Abstract
Sebrafisk har blitt et kraftig verktøy for å vurdere utvikling, gjenfødelse, og kreft. Mer nylig har allograft celle transplantasjon protokoller blitt utviklet som tillatelse engraftment av normale og maligne celler i bestrålt, syngent, og immun kompromittert voksen sebrafisk. Disse modellene når kombinert med optimaliserte celle transplantasjon protokoller tillate for rask vurdering av stamcellefunksjonen, regenerering etter skade, og kreft. Her presenterer vi en metode for celle transplantasjon av sebrafisk voksen skjelettmuskulatur og embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), en pediatrisk sarkom som deler egenskaper med embryonale muskler, inn immun kompromittert voksen rag2 E450fs homozygot mutant sebrafisk. Viktigere er disse dyr mangler T-celler og har redusert B-celle-funksjon, tilrettelegging for innpoding av et bredt spekter av vev fra ubeslektede donordyrene. Våre optimaliserte protokoller viser at fluoresceinmerket muskelcelle preparasjon fra α-aktin-RFP transgen sebrafisk innpode robust når implantert i ryggmuskulaturen av rag2 homozygot mutant fisk. Vi viser også engraftment av fluorescerende-transgen ERMS hvor fluorescens er begrenset til celler basert på differensiering status. Spesifikt ble ERMS opprettet i AB-stamme myf5-GFP; mylpfa-mCherry doble transgene dyr og tumorer injisert i peritoneum til voksen immun kompromittert fisk. Anvendeligheten av disse protokollene strekker seg til innpoding av et bredt spekter av normale og maligne donorceller som kan bli implantert inn i ryggmuskulaturen eller i peritoneum fra voksne sebrafisk.
Introduction
Sebrafisk er en utmerket modell for regenerative studier fordi de kan regenerere amputert finnene, samt en skadet hjerne, retina, ryggmarg, hjerte, skjelettmuskel og andre vev 1. Stamcelle og regenerative studier i voksen sebrafisk har i stor grad fokusert på karakterisering av regenerering i respons til skade, mens identifisering av stamceller og stamceller fra ulike vev av celletransplantasjon har bare nylig blitt utforsket to. Sebrafisk har også blitt anvendt for undersøkelse av kreft gjennom generering av transgene cancermodeller som etterligner human sykdom 3-10.
I innstillingen av kreft, har celletransplantasjon tilnærminger blitt allment vedtatt og tillate dynamisk vurdering av viktige kreft prosesser, inkludert selvfornyelse 11, funksjonell heterogenitet 12,13, neovascularization 14, spredning,terapi responser 15, og invasjon 16,17. Imidlertid er innpodet celler ofte avvist fra mottaker fisk på grunn av å være vert for immunforsvaret som angriper og dreper pode 18. Flere metoder er blitt brukt for å overvinne avvisning av transplantert celler. For eksempel, kan mottaker dyr immunsystem bli forbigående ablated av lavdose gamma-bestråling før transplantasjonen 18,19. Imidlertid vil mottakeren immunsystemet gjenopprette etter 20 dager etter bestråling og drepe donorceller 18. Alternativt har deksametason behandling blitt anvendt for å undertrykke T og B-cellefunksjonen, noe som gir lengre immunundertrykkende kondisjonering og tilrettelegging for innpoding av et bredt spekter av humane tumorer i opptil 30 dager 14. Disse eksperimentene krever konstant medikamentdosering og er begrenset til å studere fra solide tumorer. Langsiktige engraftment analyser har brukt genetisk identiske syngene linjene 20-22, hvor donor og recipient celler er immune matchet. Men disse modellene krever transgene linjer av interesse å bli krysset inn i syngent bakgrunnen for mer enn fire generasjoner til å produsere fullt syngene linjer. For å unngå problemer med immunavstøtning i mottaker fisk, har gruppen vår nylig utviklet en immun kompromittert rag2 E450fs homozygote mutante (ZFIN allel betegnelse rag2 FB101) linje som har redusert T- og B-celle-funksjon, og som tillater innpoding av et bredt spekter av vev 23. Lignende svekket immunforsvar musemodeller har vært brukt mye for celle transplantasjon av mus og menneskelig vev 24.
