Introduction
Estenose aórtica clínica (AS) é bem conhecido para promover um aumento progressivo no ventrículo esquerdo (VE) da pós-carga. Para compensar essa carga hemodinâmica cronicamente crescente, hipertrofia ventricular esquerda (HVE) segue como um 1,2 resposta adaptativa. O desenvolvimento de HVE é frequentemente associada a alterações na microcirculação coronária. Pensa-se que a disfunção microvascular contribui para isquemia crónica nesses pacientes 5. Além de fluxo coronário 3,4, a reserva de fluxo coronário (CFR) representa a mudança funcional das artérias coronárias 1,3 e é definido como a razão da velocidade de fluxo máxima em hiperemia a velocidade de fluxo da linha de base ou de repouso velocidade de fluxo 4,6,7. CFR é diminuída durante a remodelação do VE 1-3,5-9 e é usado como um índice da extensão da gravidade funcional da disfunção coronária 1,10,17. Ele é conhecido por ser prejudicada em muitas formas de cardiomiopatia dilatada 10 e também s coronáriastenosis 6. CFR também é um marcador de prognóstico para desfechos clínicos 12.
Remodelamento do VE no cenário de disfunção cardíaca, como isquemia ou LVH também é acompanhado por extensa fibrose, alterações na microcirculação coronariana e espessamento das artérias coronárias 1,2. Como resultado destas alterações na fisiologia coronária, é provável que exista remodelação das artérias coronárias. Isso ajuda a atenuar os efeitos da baixa difusão de oxigênio e disfunção diastólica do VE que poderia resultar em susceptibilidade a 1,2,13 isquemia miocárdica.
Camundongos geneticamente modificados são agora uma ferramenta de investigação amplamente predominante para imitar condições de doenças humanas, tais como a aterosclerose coronária 5,7,10,12,17. Particularmente o modelo de sobrecarga de pressão em ratos tem sido amplamente estudada 14,17. O modelo de constrição trans-aórtico (TAC) tem demonstrado estar associada com fibrose extensiva, e coronary estenose resultante, em parte, do espessamento médio das artérias coronárias e com acompanhamento de mudanças nos padrões de fluxo coronariano 1,11,17,19 semelhantes ao que é visto no cenário de HVE em seres humanos. Embora se saiba que a sobrecarga de pressão prolongada leva à insuficiência cardíaca descompensada em cerca de 4-8 semanas, os efeitos sobre a dinâmica de fluxo coronariano e reserva de fluxo nesses modelos, no início do processo de progressão da doença, e em diferentes fases após a bandagem, são ainda ser claramente delineados.
Numerosas espécies de ratos estão atualmente disponíveis para fins de pesquisa, incluindo bem caracterizado LDLR - / - ou ApoE - / - ratos 10-12, e estes têm solicitado o desenvolvimento de técnicas sensíveis para avaliar a função cardiovascular e morfologia em ratos vivos 11-15. Essas técnicas incluem ressonância magnética, PET, contraste CT, ultra-som de alta freqüência, e feixe de elétrons tomografia 2,9,17,19, todos os quais oferecem alternativas promissoras para invasivamétodos como cateterismos cardíacos e cineangiocoronariografia 12. No entanto, nos ratos com tamanho muito pequeno das artérias coronárias e os batimentos cardíacos elevados (HR), a imagem latente de circulação coronariana ainda constitui um desafio técnico para muitas técnicas disponíveis atualmente 4,12. Curiosamente, tem havido um aumento exponencial avanços técnicos na área de ecocardiografia transtorácica com Doppler (TTDE), incluindo o desenvolvimento de alta freqüência cabeças de digitalização matriz com frequências centrais de 15 a 50 MHz, permitindo resoluções axiais de aproximadamente 30-100 mm, em profundidades de 8-40 mm, e taxas de quadro superior a 400 quadros-capturado / sec. Por sua vez, as técnicas baseadas em TTDE surgiram como uma ferramenta de enorme potencial para geração de imagens navios maiores 2 ou até menores, como artérias coronárias 5,12.
