Abstract
דג הזברה הפכה כלי רב עוצמה להערכת התפתחות, התחדשות, וסרטן. לאחרונה, פרוטוקולי השתלת תאי שתל פותחו שengraftment ההיתר של תאים נורמלים וממאירים למוקרנים, syngeneic, ודג זברה מבוגר נפגע חיסונית. מודלים אלה כאשר בשילוב עם פרוטוקולי השתלת תאים מותאמים מאפשרים הערכה המהירה של תפקוד תאי גזע, פציעה הבאה התחדשות, וסרטן. כאן, אנו מציגים שיטה להשתלת תאים של מבוגר דג הזברה שרירי שלד וראדומיוסרקומה העוברית (ERMS), סרקומה ילדים שחולקת תכונות עם שרירים עובריים, לrag2 המבוגר החיסוני החלש דג הזברה מוטציה הומוזיגוטים E450fs. חשוב לציין, החיות האלה חסרות תאי T וצמצמו תפקוד תא B, להקל engraftment של מגוון רחב של רקמות מבעלי החיים תורם זרים. הפרוטוקולים מותאמים שלנו מראים שכותרתו fluorescently prepar תא שרירations מדג הזברה מהונדס α-תקטין RFP נקלט וחסונה כאשר מושתלים לתוך שרירי הגב של דגים מוטנטים הומוזיגוטים rag2. אנחנו גם מדגימים engraftment של ERMS ניאון-המהונדס שבו הקרינה מוגבלת לתאים המבוססים על מצב בידול. באופן ספציפי, ERMS נוצרו בmyf5-GFP AB-זן; בעלי החיים mylpfa-mCherry כפולים מהונדסים וגידולים שהוחדרו לתוך הצפק של דגים בסכנת חיסון מבוגר. השירות של פרוטוקולים אלה משתרע על engraftment של מגוון רחב של תאי תורם נורמלים וממאירים שניתן מושתל לתוך שרירים או הצפק של דג הזברה מבוגרת גב.
Introduction
דג הזברה הוא מודל מצוין ללימודי משובי כי הם יכולים להתחדש סנפירים נקטעו, כמו גם מוח פגוע, רשתית, חוט השדרה, לב, שרירי שלד ורקמות אחרות 1. תאי גזע ומחקרי משובי בדג זברה מבוגרת התמקדו במידה רבה באפיון של התחדשות בתגובה לפציעה, ואילו זיהוי של גזע ואב תאים מרקמות שונות על ידי השתלת תאים רק לאחרונה נחקר 2. גם דג הזברה הפכה משמש יותר ויותר למחקר של הסרטן באמצעות הדור של דגמי סרטן מהונדסים המחקים מחלה אנושית 3-10.
בהגדרה של סרטן, גישות השתלת תאים הפכו לאימוץ נרחב ומאפשרות הערכה הדינמית של תהליכי הסרטן חשובים לרבות חידוש עצמי 11, הטרוגניות פונקציונלית 12,13, neovascularization 14, הפצה,תגובות טיפול 15, ופלישת 16,17. עם זאת, תאי engrafted לעתים קרובות דחו מדגי הנמען אמורים לארח הגנה חיסונית שלתקוף ולהרוג את השתל 18. כמה שיטות כבר בשימוש על מנת להתגבר דחייה של תאי engrafted. לדוגמא, בעלי החיים נמען המערכת חיסונית ניתן מלוטשים זמנית על-ידי גמא-קרינה במינון נמוך לפני ההשתלה 18,19. עם זאת, המערכת החיסונית הנמען תתאושש ב -20 ימים שלאחר הקרנה-ולהרוג את תאי תורם 18. לחלופין, טיפול dexamethasone נעשה שימוש כדי לדכא T ותפקוד תא B, מתן מדכא חיסון אוויר זמן רב יותר ולהקל על קליטתם של מגוון רחב של גידולים בבני אדם לעד 30 ימים 14. ניסויים אלה דורשים מינון תרופה קבוע ומוגבלים ללמוד מגידולים מוצקים. מבחני engraftment לטווח ארוך השתמשו קווי syngeneic גנטי זהים 20-22, שבו תורם וrecipiתאי ent הם חיסון מתאים. עם זאת, מודלים אלה דורשים קווים מהונדסים של ריבית שחצו את הגבול לתוך רקע syngeneic במשך יותר מארבעה דורות לייצר קווי syngeneic באופן מלא. כדי לייתר נושאים של דחייה חיסונית בדגי נמען, הקבוצה שלנו לאחרונה פיתחה חיסון מוטציה E450fs rag2 התפשרה הומוזיגוטים קו (fb101 rag2 ייעוד אלל ZFIN) שירידה בתפקוד תאי T ו- B, ואשר יאפשר קליטתם של מגוון רחב של רקמות 23. מודלים של עכברים חיסוניים חלשים דומים נעשו שימוש נרחב להשתלת תאים של עכבר ורקמות אנושיות 24.
