Abstract
Zebra balığı geliştirme, yenilenme ve kanser değerlendirmek için güçlü bir araç haline gelmiştir. Daha yakın zamanda, allogreft hücre nakli ışınlanmış, singeneik ve bağışıklık sistemi zayıflamış yetişkin zebrabalıkları halinde normal ve habis hücrelerin izinlerini bütünleşmesini geliştirilmiştir. Optimize hücre nakli protokolleri ile birleştiğinde Bu modeller kök hücre fonksiyonu, rejenerasyon aşağıdaki yaralanma ve kanserin hızlı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, biz bağışıklık sistemi zayıflamış erişkin rag2 E450fs homozigot mutant zebrafish içine Zebra balığı yetişkin iskelet kası ve embriyonal rabdomyosarkomu (EBYS), embriyonik kas özellikleri paylaşan bir çocuk sarkomu, hücre transplantasyonu için bir yöntem mevcut. Daha da önemlisi, bu hayvanlar, T hücreleri olmadığı ve ilişkili olmayan ve donor hayvandan alınan dokularda geniş bir naklini kolaylaştırmak B hücresi fonksiyonunu azaltmıştır. Bizim optimize protokoller floresan kas hücresi HAZIRLIK etiketli gösterisirag2 homozigot mutant balık dorsal kas içine implante zaman α-aktin-RFP transgenik zebrafish gelen ations sağlam aşılamak. Ayrıca floresan farklılaşma durumuna göre hücreler ile sınırlı olan, floresan transgenik ERMS naklini göstermektedir. Özellikle, EBYS AB-gerinme myf5-GFP oluşturulan; mylpfa mCherry çift transgenik hayvanlar ve tümörler yetişkin bağışıklık tehlikeye balık periton içine enjekte. Bu protokollerin programı sırt kaslarının veya yetişkin zebrabalıkları periton içine implante edilebilir, normal ve malignan donör hücrelerin geniş bir bütünleşme için de geçerlidir.
Introduction
Onlar Ampute yüzgeçleri, yanı sıra hasarlı beyin, retina, omurilik, kalp, iskelet kası ve diğer dokuları 1 yeniden çünkü Zebra balığı rejeneratif çalışmalar için mükemmel bir model vardır. Hücre nakli, çeşitli dokulardan kök hücrelerin tanımlanması sadece son 2 araştırılmaktadır ise yetişkin zebrabalıkları hücre ve rejeneratif çalışmalar, büyük ölçüde, bir hasara yanıt olarak rejenerasyon karakterizasyonu üzerine odaklanmıştır Stem. 10 - balığı aynı zamanda insan hastalıklarının 3 taklit transgenik kanser modelleri üretilmesiyle kanseri araştırması için giderek artan bir ikinci hale gelmiştir.
Kanser ortamda, hücre transplantasyonu yaklaşımları yaygın olarak kabul ve kendini yenileme 11, fonksiyonel heterojenite 12,13, neovaskülarizasyon 14, çoğalması da dahil olmak üzere önemli kanser süreçlerinin dinamik değerlendirilmesine imkan haline gelmiş,tedavi yanıtları 15, ve işgali 16,17. Ancak, engrafted hücreleri sıklıkla saldırı ve greft 18 öldürmek bağışıklık savunma ev sahipliği nedeniyle alıcı balık reddedilir. Birçok yöntem nakledilmiş hücreler reddini üstesinden gelmek için kullanılmıştır. Örneğin, alıcı hayvanlar bağışıklık sistemi geçici transplantasyon öncesinde 18,19 için düşük dozda y-ışıma ile buharlaştınldığı edilebilir. Ancak, alıcının bağışıklık sistemi 20 gün sonrası radyoterapi kurtarmak ve donör hücreleri 18 öldürecek. Seçenek olarak ise, deksametazon tedavisi uzun immün baskılayıcı soğutucu sağlamanın ve 30 gün 14 insan tümörlerinin geniş naklini kolaylaştırmak, T ve B hücresi işlevini baskı altına alan için kullanılmıştır. Bu deneyler, sürekli ilaç dozajı gerektirir ve katı tümörlerin çalışma ile sınırlıdır. 22, donör ve recipi - Uzun vadeli engraftmant deneyleri genetik özdeş singenik hatları 20 kullandıkent hücreleri eşleşti bağışıklık bulunmaktadır. Ancak, bu modeller ilgi transgenik hatları tamamen singenik hatları üretmek için fazla dört nesildir singenik plana geçti gerektirir. Alıcı balık bağışıklık ret sorunları ortadan kaldırmak için, bizim grup son zamanlarda bir bağışıklık T ve B hücre fonksiyonlarında azalma ve dokularda 23 geniş naklini izin hangi tehlikeye rag2 E450fs homozigot mutant (ZFIN alel tanımı rag2 fb101) çizgi geliştirmiştir. Benzer bağışıklık sistemi zayıflamış fare modelleri, fare ve insan dokuları 24 hücre transplantasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır.
