kann auch mit einer kleinen Menge der Suspension aus Schritt 6.5, um die relativen Verhältnisse von fluoreszierenden Zellen in der Probe durchgeführt werden, zu quantisieren.
HINWEIS: Seite 100 ul der Zellsuspension (nach Filterung in Schritt 3.5) einstellen und mit 400 ul verdünntvon 0.9x PBS + 5% FBS Suspensionspuffer für die Durchflusszytometrie-Analyse. Um eine ordnungsgemäße Gating zu gewährleisten, führen Sie weitere Analyse mit einzelnen transgenen Tumorgewebe oder Muskel von erwachsenen Wildtyp-GFP Myf5 und mylpfa-mCherry Fisch isoliert. Führen Durchflusszytometrie im wesentlichen wie in Schritt 2 von Abschnitt 1 beschrieben.
7. Die Transplantation von ERMS in Adult Rag2 Homozygote Mutanten Zebrafisch
- Reinigen einer 10 ul 26S G Mikrospritze durch Einziehen und Ausstoßen von 10% Chlorbleichlauge (5 mal), gefolgt von 70% Ethanol (5 mal), und dann mit Suspensionspuffer (0,9 x PBS + 5% FBS, 10 mal, gefolgt ).
- Anesthetize Empfänger homozygot Rag2 mutierten Fische, indem einzelne Tropfen Tricaine methansulfonat (MS222 4 mg / ml Stammlösung) in eine Petrischale die Fische, die im System Wasser bis Operculum Bewegungen sind langsam und Fisch immer noch.
- Zeigen betäubt Empfänger Zebrafisch auf einem nassen Papiertuch oder sponge, mit der Bauchseite nach oben ein.
- Injizieren 5 ul der Zellsuspension in die Bauchhöhle (2,5 x 10 4 Zellen pro Empfänger).
HINWEIS: Die Injektionsnadel muss zwischen Injektionen von verschiedenen Tumoren wie in Schritt 4.1 beschrieben gereinigt werden. 5 bis 10 ul effizient intraperitoneal transplantiert werden, je nach Empfänger Fischgröße. Tumor Verpflanzung kann durch Injektion 1 × 10 4 bis 5 × 10 5 Zellen pro Empfänger unsortierten Fisch (Tabelle 1) durchgeführt werden. - Vorsichtig Empfänger Zebrafisch in einen Reintank mit einem Plastiklöffel.
- Beurteilen Empfänger Zebrafisch zur Transplantation bei 10, 20, 30 Tage nach der Transplantation durch Bild narkotisierten Fisch unter Hellfeld und Epifluoreszenzmikroskopie.
- Nutzen Sie eingepflanzt Fisch für Downstream-Anwendungen einschließlich Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) zum Differenzierungsstatus (Abbildung 3 H), histologischen Standard analy bewertensis (3F), Imaging Therapie Antworten 15, und / oder serielle Transplantation nähert einschließlich Grenzverdünnungsanalyse 11.
Representative Results
Ein Verfahren für die Herstellung und Transplantation Skelettmuskelzellen von α-Aktin-RFP transgenen Spendern in immungeschwächten homozygot Rag2 mutierten Zebrafisch nachgewiesen wurde (Protokoll Abschnitt 1, 1A und 2). Skelettmuskelgewebe wurde aus α-Actin-RFP transgenen Spendern hergestellt und die resultierenden Einzelzellsuspension enthielt 84,3% lebensfähigen Zellen, wie durch DAPI Ausschluss folgenden Durchflusszytometrie (2B) beurteilt. RFP-positiven Zellen umfasste 35,3% dieses Einzelzellsuspension (2C). Transplantation von Zellen in die dorsale Skelettmuskel Rag2 homozygote Mutante Empfänger Fisch geführt, um konsistente und starke Anwachsen durch Differenzierung der einzelnen Zellen in kernige Fasern (1 x 10 6 Zellen pro Fisch injiziert, Tabelle 1, Abbildung 2D-I) bewertet. Wilde ArtEmpfänger Fisch konnte Muskelfasern während der 30-Tage-Versuch (n = 13) einprägen. 10 Tage nach der Transplantation, 9 von 14 Rag2 homozygot mutierten Zebrafisch enthaltenen RFP-positiven Muskelfasern in der Nähe der Injektionsstelle (64,3%, 2E, F). Wichtig ist, beharrte engrafted RFP-positiven Muskel zu 30 Tage nach der Transplantation (2G-I), mit einer Teilmenge von Tieren, die für 115 Tage nach der Transplantation und Aussteller robusten und anhaltenden Muskel Transplantation (Daten nicht gezeigt), gefolgt. Diese Ergebnisse sind ähnlich zu denen, die von unseren Gruppe 23 mit dem gleichen Protokoll (Tabelle 1) angegeben.
