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Immunology and Infection

इम्यून से समझौता वयस्क zebrafish में सामान्य और घातक मांसपेशी कोशिका प्रत्यारोपण

Published: December 26, 2014 doi: 10.3791/52597
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2, 1,2, 1,2
1Molecular Pathology, Cancer Center and Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Stem Cell Institute, 3GABBA - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto
* These authors contributed equally

Abstract

Zebrafish विकास, उत्थान, और कैंसर का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गए हैं। हाल ही में, allograft कोशिका प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल किरणित, syngeneic, और प्रतिरक्षा के साथ छेड़छाड़ की वयस्क zebrafish में सामान्य और घातक कोशिकाओं की है कि परमिट engraftment विकसित किया गया है। अनुकूलित कोशिका प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल के साथ युग्मित जब इन मॉडलों को स्टेम सेल समारोह, उत्थान निम्नलिखित चोट, और कैंसर के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं। यहाँ, हम प्रतिरक्षा के साथ छेड़छाड़ की वयस्क rag2 E450fs समयुग्मक उत्परिवर्ती zebrafish में zebrafish वयस्क कंकाल की मांसपेशी और भ्रूणीय rhabdomyosarcoma (erms), भ्रूण मांसपेशियों के साथ सुविधाओं है कि शेयर एक बाल चिकित्सा सार्कोमा, की कोशिका प्रत्यारोपण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। महत्वपूर्ण बात है, इन जानवरों टी कोशिकाओं की कमी है और असंबंधित दाता जानवरों से ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला के engraftment को सुविधाजनक बनाने, बी सेल समारोह को कम कर दिया। हमारे अनुकूलित प्रोटोकॉल कि fluorescently पेशी सेल prepar लेबल वाले शोrag2 समयुग्मक उत्परिवर्ती मछली के पृष्ठीय मांसलता में प्रत्यारोपित जब α-actin-आरएफपी ट्रांसजेनिक zebrafish से ations मजबूती के साथ टीका लगाना। हम यह भी प्रतिदीप्ति भेदभाव की स्थिति के आधार पर कोशिकाओं तक ही सीमित है जहां फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक erms के engraftment प्रदर्शित करता है। विशेष रूप से, erms अटल बिहारी तनाव myf5-GFP में बनाया गया था; mylpfa-mCherry डबल ट्रांसजेनिक जानवरों और ट्यूमर वयस्क प्रतिरक्षा के साथ छेड़छाड़ की मछली की पेरिटोनियम में इंजेक्ट किया। इन प्रोटोकॉल की उपयोगिता पृष्ठीय मांसलता या वयस्क zebrafish के पेरिटोनियम में प्रत्यारोपित किया जा सकता है कि सामान्य और घातक दाता कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के engraftment तक फैली हुई है।

Introduction

वे amputated पंख, साथ ही एक क्षतिग्रस्त मस्तिष्क, रेटिना, रीढ़ की हड्डी, हृदय, कंकाल की मांसपेशी और अन्य ऊतकों एक पुनर्जीवित कर सकते हैं क्योंकि zebrafish पुनर्योजी के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल हैं। कोशिका प्रत्यारोपण द्वारा विभिन्न ऊतकों से स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की पहचान केवल हाल ही में दो पता लगाया गया है, जबकि वयस्क zebrafish में सेल और पुनर्योजी पढ़ाई काफी हद तक चोट के जवाब में उत्थान के लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित किया है स्टेम। - 10 zebrafish भी मानव रोग 3 नकल कि ट्रांसजेनिक कैंसर मॉडल की पीढ़ी के माध्यम से कैंसर के अध्ययन के लिए तेजी से आदी हो गए हैं।

कैंसर की सेटिंग में, कोशिका प्रत्यारोपण दृष्टिकोण व्यापक रूप से अपनाया और आत्म नवीकरण 11, कार्यात्मक विविधता 12,13, neovascularization 14, प्रसार सहित महत्वपूर्ण कैंसर प्रक्रियाओं के गतिशील मूल्यांकन की अनुमति हो गए हैं,चिकित्सा प्रतिक्रियाओं 15, और आक्रमण 16,17। हालांकि, engrafted कोशिकाओं अक्सर हमला करते हैं और भ्रष्टाचार के 18 को मारने कि प्रतिरक्षा सुरक्षा की मेजबानी की वजह से प्राप्तकर्ता मछली से खारिज कर रहे हैं। कई तरीकों engrafted कोशिकाओं की अस्वीकृति से उबरने के लिए इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण के लिए, प्राप्तकर्ता जानवरों प्रतिरक्षा प्रणाली क्षणिक पहले प्रत्यारोपण 18,19 करने के लिए कम खुराक गामा विकिरण द्वारा ablated जा सकता है। हालांकि, प्राप्तकर्ता प्रतिरक्षा प्रणाली को 20 दिन से बाद के विकिरण की वसूली और दाता कोशिकाओं 18 को मार देंगे। वैकल्पिक रूप से, dexamethasone उपचार अब प्रतिरक्षा दमनकारी कंडीशनिंग प्रदान करने और अप करने के लिए 30 दिनों के लिए 14 मानव ट्यूमर की एक विस्तृत श्रृंखला के engraftment को सुविधाजनक बनाने, टी और बी सेल समारोह को दबाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इन प्रयोगों निरंतर दवा खुराक की आवश्यकता होती है और ठोस ट्यूमर का अध्ययन करने के लिए सीमित कर रहे हैं। 22, जहां दाता और recipi - लंबी अवधि के engraftment assays के आनुवंशिक रूप से समान syngeneic लाइनों 20 का इस्तेमाल किया हैईएनटी कोशिकाओं का मिलान नहीं हुआ प्रतिरक्षा हैं। हालांकि, इन मॉडलों के हित के ट्रांसजेनिक लाइनें पूरी तरह syngeneic लाइनों का निर्माण करने के लिए और अधिक से अधिक चार पीढ़ियों के लिए syngeneic पृष्ठभूमि में पार किए जाने की आवश्यकता है। प्राप्तकर्ता मछली में प्रतिरक्षा अस्वीकृति के मुद्दों का निराकरण करने के लिए, हमारे समूह ने हाल ही में एक प्रतिरक्षा टी और बी सेल समारोह को कम कर दिया है कि और ऊतकों 23 की एक विस्तृत श्रृंखला के engraftment की अनुमति जो समझौता किया rag2 E450fs समयुग्मक उत्परिवर्ती (ZFIN एलील पदनाम rag2 fb101) लाइन विकसित की है। इसी प्रकार प्रतिरक्षा के साथ छेड़छाड़ माउस मॉडल माउस और मानव ऊतकों 24 की कोशिका प्रत्यारोपण के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है।