Burada, biz iskelet kası ve embriyonal rabdomyosarkomu (EBYS), yeni açıklanan rag2 homozigot mutant zebrafish içine, iskelet kası ile özellikleri paylaşan bir pediatrik sarkom nakli için yöntemler sunuyoruz. bir bağışıklık tehlikeye yetişkin zebrabalıkları durumuDoğrudan görselleştirmek ve normal ve malign dokularda kök hücre kendini yenileme değerlendirmek için büyük ölçekli hücre nakli çalışmaları yapmak bizim yeteneği genişler. Bu yöntemle, floresan 25 transgenik zebra balığı sağlam rag2 içinde aşılanmakta α-aktin-RFP yetişkin kas hücresi preparasyonları etiketli dorsal kas içine enjeksiyon aşağıdaki homozigot mutant Zebra balığı. Ayrıca, uyumunu ve primer myf5 GFP genişlemesini göstermektedir; rag2 E450fs homozigoz mutant zebrabalıkları intraperitonal enjeksiyonu takiben mylpfa- MCherry transgenik ERMS. Bu protokollerin yarar gösterilen örneklerde ötesine geçer ve kolayca ek zebra balığı rejeneratif doku ve kanser uygulanabilir.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri protokol # 2011N000127 altında Araştırma Hayvan Bakım, üzerinde Massachusetts General Hastanesi Alt Komitesi tarafından kabul edildi.
Yetişkin rag2 E450fs Homozigot Mutant Zebra balığı içine Bölüm 1. İskelet Kası Hücre Nakli
Yetişkin Zebra balığı Donör İskelet Kası Hücreleri 1. Hazırlık
- Floresan kas etiketli transgenik yetişkin zebrafish edinin. Bu deneyde, 30 α-aktin-RFP donör balık 25 alıcı balık başına 1 x 10 6 hücre nakli için kullanılmıştır.
- 1.6 mg Kurban verici zebra balığı / 10 dk ya da herhangi bir kapakçık hareketi elde edilene kadar sürdürülmüştür metansülfonat (MS222) tricaine ml.
- Emici bir kağıt havlu ve tüketim üzerine temiz bir jilet kullanarak dorsal kas donör balık yerleştirin. Şekil 1A belirtildiği gibi kesilmiş doku toplama (maksimize etmek için bir 45 ° açıyla anüs yakınında yapılmalıdır
- Kesilmiş dokuya 500 ul süspansiyon tamponu (önceden soğutulmuş 0.9x Fosfat Tampon Tuz ve% 5 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile desteklenmiş (PBS)) eklenir. 10 donör zebrabalıkları kadar bu kitapta bir araya yerleştirilebilir.
- Hücreler tek tip bir süspansiyon kadar> 20 kat bir jilet ile doku kıyma. Tüm dorsal kas deri, kemik ve yüzgeç dahil homojenize edilir. Süspansiyon tamponu 2 ml ekleyin. 5 ml'lik bir pipet kullanarak, hücreleri ayırmak için hücre süspansiyonu ≥20 kez çiğnemek.
- Buz üzerine yerleştirilmiş bir 50 ml'lik konik bir tüp içine 40 um mesh süzgeç vasıtasıyla hücre süspansiyonu süzün.
- Geri kalan dokunun toplanması ve 5 ml (10 verici balık izole başına kullanılabilir) bir son hacme kadar aynı süzgeç ve konik tüp süzülmeye süspansiyon tamponu, 2.5 ml Petri yıkayın.
NOT: Cilt, kemikler ve yüzgeçleri filtrasyon aşağıdaki dışı bırakılacaktır. Varsa, aynı konik tüp içine benzer süspansiyonlar birleştirir. - Tripan mavi boya ve hemasitometre kullanarak canlı hücrelerin toplam sayısını sayın.
- (Isteğe bağlı, adım 2) eğer arzu edilirse, akış sitometresi için 500 ul ayırın.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de, santrifüjleyin hücre süspansiyonu.
- 3.33 x 10 5 hücre / ul süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri atın (0.9x PBS +% 5 FBS). Toplam olarak, 3 ul alıcı başına 1 x 10 6 hücre (aşama 3) toplam alıcı balık başına enjekte edilecektir.
NOT: hücre süspansiyonu az 3 ul alıcı balık nakledilen edilmelidir. Hücre sayısı sınırlayıcı olduğu takdirde, alıcı için düşük 4 10 x 5 gibi hücreler başarılı bütünleşme (Tablo 1) yol açabilir.
Donör İskelet Kası Cell Hazırlık 2. Akış Sitometri Analizi (İsteğe bağlı)
- I tarif edilen bir vahşi tip, transgenik olmayan bir balık kas izolen 1,1 adıma. Bu örnek, negatif kontrol olarak hizmet eder ve Akış Sitometrisi kapıları ayarlamak için yararlıdır.