Her presenterer vi metoder for transplantasjon av skjelettmuskulatur og embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), en pediatrisk sarkom som deler egenskaper med muskel-skjelettlidelser, i den nylig beskrevet rag2 homozygot mutant sebrafisk. Tilgjengeligheten av en immun kompromittert voksen sebrafiskutvider vår evne til å utføre store celle transplantasjon studier for å direkte visualisere og vurdere stamcelleselvfornyelse innenfor normale og maligne vev. Med denne metoden, fluoresceinmerket muskelcellepreparater fra voksen α-aktin-RFP 25 transgen sebrafisk robust innpode i rag2 homozygot mutant sebrafisk etter injeksjon i ryggmuskulaturen. Videre viser vi engraftment og utvidelse av primær myf5 -GFP; mylpfa- mCherry transgene ERMS følgende intraperitoneal injeksjon i rag2 E450fs homozygot mutant sebrafisk. Nytten av disse protokollene går utover de viste eksempler og enkelt kan brukes til flere sebrafisk regenerative vev og kreft.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Massachusetts General Hospital underkomité på Forsknings Animal Care under protokoll # 2011N000127.
Seksjon 1. Skeletal Muscle Cell Transplantasjon inn Adult rag2 E450fs Homozygot Mutant Sebrafisk
1. Utarbeidelse av Adult sebrafisk Donor skjelettmuskelceller
- Skaff transgen voksen sebrafisk som har fluoresceinmerket muskel. I dette eksperiment ble 30 α p-aktin-RFP donorfisk 25 anvendes for å transplantere en 6 x 10 celler pr mottaker fisk.
- Sacrifice donor sebrafisk i 1,6 mg / ml Tricaine metansulfonatet (MS222) i 10 min eller til det ikke operculum bevegelse er tydelig.
- Plasser donor fisk på absorberende tørkepapir og avgiftsdirektoratet ryggmuskelen ved hjelp av en ren barberblad. Bør gjøres kuttet nær anus i en 45 ° vinkel for å maksimere vev samling (som nevnt i figur 1A
- Legg 500 ul suspensjon buffer (på forhånd avkjølt 0,9x fosfatbuffer saltvann (PBS) supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS)) til den dissekerte vev. Opptil 10 donor sebrafisk kan plasseres sammen i dette volumet.
- Hakke vevet med et barberblad> 20 ganger inntil cellene er i en jevn suspensjon. Hele ryggmuskulaturen er homogenisert inkludert hud, bein og svømmeføtter. Tilsett 2 ml suspensjonsbuffer. Ved hjelp av en 5 ml pipette, finfordel cellesuspensjonen ≥20 ganger for å distansere celler.
- Filtrer cellesuspensjonen gjennom en 40 pm sikt sil inn i en 50 ml konisk rør plassert på is.
- Vask petriskål med ytterligere 2,5 ml suspensjon buffer for å samle gjenværende vev og filtrer gjennom samme sil og konisk rør, til et sluttvolum på 5 ml (10 donorfisk kan brukes per isolat).
MERK: Hud, bein og finnene vil bli ekskludert etter filtrering. Hvis det er aktuelt, kan du kombinere lignende suspensjoner i samme konisk tube. - Telle det totale antall levedyktige celler ved hjelp av trypan-blått fargestoff og et hemocytometer.
- Book 500 ul i flowcytometri, hvis ønskelig (valgfritt, trinn 2).
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 1000 xg, i 10 min, ved 4 ° C.
- Kast supernatant og resuspender celler på 3,33 x 10 5 celler / mikroliter (0,9x PBS + 5% FBS). Totalt vil tre ul injiseres per mottaker fisk for totalt 1 x 10 6 celler per mottaker (trinn 3).
MERK: Mindre enn 3 mL av cellesuspensjonen skal bli transplantert inn i mottakeren fisk. Hvis celleantall er begrensende, kan så lite som 5 x 10 4 celler pr mottaker føre til vellykket innpoding (tabell 1).
2. flowcytometrisystemer Analyse av Donor Skeletal Muscle Cell Forberedelse (valgfritt)
- Isolere muskel fra en vill-type, ikke-transgen fisk som beskrevet in trinn 1.1. Denne prøve tjener som den negative kontroll, og er nyttig for å sette flowcytometrisystemer porter.
- Legg en passende levedyktighet fargestoff. For eksempel legge 5 mL av lager DAPI løsning (500 ng / mL) til 500 mL av muskel forberedelse. Vortex litt før analyse. Erverve 5 x 3 til 1 oktober x 10 4 hendelser. Analyser villtypekontrollprøver først å plassere porter, etterfulgt av analyse av muskel-celler isolert fra transgene fisken.