כאן, אנו מציגים שיטות להשתלה של שרירי שלד וראדומיוסרקומה העוברית (ERMS), סרקומה ילדים שחולקת תכונות עם שרירי שלד, לדג הזברה המוטציה הומוזיגוטים rag2 תאר זה עתה. הזמינות של דג הזברה מבוגר נפגע חיסוניתמרחיב את היכולת שלנו לבצע מחקרי השתלת תאים בקנה מידה גדולה כדי לחזות באופן ישיר ולהעריך התחדשות עצמית של תאי גזע בתוך רקמות נורמליות וממאירים. בשיטה זו, שכותרתו fluorescently הכנות תא שריר מהמבוגרים α-תקטין RFP 25 דג הזברה מהונדס וחסונה נקלט בrag2 דג הזברה מוטציה הומוזיגוטים לאחר הזרקה לשרירי הגב. יתר על כן, אנו מראים engraftment והרחבת -GFP myf5 הראשוני; ERMS המהונדס mCherry mylpfa- לאחר הזרקת intraperitoneal לrag2 דג הזברה מוטציה הומוזיגוטים E450fs. השירות של פרוטוקולים אלה הוא מעבר לדוגמות שמוצגים וניתן ליישם בקלות לרקמות נוספות דג הזברה משובי וסרטן.
Protocol
נהלי כל החיה אושרו על ידי בית חולים כללי מסצ'וסטס ועדת משנה למחקר טיפול בבעלי חיים, תחת פרוטוקול # 2011N000127.
סעיף 1. השתלת תאים שרירי שלד לrag2 מבוגרי E450fs הומוזיגוטים Mutant דג הזברה
1. הכנה של תאי שריר למבוגרים דג הזברה תורם שלד
- להשיג דג הזברה מבוגר מהונדס שכותרתו fluorescently שריר. בניסוי זה, 30 α דגי תורם -actin-RFP 25 נוצלו להשתיל 1 x 10 6 תאים לכל דגי נמען.
- דג הזברה תורם הקרבה ב1.6 מ"ג / מ"ל tricaine methanesulfonate (MS222) למשך 10 דקות או עד שאין תנועת operculum ניכרה.
- הנח דגי תורם על מגבת נייר סופגת ובלו השרירים הגב באמצעות סכין גילוח נקי. החתך צריך להיעשות באזור פי הטבעת בזווית של 45 מעלות על מנת למקסם את אוסף רקמות (כפי שמצוין באיור 1 א
- להוסיף 500 חיץ השעיה μl (0.9x מראש צונן פוספט הצפת מלוח (PBS) בתוספת 5% בסרום שור עוברי (FBS)) לרקמה גזור. עד 10 דג הזברה תורם יכול להיות ממוקם יחד בכרך זה.
- לרכך את הרקמה עם סכין גילוח> 20 פעמים עד תאים בתרחיף אחיד. שרירי הגב כולו הומוגני כוללים עור, עצמות וסנפירים. הוסף 2 מיליליטר של חיץ השעיה. בעזרת פיפטה 5 מיליליטר, triturate ההשעיה תא ≥20 פעמים לנתק תאים.
- סנן את ההשעיה התא דרך מסננת רשת 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר מונח על קרח.
- לשטוף את צלחת פטרי עם 2.5 מיליליטר נוסף של חיץ השעיה כדי לאסוף רקמה שנותרה ולסנן דרך אותה המסננת וצינור חרוטי, לנפח סופי של 5 מיליליטר (10 דגי תורם יכולים לשמש לבודד).
הערה: עור, עצמות וסנפירים יוחרגו הבאים סינון. במידת צורך, לשלב השעיות דומות לאותו צינור חרוטי. - לספור את המספר הכולל של תאי קיימא באמצעות צבע כחול trypan וhemocytometer.
- שומר 500 μl לזרימה cytometry, אם ארצה בכך (לא חובה, שלב 2).
- השעיה תא צנטריפוגה XG ב 1000, במשך 10 דקות, בשעה 4 מעלות צלזיוס.
- בטל תאי supernatant ו resuspend ב3.33 x 10 5 תאים / μl (0.9x PBS + 5% FBS). בסך הכל, 3 μl יהיה מוזרק לדגי נמען עבור הסכום כולל של 1 x 10 6 תאים לכל נמען (שלב 3).
הערה: פחות מ -3 μl של השעיה תא צריך להיות מושתל לדגי הנמען. אם מספר תא הגבלה, נמוך כמו 5 x 10 4 תאים לכל נמען יכולים להוביל לengraftment המוצלחת (טבלה 1).
2. ניתוח תזרים Cytometry של תא שריר שלד תורם הכנה (אופציונלית)
- לבודד שרירים מסוג בר, דגים שאינם מהונדסים כפי שתואר in שלב 1.1. מדגם זה משמש כביקורת השלילית והוא שימושי לקביעת שערי cytometry הזרימה.