- Uygun bir canlılık boya ekleyin. Örneğin, kas hazırlanması 500 ul stok DAPI çözeltisi (500 ng / | il), 5 ul ilave edin. Analiz biraz önce vorteksleyin. 5 x 10 3 1 x 10 4 olaylarını Edinme. Transgenik balık izole kas hücrelerinin analizi ile takip kapıları yerleştirmek için ilk vahşi tip kontrol numuneleri analiz edin.
NOT: sitometri analizi Akış genellikle disseke hücrelerin% 60'dan fazla canlılığını (Şekil 2) muhafaza hangi süre içinde kas doku diseksiyonu sonra 1 saat içinde gerçekleştirilir. Hücreler her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. Toplam hücre canlılığı, tripan mavi boya ve bir hemositometre kullanılarak transplantasyon öncesinde yeniden değerlendirilebilir.
Yetişkin rag2 Homozigot Mutant Zebra balığı içine İskelet Kası Hücreleri 3. İntramüsküler Nakli
- 10 μ temizleyin, Çizim ve% 70 etanol (5 kez) ile ve ardından,% 10 çamaşır suyu (5 defa), dışarı atılmasını ve daha sonra süspansiyon tamponu (0.9x PBS +% 5 FBS, 10 kez) ile L 26S G mikro şırınga.
- Kapakçık hareketleri yavaş kadar sistem suda balık içeren bir Petri kutusu içine tricaine metansülfonat (MS222, 4 mg / ml stok çözelti) tek damla ilave edilerek 2-4 aylık homozigoz mutan rag2 balık ya da (kontrol olarak), vahşi tip bir alıcı balık anestezisi ve balık hala.
Not: tricaine anestezi dozu alıcı zebrabalıkları yaşına ve boyutuna bağlı olacaktır. - Sol tarafı yukarı bakacak şekilde, bir nemli kağıt havlu veya sünger üzerinde anestezi alıcı zebrafish yerleştirin.
- Latero-dorsal kas içine şırınga iğnesi takın (1A Şekil bakınız). Enjeksiyonlar 45 ° açıyla yapılır emin olun. Alıcı başına 1 x 10 6 hücre toplam balık başına (adım 1.12 hazırlandı) hücre süspansiyonu 3 ul enjekte edilir.
- Dikkatle kurtarmak için bir plastik kaşık kullanarak temiz bir tanka enjekte zebrafish aktarın.
- Parlak alan ve Epifloresans mikroskobu altında anestezi balık görüntüleme 10, 20, 30 gün sonrası transplantasyon de engreftman oranları için alıcı zebrafish değerlendirin.
Yetişkin Homozigot rag2 Mutant Zebra balığı içine Bölüm 2. Embryonel Rabdomyosarkom (EBYS) Transplantasyon
Zebra balığı Embriyolar 4. DNA Mikroenjeksiyon
- 6 saat veya O / N 37 ° C'de Xhol ile DNA 10 ug, sindirerek rag2-kRASG12D plazmid 7 linearize.
- Standart fenol DNA arındırın: kloroform ekstraksiyonu ve etanol ile çökeltilmesi. Iyonu giderilmiş su içinde 20 ul (alternatif olarak, ticari bir DNA fragmanı, arıtma kolonları kullanılabilir).
- Bir% 1 agaroz jeli üzerinde sindirilmemiş ve sindirilmiş DNA çalıştırın ve DNA, b konsantrasyonunu belirlemeky spektrometre okuma. 1, 1: Seçenek olarak ise, 1 numuneler çalıştırmak 5 ve bir% 1 agaroz jeli üzerinde 1:10 seyreltmeleri ve bir DNA merdiveni göre tayin edin.
- 0.1 M KCl ve 0.5x Tris-EDTA içinde 15 ng sindirilmiş rag2-kRASG12D DNA / ml bir nihai konsantrasyonda, bir enjeksiyon karışım hazırlayın. Enjeksiyon hacmi 2 nl enjekte nihai DNA miktarı 30 pg olacaktır.
Not: Üç farklı DNA yapıları kadar etkin bir şekilde birlikte enjekte embriyo DNA başına 60 pg fazla olabilir. Olmak Bu transgenler genomuna entegre olan ve gelişen tümör 26 içinde eş-ifade edilmiştir. - Ilgi konusu bir zebra balığı suşu (Şekil 1B) içine 27 tarif edildiği gibi esas olarak tek bir hücre aşamasında embriyoların içine doğrusallaştırılmış rag2-kRASG12D enjekte edilir. Enjeksiyonlar yüksek verimlilik için sarısında hücrede olup yapılmalıdır. Bu deneyde, bir çift transgenik AB-suşu ise; myf5-GFP, mylpfa mCherry kullanıldı. Standart yetiştirme s kullanarak zebrafish kaldırın28 rotocols.
NOT: Enjeksiyon sağkalım sık kullanılan Zebra balığı gerginlik bağlıdır. Ortalama olarak, enjekte edilen embriyoların 30% ERMS gelişecektir. 300-600 embriyoların GFP-pozitif ve yeterince MCherry pozitif primer tümörler nakli ve analiz için oluşturulacak sağlamak amacıyla deney başına enjekte edilmelidir.