यहाँ, हम कंकाल की मांसपेशी और भ्रूणीय rhabdomyosarcoma (erms), नव वर्णित rag2 समयुग्मक उत्परिवर्ती zebrafish में, कंकाल की मांसपेशी के साथ सुविधाओं है कि शेयर एक बाल चिकित्सा सार्कोमा के प्रत्यारोपण के लिए तरीके प्रस्तुत करते हैं। एक प्रतिरक्षा के साथ छेड़छाड़ की वयस्क zebrafish की उपलब्धतासीधे कल्पना और सामान्य और घातक ऊतकों के भीतर स्टेम सेल आत्म नवीकरण का आकलन करने के लिए बड़े पैमाने पर सेल प्रत्यारोपण पढ़ाई प्रदर्शन करने की हमारी क्षमता बढ़ती है। इस विधि के साथ, fluorescently 25 ट्रांसजेनिक zebrafish विवेकशीलतापूर्वक rag2 में टीका लगाना α-actin-आरएफपी वयस्क से पेशी सेल की तैयारी में लेबल पृष्ठीय मांसलता में इंजेक्शन के बाद समयुग्मक उत्परिवर्ती zebrafish। इसके अलावा, हम engraftment और प्राथमिक myf5 -GFP के विस्तार का प्रदर्शन, rag2 E450fs समयुग्मक उत्परिवर्ती zebrafish में intraperitoneal इंजेक्शन निम्नलिखित mylpfa- mCherry ट्रांसजेनिक erms। इन प्रोटोकॉल की उपयोगिता दिखाया उदाहरणों से परे चला जाता है और आसानी से अतिरिक्त zebrafish पुनर्योजी ऊतकों और कैंसर के लिए लागू किया जा सकता है।

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं प्रोटोकॉल # 2011N000127 अनुसंधान के तहत पशु की देखभाल, पर मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल उपसमिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

वयस्क rag2 E450fs Homozygous उत्परिवर्ती Zebrafish में धारा 1. कंकाल की मांसपेशी सेल प्रत्यारोपण

वयस्क zebrafish दाता कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं के 1. तैयारी

  1. Fluorescently पेशी लेबल किया है कि ट्रांसजेनिक वयस्क zebrafish प्राप्त करते हैं। इस प्रयोग में, 30 α -actin-आरएफपी दाता मछली 25 प्राप्तकर्ता मछली प्रति 1 x 10 6 कोशिकाओं प्रत्यारोपण के लिए उपयोग किया गया।
  2. 1.6 मिलीग्राम में बलिदान दाता zebrafish / 10 मिनट के लिए या कोई operculum आंदोलन स्पष्ट है जब तक methanesulfonate (MS222) tricaine एमएल।
  3. एक शोषक कागज तौलिया और उत्पाद शुल्क पर एक साफ रेजर ब्लेड का उपयोग पृष्ठीय पेशी दाता मछली रखें। चित्रा 1 ए में नोट के रूप में कटौती ऊतक संग्रह (अधिकतम करने के लिए एक 45 डिग्री के कोण पर गुदा के पास बनाया जाना चाहिए
  4. विच्छेदित ऊतक के लिए 500 μl निलंबन बफर (पूर्व ठंडा 0.9x फॉस्फेट बफर खारा 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक (पीबीएस)) जोड़ें। 10 दाता zebrafish अप करने के लिए इस खंड में एक साथ रखा जा सकता है।
  5. कोशिकाओं को एक वर्दी निलंबन में हैं जब तक> 20 बार एक धार के साथ ऊतक कीमा। पूरे पृष्ठीय मांसलता त्वचा, हड्डियों और पंख सहित homogenized है। निलंबन बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें। एक 5 मिलीलीटर विंदुक का प्रयोग, कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए सेल निलंबन ≥20 टाइम्स triturate।
  6. बर्फ पर रखा एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक 40 माइक्रोन जाल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर।
  7. शेष ऊतक को इकट्ठा करने और 5 मिलीलीटर (10 दाता मछली को अलग प्रति इस्तेमाल किया जा सकता है) की अंतिम मात्रा करने के लिए, एक ही झरनी और शंक्वाकार ट्यूब के माध्यम से फिल्टर करने के लिए निलंबन बफर के एक अतिरिक्त 2.5 मिलीलीटर के साथ पेट्री डिश धो लें।
    नोट: त्वचा, हड्डियों और पंख निस्पंदन निम्नलिखित बाहर रखा जाएगा। यदि लागू हो, वही शंक्वाकार ट्यूब में इसी तरह के निलंबन गठबंधन।
  8. Trypan नीले रंग और एक hemocytometer का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना।
  9. (वैकल्पिक, चरण 2) अगर वांछित, प्रवाह cytometry के लिए 500 μl सुरक्षित रखते हैं।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1000 XG, पर अपकेंद्रित्र सेल निलंबन।
  11. 3.33 x 10 5 कोशिकाओं / μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं त्यागें (0.9x पीबीएस + 5% FBS) के। कुल में, तीन μl प्राप्तकर्ता प्रति 1 x 10 6 कोशिकाओं (चरण 3) की कुल के लिए प्राप्तकर्ता मछली प्रति इंजेक्ट किया जाएगा।
    नोट: सेल निलंबन के कम से कम तीन μl प्राप्तकर्ता मछली में प्रत्यारोपित किया जाना चाहिए। सेल संख्या सीमित है, तो प्राप्तकर्ता के रूप में प्रति कम 4 से 10 एक्स 5 के रूप में कोशिकाओं सफल engraftment (तालिका 1) के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

