Abstract
Zebrafisk har blivit ett kraftfullt verktyg för att bedöma utvecklingen, förnyelse, och cancer. På senare tid har allograft celltransplantationsprotokoll utvecklats som tillåter inympning av normala och maligna celler i bestrålas, syngena, och nedsatt immunförsvar vuxna zebrafisk. Dessa modeller när den kombineras med optimerade celltransplantationsprotokoll möjliggör snabb bedömning av stamcellsfunktion, regeneration efter skada, och cancer. Här presenterar vi en metod för celltransplantation av zebrafisk vuxen skelettmuskel och embryonal rabdomyosarkom (ERMS), en pediatrisk sarkom som delar drag med embryonala muskler, till nedsatt immunförsvar vuxen rag2 E450fs homozygot mutant zebrafisk. Viktigt är dessa djur saknar T-celler och har nedsatt B-cell-funktion, vilket underlättar inympning av ett brett spektrum av vävnader från obesläktade givardjur. Våra optimerade protokollen visar att fluorescensmärkt muskelcell preparsamheten från α-aktin-RFP transgen zebrafisk ympas kraftigt när implanteras i ryggmuskulaturen för rag2 homozygot mutant fisk. Vi visar även inympning av fluorescerande-transgen ERMS där fluorescens är begränsad till celler baserat på differentieringsstatus. Specifikt ERMS skapades i AB-stammen myf5-GFP; mylpfa-mCherry dubbeltransgena djur och tumörer injicerades i peritoneum hos vuxna immun äventyras fisk. Användbarheten av dessa protokoll omfattar inympning av ett brett spektrum av normala och maligna donatorceller som kan implanteras i dorsala muskulatur eller peritoneum hos vuxna zebrafisk.
Introduction
Zebrafisk är en utmärkt modell för regenerativa studier eftersom de kan regenerera amputerade fenor, såväl som en skadad hjärna, retina, ryggmärg, hjärta, skelettmuskel och andra vävnader 1. Stamcells och regenerativ studier i vuxenzebrafisk har till stor del fokuserat på karakterisering av förnyelse som svar på skada, medan identifiering av stamceller och progenitorceller från olika vävnader genom celltransplantation har först nyligen undersökts 2. Zebrafisk har också blivit allt använt för studien av cancer genom generering av transgena cancermodeller som efterliknar människosjukdom 3-10.
I inställningen av cancer, har celltransplantations metoder blir allmänt antagits och tillåta den dynamiska bedömningen av viktiga cancerprocesser inklusive självförnyelse 11, funktionell heterogenitet 12,13, kärlnybildning 14, spridning,terapisvar 15, och invasion 16,17. Men engrafted cellerna ofta avvisas från mottagaren fisk pga värd immunförsvar som angriper och dödar transplantatet 18. Flera metoder har använts för att övervinna avstötning av engrafted celler. Till exempel kan de mottagande djuren immunförsvar vara övergående ablateras med låg dos gammastrålning före transplantation 18,19. Dock kommer mottagaren immunsystemet återhämtar med 20 dagar efter bestrålning och döda givarceller 18. Alternativt har dexametason behandling använts för att hämma T- och B-cellsfunktion, vilket ger längre immun suppressiv konditionering och underlättar inympning av ett brett spektrum av humana tumörer under upp till 30 dagar 14. Dessa experiment kräver ständig läkemedelsdosering och är begränsade för att studera av solida tumörer. Långsiktiga transplantations analyser har använt genetiskt identiska syngena linjerna 20-22, där givaren och recipient celler är immuna matchas. Men dessa modeller kräver transgena linjer av intresse som ska korsas in i syngena bakgrund för mer än fyra generationer att producera fullt syngena linjer. För att undanröja problem av immunavstötning hos mottagaren fisk, har vår grupp nyligen utvecklat en immun äventyras rag2 E450fs homozygot mutant (ZFIN allel beteckning rag2 fb101) linje som har minskat T-cellsfunktion och B och som tillåter inympning av ett brett spektrum av vävnader 23. Liknande immun äventyras musmodeller har använts i stor utsträckning för celltransplantation av mus och mänskliga vävnader 24.