MERK: Flow-cytometri-analyse utføres vanligvis i løpet av 1 time etter at muskelvevet disseksjon, i løpet av hvilken tid de dissekerte cellene beholder mer enn 60% levedyktighet (figur 2). Celler bør holdes på is til alle tider. Totalt celle-levedyktighet kan gjen vurderes før transplantasjon ved hjelp av trypan-blått fargestoff og et hemocytometer.
3. Intramuscular Transplantasjon av skjelettmuskelceller i voksen rag2 Homozygot Mutant Sebrafisk
- Rengjøre en 10 μ; L 26S G mikro-sprøyte ved å trekke inn og kaste ut 10% blekemiddel (5 ganger), etterfulgt av 70% etanol (5 ganger), og deretter etterfulgt av suspensjonsbuffer (0,9x PBS + 5% FBS, 10 ganger).
- Bedøve 2-4 måneder gamle homozygot rag2 mutant fisk eller villtype mottaker fisk (som kontroller) ved å tilsette enkeltdråper Tricaine metansulfonat (MS222, 4 mg / ml stamløsning) i en petriskål inneholdende fisk i systemet vann inntil operculum langsomme bevegelser og fisk er fremdeles.
MERK: Dose of Tricaine anestesi vil avhenge av alder og størrelse på mottakerens sebrafisk. - Plasser bedøvet mottaker sebrafisk på en fuktig papir håndkle eller svamp, med den venstre siden vendt opp.
- Stikk sprøytespissen inn i latero-ryggmuskulaturen (se figur 1A). Sikre at injeksjoner er utført i 45 ° vinkel. Injiser 3 mL av cellesuspensjonen (fremstilt i trinn 1.12) per fisk for totalt 1 x 10 6 celler pr mottaker.
- Overføre nøye injisert sebrafisk i en ren tank med en plastskje til å komme seg.
- Vurdere mottaker sebrafisk for engraftment priser på 10, 20, 30 dager etter transplantasjon av tenkelig bedøvet fisk under lyse felt og epifluorescence mikroskopi.
Seksjon 2. Embryonalt rhabdomyosarcoma (ERMS) Transplantasjon inn Adult Homozygot rag2 Mutant Sebrafisk
4. DNA Mikroinjeksjon av Sebrafisk embryoer
- Linearisere rag2-kRASG12D plasmid 7 ved å spalte 10 pg av DNA med Xhol, ved 37 ° C i 6 timer, eller O / N.
- Rense DNA ved standard fenol: kloroform ekstraksjon og bunnfall med etanol. Resuspender i 20 mL deionisert vann (alternativt kommersielle DNA-fragment Rensing av kolonner kan benyttes).
- Kjør ufordøyet og fordøyd DNA på en 1% agarosegel, og bestemme konsentrasjonen av DNA-by spektrometer lesing. Alternativt kan kjøre prøver på 1: 1, 1: 5 og 1:10 fortynninger på en 1% agarosegel og kvantifisere sammenlignet med et DNA-stige.
- Tilberede en injeksjonsblanding ved en sluttkonsentrasjon på 15 ng / ul av spaltet rag2-kRASG12D DNA i 0,1 M KCl og 0,5x Tris-EDTA. Den endelige DNA-mengden injisert i 2 nl injeksjonsvolum vil være 30 s.
MERK: Opp til tre ulike DNA-konstruksjoner kan være effektivt co-injisert i maksimalt 60 pg av DNA per embryo. Disse transgener blitt integrert i genomet og ko-uttrykt i tumorfremkall 26. - Injisere linearized rag2-kRASG12D i ett-celle trinns embryoer vesentlige som beskrevet 27 inn i en sebrafisk stamme av interesse (figur 1B). Injeksjoner skal utføres i cellen og ikke i eggeplomme for høyere effektivitet. I dette eksperimentet ble en dobbelt transgen AB-stamme; myf5-GFP, ble mylpfa-mCherry anvendes. Hev sebrafisk ved hjelp av standard oppdrett protocols 28.
MERK: Injeksjon overlevelse er ofte avhengig av sebrafisk belastning brukt. I gjennomsnitt vil 30% av injisert embryoer utvikler ERMS. 300-600 embryoer skal injiseres per forsøk for å sikre at et tilstrekkelig GFP-positive og mCherry-positive primære tumorer er generert for transplantasjon og analyse.
5. Screening for Primær ERMS i Sebrafisk Larver
- Observere injisert sebrafisk fra 10 til 30 dager etter injeksjonen for fremveksten av eksternt synlige primære ERMS.