Zebra balığı Larva İlköğretim ERMS 5. Eleme
- 10 ila 30 gün dışarıdan görünür birincil ERMS ortaya çıkması için enjeksiyon sonrası enjekte zebrafish gözlemleyin.
- 30 gün sonrası enjeksiyon anda, operkulum hareketleri yavaş ve balık hala kadar balık sistemi su içeren bir Petri kabı içine tricaine methanesulfonate (MS222 4 mg / ml stok çözelti) tek damla ekleyerek alıcı zebrafish uyutmak.
Not: tricaine anestezi dozu alıcı zebrabalıkları yaşına ve boyutuna bağlı olacaktır. Primer tümör taşıyan zebra tricaine düşük dozlarda gerektirir. - Birincil EBYS-yatak seçinBir Epifloresans mikroskop kullanarak, myf5-GFP pozitif ve mylpfa mCherry pozitif olan balık.
6. EBYS Tümör Hazırlık
- 10 dakika süre ile ya da herhangi bir kapakçık hareketi belirgin olana kadar 1.6 mg / ml tricaine metansülfonat (MS222) seçilen primer EBYS taşıyan zebrafish kurban.
- Ayrı ayrı tümör taşıyan zebrafish işleyin. Temiz bir Petri kabındaki balık yerleştirin ve bir jilet ve ince forseps (Şekil 1B gösterildiği gibi) kullanılarak tümör çevresindeki teşrih. Temiz bir Petri kabı disseke tümör dokusu aktarın.
- % 5 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş önceden soğutulmuş 0.9x fosfat tamponlu salin (PBS) ile 100 ul ekle. Temiz bir jilet ile kıyma doku> hücreleri kadar 20 kat homojen bir süspansiyon vardır.
- Pipet süzülmüş 1000 ul kullanarak hücreleri ayırmak için yukarı ve aşağı birkaç kez aynı tampon 900 ul (0.9x PBS +% 5 FBS), pipet ekleyin. Bir 40 yoluyla Filtre# 956; tekabül 50 ml konik tüp içine m örgü süzgeç. Buz üzerinde muhafaza edin.
- Tampon ilave 2-4 ml Petri kabı yıkayın ve aynı süzgeçten ile ve buna karşılık gelen, konik bir tüp içine geçmektedir.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de, santrifüjleyin.
- Tampon 100 ul supernatant ve tekrar süspansiyon atın.
- Tripan mavi boya ve hemasitometre kullanarak canlı hücrelerin toplam sayısını sayın.
- Aynı tampon içinde istenen konsantrasyona seyreltilir hücreleri (0.9x PBS +% 5 FBS). Hücreler, alıcı başına 2.5 x 10 4 hücrelerinin toplam alıcı zebrabalıkları başına 5 ul nakli için / ml, 5 x 10 3 hücre olacak şekilde seyreltilir.
- Akış sitometrisi analizi, aynı zamanda örnek içinde flüoresan hücrelerin nispi oranı nicemlemek için adım 6.5 süspansiyon küçük bir miktarı ile gerçekleştirilebilmektedir.
NOT: kenara (Adım 3.5 filtreleme takip) hücre süspansiyonu 100 ul Set ve 400 ul sulandırmakAkış sitometrisi analizi için 0.9x PBS +% 5 FBS süspansiyon tamponu. Uygun yolluk sağlamak için, yetişkin vahşi tip, myf5-GFP ve mylpfa mCherry balık izole tek transgenik tümör dokusu veya kas kullanarak ek analiz yapmak. Bölüm 1, adım 2'de açıklandığı şekilde, esas Akış Sitometri yapın.
Yetişkin rag2 homozigot mutant zebrafish içine ERMS 7. Nakli
- (5 kez) içeri çekilmesi ve% 10,% 70 etanol, ardından ağartıcı çözeltisi (5 kez) uzaklaştırılması ile 10 ul 26S G mikro şırınga temizleyin ve sonra süspansiyon tamponu (0.9x PBS +% 5 FBS, 10 kez ve ardından ).
- Kapakçık hareketleri yavaş ve balık hala kadar sistem suda balık içeren bir Petri kutusu içine tricaine metansülfonat (MS222 4 mg / ml stok çözelti) tek damla ilave edilerek alıcı homozigoz mutan rag2 balık anestezisi.
- Islak kağıt havlu veya spo üzerinde anestezi alıcı zebrafish yerleştirinnge, ventral yüzü yukarı bakacak.
- Periton boşluğuna (alıcı başına 2.5 x 10 4 hücre) hücre süspansiyonu 5 ul enjekte edilir.