Här presenterar vi metoder för transplantation av skelettmuskulaturen och embryonal rabdomyosarkom (ERMS), en pediatrisk sarkom som delar drag med skelettmuskel, till det nyligen beskrivna rag2 homozygot mutant zebrafisk. Tillgängligheten av en immun äventyras vuxen zebrafiskutökar vår förmåga att utföra storskaliga celltransplantationsstudier för att direkt visualisera och utvärdera stamcellssjälvförnyelse inom normala och maligna vävnader. Med denna metod, fluorescensmärkt preparat muskelcell från vuxen α-aktin-RFP 25 transgen zebrafisk robust inympa i rag2 homozygot mutant zebrafisk efter injektion i ryggmuskulaturen. Dessutom visar vi inympning och expansion av primär myf5 -GFP; mylpfa- mCherry transgena ERMS efter intraperitoneal injektion i rag2 E450fs homozygot mutant zebrafisk. Nyttan av dessa protokoll går utöver de exempel som visas och kan lätt appliceras på ytterligare zebrafisk regenerativa vävnader och cancer.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av Massachusetts General Hospital utskottet för forskning Djurvård, enligt protokollet # 2011N000127.
§ 1. skelettmuskulatur Cell Transplantation in Adult rag2 E450fs Homozygot Mutant Zebrafish
1. Beredning av vuxna zebrafisk Donor skelettmuskelceller
- Skaffa transgen vuxna zebrafisk som fluorescerande har märkt muskler. I detta experiment var 30 α-aktin-RFP donator fisk 25 utnyttjas för att transplantera ett x 10 6 celler per mottagare fisk.
- Offer donatorzebrafisk i 1,6 mg / ml tricaine metansulfonat (MS222) under 10 minuter eller tills ingen operculum rörelse är uppenbar.
- Placera givar fisk på ett absorberande pappersduk och punktskatter ryggmuskeln med en ren rakblad. Snittet bör göras nära anus i 45 ° vinkel för att maximera vävnadssamling (som noterats i Figur 1A
- Lägg 500 pl suspensionsbuffert (förkylt 0.9x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kompletterad med 5% fetalt bovint serum (FBS)) till den dissekerade vävnaden. Upp till 10 givare zebrafisk kan placeras tillsammans i denna volym.
- Finhacka vävnaden med ett rakblad> 20 gånger tills cellerna är i en enhetlig suspension. Hela ryggmuskulaturen homogeniseras inklusive hud, ben och fenor. Lägg 2 ml suspensionsbuffert. Med hjälp av en 5 ml pipett, mal sönder cellsuspensionen ≥20 gånger att dissociera cellerna.
- Filtrera cellsuspensionen genom ett 40 ^ m nät sil in i en 50 ml koniskt rör placerades på is.
- Tvätta petriskål med ytterligare 2,5 ml suspension buffert för att samla in kvarvarande vävnaden och filtrera genom samma sil och koniskt rör, till en slutlig volym av 5 ml (10 donator fisk kan användas per isolat).
OBS: Hud, ben och fenor kommer att uteslutas efter filtrering. Om tillämpligt, kombinera liknande suspensioner i samma koniska rör. - Räkna det totala antalet livskraftiga celler med användning av trypanblått och en hemocytometer.
- Reservera 500 | il för flödescytometri, om så önskas (valfritt, steg 2).
- Centrifugera cellsuspensionen vid 1000 x g, under 10 minuter, vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna vid 3,33 x 10 5 celler / l (0.9x PBS + 5% FBS). Totalt kommer 3 pl injiceras per mottagare fisk för totalt 1 x 10 6 celler per mottagare (steg 3).
OBS: Mindre än 3 l cell suspension ska transplanteras in mottagaren fisken. Om mobilnummer är begränsande, kan så lite som 5 x 10 4 celler per mottagare leda till framgångsrik engraftment (tabell 1).
2. Flödescytometri Analys av Donator skelettmuskulatur Cell Beredning (tillval)
- Isolera muskler från en vild typ, icke-transgen fisk som beskrivs in steg 1.1. Detta prov fungerar som den negativa kontrollen och är användbar för inställning av flödescytometri grindar.
- Lägg en lämplig livskraft färgämne. Till exempel, tillsätt 5 ìl av aktie DAPI lösning (500 ng / l) till 500 fil muskel förberedelser. Vortex något före analys. Förvärva 5 x 3-01 oktober x 10 4 evenemang. Analysera vilda typ kontrollprover första att placera grindar följt av analys av muskelceller isolerade från transgen fisk.