दाता कंकाल की मांसपेशी सेल तैयार 2. फ्लो विश्लेषण (वैकल्पिक)

  1. मैं उल्लिखित के रूप में एक जंगली प्रकार, गैर ट्रांसजेनिक मछली से मांसपेशियों को अलग-थलगएन 1.1 कदम। यह नमूना नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है और फ्लो फाटकों की स्थापना के लिए उपयोगी है।
  2. एक उपयुक्त व्यवहार्यता डाई जोड़ें। उदाहरण के लिए, मांसपेशियों की तैयारी के 500 μl को शेयर DAPI के समाधान (500 एनजी / μl) के 5 μl जोड़ें। विश्लेषण करने के लिए थोड़ा पूर्व भंवर। 5 एक्स 3-01 अक्टूबर 10 x 4 घटनाओं मोल। ट्रांसजेनिक मछली से अलग मांसपेशियों की कोशिकाओं का विश्लेषण द्वारा पीछा फाटकों स्थान के लिए सबसे पहले जंगली प्रकार नियंत्रण के नमूने का विश्लेषण करें।
    नोट: प्रवाह cytometry विश्लेषण आमतौर पर विच्छेदित कोशिकाओं 60% से अधिक व्यवहार्यता (चित्रा 2) बनाए रखने के लिए जो समय के दौरान मांसपेशियों के ऊतकों को विच्छेदन के बाद एक घंटा, भीतर किया जाता है। प्रकोष्ठों सभी समय पर बर्फ पर रखा जाना चाहिए। कुल सेल व्यवहार्यता trypan नीले रंग और एक hemocytometer का उपयोग पहले प्रत्यारोपण के लिए फिर से मूल्यांकन किया जा सकता है।

वयस्क rag2 Homozygous उत्परिवर्ती Zebrafish में कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं 3. Intramuscular ट्रांसप्लांटेशन

  1. एक 10 μ साफ; में ड्राइंग और 70% इथेनॉल (5 बार) द्वारा पीछा 10% ब्लीच समाधान (5 बार), खदेड़ने, और फिर निलंबन बफर (0.9x पीबीएस + 5% FBS के, 10 बार) द्वारा पीछा द्वारा एल 26S जी सूक्ष्म सिरिंज।
  2. Operculum आंदोलनों धीमी जब तक सिस्टम पानी में मछली युक्त एक पेट्री डिश में tricaine methanesulfonate (MS222, 4 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान) के एकल बूँदें जोड़कर 2-4 महीने पुराने समयुग्मक rag2 उत्परिवर्ती मछली या (नियंत्रण) के रूप में जंगली प्रकार प्राप्तकर्ता मछली anesthetize और मछली अभी भी कर रहे हैं।
    नोट: tricaine संज्ञाहरण की खुराक प्राप्तकर्ता zebrafish के उम्र और आकार पर निर्भर करेगा।
  3. बाईं ओर का सामना करना पड़ के साथ, एक नम कागज तौलिया या स्पंज पर anesthetized प्राप्तकर्ता zebrafish रखें।
  4. Latero-पृष्ठीय मांसलता में सिरिंज सुई डालें (1 ए चित्र देखें)। इंजेक्शन एक 45 डिग्री के कोण पर प्रदर्शन कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें। प्राप्तकर्ता प्रति 1 x 10 6 कोशिकाओं की कुल के लिए मछली प्रति (कदम 1.12 में तैयार) सेल निलंबन के 3 μl इंजेक्षन।
  5. ध्यान से उबरने के लिए एक प्लास्टिक के चम्मच का उपयोग कर एक साफ टैंक में इंजेक्शन zebrafish हस्तांतरण।
  6. उज्ज्वल क्षेत्र और epifluorescence माइक्रोस्कोपी के तहत anesthetized मछली इमेजिंग द्वारा 10, 20, 30 दिनों के बाद प्रत्यारोपण में engraftment दरों के लिए प्राप्तकर्ता zebrafish का आकलन करें।

वयस्क Homozygous rag2 उत्परिवर्ती Zebrafish में धारा 2. भ्रूणीय Rhabdomyosarcoma (erms) ट्रांसप्लांटेशन