- להוסיף צבע כדאיות מתאים. לדוגמא, להוסיף 5 μl של פתרון DAPI המניות (500 ng / μl) 500 μl של הכנת שריר. מערבולת מעט לפני הניתוח. לרכוש 5 x 03-01 אוקטובר x 10 4 אירועים. ניתוח דגימות שליטת סוג בר הראשון למקום שערים ואחריו ניתוח של תאי שריר מבודדים מדג מהונדס.
הערה: זרימת cytometry הניתוח מבוצעת בדרך כלל בתוך שעה 1 לאחר נתיחת רקמת השריר, שבמהלכו התאים גזורים לשמור כדאיות יותר מ -60% (איור 2). תאים צריכים להיות כל הזמן על קרח בכל העת. כדאיות תא סה"כ ניתן מחדש העריכו לפני ההשתלה באמצעות צבע כחול trypan וhemocytometer.
3. תוך שרירית השתלה של תאי שריר שלד לrag2 מבוגרי הומוזיגוטים Mutant דג הזברה
- נקה 10 μ; L 26s G מיקרו-מזרק על ידי ציור ובגירוש פתרון אקונומיקה 10% (5 פעמים), ואחריו 70% אתנול (5 פעמים), ולאחר מכן על ידי חיץ השעיה (FBS PBS + 5% 0.9x, 10 פעמים).
- הרדימי דגים ישנים 2-4 חודש הומוזיגוטים rag2 מוטציה או דגי נמען הסוג בר (כפקדים) על ידי הוספת טיפות בודדות של methanesulfonate tricaine (MS222, 4 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות) לתוך צלחת פטרי המכילה את הדג במי מערכת עד תנועות operculum איטיות ודגים עדיין.
הערה: המנה של ההרדמה tricaine תהיה תלויה בגיל ובגודל של דג הזברה נמען. - הנח דג הזברה נמען הרדים על מגבת נייר לחה או ספוג, עם הצד השמאלי פונה כלפי מעלה.
- הכנס את מחט המזרק לתוך שרירי latero-הגב (ראה איור 1 א). ודא שזריקות מבוצעות בזווית של 45 מעלות. הזרק 3 μl של ההשעיה התא (מוכנה בשלב 1.12) לדגים עבור הסכום כולל של 1 x 10 6 תאים לכל נמען.
- להעביר בזהירות דג הזברה מוזרקת לתוך טנק נקי בעזרת כף פלסטיק להתאושש.
- להעריך דג הזברה נמען לשיעורי engraftment בגיל 10, לאחר ההשתלה 20, 30 ימים על ידי הדמיה דגים הרדימו תחת שדה בהיר ומיקרוסקופיה epifluorescence.
סעיף 2. העוברית ראדומיוסרקומה (ERMS) השתלה לתוך הומוזיגוטים למבוגרים rag2 Mutant דג הזברה
4. DNA Microinjection של עוברי דג הזברה
- Linearize פלסמיד rag2-kRASG12D 7 על ידי לעכל 10 מיקרוגרם של ה- DNA עם XhoI, על 37 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות או O / N.
- לטהר DNA על ידי פנול הסטנדרטי: מיצוי כלורופורם ולזרז עם אתנול. Resuspend ב -20 μl של מים ללא יונים (לחלופין, ניתן להשתמש בעמודות טיהור קטע DNA מסחריות).
- הפעל את ה- DNA לא מעוכל ומתעכל על ג'ל agarose 1% ולקבוע את הריכוז של b DNAקריאת ספקטרומטר y. לחלופין, להפעיל דגימות בשעה 1: 1, 1: 5, ודילולי 1:10 על ג'ל agarose 1% ולכמת בהשוואה לסולם DNA.
- הכן תערובת הזרקה בריכוז סופי של 15 ng / μl של מתעכל DNA rag2-kRASG12D ב 0.1 M KCl ו0.5x טריס-EDTA. כמות ה- DNA הסופית המוזרקת ב 2 NL של נפח הזרקה תהיה 30 pg.
הערה: עד שלושה מבני DNA שונים יכול להיות ביעילות שותף מוזרק במקסימום של 60 pg של DNA לעובר. transgenes אלה להשתלב בגנום ושיתוף ביטוי בגידול בפיתוח 26. - הזרק rag2-kRASG12D לינארית לעוברי שלב אחד תא במהות כפי שתואר 27 לזן דג הזברה של עניין (איור 1). יש לבצע זריקות בתא ולא בחלמון ליעילות גבוהה יותר. בניסוי זה, AB-מתח כפול מהונדס; myf5-GFP, mylpfa-mCherry היה בשימוש. להעלות דג הזברה באמצעות p גידול הסטנדרטיrotocols 28.
הערה: הישרדות הזרקה היא לעתים קרובות תלויה בזן דג הזברה בשימוש. בממוצע, 30% מעוברים מוזרקים יפתחו ERMS. 300-600 עובר צריך להיות מוזרק לכל ניסוי, על מנת להבטיח כי גידולים ראשוניים מספיק GFP חיובי וmCherry חיוביים נוצרים להשתלה וניתוח.