OBS: Flödescytometri analys utförs vanligen inom en timme efter muskelvävnad dissektion, under vilken tid de dissekerade cellerna behålla mer än 60% livsduglighet (figur 2). Celler bör hållas på is hela tiden. Totalt cellviabilitet kan omprövas före transplantation med hjälp trypanblått och en hemocytometer.
3. Intramuskulär Transplantation av skelettmuskelceller i Adult rag2 Homozygot Mutant Zebrafish
- Rengör en 10 μ; L 26S G mikro sprutan genom att dra in och utvisa 10% blekmedel (5 gånger), följt av 70% etanol (5 gånger), och sedan följt av fjädring buffert (0.9x PBS + 5% FBS, 10 gånger).
- Söva 2-4 månader gamla homozygot rag2 mutant fisk eller vildtyp mottagaren fisk (som kontroller) genom att lägga till enstaka droppar tricaine metansulfonat (MS222, 4 mg / ml stamlösning) i en petriskål med fisken i systemet vatten tills gällocket rörelser långsam och fisk är fortfarande.
OBS: Dos av tricaine anestesi beror på ålder och storlek på mottagarens zebrafisk. - Placera sövda mottagare zebrafisk på en fuktig pappershandduk eller svamp, med den vänstra sidan uppåt.
- För in injektionsnålen i latero-dorsala muskulatur (se Figur 1A). Se till att injektioner utförs vid en 45 ° vinkel. Injicera 3 pl av cellsuspensionen (framställd i steg 1,12) per fisk för totalt 1 x 10 6 celler per mottagare.
- Försiktigt överföra injiceras zebrafisk i en ren tank med hjälp av en plastsked att återhämta sig.
- Bedöm mottagare zebrafisk för transplantations priser vid 10, 20, 30 dagar efter transplantation genom avbildning sövda fiskar under ljusa fält och epifluorescensmikroskopi.
§ 2. Embryonal Rabdomyosarkom (ERMS) Transplantation in Adult Homozygot rag2 Mutant Zebrafish
4. DNA mikroinjektion av Zebrafish embryon
- Linjärisera rag2-kRASG12D plasmiden 7 genom att digerera 10 ^ g DNA med Xhol, vid 37 ° C under 6 h eller O / N.
- Rena DNA genom standard fenol: kloroformextraktion och utfällning med etanol. Resuspendera i 20 | il avjoniserat vatten (alternativt kommersiella DNA-fragmentreningskolonner kan användas).
- Kör osmält och klippta DNA: t på en 1% agarosgel och bestämma koncentrationen av DNA-By spektrometer läsning. Alternativt köra prover på en: 1, 1: 5, och 1:10 spädningar på en 1% agarosgel och kvantifiera jämfört med en DNA-stege.
- Förbered en insprutningsblandning vid en slutlig koncentration av 15 ng / ul av digere rag2-kRASG12D DNA i 0,1 M KCl och 0,5x Tris-EDTA. Den slutliga DNA-mängd som injiceras på 2 nl av injektionsvolymen blir 30 pg.
OBS: Upp till tre olika DNA-konstruktioner kan vara effektivt samarbete injiceras i högst 60 pg DNA per embryo. Dessa transgener blir integrerade i genomet och samuttryckt inom utvecklings tumören 26. - Injicera arise rag2-kRASG12D i en cell skede embryon väsentligen såsom beskrivits 27 i en zebrafisk stam av intresse (Figur 1B). Injektioner bör utföras i cellen och inte i äggulan för högre effektivitet. I detta experiment, en dubbel transgen AB-stam; myf5-GFP, var mylpfa-mCherry användas. Höj zebrafisk med standard uppfödning protocols 28.
OBS: Injektions överlevnad är ofta beroende av den zebrafisk stam som används. I genomsnitt kommer 30% av injicerade embryon utvecklas ERMS. 300-600 embryon ska injiceras per experiment för att se till att tillräckligt många GFP-positiva och mCherry-positiva primära tumörer genereras för transplantation och analys.
5. Screening för Primära ERMS i Zebrafish Larver
- Observera injiceras zebrafisk från 10 till 30 dagar efter injektion för uppkomsten av utvändigt synliga primära ERMS.