Wir haben außerdem ein Verfahren zur Erzeugung, Herstellung und Transplantation von ERMS Tumorzellen in die Bauchhöhle des Rag2 homozygote Mutante Empfänger Fisch (Protocol Abschnitt 2, Figur 1B und Figur 3). ERMS wurden in doubl erzeugte transgenen Myf5-GFP; mylpfa-mCherry Fisch, der gezeigt wurde, dass die Visualisierung von intratumoralen Heterogenität und funktionelle Analyse von Tumorzellpopulationen nach der Transplantation 11 ermöglichen. Es sind jedoch weitere molekulare Charakterisierung der Teilgesamtheit schwierig, weil Fische sind klein, wenn sie ERMS zwischen 10 bis 30 Tage des Lebens und die Anzahl der Tumorzellen für Downstream-Anwendungen Begrenzung zu entwickeln. Eine Lösung ist die Tumorzellzahlen von Transplantations LOSSAR ins Erwachsenen Empfänger Zebrabärbling erweitern. Bisher wurden ähnliche Experimente wurden mit CG1-Dehnungs-syngenen Fisch abgeschlossen und über 4 Generationen von Rückkreuzung zu syngenen Linien, die transgen für Myf5-GFP war die Entwicklung erforderlich; mylpfa-mCherry. Um diese Probleme zu umgehen, haben wir gezeigt, die Nützlichkeit von immungeschwächten Rag2 homozygot mutierten Zebrafisch-Empfänger zur Grund ERMS von einem AB-Dehnungs-Zebrafisch einprägen. Alle primären ERMS in ra eingepflanztg2 homozygot mutierten Tiere, erleichtert Expansion des Tumors (Tabelle 1). Ähnliche Ergebnisse wurden vor kurzem, wo 24 von 27 Rag2 homozygot mutierten Zebrafisch engrafted ERMS berichtet, während 0 von 7 Wildtyp-Geschwister engrafted Krankheit 23. Ein repräsentatives Beispiel eines eingepflanzten ERMS ist auf 30 Tage nach der Transplantation in 3E gezeigt. Engrafted LOSSAR teilen histologischen Merkmale der embryonalen Rhabdomyosarkom, ähnlich der in dem Primärtumor (3B und 3F) gefunden. FACS-Analyse bestätigte, dass ERMs enthaltenen funktionell verschiedene Tumor ausbreitet und differenzierten Zellen, die Myf5-GFP und / oder mylpfa-mCherry auszudrücken. Die Überlebensraten nach der intraperitonealen Injektion Verfahren waren von mehr als 95%. Empfänger Zebrafisch häufig erliegen von Tumorlast nach Ablauf der 30 Tage nach der Transplantation Zeitpunkt.
Abbildung 1. Protokoll Schaltplan für (A) normal und (B) bösartigen Skelettmuskelzelltransplantation in Rag2 homozygote Mutante Zebrafisch. Optionale Schritte sind mit einem (*).