NOT: Aşama 4.1 de tarif edildiği gibi enjeksiyon iğne farklı tümörlerin enjeksiyonlar arasında temizlenmesi gerekir. 5-10 ul etkili bir alıcı balık boyutuna bağlı olarak, intraperitoneal olarak transplante edilebilir. Tümör melezleme alıcı balık başına 1 x 10 4 5 10 5 x sıralanmamış hücreleri (Tablo 1) enjekte edilmesiyle gerçekleştirilebilmektedir. - Dikkatle plastik kaşık ile temiz bir tanka alıcı zebrafish yerleştirin.
- Parlak alan ve Epifloresans mikroskobu altında anestezi balık görüntüleme 10, 20, 30 gün sonrası transplantasyon de engreftman oranları için alıcı zebrafish değerlendirin.
- Farklılaşma durumunu (Şekil 3H), standart histolojik analı değerlendirmek için Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) dahil mansap uygulamalar için engrafted balık yararlanınsis (Şekil 3F), görüntüleme terapi yanıtları 15, ve / veya seri transplantasyon seyreltme analizi 11 sınırlayıcı dahil yaklaşır.
Representative Results
İmmün içine hazırlanıyor ve α-aktin-RFP transgenik donörlerden iskelet kas hücreleri nakli için bir prosedür homozigot mutant zebrafish rag2 tehlikeye (Protokol Bölüm 1, Şekil 1A ve Şekil 2) gösterilmiştir. İskelet kas dokusu α-aktin-TTT transgenik olan donörlerden hazırlanmış olan ve Akış Sitometrisi analizi (Şekil 2B), aşağıdaki DAPI dışta bırakılması ile değerlendirildi Elde edilen tek bir hücre süspansiyonu% 84.3 canlı hücreleri ihtiva etmiştir. TTT-pozitif hücreler, bu tek bir hücre süspansiyonu (Şekil 2C) 35.3% içermiştir. (Balık başına enjekte edilen 1 x 10 6 hücre, Tablo 1, Şekil 2D-I) 'i çok çekirdekli elyafların içine tek hücrelerin farklılaşması ile değerlendirilen rag2 homozigoz mutant alıcı balık dorsal iskelet kasına hücre transplantasyonu, tutarlı ve güçlü bir bütünleşme yol açmıştır. Vahşi tipalıcı Balık 30 günlük deney (n = 13) üzerinde kas lifleri aşılamak için başarısız oldu. 10 gün sonrası nakli, 14 rag2 homozigot mutant zebrafish dışarı 9 enjeksiyonu (% 64.3, Şekil 2E, F) yakın site RFP-pozitif kas lifleri içeriyordu. Önemlisi, engrafted TTT-pozitif kas sonrası melezleme ve sergileyen güçlü ve kalıcı kas engraftmant (veriler gösterilmemiştir) 115 gün süreyle takip edilen hayvanların bir alt kümesi ile, post-transplantasyon 30 gün (Şekil 2G-I) devam etti. Bu sonuçlar, aynı protokol (Tablo 1) kullanarak bir grup 23 ile daha önceden rapor edilenlere benzerdir.
Ayrıca rag2 homozigoz mutant alıcı balık (Protokol Bölüm 2, Şekil 1B ve Şekil 3) periton boşluğuna EBYS tümör hücrelerinin üretimi, hazırlanması ve nakli için bir yöntem sunulmuştur. EBYS doubl olarak hesaplanmıştıre transgenik myf5-GFP; mylpfa mCherry balık içi tümöral heterojenite ve nakli 11 aşağıdaki tümör hücre alt fonksiyonel analiz görselleştirme izin gösterilmiştir. Bunlar 10-30 yaşam gün ve tümör hücrelerinin sayısı alt baş uygulamalar için sınırlandırıcı arasında ERMS geliştirirken, balık küçük Ancak, her bir alt populasyonun daha moleküler karakterizasyonu zordur. Bir çözüm yetişkin alıcı Zebra balığı içine ERMS aşılanması ile tümör hücresi sayıları genişletmektir. Bugüne kadar, benzer deneyler CG1-streyn singeneik balık ile tamamlanmış olup, myf5-GFP için transgenik olan genetik olarak özdeş hatlarını geliştirmek için geri çaprazlama 4 kuşak fazla gerekmektedir; mylpfa mCherry. Bu sorunları aşmak için, biz bir AB-gerinme zebrabalıkları birincil ERMS aşılamak bağışıklık tehlikeye rag2 homozigot mutant alıcı zebrabalıkları yararını göstermiştir. Bütün birincil EBYS ra aşılanang2 tümör (Tablo 1) genişlemesini kolaylaştırmak homozigoz mutant hayvanlar. 0 7 vahşi tip kardeşler hastalığı 23 engrafted ise benzer sonuçlar son zamanlarda, nerede 24 27 rag2 homozigot mutant Zebra balığı engrafted EBYS bildirilen edilmiştir. Bir aşılanan ERMS temsili bir örneği, Şekil 3E'de 30 gün sonra nakli gösterilir. Engrafted EBYS primer tümörün (Şekil 3B ve 3F) bulunan benzer embriyonel rabdomyosarkomu, histolojik özellikleri paylaşır. FACS analizi bu myf5-GFP ve / veya mylpfa-mCherry ifade eden hücreleri ve farklılaşmış hücrelerin ilerleyen fonksiyonel olarak farklı tümör bulunan ERMS doğruladı. Intraperitoneal enjeksiyon prosedür takip sağkalım oranları% 95 fazla olmuştur. Alıcı Zebra balığı genellikle 30 gün sonrası transplantasyon zamanı noktadan sonra tümör yükünden yenik.