5. הקרנה לERMS הראשי בדג הזברה זחלים
- שים לב דג הזברה מוזרק 10-30 ימים הודעת הזרקה להופעתה של ERMS העיקרי נראה כלפי חוץ.
- שבלאחר הזרקה 30 ימים, להרדים דג הזברה נמען על ידי הוספת טיפות בודדות של methanesulfonate tricaine (4 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות MS222) לתוך צלחת פטרי המכילה מים מערכת דגים עד תנועות operculum איטיות ודגים עדיין.
הערה: המנה של ההרדמה tricaine תהיה תלויה בגיל ובגודל של דג הזברה נמען. דג הזברה נושאי גידול ראשוני דורשת מינונים נמוכים יותר של tricaine. - בחר ERMS נושאות עיקריותדגים כי הם myf5-GFP -positive וmylpfa-mCherry -positive, באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence.
6. גידול ERMS הכנה
- להקריב דג הזברה ERMS נושאות עיקריות שנבחר ב1.6 מ"ג / מיליליטר tricaine methanesulfonate (MS222) למשך 10 דקות או עד שאין תנועת operculum ניכרה.
- לעבד כל דג הזברה נושאי גידול בנפרד. הניחו דגים בצלחת פטרי נקייה ולנתח סביב הגידול באמצעות סכין גילוח ומלקחיים עדינים (כפי שמוצג באיור 1). העבר את רקמת גידול גזור בצלחת פטרי נקייה.
- הוספה של 0.9x מראש צונן פוספט הצפת מלוח (PBS) 100 μl בתוספת 5% בסרום שור עוברי (FBS). רקמת בשר טחון עם סכין גילוח נקי> 20 פעמים עד תאים בתרחיף אחיד.
- להוסיף 900 μl של אותו המאגר (0.9x FBS + 5% PBS), פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לנתק תאים באמצעות 1000 μl המסונן קצה פיפטה. לסנן באמצעות 40 ו# 956; מסננת רשת מ 'לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר המקביל. אחסן על קרח.
- לשטוף את צלחת פטרי עם 2-4 מיליליטר נוסף של חיץ, ולעבור את אותו מסננת הרשת ולתוך צינור חרוטי המקביל.
- צנטריפוגה XG ב 1000, במשך 10 דקות, בשעה 4 ° C.
- בטל supernatant וגלול במאגר של 100 μl.
- לספור את המספר הכולל של תאי קיימא באמצעות צבע כחול trypan וhemocytometer.
- לדלל תאים לריכוז רצוי באותו החיץ (0.9x PBS + 5% FBS). תאים צריכים להיות מדוללים ל 5 x 10 3 תאים / μl להשתלת 5 μl לדג זברה נמען בסכום כולל של 2.5 x 10 4 תאים לכל נמען.
- ניתוח cytometry הזרימה גם יכול להתבצע עם כמות קטנה של ההשעיה מצעד 6.5 לקוואנטיזציה היחסים היחסי של תאי ניאון בתוך המדגם.
הערה: מניח בצד של השעיה תא (לאחר סינון בשלב 3.5) 100 μl ולדלל עם 400 μlשל 0.9x PBS 5% חיץ ההשעיה FBS + לניתוח cytometry הזרימה. כדי להבטיח gating הנכון, לבצע ניתוח נוסף באמצעות רקמה אחת מהונדס גידול או שריר מבודד מסוג בוגר פראי, myf5-GFP ודגי mylpfa-mCherry. לבצע cytometry הזרימה במהות כמתואר בשלב 2 של סעיף 1.
7. השתלה של ERMS למבוגרי rag2 הומוזיגוטים Mutant דג הזברה
- נקה 10 μl מיקרו-מזרק 26s G על ידי ציור ובגירוש פתרון אקונומיקה 10% (5 פעמים), ואחריו אתנול 70% (5 פעמים), ולאחר מכן על ידי חיץ השעיה (FBS PBS + 5% 0.9x, 10 פעמים ).
- הרדימי דגים מוטנטים rag2 הומוזיגוטים נמען על ידי הוספת טיפות בודדות של methanesulfonate tricaine (4 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות MS222) לתוך צלחת פטרי המכילה את הדג במי מערכת עד תנועות operculum הן איטיות ודגים עדיין.
- הנח דג הזברה נמען הרדים על מגבת נייר רטובה או SPOnge, עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה.
- הזרק 5 μl של ההשעיה התא לתוך חלל הצפק (2.5 x 10 4 תאים לכל נמען).