Zebrafish भ्रूण 4. डीएनए Microinjection

  1. 6 घंटा या हे / N के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर XhoI के साथ डीएनए के 10 माइक्रोग्राम प्रति, पचाने द्वारा rag2-kRASG12D प्लाज्मिड 7 linearize।
  2. मानक फिनोल से डीएनए शुद्ध: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और इथेनॉल के साथ वेग। विआयनीकृत पानी के 20 μl में Resuspend (वैकल्पिक रूप से, वाणिज्यिक डीएनए टुकड़ा शुद्धि कॉलम में इस्तेमाल किया जा सकता है)।
  3. एक 1% agarose जेल पर पचाया और पचा डीएनए चलाने और डीएनए ख की एकाग्रता का निर्धारणY स्पेक्ट्रोमीटर पढ़ने। 1, 1: वैकल्पिक रूप से, एक पर नमूने को चलाने के 5, और एक 1% agarose जेल पर 1:10 dilutions और एक डीएनए सीढ़ी की तुलना में यों।
  4. 0.1 एम KCl और 0.5x Tris-EDTA में 15 एनजी पच rag2-kRASG12D डीएनए के / μl के अंतिम एकाग्रता में एक इंजेक्शन मिश्रण तैयार करें। इंजेक्शन की मात्रा के 2 NL में इंजेक्ट अंतिम डीएनए राशि 30 पीजी हो जाएगा।
    नोट: तीन अलग डीएनए निर्माणों अप करने के लिए कुशलतापूर्वक सह इंजेक्शन भ्रूण प्रति डीएनए के 60 पीजी की एक अधिकतम में हो सकता है। बन ये ट्रांसजीन जीनोम में एकीकृत और विकासशील ट्यूमर 26 के भीतर सह व्यक्त किया।
  5. ब्याज की एक zebrafish तनाव (चित्रा 1 बी) में 27 के रूप में वर्णित अनिवार्य रूप से एक सेल चरण भ्रूण में linearized rag2-kRASG12D इंजेक्षन। इंजेक्शन उच्च दक्षता के लिए जर्दी में सेल में और नहीं किया जाना चाहिए। इस प्रयोग, एक डबल ट्रांसजेनिक अटल-तनाव में; myf5 GFP, mylpfa-mCherry इस्तेमाल किया गया था। मानक के पालन पी का प्रयोग zebrafish उठाएँ28 rotocols।
    नोट: इंजेक्शन अस्तित्व अक्सर इस्तेमाल zebrafish तनाव पर निर्भर है। औसत पर, इंजेक्शन भ्रूण के 30% erms का विकास होगा। 300-600 भ्रूण कि GFP पॉजिटिव पर्याप्त और mCherry पॉजिटिव प्राथमिक ट्यूमर प्रत्यारोपण और विश्लेषण के लिए उत्पन्न कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग प्रति इंजेक्शन होना चाहिए।

Zebrafish लार्वा में प्राथमिक erms के लिए 5. स्क्रीनिंग

  1. 10 से 30 दिनों के बाहर से दिखाई दे प्राथमिक erms के उद्भव के लिए इंजेक्शन पद से इंजेक्शन के लिए zebrafish का निरीक्षण करें।
  2. 30 दिनों के बाद इंजेक्शन पर, operculum आंदोलनों धीमी और मछली अभी भी कर रहे हैं जब तक मछली प्रणाली पानी युक्त एक पेट्री डिश में tricaine methanesulfonate (MS222 4 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान) के एकल बूँदें जोड़कर प्राप्तकर्ता zebrafish anesthetize।
    नोट: tricaine संज्ञाहरण की खुराक प्राप्तकर्ता zebrafish के उम्र और आकार पर निर्भर करेगा। प्राथमिक ट्यूमर असर zebrafish tricaine की कम मात्रा की आवश्यकता होती है।
  3. प्राथमिक erms असर का चयन करेंएक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग, myf5-GFP के -positive और mylpfa-mCherry -positive हैं कि मछली।

6. erms ट्यूमर तैयारी

  1. 10 मिनट के लिए या कोई operculum आंदोलन स्पष्ट है जब तक 1.6 मिलीग्राम / एमएल tricaine methanesulfonate (MS222) में चयनित प्राथमिक erms असर zebrafish बलिदान।
  2. अलग से एक ट्यूमर असर zebrafish प्रक्रिया। एक साफ पेट्री डिश में मछली प्लेस और एक रेजर ब्लेड और ठीक संदंश (चित्रा 1 बी में दिखाया गया है) का उपयोग कर ट्यूमर के आसपास काटना। एक साफ पेट्री डिश को विच्छेदित ट्यूमर के ऊतक स्थानांतरण।
  3. 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक पूर्व ठंडा 0.9x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 100 μl जोड़ें। एक साफ धार के साथ कीमा ऊतक> कोशिकाओं तक 20 बार एक वर्दी निलंबन में हैं।
  4. विंदुक टिप फ़िल्टर्ड एक 1000 μl का उपयोग कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए ऊपर और नीचे कई बार एक ही बफर के 900 μl (0.9x पीबीएस + 5% FBS), पिपेट जोड़ें। एक 40 और के माध्यम से फ़िल्टर# 956; इसी 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एम जाल छलनी। बर्फ पर स्टोर।
  5. बफर के एक अतिरिक्त 2-4 मिलीलीटर के साथ पेट्री डिश धो लें, और एक ही जाल छलनी के माध्यम से और इसी शंक्वाकार ट्यूब में गुजरती हैं।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  7. बफर के 100 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend त्यागें।
  8. Trypan नीले रंग और एक hemocytometer का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना।
  9. एक ही बफर में वांछित एकाग्रता के लिए कोशिकाओं पतला (0.9x पीबीएस + 5% FBS) के। प्रकोष्ठों प्राप्तकर्ता प्रति 2.5 एक्स 10 4 कोशिकाओं के कुल में प्राप्तकर्ता zebrafish प्रति 5 μl रोपाई के लिए / μl 5 एक्स 10 3 कोशिकाओं को पतला होना चाहिए।
  10. फ्लो विश्लेषण भी नमूना भीतर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के सापेक्ष अनुपात quantize करने के लिए कदम 6.5 से निलंबन की एक छोटी राशि के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है।
    नोट: एक तरफ (3.5 चरण में छानने के बाद) सेल निलंबन के 100 μl सेट और 400 μl के साथ पतलाफ्लो विश्लेषण के लिए 0.9x पीबीएस + 5% FBS के निलंबन बफर की। उचित gating के लिए सुनिश्चित करने के लिए, वयस्क जंगली प्रकार, myf5-GFP और mylpfa-mCherry मछली से अलग एकल ट्रांसजेनिक ट्यूमर के ऊतक या मांसपेशी का उपयोग करते हुए अतिरिक्त विश्लेषण करते हैं। धारा 1 के चरण 2 में वर्णित के रूप में अनिवार्य रूप से फ्लो प्रदर्शन करते हैं।