Outro avanço fundamental que tem permitido os investigadores a realizar estudos de diagnóstico por imagem da vasculatura em um pequenonimals é o uso cuidadosamente controlada de anestésicos que mantêm a frequência cardíaca e respiratória dos animais durante o exame 11. Manutenção da anestesia controlada é particularmente importante para os estudos relacionados à vasodilatação em camundongos, e o efeito da anestesia também precisa ser mais explorado neste contexto 10,11. Nos seres humanos, por outro lado, as medições do CFR TTDE derivados tornaram-se uma ferramenta mais comumente utilizado para avaliação das artérias coronárias epicárdicas estenosadas e não obstruídos, predominantemente na descendente anterior esquerda (LAD) artéria coronária 5,16. No entanto, o papel prognóstico do CFR e mudanças na circulação coronariana em pacientes assintomáticos ou camundongos com função sistólica preservada LV em repouso tem sido muito menos explorado 16. Portanto, o objetivo do estudo foi, primeiramente, estabelecer um protocolo passo-a-passo claro, para avaliar mudanças no fluxo coronariano, por meio TTDE em um modelo de sobrecarga de pressão do mouse; segundo, este estudo examinou o sinal prognósticoificance do CFR e alterações de fluxo coronariano em resposta à pressão estresse sobrecarga nesses camundongos. Nossa hipótese é que a avaliação com base TTDE do CFR e do fluxo coronário pode ser útil na detecção precoce de disfunção coronária que pode preceder a disfunção ventricular esquerda.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos foram realizados em ratos de acordo com a American Veterinary Medical Association (AVMA) orientações e aprovado Institutional Animal Care e usar os comités (IACUC) protocolos.
1. Projeto de Estudo
- Use 8-10 semanas de idade do sexo masculino camundongos C57BL / 6 (BW ~ 25 g) no estudo.
- Aleatória a ratinhos (n = 11) em dois grupos, o grupo de estudo seleccionados para bandeamento aórtico (n = 8), e o grupo de controlo (n = 3) se submeter a operação simulada através de toracotomia.
- Prepare o animal para geração de imagens através da remoção de pêlos do peito usando creme depilatório que é da classe médica.
- Realizar uma primeira ultra-sonografia (seção 2) 24 horas antes da bandagem aórtica para determinar parâmetros basais no dia -1, entre um intervalo de 1% e 2,5% de isoflurano (misturado com 100% de O2 via nosecone) anestesia induzida.
- Escolha um agente anestésico medicamente aprovado (ou seja, o isoflurano) e monitorar o grau de anestesia (2-3% para induce, e 1,0% para manter).
NOTA: a anestesia adequada é essencial para a manutenção dos batimentos cardíacos em taxas fisiológicas normais (cerca de 500 batimentos / min). - Confirmar a profundidade de anestesia por perda de movimento a partir do animal em resposta a um reflexo de pedal retirada. Use pomada paralube veterinário sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia.
- Realizar a cirurgia no Dia 0 20,21.
- Para bandagem aórtica, ligadura da aorta, com uma sutura de seda 7-0 em torno de um cônico 26 G agulha colocada no arco.
Nota: Os detalhes referentes ao protocolo experimental, incluindo os procedimentos de bandagem aórtica cirúrgicos, têm sido descritos anteriormente 20,21. - Realizar imagem de ultra-som pós-cirurgia (seção 2) pelo Dia (s) 2, 6 e 13.
- Eutanásia os ratos no dia 14 e colher os corações para avaliação histológica. Eutanásia dos animais usando uma overdose de pentobarbital seguido por remoção de um órgão vital tal como o coração. Prender os corações em diastole e corrigir com formalina. Use o procedimento da retirada de coração que tem sido descrito anteriormente 22.
- Corrigir todos os tecidos do coração com solução tamponada de formol a 10%. Para trichrome coloração, incorporar tecidos em parafina antes do corte. Use os detalhes de tricromo que têm sido bem ilustrado anteriormente 14,23.