- Vid 30 dagar efter injektion, söva mottagaren zebrafisk genom tillsats enstaka droppar tricaine metansulfonat (MS222 4 mg / ml stamlösning) i en petriskål innehållande fisk systemet vatten tills operculum rörelser långsam och fisk är fortfarande.
OBS: Dos av tricaine anestesi beror på ålder och storlek på mottagarens zebrafisk. Primära tumörbärande zebrafisk kräver lägre doser av tricaine. - Välj primär ERMS bärandefisk som är myf5-GFP -positivt och mylpfa-mCherry -positivt, med hjälp av en epifluorescensmikroskop.
6. ERMS Tumör Beredning
- Offer vald primär ERMS bärande zebrafisk i 1,6 mg / ml tricaine metansulfonat (MS222) under 10 minuter eller tills ingen operculum rörelse är uppenbar.
- Bearbeta varje tumörbärande zebrafisk separat. Placera fisk i en ren petriskål och dissekera kring tumören med ett rakblad och fin pincett (såsom visas i Figur 1B). Överför dissekerade tumörvävnad till en ren petriskål.
- Lägg 100 pl av förkylt 0.9x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kompletterad med 5% fetalt bovint serum (FBS). Köttfärs vävnad med en ren rakblad> 20 gånger tills cellerna är i en jämn suspension.
- Lägg 900 | il av samma buffert (0.9x PBS + 5% FBS), pipett upp och ned flera gånger för att dissociera cellerna med hjälp av en 1000 | il filtrerade pipettspetsen. Filtrera genom ett 40 &# 956; m mesh sil till motsvarande 50 ml koniska rör. Förvara på is.
- Tvätta petriskål med en ytterligare 2-4 ml buffert, och passerar genom samma nät sil och i motsvarande koniska rör.
- Centrifugera vid 1000 x g, under 10 minuter, vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten och återsuspendera i 100 ^ il buffert.
- Räkna det totala antalet livskraftiga celler med användning av trypanblått och en hemocytometer.
- Späd celler till önskad koncentration i samma buffert (0.9x PBS + 5% FBS). Celler bör spädas till 5 x 10 3 celler / il för omplantering 5 pl per mottagare zebrafisk i totalt 2,5 x 10 4 celler per mottagare.
- Flödescytometri analys kan också utföras med en liten mängd av suspensionen från steg 6,5 att kvantisera de relativa förhållandena av fluorescerande celler i provet.
OBS: Avsätt 100 pl av cellsuspensionen (efter filtrering i steg 3.5) och späd med 400 | ilav 0.9x PBS + 5% FBS fjädring buffert för flödescytometri analys. För att säkerställa korrekt gating, utföra ytterligare analyser med hjälp av enstaka transgen tumörvävnad eller muskel isolerade från vuxna vildtyp, myf5-GFP och mylpfa-mCherry fisk. Utför flödescytometri huvudsak enligt beskrivningen i steg 2 i avsnitt 1.
7. Transplantation av ERMS in Adult rag2 Homozygot Mutant Zebrafish
- Rengör en 10 pl 26S G mikro sprutan genom att dra in och utvisa 10% blekmedel (5 gånger), följt av 70% etanol (5 gånger), och sedan följt av fjädring buffert (0.9x PBS + 5% FBS, 10 gånger ).
- Bedöva mottagare homozygot rag2 mutant fisk genom att tillsätta enstaka droppar tricaine metansulfonat (MS222 4 mg / ml stamlösning) i en petriskål innehållande fisken i systemet vatten tills operculum rörelser är långsam och fisk är fortfarande.
- Placera sövda mottagare zebrafisk på en våt pappershandduk eller spoNBE, med den ventrala sidan uppåt.
- Injicera 5 pl av cellsuspensionen in i peritonealhålan (2,5 x 10 4 celler per mottagare).
OBS: Injektionsnålen ska rengöras mellan injektioner av olika tumörer som beskrivs i steg 4.1. 5 till 10 pl effektivt kan transplanteras intraperitonealt, beroende på mottagarens fiskstorlek. Tumör engraftment kan åstadkommas genom att injicera 1 x 04-5 oktober x 10 5 osorterade celler per mottagare fisk (tabell 1). - Placera försiktigt mottagande zebrafisk i en ren tank med en plastsked.