- Ved 30 dager etter injeksjon, bedøve mottaker sebrafisk ved å tilsette enkeltdråper Tricaine metansulfonat (MS222 4 mg / ml stamløsning) i en petriskål inneholdende fisk system vann inntil operculum bevegelser langsom og fisk er likevel.
MERK: Dose of Tricaine anestesi vil avhenge av alder og størrelse på mottakerens sebrafisk. Primærtumorbærende sebrafisk kreve lavere doser av Tricaine. - Velg primær ERMS bærendefisk som er myf5-GFP -positivt og mylpfa-mCherry -positivt, ved hjelp av en epifluorescence mikroskop.
6. ERMS Tumor Forberedelse
- Ofre utvalgt primær ERMS bærende sebrafisk i 1,6 mg / ml Tricaine metansulfonatet (MS222) i 10 min eller til det ikke operculum bevegelse er tydelig.
- Behandle hver svulst bærende sebrafisk separat. Plassere fisken i en ren petriskål og dissekere rundt svulsten ved hjelp av et barberblad og fin pinsett (som vist på figur 1B). Overfør dissekert tumorvev på en ren petriskål.
- Tilsett 100 ul av på forhånd avkjølt 0,9x fosfatbuffer saltvann (PBS) supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS). Kjøttdeig vev med et rent barberblad> 20 ganger til cellene er i en ensartet suspensjon.
- Legg 900 mL av samme buffer (0,9x PBS + 5% FBS), pipette opp og ned flere ganger for å distansere celler ved hjelp av en 1000 mL filtrert pipettespissen. Filtrer gjennom en 40 &# 956; m sil til den tilsvarende 50 ml konisk rør. Lagre på is.
- Vask petriskål med en ytterligere 2-4 ml buffer, og passerer gjennom samme sil og inn i den tilsvarende konisk rør.
- Sentrifuger ved 1000 x g, i 10 min, ved 4 ° C.
- Fjern supernatant og resuspender i 100 ul buffer.
- Telle det totale antall levedyktige celler ved hjelp av trypan-blått fargestoff og et hemocytometer.
- Fortynn cellene til ønsket konsentrasjon i den samme buffer (0,9x PBS + 5% FBS). Celler bør fortynnes til 5 x 10 3 celler / mL for omplanting 5 ul pr mottaker sebrafisk i totalt 2,5 x 10 4 celler pr mottaker.
- Strømningscytometri-analyse kan også utføres med en liten mengde av suspensjonen fra trinn 6,5 til kvantisere de relative forhold av fluorescerende celler i prøven.
MERK: Sett til side 100 mL av cellesuspensjon (etter filtrering i trinn 3.5) og fortynn med 400 mLav 0,9x PBS + 5% FBS suspensjon buffer for flowcytometrisystemer analyse. For å sikre riktig separasjon, foreta ytterligere analyse ved hjelp av enkelt transgen svulstvev eller muskel isolert fra voksen villtype, myf5-GFP og mylpfa-mCherry fisk. Utføre flowcytometrisystemer vesentlige som beskrevet i trinn 2 av seksjon 1.
7. Transplantasjon av ERMS inn Adult rag2 Homozygot Mutant Sebrafisk
- Rense en 10 pl 26S G mikro-sprøyte ved å trekke inn og kaste ut 10% blekemiddel (5 ganger), etterfulgt av 70% etanol (5 ganger), og deretter etterfulgt av suspensjonsbuffer (0,9x PBS + 5% FBS, 10 ganger ).
- Bedøve mottaker homozygot rag2 mutant fisk ved å tilsette enkeltdråper Tricaine metansulfonat (MS222 4 mg / ml stamløsning) i en petriskål inneholdende fisk i systemet vann inntil operculum bevegelser er langsomme og fisk er likevel.
- Plasser bedøvet mottaker sebrafisk på en våt papirhåndkle eller sponge, med den ventrale siden opp.
- Injiser 5 ul av cellesuspensjonen inn i det peritoneale hulrom (2,5 x 10 4 celler pr mottaker).
MERK: kanylen bør rengjøres mellom injeksjoner av ulike svulster som beskrevet i trinn 4.1. 5 til 10 ul effektivt kan transplanteres intraperitonealt, avhengig av mottakerens fiskestørrelse. Tumor innpoding kan oppnås ved injisering av 1 x 4-5 oktober x 10 5 celler per usorterte mottaker fisk (tabell 1). - Plassere mottakeren sebrafisk nøye inn i en ren tank med en plastskje.