(A) Normal ve (B) rag2 homozigoz mutant Malign iskelet kası hücre transplantasyonu için Şekil 1. Protokol şematik Zebra balığı. Opsiyonel adımlar (*) ile işaretlenmiştir.
Rag2 homozigot mutant zebrafish içine Şekil 2. İskelet kası engraftmant. (A) α-aktin-RFP transgenik donör Zebra balığı. Izole kas hücre süspansiyonu (B) Hücre canlılığı DAPI boya dışlama tarafından değerlendirilir ve akım sitometri gibi. Bir vahşi tipli kontrol ile karşılaştırıldığında (C) α-aktin-TTT vericisinden (kırmızı) kas hücre süspansiyonu içinde bulunan TTT-pozitif hücreleri oranı,(Gri). (DE) 30 gün sonrası transplantasyon parlak alan ve vahşi tip hayvanlara (D) veya rag2 homozigot mutant balık (E) floresan görüntüleri birleşti. Zamanla (F) Aşı oranları. Gri-engrafted balık gösterirken Kırmızı engrafted hayvan sayısını belirtir. Her bir zaman noktasında analiz edilen hayvan sayısı belirtilmiştir. Zaman (ok başları) üzerinden farklı kas liflerinin tutma gösteren (GI) 10 (G) gösterilen paneli E kutulu bölgenin yüksek büyütme görüntüleri, 20 (H) ve 30 (I) gün transplantasyon sonrası. Ölçek çubukları 2 mm eşit. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Myf5-GFP Şekil 3. Nakli; rag2 homozigot mutant haline mylpfa mCherry EBYS . AB-gerinme myf5-GFP ortaya çıkan Zebra balığı (AD) rag2-kRASG12D kaynaklı birincil EBYS; hayatın 30 gün mylpfa mCherry zebrabalıkları. (EH) rag2 homozigot mutant Zebra balığı ERMS engrafted ve post-transplantasyon 30 gün analiz. (A, E), parlak alan ve birincil ve nakledilen ERMS floresan görüntüleri birleşti. Tümör alanı ana hatlarıyla ve ok ucu E enjeksiyon sitesini gösterir. (B, F) Hematoksilen ve kanser ile ilişkili artmış selülarite alanları gösteren birincil (B) eozin boyalı parafin kesitleri ve engrafted EBYS (F). (Cı-DAPI boya dışlama tarafından değerlendirilir ve akım sitometri G) Hücre canlılığı. (D, H), Floresan tümör hücresi alt-popülasyonları akış sitometri ile değerlendirildi. Ölçek çubukları 2 mm (A, E) ve 50 um (B, F) eşit. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kas ve EBYS hücre transplantasyonu için Tablo 1. Aşı sonuçları. (*) Daha önce aynı teknikleri kullanarak verileri 23 rapor işaretidir. Veri Doğa Yöntemleri izniyle edilir. Bu tablonun büyük halini görmek için buraya tıklayınız.
Discussion
Yetişkin dorsal iskelet kası Verimli ve sağlam engreftman rag2 homozigot mutant balık dorsal kas içine hücre enjeksiyonu ile takip çok basit bir hücre hazırlama yöntemi ile elde edilmiştir. Bazı ilişkili ölüm anında% 10 den% 35 deney bağlı olarak değişen, implantasyon prosedürü izleyerek genel olarak, kas içi enjeksiyon işlemleri, çok sağlam idi. Ek optimizasyon olasılıkla hücrelerin implante kolaylığı kolaylaştıracak enjeksiyon ve mikroskop ve mikromanipülatör kullanarak sabit enjeksiyon cihazının geliştirilmesi için küçük göstergesi iğne, kullanımı üzerine merkezi olacak. Yaklaşımımız da donor hayvandan alınan ayrıştırılmamış kas hücreleri kullanılır ve yalnızca yaklaşık% 30 kas progenitör hücre içermektedir. Muhtemelen alıcı balık içine artan engraftment neden zenginleştirilmiş hücre süspansiyonları sağlayacak kök hücreler ve FACS izolasyon etiket transgenik muhabiri hatlarının kullanımı. İskelet kası cDaha önce açıklandığı gibi 29 arşın da, zenginleştirilmiş ve transplantasyon kültürlü önce olabilir. Dikkate değer, bizim sonuçlar 10 gün kas uyumunu ve yenilenme değerlendirmek için sağlam ve hızlı bir deneysel platform olarak bu modeli kurulması, nakli sonrası önce niş kurulması ve donör kas dokusunun farklılaşma adımları meydana geldiğini göstermektedir. Ayrıca, bu deneyler açıkça ortaya cardiotoxin ya da baryum klorür ile kas yaralanma öncesi 30,31 bütünleşmesini önce iki gün gereklidir farelerde, tamamlanmış olan kontrast. Bu nakli prosedürü sırasında üretilen iğne yaralanması alıcı hayvan 32,33 içinde bir rejeneratif ortamda üretimini uyararak bütünleşmesini güçlendiren olasıdır. Biz de erken iskelet kas gelişimini etkileyen genetik mutasyonlar değerlendirmesini sağlayan, bizim yöntem kolayca genç Zebra balığı iskelet kas dokusunun nakli adapte olacağını tasavvurancak larva aşamasında öldürücülüğü neden.