- Bedöm mottagare zebrafisk för transplantations priser vid 10, 20, 30 dagar efter transplantation genom avbildning sövda fiskar under ljusa fält och epifluorescensmikroskopi.
- Utnyttja engrafted fisk för tillämpningar efter inklusive Fluorescens Aktivt cellsortering (FACS) för att bedöma differentiering status (figur 3H), standard histologiska analysis (Figur 3F), bildterapisvar 15, och / eller serie transplantation närmar inklusive begränsande utspädningsanalys 11.
Representative Results
Ett förfarande för att förbereda och transplantera skelettmuskelceller från α-aktin-RFP transgena givare till nedsatt immunförsvar homozygot rag2 mutant zebrafisk har visats (protokollenheten 1, Figur 1A och Figur 2). Skelettmuskelvävnad framställdes från α-aktin-RFP transgena donatorer och den erhållna encellssuspension innehöll 84,3% levande celler såsom bestämdes genom DAPI uteslutning efter flödescytometrianalys (Figur 2B). RFP-positiva celler bestod 35,3% av denna enda cellsuspension (figur 2C). Transplantation av celler i ryggskelettmuskel av rag2 homozygot mutant mottagare fisk ledde till en konsekvent och stark engraftment enligt bedömning av differentiering av enskilda celler i flerkärniga fibrer (1 x 10 6 celler injicerade per fisk, Tabell 1, Figur 2D-I). Wild typmottagare fisken inte inympa muskelfibrer över 30-dagars experiment (n = 13). Genom 10 dagar efter transplantation, 9 av 14 rag2 homozygot mutant zebrafisk innehöll RFP-positiva muskelfibrer nära injektionsstället (64,3%, figur 2E, F). Viktigt engrafted RFP-positiva muskel kvarstod till 30 dagar efter transplantation (figur 2G-I), med en undergrupp av djur följs för 115 dagar post-transplantations och som uppvisar robust och ihållande muskeltransplantations (data ej visade). Dessa resultat liknar de som tidigare rapporterats av vår grupp 23 med användning av samma protokoll (tabell 1).
Vi har också lagt fram en metod för generering, förberedelse och transplantation av Erms tumörceller i bukhålan av rag2 homozygot mutant mottagare fisk (protokollenheten 2, Figur 1B och figur 3). ERMS alstrades i dubbee transgen myf5-GFP, mylpfa-mCherry fisk som har visat sig möjliggöra visualisering av intratumoral heterogenitet och funktionell analys av tumörcellspopulationer efter transplantation 11. Dock är ytterligare molekylär karakterisering av varje subpopulation svårt eftersom fisk är små när de utvecklar ERMS mellan 10 till 30 dagar i livet och antalet tumörceller är begränsande för tillämpningar efter. En lösning är att expandera siffror tumörcells genom engrafting ERMS i vuxen mottagare zebrafisk. Hittills har liknande experiment utförts på CG1-stam syngena fisk och krävs på över fyra generationer av återkorsning att utveckla syngena linjer som var transgena för myf5-GFP; mylpfa-mCherry. För att kringgå dessa problem, visade vi nyttan av nedsatt immunförsvar rag2 homozygot mutant mottagare zebrafisk att inympa primära ERMS från en AB-stam zebrafisk. Alla primära ERMS engrafted i rag2 homozygota mutanta djur, underlätta expansion av tumör (tabell 1). Liknande resultat har nyligen rapporterat om 24 av 27 rag2 homozygot mutant zebrafisk engrafted ERMS, medan 0 av 7 vildtyp syskon engrafted sjukdom 23. Ett representativt exempel på en inympad ERMS visas vid 30 dagar efter transplantation i figur 3E. Engrafted ERMS dela histologiska särdrag hos embryonal rabdomyosarkom, liknande den som finns i den primära tumören (figur 3B och 3F). FACS-analys bekräftade att ERMS innehöll funktionellt distinkt tumör förökningsceller och differentierade celler som uttrycker myf5-GFP och / eller mylpfa-mCherry. Överlevnaden efter intraperitoneal injektion förfarandet var på över 95%. Mottagarens zebrafisk duka vanligen från tumörbörda efter 30 dagar efter transplantation tidpunkt.
Figur 1. Protokoll schema för (A) normal och (B) malign skelettmuskelcelltransplantation i rag2 homozygot mutant zebrafisk. Valfria steg är markerade med (*).