הערה: מחט הזריקה יש לנקות בין הזריקות של גידולים שונים כמתואר בשלב 4.1. 5 עד 10 μl ניתן להשתיל ביעילות intraperitoneally, תלוי בגודל דגי נמען. engraftment גידול יכולה להיות מושלמת על ידי הזרקת 1 x 10 x 4 עד 5 10 5 תאים לא ממוינים לדגי נמען (טבלת 1). - בזהירות להניח דג הזברה נמען לתוך טנק נקי עם כפית פלסטיק.
- להעריך דג הזברה נמען לשיעורי engraftment בגיל 10, לאחר ההשתלה 20, 30 ימים על ידי הדמיה דגים הרדימו תחת שדה בהיר ומיקרוסקופיה epifluorescence.
- לנצל דגי engrafted עבור יישומים במורד הזרם כוללים תא קרינה המופעל מיון (FACS) כדי להעריך את מצב בידול (איור 3H) analy היסטולוגית סטנדרטי,sis (איור 3F), תגובות טיפול הדמיה 15, ו / או השתלה סידורי גישות לרבות הגבלת ניתוח דילול 11.
Representative Results
הליך הכנה והשתלת תאי שריר שלד מתורמים מהונדסים α-תקטין RFP לחיסון חלש דג הזברה המוטציה rag2 הומוזיגוטים הודגם (סעיף 1 לפרוטוקול, איור 1 א ואיור 2). רקמת שריר שלד הוכנה מתורמים מהונדסים α-יקטין RFP והשעית תא בודד וכתוצאה מכך הכילה תאי קיימא 84.3% כפי שהוערך על ידי הרחקת DAPI הבאה ניתוח cytometry הזרימה (איור 2). תאי RFP-חיוביים מורכבים 35.3% מהשעית תא בודד זה (איור 2 ג). השתלה של תאים לתוך שריר שלד הגב של דג נמען rag2 הומוזיגוטים מוטציה הובילה לקליטתם עקבית וחזקה כפי שהוערך על ידי התמיינות של תאים בודדים לתוך סיבי multinucleated (1 x 10 6 תאים המוזרקים לדגים, טבלת 1, איור 2 ד-I). Wild סוגנמען דגים לא הצליחו נקלטי סיבי שריר על הניסוי של 30 היום (n = 13). ב -10 ימים שלאחר השתלה, 9 מתוך דג הזברה מוטציה הומוזיגוטים 14 rag2 הכילו סיבי שריר RFP-חיובי בסמוך למקום הזרקה (64.3%, איור 2E, F). חשוב לציין, שריר RFP-חיובי engrafted נמשכו 30 ימים שלאחר השתלה (איור 2G-I), עם תת-קבוצה של בעלי חיים שעוקבים אחריו ל- 115 ימים שלאחר engraftment-וengraftment שרירים החזקה והמתמשכת בתערוכה (מידע לא מוצג). תוצאות אלה דומות לאלה שדווחו בעבר על ידי הקבוצה שלנו 23 תוך שימוש באותו הפרוטוקול (טבלת 1).
יש לנו גם הצגתי שיטה לדור, ההכנה וההשתלה של תאים סרטניים ERMS לתוך חלל הצפק של דגי rag2 הומוזיגוטים מוטציה נמען (פרוטוקול סעיף 2, איור 1 ואיור 3). ERMS נוצרו בdoublדואר myf5-GFP המהונדס; דגי mylpfa-mCherry אשר הוכח כדי לאפשר להדמיה של ההטרוגניות התוך tumoral וניתוח פונקציונלי של תת-אוכלוסיות תאים סרטניים לאחר השתלת 11. עם זאת, אפיון מולקולרי נוסף של כל תת-אוכלוסייה קשה בגלל דגים קטנים כאשר הם מפתחים ERMS בין 10 עד 30 ימים של חיים ואת מספר התאים הסרטניים מגביל עבור יישומים במורד הזרם. פתרון אחד הוא להרחיב את מספר תאים הסרטניים על ידי engrafting ERMS לדג זברה נמען מבוגר. עד כה, ניסויים דומים הושלמו באמצעות דגי syngeneic CG1 מתח ונדרשו בעודף של 4 דורות של backcrossing לפתח קווי syngeneic שהיו מהונדסים לmyf5-GFP; mylpfa-mCherry. כדי לעקוף בעיות אלה, שהדגמנו את התועלת של דג הזברה נמען מוטציה חיסוני rag2 התפשר הומוזיגוטים לנקלטים ERMS העיקרי מדג זברה AB-מתח. כל ERMS העיקרי engrafted לra G2 בעלי חיים הומוזיגוטים מוטציה, המאפשרים התרחבות של הגידול (לוח 1). תוצאות דומות דווחו לאחרונה שבו 24 מתוך 27 rag2 ERMS engrafted דג הזברה מוטציה הומוזיגוטים, בעוד 0 של 7 אחים סוג בר engrafted מחלה 23. דוגמא מייצגת של ERMS engrafted מוצגת ליום 30 בימים שלאחר ההשתלה באיור 3E. Engrafted ERMS לשתף תכונות היסטולוגית של ראדומיוסרקומה העוברית, דומה לזה שנמצא בגידול הראשוני (איור 3 ו3F). ניתוח FACS אישר כי ERMS הכיל תפקודי גידול שונה הפצת תאים ותאים מובחנים המבטאים myf5-GFP ו / או mylpfa-mCherry. שיעורי הישרדות בעקבות הליך הזרקת intraperitoneal היו בעודף של 95%. דג הזברה נמען להיכנע נפוצה מניטל גידול לאחר נקודת הזמן שלאחר השתלת 30 ימים.