Biz de olmayan klimalı, rag2 homozigot mutant balık içine intraperitoneal enjeksiyon yoluyla zebrabalıkları ERMS nakledilmesiyle için ayrıntılı bir protokol hazırladık. Bu yaklaşım, bir singenik transgenik hattı içinde tümörler oluşturmak için gerek kalmadan çift transgenik primer tümörlerin yayılması için yararlı oldu. Bizim son çalışma hücre nakli yaklaşımlar, tek bir tümör hayvanların binlerce içine genişletilmiş ve büyüme, kendini yenileme ve neovaskülarizasyon 15 üzerindeki etkileri için değerlendirilebilir vivo, in EBYS uyuşturucu hassasiyetini değerlendirmek için yeni deneysel modeller sağladığını göstermiştir. Ayrıca, başarılı bir şekilde, T hücresi akut lenfoblastik lösemi, melanoma, ve EBYS 23 de dahil olmak üzere rag2 homozigoz mutant balığa tümörler geniş bir nakledilmiş olması. Geleceğe doğru baktığımızda, biz bu satırları kanser önemli fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için yararlı olacağını tasavvurintra-tümöral heterojenite, işgali, metastaz, anjiyogenez ve tedavi direnci değerlendirilmesi de dahil olmak üzere vivo. Ayrıca, optik açık Casper suşu zebrabalıkları 34 rag2 homozigot mutant balık üretimi muhtemelen bu kanser işaretlerinden çoğunun doğrudan görüntüleme kolaylaştıracaktır.
Toplam olarak, biz yetişkin rag2 homozigot mutant bağışıklık sistemi zayıflamış Zebra balığı normal etiketli-floresan ve malign iskelet kasının başarılı bütünleşme için ayrıntılı protokolleri sağlamak.
Acknowledgments
Bu çalışma Vakfı (DML), Amerikan Kanser Derneği (DML), MGH Howard Goodman Bursu (DML) ve Amerikan Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe Standı Alex'in Limonata tarafından desteklenen R24OD016761 ve 1R01CA154923 (DML). CNY Sitometrisi Çekirdek ve Akış Görüntü Analizi, paylaşılan enstrümantasyon hibe sayısı 1S10RR023440-01A1. IMT Bilim ve Teknoloji Portekizce Vakfı (- FCT Fundação para bir Ciência e Tecnologia) bir burs ile finanse edilmektedir. QT Çin Burs Konseyi tarafından finanse edilmektedir. Biz onu yararlı yorumlar ve tavsiye için Angela Volorio teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-EDTA buffer solution 1x | Sigma-Aldrich | 93283-100ML | Microinjection. Injection mix. |
| Potassium Chloride | Fisher Science Education | S77375-1 | Microinjection. Injection mix. |
| XhoI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0146S | Microinjection. Plasmid linearization. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 (50) or 28106 (250) | Microinjection. For purification of linearized plasmid up to 10 kb. |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | BP1753I-100 | Microinjection. For purification of linearized plasmid. |
| UltraPure Agarose, 500 g | Invitrogen | 16500-500 | Microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx | Microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | flow cytometry/FACS |
| 5 ml polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352058 | flow cytometry collection tube |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | FACS |
| 5 ml polypropylene round bottom tube | BD Falcon | 352063 | FACS collection tube |
| BD LSR II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | flow cytometry |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010-023 | transplantation |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-01 | transplantation |
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Western Chemical Inc. | http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html | Transplantation. Anesthetic. Caution: Irritant. Irritating to eyes, respiratory system, and skin. |
| VWR Absorbent Bench Underpads | VWR | 56616-018 | Transplantation. Regular paper towels or sponge can be used as an alternative. |
| Singe Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | transplantation |
| Petri Dish, Polystryrene Disposable Sterile | VWR | 25384-302 | transplantation |
| Cell Strainer, 40 µm Nylon | Falcon-Corning Incorporated | 352340 | transplantation |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430828 | transplantation |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | transplantation |
| Hemacytometer Set | Hausser Scientific | 1483 | transplantation |
| Hamilton syringe, fixed needle, volume 10 µl, needle size 26s ga (bevel tip) | Hamilton | 80366 | transplantation |
| Austin's A-1 Bleach, Commercial | James Austin Company | Transplantation. Any commercial solution can be used. | |
| Ethanol 190 Proof | Decon Labs, Inc. | DSP-MD.43 | Microinjection (linearized plasmid purification) and transplantation. Any commercial solution can be used. |
| High Speed Microcentrifuge, 300D Digital Microcentrifuge | Denville Scientific Inc. | C0265-24 | transplantation |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | 75004539 | Transplantation. Catalog number for 120 V, 60 Hz (US). |
| 5 ml serological pipets | BD Falcon | 357529 | transplantation |
| Corning Stripettor Plus Pipetting Controller | Corning Incorporated | 4090 | Transplantation. Any automatic pipetting controller can be used. |
| Powder free examination gloves | All steps. Any commercial brand can be used. | ||
| Filter pipet tips and micropipettes | All steps. Any commercial brand can be used. | ||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11205-20 | transplantation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | Scoring. Any appropriate fluorescent stereomicroscope can be used. |
| Olympus DP72 microscope digital camera | Olympus | DP72 | Scoring. Multiple adequate cameras for the selected imaging system can be used. |
References
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29 (11), (2013).