Figur 2. Skelettmuskel ympning i rag2 homozygot mutant zebrafisk. (A) α-aktin-RFP transgen donator zebrafisk. (B) Cellviabilitet av isolerade muskelcellsuspension som bedömts av DAPI färgexklusion och flödescytometri. (C) Andel RFP-positiva celler som finns i muskeln cellsuspensionen från α-aktin-RFP donator (röd), jämfört med en vildtyp-kontroll(Grå). (DE) Sammanslagen ljusa fält och fluorescerande bilder av vildtyp djur (D) eller rag2 homozygot mutant fisk (E) på 30 dagar efter transplantation. (F) Engraftment skattesatser över tiden. Rött betecknar antalet ympade djur medan grått visar icke-engrafted fisk. Antal djur som analyserades vid varje tidpunkt är angivna. (GI) Hög förstoring bilder av boxed regionen i panelen E visas vid 10 (G), 20 (H) och 30 (I) dagar efter transplantation, visar retention av differentierade muskelfibrer över tid (pilspetsar). Skala barer lika 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Transplantation av myf5-GFP; mylpfa-mCherry ERMS in rag2 homozygot mutant . zebrafisk (AD) rag2-kRASG12D inducerade primära ERMS uppstår i AB-stammen myf5-GFP; mylpfa-mCherry zebrafisk på 30 dagar i livet. (EH) rag2 homozygot mutant zebrafisk engrafted med ERMS och analyseras på 30 dagar efter transplantation. (A, E) Sammanslagen ljusa fält och fluorescerande bilder av primära och transplanterade ERMS. Tumörområdet beskrivs och pilspets indikerar injektionsstället i E. (B, F) Hematoxylin- och eosin-färgade paraffinsektioner av primär (B) och ympade ERMS (F) visar områden med ökad cellularitet associerad med cancer. (C,G) Cellivsduglighet som bedömts av DAPI färgexklusion och flödescytometri. (D, H) Lysrörstumörcells subpopulationer, enligt bedömning av flödescytometri. Skala barer lika 2 mm (A, E) och 50 pm (B, F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Engraftment resultat för muskler och ERMS celltransplantation. (*) Anger tidigare rapporterade data med samma teknik 23. Data återges med tillstånd från Nature Methods. Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Discussion
Effektiv och robust inympning av vuxenryggskelettmuskel uppnåddes med en mycket enkel beredning cellmetod följt av injektion av celler i ryggmuskulaturen för rag2 homozygot mutant fisk. Generellt injektion intramuskulär förfaranden var mycket robust, med några tillhörande döden omedelbart efter implantationen förfarandet, från 10% till 35% beroende på experimentet. Ytterligare optimering kommer sannolikt att koncentreras på utnyttjande av mindre nålar för injektion och utveckling av stationära injektionsapparat med ett mikroskop och mikromanipulator, vilket kommer att underlätta enkel implantera celler. Vårt tillvägagångssätt används också osorterade muskelceller från donatordjur och endast innehöll ungefär 30% muskel progenitorceller. Användning av transgena reporter linjer som märka stamceller och FACS isolering kommer sannolikt att ge anrikade cellsuspensioner som leder till ökad engraftment in mottagarens fisk. Skelettmuskel calnar skulle också kunna berikas och odlas före transplantation, såsom tidigare beskrivits 29. Anmärkningsvärt, våra resultat visar också att stegen nisch etablering och differentiering av donator muskelvävnad ske innan 10 dagar efter transplantation, upprättande denna modell som en robust och snabb experimentell plattform för att bedöma muskel engraftment och förnyelse. Dessutom är dessa experiment brutalt kontrast med dem avslutades i möss, där det krävs förhands skada av muskler med cardiotoxin eller bariumklorid två dagar före engraftment 30,31. Det är troligt att nålskada producerats under transplantationen förfarandet potentierar engraftment genom att stimulera produktionen av en regenerativ miljö inom mottagardjuret 32,33. Vi ser framför oss också att vår metod lätt kommer att anpassas till transplantation av skelettmuskulaturen vävnad från yngre zebrafisk, vilket gör bedömningen av genetiska mutationer som påverkar tidiga skelettmuskelutvecklingmen leder till dödlighet i larvstadierna.