o: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
סכמטי 1. פרוטוקול איור ל() רגיל והשתלת תאי שריר שלד ממארת למוטציה הומוזיגוטים rag2 (B) דג הזברה. צעדים אופציונליים מסומנים ב (*).
איור 2. engraftment שלד שריר לדג הזברה מוטציה הומוזיגוטים rag2. () דג הזברה תורם מהונדס α-יקטין RFP. כדאיות (B) תא של השעיה תא שריר מבודדת כפי שהוערך על ידי הרחקת צבע DAPI וcytometry זרימה. חלקם של תאי RFP-חיובי שנמצאו בתוך ההשעיה תא שריר מתורם α-יקטין RFP (אדום) (ג), בהשוואה לשליטה פראית סוג(אפור). (DE) מוזגו שדה בהיר ותמונות ניאון של חיות בר סוג (D) או דגי rag2 הומוזיגוטים מוטציה (E) ליום 30 בימים שלאחר השתלה. שיעורים (F) engraftment לאורך זמן. אדום מציין מספר בעלי החיים engrafted בעוד אפור תערוכות דגים-engrafted שאינם. מספר בעלי החיים ניתחו בכל נקודת זמן מצוין. (GI) תמונות בהגדלה גבוהות של אזור התאגרף בE הלוח הראו על 10 (G), 20 (H) ו- 30 (I) ימים לאחר ההשתלה, מראה שימור של סיבי שריר מובחנים לאורך הזמן (ראשי חץ). ברים בקנה מידה שווים 2 מ"מ. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
השתלת איור 3. myf5-GFP; mylpfa-mCherry ERMS למוטציה הומוזיגוטים rag2 . דג הזברה ERMS (AD) rag2-kRASG12D המושרה העיקרי המתעורר בmyf5-GFP AB-זן; דג הזברה mylpfa-mCherry ליום 30 בימי חיי. דג הזברה (EH) rag2 הומוזיגוטים מוטציה engrafted עם ERMS ונותח לאחר 30 ימים שלאחר השתלה. (A, E) מוזגו שדה בהיר ותמונות ניאון של ERMS הראשוני והמושתל. אזור גידול מתואר וראש החץ מצביע על אתר הזרקה בE. (B, F) Hematoxylin- וחתכים מוכתמים eosin פרפין של ראשוני (B) וERMS engrafted (F) מראים אזורים של תאי מוגברים קשורות לסרטן. (C,G כדאיות תא) כפי שהוערך על ידי הרחקת צבע DAPI וcytometry זרימה. (D, H) תת-אוכלוסיות תאי גידול פלורסנט, כפי שהוערך על ידי cytometry זרימה. ברים בקנה מידה שווה 2 מ"מ (A, E) ו -50 מיקרומטר (B, F). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תוצאות טבלה 1. engraftment לשריר והשתלת תאי ERMS. (*) מציינים שדווחו בעבר נתונים תוך שימוש בטכניקות 23. הנתונים מודפסים ברשות משיטות טבע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.
Discussion
engraftment היעילה וחזקה של שרירי שלד הגבי מבוגר הושגה עם שיטת הכנת תא פשוטה מאוד ואחרי הזרקה של תאים לתוך שרירי הגב של דגים מוטנטים הומוזיגוטים rag2. באופן כללי, נהלי זריקה תוך שרירית היו מאוד חזקים, עם כמה מוות הקשורים מייד לאחר הליך ההשתלה, הנע בין 10% ל -35%, תלויים בניסוי. אופטימיזציה נוספות צפויה תתמקד בניצול של מחטים קטנות יותר מד להזרקה ופיתוח של מנגנון הזרקה נייח באמצעות מיקרוסקופ וmicromanipulator, אשר תקל על קלות של השתלת תאים. הגישה שלנו משמשת גם תאי שריר לא ממוינים מבעלי החיים תורמים והכילה רק כ תאי שריר 30%. שימוש בקווי כתב מהונדסים שתווית תאי גזע ובידוד FACS צפוי לספק השעיות תא מועשרות שיובילו לengraftment המוגברת לדגי נמען. שלד שריר גאמות גם יכולות להיות מועשרת ותרבותית לפני ההשתלה, כפי שתוארו בעבר 29. למרבה הפלא, גם התוצאות שלנו מצביעות על כך שהצעדים של הקמת נישה והתמיינות של רקמת שריר תורם מתרחשים לפני 10 ימים שלאחר השתלה, הקמת מודל זה כפלטפורמה ניסיונית חזקה ומהירה על מנת להעריך engraftment שריר והתחדשות. יתר על כן, ניסויים אלה בוטים בניגוד לאלה הושלמו בעכברים, שבו לפני פציעה של שריר עם כלוריד cardiotoxin או בריום נדרש יומיים לפני engraftment 30,31. סביר להניח כי פגיעת המחט הופקה במהלך הליך ההשתלה מגבירה engraftment על ידי גירוי הייצור של סביבת משובי בתוך החיה נמען 32,33. כמו כן, אנו צופים כי השיטה שלנו תהיה להתאים בקלות להשתלה של רקמת שריר שלד מדג הזברה צעירה, המאפשרים הערכה של מוטציות גנטיות המשפיעות על התפתחות שרירים שלד מוקדמתאבל להוביל לקטלני בשלבי הזחל.