- Vurdere mottaker sebrafisk for engraftment priser på 10, 20, 30 dager etter transplantasjon av tenkelig bedøvet fisk under lyse felt og epifluorescence mikroskopi.
- Utnytte innpodet fisk for nedstrøms applikasjoner, inkludert fluorescensaktivert Cell Sorting (FACS) for å vurdere differensiering status (figur 3 H), standard histologisk analysis (Figur 3F), bildebehandling terapi responser 15, og / eller serie transplantasjon tilnærminger inkludert begrenset utvanning analyse 11.
Representative Results
En prosedyre for å forberede og transplantere skjelettmuskelceller fra α-aktin-RFP transgene givere i immun kompromittert homozygot rag2 mutant sebrafisk har blitt demonstrert (protokoll avsnitt 1, Figur 1A og figur 2). Skjelettmuskelvevet ble fremstilt fra α-aktin-RFP transgene givere og den resulterende enkeltcelle-suspensjon inneholdt 84,3% av levedyktige celler som vurdert av DAPI utelukkelse følgende flowcytometrisystemer analyse (figur 2B). RFP-positive celler omfattet 35,3% av enkeltcellesuspensjonen (figur 2C). Transplantasjon av celler i den dorsale skjelettmuskel av rag2 homozygote mutante mottaker fisk ført til konsekvent og sterk innpoding vurdert ved differensiering av enkeltceller i multinucleated fibre (1 x 10 6 celler injisert per fisk, Tabell 1, figur 2D-I). Wild typenmottaker fisken ikke klarte å innpode muskelfibre over 30-dagers eksperiment (n = 13). Etter 10 dager etter transplantasjon, 9 av 14 rag2 homozygot mutant sebrafisk inneholdt RFP-positive muskelfibre i nærheten injeksjonsstedet (64.3%, 2E F). Viktigere, innpodet RFP-positive muskel varte 30 dager etter transplantasjon (fig 2G-I), med en undergruppe av dyr som blir fulgt i 115 dager etter innpodingen og utviser sterk og vedvarende muskel innpoding (data ikke vist). Disse resultatene er lik de som tidligere er rapportert av vår gruppe 23 ved bruk av samme protokoll (tabell 1).
Vi har også presentert en metode for generering, forberedelse og transplantasjon av ERMS tumorceller i bukhulen av rag2 homozygote mutante mottaker fisk (protokoll Section 2, figur 1B og Figur 3). ERMS ble generert i dobbee transgen myf5-GFP; mylpfa-mCherry fisk som har blitt vist for å tillate visualisering av intra-tumoral heterogenitet og funksjonell analyse av tumorcellepopulasjoner etter transplantasjon 11.. Imidlertid er ytterligere molekylær karakterisering av hver undergruppe vanskelig fordi fisk er små når de utvikler ERMS mellom 10 til 30 dager av livet og antall kreftceller er begrensende for nedstrøms applikasjoner. En løsning er å utvide svulst celle tall ved engrafting ERMS inn i voksen mottaker sebrafisk. Hittil har lignende eksperimenter er gjennomført ved hjelp av CG1-belastning syngent fisk og krevde i overkant av fire generasjoner av tilbakekryssing å utvikle syngene linjene som var transgen for myf5-GFP; mylpfa-mCherry. For å omgå disse problemene, demonstrerte vi nytten av immun kompromittert rag2 homozygot mutant mottaker sebrafisk for å innpode primære ERMS fra en AB-belastning sebrafisk. Alle primær ERMS innpodet i rag2 homozygote mutante dyr, som letter ekspansjon av tumor (Tabell 1). Lignende resultater ble nylig rapportert hvor 24 av 27 rag2 homozygot mutant sebrafisk innpodet ERMS, mens 0 av 7 villtype søsken innpodet sykdom 23. Et representativt eksempel på en innpodet ERMS er vist ved 30 dager etter transplantasjon i figur 3E. Innpodet ERMS dele histologiske trekk ved embryonal rhabdomyosarcoma, lik den som finnes i primærtumor (Figur 3B og 3F). FACS analyse bekreftet at ERMS inneholdt funksjonelt tydelig svulst formeringsmateriale celler og differensierte celler som uttrykker myf5-GFP og / eller mylpfa-mCherry. Overlevelsesprosenten etter den intraperitoneale injeksjonsprosedyren var i overkant av 95%. Mottaker sebrafisk ofte bukke fra tumorbelastning etter 30 dager etter transplantasjon tidspunkt.