Abbildung 2. Die Skelettmuskulatur Transplantation in Zebrafisch-Mutante Rag2 homozygot. (A) α-Aktin-RFP transgenen Spenderzebrafisch. (B) Zelllebensfähigkeit der isolierten Muskelzellsuspension durch DAPI-Ausschluss bewertet und Durchflusszytometrie. (C) Anteil der RFP-positiven Zellen in der Muskelzellsuspension aus α-Aktin-RFP Spender (rot) gefunden wird, im Vergleich zu einem Wildtyp-Kontrolle(Grau). (DE) verschmolzen Hellfeld- und Fluoreszenzbilder von Wildtyp-Tiere (D) oder Rag2 homozygot mutierten Fische (E) nach 30 Tagen nach der Transplantation. (F) Engraftment Raten über die Zeit. Rot bezeichnet Zahl der transplantierten Tieren während grau zeigt nicht eingepflanzt Fisch. Anzahl der Tiere zu jedem Zeitpunkt analysiert werden angezeigt. (GI) Hohe Vergrößerung Bilder boxed Region im Panel E 10 (G) gezeigt, 20 (H) und 30 (I) Tage nach der Transplantation, welche Eigentums differenzierten Muskelfasern im Laufe der Zeit (Pfeilspitzen). Maßstabsbalken gleich 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3: Die Transplantation von Myf5-GFP; mylpfa-mCherry ERMS in Rag2 homozygote Mutante . Zebrafisch (AD) Rag2-kRASG12D induzierten primären ERMS sich in AB-Dehnungs Myf5-GFP; mylpfa-mCherry Zebrafisch nach 30 Tagen des Lebens. (EH) Rag2 homozygot mutierten Zebrafisch mit ERMS eingepflanzt und nach 30 Tagen nach der Transplantation analysiert. (A, E) fusioniert Hellfeld- und Fluoreszenzbilder von Primär- und transplantiert ERMS. Tumorbereich skizziert und Pfeilspitze zeigt an der Injektionsstelle in E. (B, F) Hematoxylin- und Eosin-gefärbten Paraffinschnitten von Primär (B) und eingepflanzt ERMS (F), die Bereiche erhöhter Zellularität im Zusammenhang mit Krebs. (C,G) Zelllebensfähigkeit wie durch DAPI-Farbstoffausschluss beurteilt und Durchflusszytometrie. (D, H) Fluorescent Tumorzell-Subpopulationen, wie Flow-Zytometrie bewertet. Maßstabsbalken gleich 2 mm (A, E) und 50 um (B, F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Tabelle 1 Engraftment Ergebnisse für Muskel- und ERMS Zell-Transplantation. (*) Bezeichnet zuvor berichteten Daten mit den gleichen Techniken 23. Die Daten werden mit Genehmigung von Nature Methods nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
Discussion
Effiziente und robuste Verpflanzung von Erwachsenen Rückenskelettmuskel wurde mit einem sehr einfachen Herstellungsverfahren Zelle gefolgt von der Injektion von Zellen in die Rückenmuskulatur Rag2 homozygoten mutierten Fisch erreicht. Im Allgemeinen waren die intramuskuläre Injektion Verfahren sehr robust, mit einigen assoziierten Todes unmittelbar nach der Implantation, im Bereich von 10% bis 35%, je nach Experiment. Weitere Optimierung wird wahrscheinlich zu zentrieren auf Nutzung von dünneren Nadeln für die Injektion und die Entwicklung von stationären Einspritzvorrichtung mit einem Mikroskop und Mikromanipulator, der Einfachheit der Implantation von Zellen erleichtern. Unser Ansatz verwendet, unsortierte auch Muskelzellen von Spendertieren und nur ca. 30% Muskelvorläuferzellen enthalten. Verwendung von transgenen Reporter Linien, die Stammzellen und FACS Isolierung beschriften wird wahrscheinlich bieten angereicherten Zellsuspensionen, die zu einer erhöhten Transplantation in Empfänger Fische führen. Skelettmuskulatur cells könnte auch angereichert und kultiviert vor der Transplantation, wie zuvor beschrieben 29. Bemerkenswert ist, unsere Ergebnisse zeigen auch, dass die Schritte des Nischen Aufbau und Differenzierung von Spender Muskelgewebe auftreten, bevor 10 Tage nach der Transplantation, zur Schaffung dieses Modell als robuste und schnelle experimentelle Plattform, um Muskeln Transplantation und Regeneration zu bewerten. Darüber hinaus sind diese Experimente krassen Kontrast zu den in Mäusen, in denen vor der Verletzung des Muskels mit Cardio oder Bariumchlorid benötigt zwei Tage vor dem Anwachsen 30,31 abgeschlossen. Es ist wahrscheinlich, dass während des Transplantationsverfahrens hergestellt Verletzung durch die Nadel potenziert Verpflanzung durch Stimulierung der Produktion eines regenerativen Umgebung innerhalb des Empfängertieres 32,33. Wir haben auch vorstellen, dass unsere Methode wird einfach auf die Transplantation von Skelettmuskelgewebe von jüngeren Zebrafisch angepasst werden, so dass Einschätzung der genetischen Mutationen, die früh Skelettmuskel Entwicklung beeinflussenführen aber zu Letalität bei den Larvenstadien.