יש לנו גם סיפק פרוטוקול מפורט לengraftment של ERMS דג הזברה על ידי הזרקת intraperitoneal לדגי מיזוג עישון, rag2 הומוזיגוטים מוטציה. גישה זו הייתה שימושית עבור הרחבת גידולים ראשוניים מהונדסים כפולים ללא צורך ביצירה גידולים בתוך קו מהונדס syngeneic. העבודה האחרונה שלנו הראתה כי גישות השתלת תאים לספק מודלים ניסיוניים רומן להעריך רגישות תרופת ERMS in vivo, שבו גידול יחיד יכול להיות מורחב לאלפי בעלי חיים והעריך להשפעות על צמיחה, התחדשות עצמית, וneovascularization 15. יתר על כן, יש לנו בהצלחה engrafted מגוון רחב של גידולים לדגים מוטנטים הומוזיגוטים rag2 בן לוקמיה לימפובלסטית החריפה של תאי T, מלנומה, וERMS 23. במבט לעתיד, אנו רואים קווים אלו יהיו שימושיים להערכת תכונות פונקציונליות חשובות של סרטן בvivo כולל הערכת ההטרוגניות התוך tumoral, פלישה, גרורות, אנגיוגנזה, והתנגדות לטיפול. יתר על כן, הדור של דגים מוטנטים הומוזיגוטים rag2 בדג הזברה מתח קספר ברור אופטי 34 צפוי להקל הדמיה ישירה של רבים מסימני היכר של סרטן אלה.
בסך הכל, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לengraftment המוצלחת של שרירי שלד fluorescently שהכותרת נורמלים וממאירים לדג זברה הומוזיגוטים rag2 המבוגר חיסוני מוטציה בסכנה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי הלימונדה של אלכס יעמוד קרן (DML), האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן (DML), MGH הווארד גודמן המלגה (DML), ומכוני בריאות הלאומי של ארה"ב מעניקים R24OD016761 ו1R01CA154923 (DML). CNY cytometry הזרימה Core ותמונת ניתוח תזרים, 1S10RR023440-01A1 מספר מענק מכשור משותף. IMT ממומן על ידי מענק מהקרן פורטוגזית למדע וטכנולוגיה (פסקה Fundação דואר Ciencia Tecnologia - FCT). QT ממומן על ידי מועצת מלגות סין. אנו מודים לאנג'לה Volorio על ההערות מועילות שלה וייעוץ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-EDTA buffer solution 1x | Sigma-Aldrich | 93283-100ML | Microinjection. Injection mix. |
| Potassium Chloride | Fisher Science Education | S77375-1 | Microinjection. Injection mix. |
| XhoI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0146S | Microinjection. Plasmid linearization. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 (50) or 28106 (250) | Microinjection. For purification of linearized plasmid up to 10 kb. |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | BP1753I-100 | Microinjection. For purification of linearized plasmid. |
| UltraPure Agarose, 500 g | Invitrogen | 16500-500 | Microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx | Microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | flow cytometry/FACS |
| 5 ml polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352058 | flow cytometry collection tube |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | FACS |
| 5 ml polypropylene round bottom tube | BD Falcon | 352063 | FACS collection tube |
| BD LSR II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | flow cytometry |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010-023 | transplantation |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-01 | transplantation |
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Western Chemical Inc. | http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html | Transplantation. Anesthetic. Caution: Irritant. Irritating to eyes, respiratory system, and skin. |
| VWR Absorbent Bench Underpads | VWR | 56616-018 | Transplantation. Regular paper towels or sponge can be used as an alternative. |
| Singe Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | transplantation |
| Petri Dish, Polystryrene Disposable Sterile | VWR | 25384-302 | transplantation |
| Cell Strainer, 40 µm Nylon | Falcon-Corning Incorporated | 352340 | transplantation |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430828 | transplantation |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | transplantation |
| Hemacytometer Set | Hausser Scientific | 1483 | transplantation |
| Hamilton syringe, fixed needle, volume 10 µl, needle size 26s ga (bevel tip) | Hamilton | 80366 | transplantation |
| Austin's A-1 Bleach, Commercial | James Austin Company | Transplantation. Any commercial solution can be used. | |
| Ethanol 190 Proof | Decon Labs, Inc. | DSP-MD.43 | Microinjection (linearized plasmid purification) and transplantation. Any commercial solution can be used. |
| High Speed Microcentrifuge, 300D Digital Microcentrifuge | Denville Scientific Inc. | C0265-24 | transplantation |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | 75004539 | Transplantation. Catalog number for 120 V, 60 Hz (US). |
| 5 ml serological pipets | BD Falcon | 357529 | transplantation |
| Corning Stripettor Plus Pipetting Controller | Corning Incorporated | 4090 | Transplantation. Any automatic pipetting controller can be used. |
| Powder free examination gloves | All steps. Any commercial brand can be used. | ||
| Filter pipet tips and micropipettes | All steps. Any commercial brand can be used. | ||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11205-20 | transplantation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | Scoring. Any appropriate fluorescent stereomicroscope can be used. |
| Olympus DP72 microscope digital camera | Olympus | DP72 | Scoring. Multiple adequate cameras for the selected imaging system can be used. |
References
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29 (11), (2013).