Figur 1. Protokoll skjematisk for (A) normale og (B) ondartet skjelettmuskelcelletransplantasjon i rag2 homozygote mutante sebrafisk. Valgfritt trinn er merket med (*).
Figur 2. Skjelettmuskulatur engraftment inn rag2 homozygot mutant sebrafisk. (A) α-aktin-RFP transgen donor sebrafisk. (B) Cellenes levedyktighet av isolerte muskelcellesuspensjon som vurdert av DAPI fargestoff eksklusjon og flowcytometri. (C) Andel RFP-positive celler ble funnet i muskelcellesuspensjon fra α-aktin-RFP donor (rød), sammenlignet med en vill-type kontroll(Grå). (DE) fusjonerte lyse felt og fluorescerende bilder av villtype dyr (D) eller rag2 homozygot mutant fisk (E) 30 dager etter transplantasjon. (F) engraftment priser over tid. Red betegner antall innpodet dyr mens grå viser non-innpodet fisk. Antall dyr som ble analysert ved hvert tidspunkt er indikert. (GI) høy forstørrelse bilder av eske region i panelet E vist ved 10 (G), 20 (H) og 30 (I) dager etter transplantasjon, viser oppbevaring av differensierte muskelfibre over tid (pilspisser). Skala barer lik 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Transplantasjon av myf5-GFP, mylpfa-mCherry ERMS inn rag2 homozygot mutant . sebrafisk (AD) rag2-kRASG12D indusert primære ERMS som oppstår i AB-belastning myf5-GFP; mylpfa-mCherry sebrafisk på 30 dager av livet. (EH) rag2 homozygot mutant sebrafisk innpodet med ERMS og analysert 30 dager etter transplantasjon. (A, E) Sammenslåtte lyse felt og fluorescerende bilder av primære og transplanterte ERMS. Svulst området er skissert og pilspiss indikerer injeksjonsstedet i E. (B, F) Hematoxylin- og eosin-farget parafinsnitt av primær (B) og innpodet ERMS (F) viser områder med øket cellularitet assosiert med kreft. (C,G) Celleviabilitet som vurderes av DAPI fargestoff utstøting og flowcytometri. (D, H) Fluorescent tumorcelleunderpopulasjoner, som vurderes av flowcytometri. Skala barer lik 2 mm (A, E) og 50 mikrometer (B, F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. engraftment resultater for muskel og ERMS celletransplantasjon. (*) Angir tidligere rapportert data ved hjelp av de samme teknikkene 23. Dataene er gjengitt med tillatelse fra Nature Methods. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Discussion
Effektiv og robust innpoding av voksen dorsal skjelettmuskel ble oppnådd med en meget enkel celle fremstillingsmetode etterfulgt av injeksjon av celler i den dorsale muskulaturen rag2 homozygote mutante fisk. Generelt, intramuskulære injeksjonsprosedyrer var meget robust, med noen assosiert død umiddelbart etter implantering prosedyre, som strekker seg fra 10% til 35%, avhengig av forsøket. Ytterligere optimalisering vil trolig dreie seg om utnyttelse av mindre måle nåler for injeksjon og utvikling av stasjonær injeksjonsapparat ved hjelp av et mikroskop og micromanipulator, noe som vil legge til rette for enkel implantere celler. Vår tilnærming også brukt usorterte muskelceller fra donordyr og inneholdt bare ca. 30% muskel stamceller. Bruk av transgene reporter linjer som etikett stamceller og FACS isolasjon vil trolig gi beriket cellesuspensjoner som fører til økt engraftment til mottaker fisk. Skjelettmuskulatur calen kan også anrikes og dyrket før transplantasjon, som tidligere beskrevet 29. Bemerkelsesverdig, våre resultater tyder også på at trinnene nisje etablering og differensiering av donor muskelvev skje før 10 dager etter transplantasjonen, etablere denne modellen som en robust og rask eksperimentell plattform for å vurdere muskel engraftment og regenerering. Videre disse eksperimentene tydelig kontrast med de som fullførte i mus, der pre-skade av muskel med Cardiotoxin eller bariumklorid kreves to dager før engraftment 30,31. Det er sannsynlig at nålen skade som produseres under transplantasjon prosedyre potenserer innpoding ved å stimulere produksjonen av en regenerativ miljø innenfor mottakerens dyret 32,33. Vi ser også at vår metode vil være lett tilpasses til transplantasjon av skjelettmuskulatur vev fra yngre sebrafisk, slik vurdering av genetiske mutasjoner som påvirker tidlig skjelettmuskelutviklingmen føre til dødelighet på larvestadiet.