वयस्क rag2 Homozygous उत्परिवर्ती Zebrafish में erms 7. ट्रांसप्लांटेशन

  1. (5 बार) में ड्राइंग और 10% से 70% इथेनॉल के द्वारा पीछा ब्लीच समाधान (5 बार), खदेड़ने द्वारा एक 10 μl 26S जी सूक्ष्म सिरिंज साफ है, और फिर निलंबन बफर (0.9x पीबीएस + 5% FBS के 10 गुना से पीछा )।
  2. Operculum आंदोलनों धीमी गति से कर रहे हैं और मछली अभी भी कर रहे हैं जब तक सिस्टम पानी में मछली युक्त एक पेट्री डिश में tricaine methanesulfonate (MS222 4 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान) के एकल बूँदें जोड़कर प्राप्तकर्ता समयुग्मक rag2 उत्परिवर्ती मछली anesthetize।
  3. एक गीला कागज तौलिया या एसपीओ पर anesthetized प्राप्तकर्ता zebrafish रखेंnge, उदर पक्ष के साथ सामना करना पड़ रहा।
  4. पेरिटोनियल गुहा (प्राप्तकर्ता 2.5 प्रतिशत 10 x 4 कोशिकाओं) में सेल निलंबन के 5 μl इंजेक्षन।
    नोट: चरण 4.1 में वर्णित के रूप में इंजेक्शन की सुई अलग ट्यूमर के इंजेक्शन के बीच साफ किया जाना चाहिए। 5 से 10 μl कुशलतापूर्वक प्राप्तकर्ता मछली के आकार पर निर्भर करता है, intraperitoneally प्रत्यारोपित किया जा सकता है। ट्यूमर engraftment प्राप्तकर्ता मछली प्रति एक 10 x 4 5 से 10 एक्स 5 को unsorted कोशिकाओं (तालिका 1) इंजेक्शन लगाने के द्वारा पूरा किया जा सकता है।
  5. ध्यान से एक प्लास्टिक के चम्मच के साथ एक साफ टैंक में प्राप्तकर्ता zebrafish जगह है।
  6. उज्ज्वल क्षेत्र और epifluorescence माइक्रोस्कोपी के तहत anesthetized मछली इमेजिंग द्वारा 10, 20, 30 दिनों के बाद प्रत्यारोपण में engraftment दरों के लिए प्राप्तकर्ता zebrafish का आकलन करें।
  7. भेदभाव की स्थिति (चित्रा 3H), मानक ऊतकीय analy का आकलन करने के लिए प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) सहित बहाव के अनुप्रयोगों के लिए engrafted मछली का उपयोगबहन (चित्रा 3F), इमेजिंग चिकित्सा प्रतिक्रियाओं 15, और / या धारावाहिक प्रत्यारोपण कमजोर पड़ने विश्लेषण 11 सीमित सहित दृष्टिकोण।

Representative Results

प्रतिरक्षा में तैयारी और α-actin-आरएफपी ट्रांसजेनिक दाताओं से कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं रोपाई के लिए एक प्रक्रिया समयुग्मक rag2 उत्परिवर्ती zebrafish से समझौता (प्रोटोकॉल धारा 1, चित्रा 1 ए और चित्रा 2) का प्रदर्शन किया गया है। कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों α-actin-आरएफपी ट्रांसजेनिक दाताओं से तैयार किया गया था और फ्लो विश्लेषण (चित्रा 2B) निम्नलिखित DAPI के बहिष्कार द्वारा मूल्यांकन के रूप में उत्पन्न होने वाली एकल कोशिका निलंबन 84.3% व्यवहार्य कोशिकाओं निहित। आरएफपी पॉजिटिव कोशिकाओं इस एकल कक्ष निलंबन (चित्रा -2) की 35.3% शामिल थे। (मछली प्रति इंजेक्शन के 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं, 1 टेबल, चित्रा 2 डी-आई) multinucleated तंतुओं में एकल कक्षों का भेदभाव द्वारा मूल्यांकन के रूप में rag2 समयुग्मक उत्परिवर्ती प्राप्तकर्ता मछली के पृष्ठीय कंकाल की मांसपेशी में कोशिकाओं के प्रत्यारोपण सुसंगत और मजबूत engraftment के लिए नेतृत्व किया। वन्य प्रकारप्राप्तकर्ता मछली 30 दिन प्रयोग (एन = 13) के ऊपर मांसपेशी फाइबर टीका लगाना करने में विफल रहा। 10 दिनों के बाद प्रत्यारोपण करके, 14 rag2 समयुग्मक उत्परिवर्ती zebrafish के बाहर 9 इंजेक्शन (64.3%, चित्रा 2 ई, एफ) के स्थल के निकट आरएफपी पॉजिटिव मांसपेशी फाइबर होता है। महत्वपूर्ण बात है, engrafted आरएफपी पॉजिटिव पेशी के बाद engraftment और प्रदर्शन मजबूत और लगातार पेशी engraftment (नहीं दिखाया डेटा) 115 दिनों के लिए पीछा किया जा रहा जानवरों की एक सबसेट के साथ, बाद प्रत्यारोपण 30 दिनों (चित्रा 2 जी-आई) के लिए बनाए। इन परिणामों के एक ही प्रोटोकॉल (तालिका 1) का उपयोग हमारे समूह में 23 से पहले की रिपोर्ट उन लोगों के लिए समान हैं।