Vi har också ett detaljerat protokoll för inympning av zebrafisk ERMS genom intraperitoneal injektion i icke-rade, rag2 homozygot mutant fisk. Detta tillvägagångssätt var användbart för expansion av dubbeltransgena primära tumörer utan behov av att alstra tumörer inom en syngen transgen linje. Vårt senaste arbete har visat att celltransplantations metoder tillhandahålla nya experimentella modeller för att bedöma ERMS läkemedelskänslighet in vivo, där en enda tumör kan utökas till tusentals djur och bedömas för effekter på tillväxt, självförnyelse och kärlnybildning 15. Dessutom har vi framgångsrikt engrafted ett brett spektrum av tumörer in rag2 homozygot mutant fisk inklusive T-cell akut lymfoblastisk leukemi, melanom och ERMS 23. Ser mot framtiden, föreställer vi oss dessa linjer kommer att vara användbar för att bedöma viktiga funktionella egenskaper av cancer ivivo inklusive bedömning intratumoral heterogenitet, invasion, metastas, angiogenes, och terapi motstånd. Dessutom kommer alstringen av rag2 homozygot mutant fisk i den optiskt klara Casper stam zebrafisk 34 sannolikt underlätta direkt avbildning av många av dessa kännetecken cancer.
Totalt ger vi detaljerade protokoll för den framgångsrika inympning av fluorescensmärkta normala och maligna skelettmuskel i till vuxen rag2 homozygot mutant immun äventyras zebrafisk.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Alex Lemonade Stand Foundation (DML), American Cancer Society (DML), den MGH Howard Goodman Fellowship (DML), och amerikanska National Institutes of Health beviljar R24OD016761 och 1R01CA154923 (DML). CNY flödescytometri Core och Flow bildanalys, delad instrumentering licensnummer 1S10RR023440-01A1. IMT finansieras av ett stipendium från den portugisiska Stiftelsen för vetenskap och teknik (Fundação para en Ciência e Tecnologia - FCT). QT finansieras av Kina stipendium rådet. Vi tackar Angela Volorio för hennes hjälp kommentarer och råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-EDTA buffer solution 1x | Sigma-Aldrich | 93283-100ML | Microinjection. Injection mix. |
| Potassium Chloride | Fisher Science Education | S77375-1 | Microinjection. Injection mix. |
| XhoI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0146S | Microinjection. Plasmid linearization. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 (50) or 28106 (250) | Microinjection. For purification of linearized plasmid up to 10 kb. |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | BP1753I-100 | Microinjection. For purification of linearized plasmid. |
| UltraPure Agarose, 500 g | Invitrogen | 16500-500 | Microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx | Microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | flow cytometry/FACS |
| 5 ml polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352058 | flow cytometry collection tube |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | FACS |
| 5 ml polypropylene round bottom tube | BD Falcon | 352063 | FACS collection tube |
| BD LSR II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | flow cytometry |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010-023 | transplantation |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-01 | transplantation |
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Western Chemical Inc. | http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html | Transplantation. Anesthetic. Caution: Irritant. Irritating to eyes, respiratory system, and skin. |
| VWR Absorbent Bench Underpads | VWR | 56616-018 | Transplantation. Regular paper towels or sponge can be used as an alternative. |
| Singe Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | transplantation |
| Petri Dish, Polystryrene Disposable Sterile | VWR | 25384-302 | transplantation |
| Cell Strainer, 40 µm Nylon | Falcon-Corning Incorporated | 352340 | transplantation |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430828 | transplantation |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | transplantation |
| Hemacytometer Set | Hausser Scientific | 1483 | transplantation |
| Hamilton syringe, fixed needle, volume 10 µl, needle size 26s ga (bevel tip) | Hamilton | 80366 | transplantation |
| Austin's A-1 Bleach, Commercial | James Austin Company | Transplantation. Any commercial solution can be used. | |
| Ethanol 190 Proof | Decon Labs, Inc. | DSP-MD.43 | Microinjection (linearized plasmid purification) and transplantation. Any commercial solution can be used. |
| High Speed Microcentrifuge, 300D Digital Microcentrifuge | Denville Scientific Inc. | C0265-24 | transplantation |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | 75004539 | Transplantation. Catalog number for 120 V, 60 Hz (US). |
| 5 ml serological pipets | BD Falcon | 357529 | transplantation |
| Corning Stripettor Plus Pipetting Controller | Corning Incorporated | 4090 | Transplantation. Any automatic pipetting controller can be used. |
| Powder free examination gloves | All steps. Any commercial brand can be used. | ||
| Filter pipet tips and micropipettes | All steps. Any commercial brand can be used. | ||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11205-20 | transplantation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | Scoring. Any appropriate fluorescent stereomicroscope can be used. |
| Olympus DP72 microscope digital camera | Olympus | DP72 | Scoring. Multiple adequate cameras for the selected imaging system can be used. |
References
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29 (11), (2013).