Vi har også gitt en detaljert protokoll for engraftment av sebrafisk ERMS ved intraperitoneal injeksjon i non-condition, rag2 homozygot mutant fisk. Denne fremgangsmåten var nyttig for utvidelse av doble transgene primære tumorer uten behov for generering av tumorer i en syngenisk transgen linje. Vår nylig arbeid har vist at celletransplantasjonsfremgangsmåter tilveiebringe nye eksperimentelle modeller for å vurdere ERMS medikamentsensitivitet in vivo, hvor en enkelt svulst kan utvides inn tusener av dyr og bedømt for effekter på veksten, selvfornyelse, og neovaskularisering 15. Dessuten har vi lykkes innpodet et bredt spekter av svulster i rag2 homozygot mutant fisk inkludert T-celle akutt lymfatisk leukemi, melanom, og ERMS 23. Ser mot fremtiden ser vi for oss disse linjene vil være nyttig for å vurdere viktige funksjonelle egenskaper til kreft ivivo herunder vurdere intra-tumor heterogenitet, invasjon, metastase, angiogenese, og terapi motstand. Videre vil generering av rag2 homozygot mutant fisk i optisk klart Casper belastning sebrafisk 34 sannsynlig rette direkte avbildning av mange av disse kjennetegnene ved kreft.
Totalt gir vi detaljerte protokoller for vellykket engraftment av fluoresceinmerkede normal og ondartet skjelettmuskulatur i til voksen rag2 homozygot mutant immun kompromittert sebrafisk.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av Alex 'Lemonade Stand Foundation (DML), American Cancer Society (DML), MGH Howard Goodman Fellowship (DML), og amerikanske National Institutes of Health gir R24OD016761 og 1R01CA154923 (DML). CNY flowcytometrisystemer Core og Flow Bildeanalyse, delt instrumentering stipend nummer 1S10RR023440-01A1. IMT er finansiert av et fellesskap fra den portugisiske Foundation for Science and Technology (Fundação para en Ciencia e Tecnologia - FCT). QT er finansiert av Kina Scholarship Council. Vi takker Angela Volorio for hennes nyttige innspill og råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-EDTA buffer solution 1x | Sigma-Aldrich | 93283-100ML | Microinjection. Injection mix. |
| Potassium Chloride | Fisher Science Education | S77375-1 | Microinjection. Injection mix. |
| XhoI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0146S | Microinjection. Plasmid linearization. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 (50) or 28106 (250) | Microinjection. For purification of linearized plasmid up to 10 kb. |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | BP1753I-100 | Microinjection. For purification of linearized plasmid. |
| UltraPure Agarose, 500 g | Invitrogen | 16500-500 | Microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx | Microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | flow cytometry/FACS |
| 5 ml polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352058 | flow cytometry collection tube |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | FACS |
| 5 ml polypropylene round bottom tube | BD Falcon | 352063 | FACS collection tube |
| BD LSR II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | flow cytometry |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010-023 | transplantation |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-01 | transplantation |
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Western Chemical Inc. | http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html | Transplantation. Anesthetic. Caution: Irritant. Irritating to eyes, respiratory system, and skin. |
| VWR Absorbent Bench Underpads | VWR | 56616-018 | Transplantation. Regular paper towels or sponge can be used as an alternative. |
| Singe Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | transplantation |
| Petri Dish, Polystryrene Disposable Sterile | VWR | 25384-302 | transplantation |
| Cell Strainer, 40 µm Nylon | Falcon-Corning Incorporated | 352340 | transplantation |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430828 | transplantation |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | transplantation |
| Hemacytometer Set | Hausser Scientific | 1483 | transplantation |
| Hamilton syringe, fixed needle, volume 10 µl, needle size 26s ga (bevel tip) | Hamilton | 80366 | transplantation |
| Austin's A-1 Bleach, Commercial | James Austin Company | Transplantation. Any commercial solution can be used. | |
| Ethanol 190 Proof | Decon Labs, Inc. | DSP-MD.43 | Microinjection (linearized plasmid purification) and transplantation. Any commercial solution can be used. |
| High Speed Microcentrifuge, 300D Digital Microcentrifuge | Denville Scientific Inc. | C0265-24 | transplantation |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | 75004539 | Transplantation. Catalog number for 120 V, 60 Hz (US). |
| 5 ml serological pipets | BD Falcon | 357529 | transplantation |
| Corning Stripettor Plus Pipetting Controller | Corning Incorporated | 4090 | Transplantation. Any automatic pipetting controller can be used. |
| Powder free examination gloves | All steps. Any commercial brand can be used. | ||
| Filter pipet tips and micropipettes | All steps. Any commercial brand can be used. | ||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11205-20 | transplantation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | Scoring. Any appropriate fluorescent stereomicroscope can be used. |
| Olympus DP72 microscope digital camera | Olympus | DP72 | Scoring. Multiple adequate cameras for the selected imaging system can be used. |
References
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29 (11), (2013).