हम यह भी rag2 समयुग्मक उत्परिवर्ती प्राप्तकर्ता मछली (प्रोटोकॉल धारा 2, चित्रा 1 बी और चित्रा 3) के पेरिटोनियल गुहा में erms ट्यूमर कोशिकाओं के उत्पादन, तैयारी और प्रत्यारोपण के लिए एक विधि प्रस्तुत किया है। Erms doubl में उत्पन्न किया गयाई ट्रांसजेनिक myf5-GFP; mylpfa-mCherry मछली अंतर tumoral विविधता और प्रत्यारोपण के 11 निम्नलिखित ट्यूमर सेल उप-जनसंख्या का कार्य विश्लेषण के दृश्य की अनुमति देने के लिए दिखाया गया है कि। वे 10 से 30 जीवन के दिनों और ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या बहाव के अनुप्रयोगों के लिए सीमित कर रहे हैं के बीच erms विकसित जब मछली छोटे हैं क्योंकि हालांकि, प्रत्येक उप-जनसंख्या के आगे आणविक लक्षण वर्णन मुश्किल है। एक समाधान वयस्क प्राप्तकर्ता zebrafish में erms engrafting द्वारा ट्यूमर सेल नंबर का विस्तार है। तिथि करने के लिए, इसी तरह के प्रयोगों CG1 तनाव syngeneic मछली का उपयोग कर पूरा हो चुका है और myf5-GFP के लिए ट्रांसजेनिक थे कि syngeneic लाइनों को विकसित करने के backcrossing की चार पीढ़ियों से अधिक की आवश्यकता; mylpfa-mCherry। इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, हम एक बिहारी तनाव zebrafish से प्राथमिक erms टीका लगाना करने के लिए प्रतिरक्षा के साथ छेड़छाड़ की rag2 समयुग्मक उत्परिवर्ती प्राप्तकर्ता zebrafish के उपयोगिता का प्रदर्शन किया। सभी प्राथमिक erms आरए में engraftedG2 ट्यूमर (तालिका 1) के विस्तार की सुविधा के समयुग्मक उत्परिवर्ती पशुओं,। 0 7 के जंगली प्रकार भाई बहन की बीमारी 23 engrafted जबकि इसी तरह के परिणाम हाल ही में, जहां 24 से 27 rag2 समयुग्मक उत्परिवर्ती zebrafish engrafted erms की सूचना मिली। एक engrafted erms का एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 3E में 30 दिनों के बाद प्रत्यारोपण में दिखाया गया है। Engrafted erms प्राथमिक ट्यूमर (3B चित्रा और 3F) में पाया है कि इसी तरह भ्रूणीय rhabdomyosarcoma, के histological सुविधाओं को साझा करें। FACS विश्लेषण कि myf5-GFP और / या mylpfa-mCherry व्यक्त कि कोशिकाओं और विभेदित कोशिकाओं प्रचार कार्यात्मक अलग ट्यूमर निहित erms की पुष्टि की। Intraperitoneal इंजेक्शन प्रक्रिया के बाद जीवित रहने की दरों में 95% से अधिक में थे। प्राप्तकर्ता zebrafish सामान्यतः 30 दिनों के बाद प्रत्यारोपण समय बिंदु के बाद ट्यूमर बोझ से मर जाना।


(ए) सामान्य और (बी) rag2 समयुग्मक उत्परिवर्ती में घातक कंकाल की मांसपेशी कोशिका प्रत्यारोपण के लिए चित्रा 1. प्रोटोकॉल योजनाबद्ध zebrafish। वैकल्पिक कदम (*) से चिह्नित कर रहे हैं।

चित्रा 2
Rag2 समयुग्मक उत्परिवर्ती zebrafish में चित्रा 2. कंकाल की मांसपेशी engraftment। (ए) α-actin-आरएफपी ट्रांसजेनिक दाता zebrafish। पृथक पेशी सेल निलंबन के (बी) सेल व्यवहार्यता DAPI डाई अपवर्जन द्वारा मूल्यांकन और प्रवाह cytometry के रूप में। एक जंगली प्रकार नियंत्रण की तुलना में (सी) α-actin-आरएफपी दाता (लाल) से पेशी सेल निलंबन के भीतर पाया आरएफपी पॉजिटिव कोशिकाओं का अनुपात,(ग्रे)। (डे) के 30 दिनों के बाद प्रत्यारोपण में उज्ज्वल क्षेत्र और जंगली प्रकार के पशुओं (डी) या rag2 समयुग्मक उत्परिवर्ती मछली (ई) के फ्लोरोसेंट छवियों विलय कर दिया। समय के साथ (एफ) engraftment दरों। ग्रे गैर engrafted मछली से पता चलता है, जबकि लाल engrafted पशुओं की संख्या को दर्शाता है। हर समय बिंदु पर विश्लेषण किया पशुओं की संख्या संकेत कर रहे हैं। समय (तीर) से अधिक विभेदित मांसपेशी फाइबर की अवधारण दिखा रहा है (सैनिक) 10 (जी) में दिखाया पैनल ई में बॉक्सिंग क्षेत्र के उच्च बढ़ाई छवियों, 20 (एच) और 30 (आई) दिनों के बाद प्रत्यारोपण,। स्केल सलाखों 2 मिमी के बराबर हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
Myf5-GFP की चित्रा 3. ट्रांसप्लांटेशन; rag2 समयुग्मक उत्परिवर्ती में mylpfa-mCherry erms । एबी तनाव myf5-GFP में उत्पन्न होने वाली zebrafish (एडी) rag2-kRASG12D प्रेरित प्राथमिक erms; जीवन के 30 दिनों में mylpfa-mCherry zebrafish। (एह) rag2 समयुग्मक उत्परिवर्ती zebrafish erms साथ engrafted और बाद प्रत्यारोपण 30 दिनों में विश्लेषण किया गया। (ए, ई) उज्ज्वल क्षेत्र और प्राथमिक और प्रतिरोपित erms की फ्लोरोसेंट छवियों विलय कर दिया। ट्यूमर क्षेत्र उल्लिखित है और नोक ई में इंजेक्शन साइट इंगित करता है। (बी, एफ) Hematoxylin- और कैंसर के साथ जुड़े वृद्धि हुई cellularity के क्षेत्रों दिखा प्राथमिक (बी) के eosin से सना हुआ आयल वर्गों और engrafted erms (एफ)। (सी,DAPI डाई अपवर्जन द्वारा मूल्यांकन और प्रवाह cytometry के रूप में जी) सेल व्यवहार्यता। (डी, एच) फ्लोरोसेंट ट्यूमर सेल उप आबादी, प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन के रूप में। स्केल सलाखों 2 मिमी (ए, ई) और 50 माइक्रोन (बी, एफ) के बराबर हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1
मांसपेशियों और erms सेल प्रत्यारोपण के लिए तालिका 1. engraftment का परिणाम है। (*) पहले से ही तकनीक 23 का उपयोग कर डेटा की सूचना दी अर्थ। डाटा तरीके प्रकृति से अनुमति के साथ reprinted है। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