Wir haben auch eine detaillierte Protokoll für Verpflanzung von Zebrafisch ERMS bereitgestellt durch intraperitoneale Injektion in nicht-klimatisierten, Rag2 homozygot mutierten Fische. Dieser Ansatz war nützlich für die Expansion von doppelt transgenen Primärtumoren, ohne die Notwendigkeit zum Erzeugen von Tumoren in syngenen transgenen Linie. Unsere jüngsten Arbeiten haben gezeigt, dass Zelltransplantation Ansätze, neuartige experimentelle Modelle zur ERMS Arzneimittelempfindlichkeit in vivo, wo ein einzelner Tumor kann in die Tausende von Tieren erweitert und für die Auswirkungen auf Wachstum, Selbsterneuerung und Neovaskularisation 15 beurteilen zu bewerten. Darüber hinaus haben wir erfolgreich eingepflanzt eine breite Palette von Tumoren in Rag2 homozygot mutanten Fischen, einschließlich T-Zell akute lymphatische Leukämie, Melanom, und ERMS 23. Blick auf die Zukunft stellen wir uns diese Zeilen werden für die Bewertung der wichtigsten funktionellen Eigenschaften von Krebs bei nützlich seinvivo einschließlich der Beurteilung intratumorale Heterogenität, Invasion, Metastasierung, Angiogenese und Therapieresistenz. Darüber hinaus wird die Erzeugung von Rag2 homozygot mutierten Fische in der optisch klaren Casper Belastung Zebrafisch-34 wahrscheinlich erleichtern direkte Abbildung von vielen dieser Markenzeichen von Krebs.
Insgesamt bieten wir detaillierte Protokolle für die erfolgreiche Transplantation von fluoreszenzmarkierten normalen und malignen Skelettmuskulatur in der Erwachsenen Rag2 homozygot mutierten Zebrafisch mit geschwächtem Immunsystem.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von Alex 'Lemonade unterstützt Stehen Foundation (DML), American Cancer Society (DML), die MGH Howard Goodman Fellowship (DML) und US National Institutes of Health gewährt R24OD016761 und 1R01CA154923 (DML). CNY Durchflusszytometrie Core-und Flussbildanalyse, gemeinsame Instrumente Förderkennzeichen 1S10RR023440-01A1. IMT wird durch ein Stipendium von der portugiesischen Stiftung für Wissenschaft und Technologie (- FCT Fundação para a Ciência e Tecnologia) gefördert. QT wird von der China Scholarship Council. Wir danken Angela Volorio für ihre hilfreichen Kommentare und Ratschläge.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-EDTA buffer solution 1x | Sigma-Aldrich | 93283-100ML | Microinjection. Injection mix. |
| Potassium Chloride | Fisher Science Education | S77375-1 | Microinjection. Injection mix. |
| XhoI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0146S | Microinjection. Plasmid linearization. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 (50) or 28106 (250) | Microinjection. For purification of linearized plasmid up to 10 kb. |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | BP1753I-100 | Microinjection. For purification of linearized plasmid. |
| UltraPure Agarose, 500 g | Invitrogen | 16500-500 | Microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx | Microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | flow cytometry/FACS |
| 5 ml polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352058 | flow cytometry collection tube |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | FACS |
| 5 ml polypropylene round bottom tube | BD Falcon | 352063 | FACS collection tube |
| BD LSR II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | flow cytometry |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010-023 | transplantation |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-01 | transplantation |
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Western Chemical Inc. | http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html | Transplantation. Anesthetic. Caution: Irritant. Irritating to eyes, respiratory system, and skin. |
| VWR Absorbent Bench Underpads | VWR | 56616-018 | Transplantation. Regular paper towels or sponge can be used as an alternative. |
| Singe Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | transplantation |
| Petri Dish, Polystryrene Disposable Sterile | VWR | 25384-302 | transplantation |
| Cell Strainer, 40 µm Nylon | Falcon-Corning Incorporated | 352340 | transplantation |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430828 | transplantation |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | transplantation |
| Hemacytometer Set | Hausser Scientific | 1483 | transplantation |
| Hamilton syringe, fixed needle, volume 10 µl, needle size 26s ga (bevel tip) | Hamilton | 80366 | transplantation |
| Austin's A-1 Bleach, Commercial | James Austin Company | Transplantation. Any commercial solution can be used. | |
| Ethanol 190 Proof | Decon Labs, Inc. | DSP-MD.43 | Microinjection (linearized plasmid purification) and transplantation. Any commercial solution can be used. |
| High Speed Microcentrifuge, 300D Digital Microcentrifuge | Denville Scientific Inc. | C0265-24 | transplantation |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | 75004539 | Transplantation. Catalog number for 120 V, 60 Hz (US). |
| 5 ml serological pipets | BD Falcon | 357529 | transplantation |
| Corning Stripettor Plus Pipetting Controller | Corning Incorporated | 4090 | Transplantation. Any automatic pipetting controller can be used. |
| Powder free examination gloves | All steps. Any commercial brand can be used. | ||
| Filter pipet tips and micropipettes | All steps. Any commercial brand can be used. | ||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11205-20 | transplantation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | Scoring. Any appropriate fluorescent stereomicroscope can be used. |
| Olympus DP72 microscope digital camera | Olympus | DP72 | Scoring. Multiple adequate cameras for the selected imaging system can be used. |
References
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29 (11), (2013).