- Boatman, S., Barrett, F., Satishchandran, S., Jing, L., Shestopalov, I., Zon, L. I. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood cells, molecule., & diseases. 51 (4), 271-276 (2013).
- Langenau, D. M., Traver, D., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Yang, H. W., Kutok, J. L., et al. Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish. Cancer Research. , 7256-7262 (2004).
- Patton, E. E., Widlund, H. R., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current Biology. 15 (3), 249-254 (2005).
- Sabaawy, H. E., Azuma, M., Embree, L. J., Tsai, H. -J., Starost, M. F., Hickstein, D. D. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (41), 15166-15171 (2006).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Gene. 21 (11), 1382-1395 (2007).
- Le, X., Langenau, D. M., Keefe, M. D., Kutok, J. L., Neuberg, D. S., Zon, L. I. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
- Park, S. W., Davison, J. M., Rhee, J., Hruban, R. H., Maitra, A., Leach, S. D. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Zhuravleva, J., Paggetti, J., et al. MOZ/TIF2-induced acute myeloid leukaemia in transgenic fish. British journal of haematology. 143 (3), 378-382 (2008).
- Ignatius, M. S., Chen, E. Y., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Suppl Data. Cancer cell. 21 (5), 680-693 (2012).
- Blackburn, J. S., Liu, S., et al. Clonal Evolution Enhances Leukemia-Propagating Cell Frequency. Cancer cell. 25 (3), 366-378 (2014).
- Blackburn, J. S., Langenau, D. M. Zebrafish as a model to assess cancer heterogeneity, progression and relapse. Disease model. 7 (7), 755-762 (2014).
- Zhao, C., Wang, X., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS one. 6 (7), e21768 (2011).
- Chen, E. Y., DeRan, M. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 inhibitors induce the canonical WNT/β-catenin pathway to suppress growth and self-renewal in embryonal rhabdomyosarcoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5349-5354 (2014).
- Yang, X. -J., Cui, W., et al. A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion. PloS one. 8 (4), e61801 (2013).
- Chapman, A., Fernandez del Ama, L., Ferguson, J., Kamarashev, J., Wellbrock, C., Hurlstone, A. Heterogeneous Tumor Subpopulations Cooperate to Drive Invasion. Cell Reports. 8 (8), 1-8 (2014).
- Smith, A. C. H., Raimondi, A. R., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Iyengar, S., Houvras, Y., Ceol, C. J. Screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model. Journal of visualized experiments JoVE. (69), e50086 (2012).
- Mizgireuv, I., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2790 (2011).
- Tang, Q., Abdelfattah, N. S., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature methods. 11, 821-824 (2014).
- Zhou, Q., Facciponte, J., Jin, M., Shen, Q., Lin, Q. Humanized NOD-SCID IL2rg–/– mice as a preclinical model for cancer research and its potential use for individualized cancer therapies. Cancer letters. 344 (1), 13-19 (2014).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental biology. 192 (2), 289-299 (1997).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D. D. D., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), 1-5 (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon PRess. Eugene, OR. (2000).
- Alexander, M. S., Kawahara, G., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors). Muscl, & nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of visualized experiments JoVE. (86), 1-7 (2014).
- Gerli, M. F. M., Maffioletti, S. M., Millet, Q., Tedesco, F. S. Transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration. J Vis Exp. (83), e50532 (2014).
- Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell. The FEBS journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).
- Rowlerson, a, Radaelli, G., Mascarello, F., Veggetti, Regeneration of skeletal muscle in two teleost fish: Sparus aurata and Brachydanio rerio. Cell Tissue Res. 289 (2), 311-322 (1997).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell stem cell. 2 (2), 183-189 (2008).