वयस्क पृष्ठीय कंकाल की मांसपेशी के कुशल और मजबूत engraftment rag2 समयुग्मक उत्परिवर्ती मछली के पृष्ठीय मांसलता में कोशिकाओं के इंजेक्शन द्वारा पीछा एक बहुत ही साधारण सेल तैयारी विधि के साथ प्राप्त किया गया था। कुछ जुड़े मौत तुरंत 10% से 35% प्रयोग के आधार पर करने के लिए लेकर आरोपण प्रक्रिया के बाद से सामान्य में, इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन प्रक्रियाओं, बहुत मजबूत थे। अतिरिक्त अनुकूलन की संभावना कोशिकाओं दाखिल की आसानी सुविधा होगी जो इंजेक्शन और एक माइक्रोस्कोप और micromanipulator का उपयोग स्थिर इंजेक्शन तंत्र के विकास के लिए छोटे गेज सुई, के उपयोग पर केंद्र होगा। हमारा दृष्टिकोण भी दाता जानवरों से unsorted मांसपेशियों की कोशिकाओं का इस्तेमाल किया और केवल लगभग 30% की मांसपेशी पूर्वज कोशिकाओं निहित। संभावना प्राप्तकर्ता मछली में वृद्धि हुई engraftment के लिए नेतृत्व कि समृद्ध सेल निलंबन प्रदान करेगा स्टेम कोशिकाओं और FACS अलगाव लेबल कि ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइनों का प्रयोग करें। कंकाल की मांसपेशी गपहले से 29 के रूप में वर्णित एल भी, समृद्ध और प्रत्यारोपण के लिए सुसंस्कृत पूर्व किया जा सकता है। उल्लेखनीय है, हमारे परिणाम भी 10 दिनों पेशी engraftment और उत्थान का आकलन करने के लिए एक मजबूत और तेजी से प्रयोगात्मक मंच के रूप में इस मॉडल की स्थापना, प्रत्यारोपण पोस्ट करने से पहले आला स्थापना और दाता मांसपेशियों के ऊतकों के भेदभाव के इस कदम होती है कि संकेत मिलता है। इसके अलावा, इन प्रयोगों के परस्पर विरोधी cardiotoxin या बेरियम क्लोराइड के साथ पेशी के पूर्व चोट 30,31 engraftment करने से पहले दो दिनों के लिए आवश्यक है, जहां चूहों, में पूरा उन के साथ इसके विपरीत। यह प्रत्यारोपण प्रक्रिया के दौरान उत्पादन सुई चोट प्राप्तकर्ता पशु 32,33 के भीतर एक पुनर्योजी पर्यावरण के उत्पादन प्रेरक द्वारा engraftment potentiates कि संभावना है। हम भी जल्दी कंकाल की मांसपेशी विकास को प्रभावित करने वाले आनुवंशिक परिवर्तन के आकलन के लिए अनुमति देता है, हमारे विधि आसानी से युवा zebrafish से कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों के प्रत्यारोपण के लिए अनुकूलित किया जाएगा कि कल्पनालेकिन लार्वा चरणों में मारक पैदा होती हैं।

हम भी गैर-वातानुकूलित, rag2 समयुग्मक उत्परिवर्ती मछली में intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा zebrafish erms के engraftment के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान की है। यह दृष्टिकोण एक syngeneic ट्रांसजेनिक लाइन के भीतर ट्यूमर पैदा करने के लिए आवश्यकता के बिना डबल ट्रांसजेनिक प्राथमिक ट्यूमर के विस्तार के लिए उपयोगी था। हमारे हाल ही में काम कोशिका प्रत्यारोपण दृष्टिकोण एक ही ट्यूमर जानवरों के हजारों में विस्तार और विकास, आत्म नवीकरण, और neovascularization 15 पर प्रभाव के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है, जहां इन विवो में erms दवा संवेदनशीलता का आकलन करने के उपन्यास प्रयोगात्मक मॉडल उपलब्ध कराते दिखाया है। इसके अलावा, हम सफलतापूर्वक टी सेल तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया, मेलेनोमा, और erms 23 सहित rag2 समयुग्मक उत्परिवर्ती मछली में ट्यूमर की एक विस्तृत श्रृंखला engrafted है। भविष्य की ओर देख रहे हैं, हम इन पंक्तियों में कैंसर के महत्वपूर्ण कार्यात्मक संपत्तियों का आकलन करने के लिए उपयोगी हो जाएगा कल्पनाइंट्रा-tumoral विविधता, आक्रमण, मेटास्टेसिस, एंजियोजिनेसिस, और चिकित्सा प्रतिरोध का आकलन करने सहित vivo। इसके अलावा, ऑप्टिकली स्पष्ट कैस्पर तनाव zebrafish 34 में rag2 समयुग्मक उत्परिवर्ती मछली की पीढ़ी की संभावना कैंसर के इन पहचान के कई के प्रत्यक्ष इमेजिंग सुविधा होगी।