- Boatman, S., Barrett, F., Satishchandran, S., Jing, L., Shestopalov, I., Zon, L. I. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood cells, molecule., & diseases. 51 (4), 271-276 (2013).
- Langenau, D. M., Traver, D., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Yang, H. W., Kutok, J. L., et al. Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish. Cancer Research. , 7256-7262 (2004).
- Patton, E. E., Widlund, H. R., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current Biology. 15 (3), 249-254 (2005).
- Sabaawy, H. E., Azuma, M., Embree, L. J., Tsai, H. -J., Starost, M. F., Hickstein, D. D. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (41), 15166-15171 (2006).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Gene. 21 (11), 1382-1395 (2007).
- Le, X., Langenau, D. M., Keefe, M. D., Kutok, J. L., Neuberg, D. S., Zon, L. I. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
- Park, S. W., Davison, J. M., Rhee, J., Hruban, R. H., Maitra, A., Leach, S. D. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Zhuravleva, J., Paggetti, J., et al. MOZ/TIF2-induced acute myeloid leukaemia in transgenic fish. British journal of haematology. 143 (3), 378-382 (2008).
- Ignatius, M. S., Chen, E. Y., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Suppl Data. Cancer cell. 21 (5), 680-693 (2012).
- Blackburn, J. S., Liu, S., et al. Clonal Evolution Enhances Leukemia-Propagating Cell Frequency. Cancer cell. 25 (3), 366-378 (2014).
- Blackburn, J. S., Langenau, D. M. Zebrafish as a model to assess cancer heterogeneity, progression and relapse. Disease model. 7 (7), 755-762 (2014).
- Zhao, C., Wang, X., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS one. 6 (7), e21768 (2011).
- Chen, E. Y., DeRan, M. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 inhibitors induce the canonical WNT/β-catenin pathway to suppress growth and self-renewal in embryonal rhabdomyosarcoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5349-5354 (2014).
- Yang, X. -J., Cui, W., et al. A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion. PloS one. 8 (4), e61801 (2013).
- Chapman, A., Fernandez del Ama, L., Ferguson, J., Kamarashev, J., Wellbrock, C., Hurlstone, A. Heterogeneous Tumor Subpopulations Cooperate to Drive Invasion. Cell Reports. 8 (8), 1-8 (2014).
- Smith, A. C. H., Raimondi, A. R., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Iyengar, S., Houvras, Y., Ceol, C. J. Screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model. Journal of visualized experiments JoVE. (69), e50086 (2012).
- Mizgireuv, I., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2790 (2011).
- Tang, Q., Abdelfattah, N. S., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature methods. 11, 821-824 (2014).
- Zhou, Q., Facciponte, J., Jin, M., Shen, Q., Lin, Q. Humanized NOD-SCID IL2rg–/– mice as a preclinical model for cancer research and its potential use for individualized cancer therapies. Cancer letters. 344 (1), 13-19 (2014).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental biology. 192 (2), 289-299 (1997).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D. D. D., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), 1-5 (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon PRess. Eugene, OR. (2000).
- Alexander, M. S., Kawahara, G., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors). Muscl, & nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of visualized experiments JoVE. (86), 1-7 (2014).
- Gerli, M. F. M., Maffioletti, S. M., Millet, Q., Tedesco, F. S. Transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration. J Vis Exp. (83), e50532 (2014).
- Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell. The FEBS journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).
- Rowlerson, a, Radaelli, G., Mascarello, F., Veggetti, Regeneration of skeletal muscle in two teleost fish: Sparus aurata and Brachydanio rerio. Cell Tissue Res. 289 (2), 311-322 (1997).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell stem cell. 2 (2), 183-189 (2008).