- Boatman, S., Barrett, F., Satishchandran, S., Jing, L., Shestopalov, I., Zon, L. I. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood cells, molecule., & diseases. 51 (4), 271-276 (2013).
- Langenau, D. M., Traver, D., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Yang, H. W., Kutok, J. L., et al. Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish. Cancer Research. , 7256-7262 (2004).
- Patton, E. E., Widlund, H. R., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current Biology. 15 (3), 249-254 (2005).
- Sabaawy, H. E., Azuma, M., Embree, L. J., Tsai, H. -J., Starost, M. F., Hickstein, D. D. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (41), 15166-15171 (2006).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Gene. 21 (11), 1382-1395 (2007).
- Le, X., Langenau, D. M., Keefe, M. D., Kutok, J. L., Neuberg, D. S., Zon, L. I. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
- Park, S. W., Davison, J. M., Rhee, J., Hruban, R. H., Maitra, A., Leach, S. D. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Zhuravleva, J., Paggetti, J., et al. MOZ/TIF2-induced acute myeloid leukaemia in transgenic fish. British journal of haematology. 143 (3), 378-382 (2008).
- Ignatius, M. S., Chen, E. Y., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Suppl Data. Cancer cell. 21 (5), 680-693 (2012).
- Blackburn, J. S., Liu, S., et al. Clonal Evolution Enhances Leukemia-Propagating Cell Frequency. Cancer cell. 25 (3), 366-378 (2014).
- Blackburn, J. S., Langenau, D. M. Zebrafish as a model to assess cancer heterogeneity, progression and relapse. Disease model. 7 (7), 755-762 (2014).
- Zhao, C., Wang, X., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS one. 6 (7), e21768 (2011).
- Chen, E. Y., DeRan, M. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 inhibitors induce the canonical WNT/β-catenin pathway to suppress growth and self-renewal in embryonal rhabdomyosarcoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5349-5354 (2014).
- Yang, X. -J., Cui, W., et al. A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion. PloS one. 8 (4), e61801 (2013).
- Chapman, A., Fernandez del Ama, L., Ferguson, J., Kamarashev, J., Wellbrock, C., Hurlstone, A. Heterogeneous Tumor Subpopulations Cooperate to Drive Invasion. Cell Reports. 8 (8), 1-8 (2014).
- Smith, A. C. H., Raimondi, A. R., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Iyengar, S., Houvras, Y., Ceol, C. J. Screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model. Journal of visualized experiments JoVE. (69), e50086 (2012).
- Mizgireuv, I., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2790 (2011).
- Tang, Q., Abdelfattah, N. S., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature methods. 11, 821-824 (2014).
- Zhou, Q., Facciponte, J., Jin, M., Shen, Q., Lin, Q. Humanized NOD-SCID IL2rg–/– mice as a preclinical model for cancer research and its potential use for individualized cancer therapies. Cancer letters. 344 (1), 13-19 (2014).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental biology. 192 (2), 289-299 (1997).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D. D. D., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), 1-5 (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon PRess. Eugene, OR. (2000).
- Alexander, M. S., Kawahara, G., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors). Muscl, & nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of visualized experiments JoVE. (86), 1-7 (2014).
- Gerli, M. F. M., Maffioletti, S. M., Millet, Q., Tedesco, F. S. Transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration. J Vis Exp. (83), e50532 (2014).
- Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell. The FEBS journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).
- Rowlerson, a, Radaelli, G., Mascarello, F., Veggetti, Regeneration of skeletal muscle in two teleost fish: Sparus aurata and Brachydanio rerio. Cell Tissue Res. 289 (2), 311-322 (1997).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell stem cell. 2 (2), 183-189 (2008).