कुल में, हम में वयस्क rag2 समयुग्मक उत्परिवर्ती प्रतिरक्षा समझौता किया zebrafish करने के लिए सामान्य से लेबल-fluorescently और घातक कंकाल की मांसपेशी के सफल engraftment के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Acknowledgments

इस काम फाउंडेशन (DML), अमेरिकन कैंसर सोसायटी (DML), MGH हावर्ड गुडमैन फैलोशिप (DML), और अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान स्टैंड एलेक्स नींबू पानी के द्वारा समर्थित है R24OD016761 और 1R01CA154923 (DML)। CNY फ्लो कोर और फ्लो छवि विश्लेषण, साझा इंस्ट्रूमेंटेशन अनुदान संख्या 1S10RR023440-01A1। आईएमटी विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए पुर्तगाली फाउंडेशन (- एफसीटी Fundação पैरा एक Ciencia ई Tecnologia) से एक फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित है। क्यूटी चीन छात्रवृत्ति परिषद द्वारा वित्त पोषित है। हम उसे उपयोगी टिप्पणी और सलाह के लिए एंजेला Volorio धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris-EDTA buffer solution 1x Sigma-Aldrich 93283-100ML Microinjection. Injection mix.
Potassium Chloride Fisher Science Education S77375-1 Microinjection. Injection mix.
XhoI Restriction Enzyme New England Biolabs R0146S Microinjection. Plasmid linearization.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 (50) or 28106 (250) Microinjection. For purification of linearized plasmid up to 10 kb.
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol Fisher Scientific BP1753I-100 Microinjection. For purification of linearized plasmid.
UltraPure Agarose, 500 g Invitrogen 16500-500 Microinjection. Linearized plasmid quantification.
Nanodrop 2000 Spectrophotometer Thermo Scientific http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx Microinjection. Linearized plasmid quantification.
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) Life Technologies D1306 flow cytometry/FACS
5 ml polystyrene round bottom tube BD Falcon 352058 flow cytometry collection tube
BD FACSAria II BD Biosciences Special Order Research Products (SORP) program FACS
5 ml polypropylene round bottom tube BD Falcon 352063 FACS collection tube
BD LSR II BD Biosciences Special Order Research Products (SORP) program flow cytometry
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x) Life Technologies 10010-023 transplantation
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-01 transplantation
Tricaine methanesulphonate (MS-222) Western Chemical Inc. http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html Transplantation. Anesthetic. Caution: Irritant. Irritating to eyes, respiratory system, and skin.
VWR Absorbent Bench Underpads VWR 56616-018 Transplantation. Regular paper towels or sponge can be used as an alternative.
Singe Edge Industrial Razor Blades VWR 55411-050 transplantation
Petri Dish, Polystryrene Disposable Sterile VWR 25384-302 transplantation
Cell Strainer, 40 µm Nylon Falcon-Corning Incorporated 352340 transplantation
50 ml Centrifuge Tube Corning Incorporated 430828 transplantation
Trypan Blue Stain (0.4%) Life Technologies 15250-061 transplantation
Hemacytometer Set  Hausser Scientific 1483 transplantation
Hamilton syringe, fixed needle, volume 10 µl, needle size 26s ga (bevel tip) Hamilton 80366 transplantation
Austin's A-1 Bleach, Commercial James Austin Company Transplantation. Any commercial solution can be used.
Ethanol 190 Proof Decon Labs, Inc. DSP-MD.43 Microinjection (linearized plasmid purification) and transplantation. Any commercial  solution can be used.
High Speed Microcentrifuge, 300D Digital Microcentrifuge Denville Scientific Inc. C0265-24 transplantation
Sorvall Legend XFR Centrifuge Thermo Scientific 75004539  Transplantation. Catalog number for 120 V, 60 Hz (US).
5 ml serological pipets BD Falcon 357529 transplantation
Corning Stripettor Plus Pipetting Controller Corning Incorporated 4090 Transplantation. Any automatic pipetting controller can be used.
Powder free examination gloves All steps. Any commercial brand can be used.
Filter pipet tips and micropipettes All steps. Any commercial brand can be used.
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11205-20 transplantation
Fluorescent Stereomicroscope Olympus MVX10 Scoring. Any appropriate fluorescent stereomicroscope can be used.
Olympus DP72 microscope digital camera Olympus DP72 Scoring. Multiple adequate cameras for the selected imaging system can be used.

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 94 zebrafish प्रतिरक्षा समझौता किया प्रत्यारोपण मांसपेशियों rhabdomyosarcoma, फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक
इम्यून से समझौता वयस्क zebrafish में सामान्य और घातक मांसपेशी कोशिका प्रत्यारोपण
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Tenente, I. M., Tang, Q., Moore, J. C., Langenau, D. M. Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (94), e52597, doi:10.3791/52597 (2014).

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