- Boatman, S., Barrett, F., Satishchandran, S., Jing, L., Shestopalov, I., Zon, L. I. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood cells, molecule., & diseases. 51 (4), 271-276 (2013).
- Langenau, D. M., Traver, D., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Yang, H. W., Kutok, J. L., et al. Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish. Cancer Research. , 7256-7262 (2004).
- Patton, E. E., Widlund, H. R., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current Biology. 15 (3), 249-254 (2005).
- Sabaawy, H. E., Azuma, M., Embree, L. J., Tsai, H. -J., Starost, M. F., Hickstein, D. D. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (41), 15166-15171 (2006).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Gene. 21 (11), 1382-1395 (2007).
- Le, X., Langenau, D. M., Keefe, M. D., Kutok, J. L., Neuberg, D. S., Zon, L. I. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
- Park, S. W., Davison, J. M., Rhee, J., Hruban, R. H., Maitra, A., Leach, S. D. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Zhuravleva, J., Paggetti, J., et al. MOZ/TIF2-induced acute myeloid leukaemia in transgenic fish. British journal of haematology. 143 (3), 378-382 (2008).
- Ignatius, M. S., Chen, E. Y., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Suppl Data. Cancer cell. 21 (5), 680-693 (2012).
- Blackburn, J. S., Liu, S., et al. Clonal Evolution Enhances Leukemia-Propagating Cell Frequency. Cancer cell. 25 (3), 366-378 (2014).
- Blackburn, J. S., Langenau, D. M. Zebrafish as a model to assess cancer heterogeneity, progression and relapse. Disease model. 7 (7), 755-762 (2014).
- Zhao, C., Wang, X., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS one. 6 (7), e21768 (2011).
- Chen, E. Y., DeRan, M. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 inhibitors induce the canonical WNT/β-catenin pathway to suppress growth and self-renewal in embryonal rhabdomyosarcoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5349-5354 (2014).
- Yang, X. -J., Cui, W., et al. A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion. PloS one. 8 (4), e61801 (2013).
- Chapman, A., Fernandez del Ama, L., Ferguson, J., Kamarashev, J., Wellbrock, C., Hurlstone, A. Heterogeneous Tumor Subpopulations Cooperate to Drive Invasion. Cell Reports. 8 (8), 1-8 (2014).
- Smith, A. C. H., Raimondi, A. R., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Iyengar, S., Houvras, Y., Ceol, C. J. Screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model. Journal of visualized experiments JoVE. (69), e50086 (2012).
- Mizgireuv, I., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2790 (2011).
- Tang, Q., Abdelfattah, N. S., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature methods. 11, 821-824 (2014).
- Zhou, Q., Facciponte, J., Jin, M., Shen, Q., Lin, Q. Humanized NOD-SCID IL2rg–/– mice as a preclinical model for cancer research and its potential use for individualized cancer therapies. Cancer letters. 344 (1), 13-19 (2014).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental biology. 192 (2), 289-299 (1997).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D. D. D., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), 1-5 (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon PRess. Eugene, OR. (2000).
- Alexander, M. S., Kawahara, G., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors). Muscl, & nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of visualized experiments JoVE. (86), 1-7 (2014).
- Gerli, M. F. M., Maffioletti, S. M., Millet, Q., Tedesco, F. S. Transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration. J Vis Exp. (83), e50532 (2014).
- Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell. The FEBS journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).
- Rowlerson, a, Radaelli, G., Mascarello, F., Veggetti, Regeneration of skeletal muscle in two teleost fish: Sparus aurata and Brachydanio rerio. Cell Tissue Res. 289 (2), 311-322 (1997).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell stem cell. 2 (2), 183-189 (2008).