- Boatman, S., Barrett, F., Satishchandran, S., Jing, L., Shestopalov, I., Zon, L. I. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood cells, molecule., & diseases. 51 (4), 271-276 (2013).
- Langenau, D. M., Traver, D., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Yang, H. W., Kutok, J. L., et al. Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish. Cancer Research. , 7256-7262 (2004).
- Patton, E. E., Widlund, H. R., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current Biology. 15 (3), 249-254 (2005).
- Sabaawy, H. E., Azuma, M., Embree, L. J., Tsai, H. -J., Starost, M. F., Hickstein, D. D. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (41), 15166-15171 (2006).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Gene. 21 (11), 1382-1395 (2007).
- Le, X., Langenau, D. M., Keefe, M. D., Kutok, J. L., Neuberg, D. S., Zon, L. I. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
- Park, S. W., Davison, J. M., Rhee, J., Hruban, R. H., Maitra, A., Leach, S. D. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Zhuravleva, J., Paggetti, J., et al. MOZ/TIF2-induced acute myeloid leukaemia in transgenic fish. British journal of haematology. 143 (3), 378-382 (2008).
- Ignatius, M. S., Chen, E. Y., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Suppl Data. Cancer cell. 21 (5), 680-693 (2012).
- Blackburn, J. S., Liu, S., et al. Clonal Evolution Enhances Leukemia-Propagating Cell Frequency. Cancer cell. 25 (3), 366-378 (2014).
- Blackburn, J. S., Langenau, D. M. Zebrafish as a model to assess cancer heterogeneity, progression and relapse. Disease model. 7 (7), 755-762 (2014).
- Zhao, C., Wang, X., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS one. 6 (7), e21768 (2011).
- Chen, E. Y., DeRan, M. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 inhibitors induce the canonical WNT/β-catenin pathway to suppress growth and self-renewal in embryonal rhabdomyosarcoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5349-5354 (2014).
- Yang, X. -J., Cui, W., et al. A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion. PloS one. 8 (4), e61801 (2013).
- Chapman, A., Fernandez del Ama, L., Ferguson, J., Kamarashev, J., Wellbrock, C., Hurlstone, A. Heterogeneous Tumor Subpopulations Cooperate to Drive Invasion. Cell Reports. 8 (8), 1-8 (2014).
- Smith, A. C. H., Raimondi, A. R., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Iyengar, S., Houvras, Y., Ceol, C. J. Screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model. Journal of visualized experiments JoVE. (69), e50086 (2012).
- Mizgireuv, I., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2790 (2011).
- Tang, Q., Abdelfattah, N. S., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature methods. 11, 821-824 (2014).
- Zhou, Q., Facciponte, J., Jin, M., Shen, Q., Lin, Q. Humanized NOD-SCID IL2rg–/– mice as a preclinical model for cancer research and its potential use for individualized cancer therapies. Cancer letters. 344 (1), 13-19 (2014).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental biology. 192 (2), 289-299 (1997).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D. D. D., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), 1-5 (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon PRess. Eugene, OR. (2000).
- Alexander, M. S., Kawahara, G., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors). Muscl, & nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of visualized experiments JoVE. (86), 1-7 (2014).
- Gerli, M. F. M., Maffioletti, S. M., Millet, Q., Tedesco, F. S. Transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration. J Vis Exp. (83), e50532 (2014).
- Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell. The FEBS journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).
- Rowlerson, a, Radaelli, G., Mascarello, F., Veggetti, Regeneration of skeletal muscle in two teleost fish: Sparus aurata and Brachydanio rerio. Cell Tissue Res. 289 (2), 311-322 (1997).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell stem cell. 2 (2), 183-189 (2008).