- Analisar os dados utilizando software off-line (seção 3).
2. Imagem Protocol
- Imagens eixo longo e curto da artéria coronária septal (SCA) (Modo B-)
- Usando sonda MS550D com frequência central de 40 MHz conectados à-porta ativa, defina o preset aplicação a "imagem cardíaca".
- Com o supina animais na plataforma aquecida, sob anestesia e controlado através de cone de nariz, posicionar a sonda utilizando o sistema ferroviário obter o paraesternal eixo longo (PSLAX) (Figura 1A). Assegure-se sempre que o animal é mantido quente no Platfor pré-aquecidom e a temperatura do corpo é mantida a níveis fisiológicos.
- Gire a sonda (com entalhe apontando caudally) no sentido horário de tal forma que o ângulo da sonda é de 15 ° com a linha esquerda parasternal (long-eixo view) (Figura 1B).
- Ajustar o ângulo da sonda pela inclinação ligeiramente ao longo do eixo y da sonda para se obter uma vista longitudinal de comprimento completo do SCA no centro da tela (Figura 1B).
- Uma vez que as referências apropriadas (válvula aórtica e da artéria pulmonar) são vistos, loja de cine a imagem utilizando a mais alta taxa de quadros possível.
- Ao utilizar o "xy" eixos micro-manipuladores (Figura 1D), ajuste a posição da sonda para obter a imagem mais clara da SCA.
- Gire a sonda 90 ° (com entalhe apontando caudally) no sentido horário como o efeito dentada da sonda está à esquerda de linha média (eixo curto) (Figura 1C).
- Imagens eixo longo e curto de SCA (Color-Doppler Mode)
- Uma vez que uma imagem de modo B é capturada ou armazenada cine-, clique na tecla Doppler colorido no teclado para ativar a janela acústica Doppler colorido (Figura 2).
NOTA: Este ajuda a isolar artéria coronária (seta branca indica SCA) ou no comprimento (Figura 2A) ou no eixo curto (Figura 2C). A cor vermelha é como pode ser visto em tempo real e é indicativa do sentido do fluxo (para longe da válvula aórtica). - Certifique-se que a profundidade do foco (indicado por uma seta amarela na direita da tela de imagem), encontra-se no centro da artéria coronária.
- Certifique-se de que os dados são gravados, utilizando a tecla cine-store, na maior taxa de quadros possível (> 100 frames / seg).
- Uma vez que uma imagem de modo B é capturada ou armazenada cine-, clique na tecla Doppler colorido no teclado para ativar a janela acústica Doppler colorido (Figura 2).
- PW Doppler Imaging da SCA (Pulsed-Wave ou Modo PW)
- Enquanto estiver no modo cor-Doppler, clique na tecla PW para abrir uma linha amarela-indicador sobre a artéria coronária (Figura 2, mostrada em vermelho).
- Coloque a amareloPW linha no meio da artéria coronária em vista, a um ângulo que é paralela à direccionalidade do fluxo. Note-se que as medidas de velocidade são altamente dependentes do ângulo de aquisição de imagem.
- Ajuste o ângulo do fluxo (tecla ângulo PW) e do volume da amostra (chave SV) de tal forma que a chave ângulo PW é de 60 ° ou menos, e volume de amostra captura fluir bem no centro da SCA.
- Use loja cine para capturar as formas de onda que indicam a velocidade do fluxo coronário no pico sístole (S) e a diástole (D) (figuras 3A e 3B), utilizando 1% e 2,5% de isoflurano.
3. Cálculo e Análise de Dados
- Selecione o tempo de velocidade integral (VTI) ferramenta para obter o sistólica de pico e velocidade diastólica das imagens mostradas nas Figuras 3A e 3B.
- Calcule o índice de reserva de fluxo coronariano (CFR) como a razão de hiperemia (2,5% de isoflurano) pico diastólica fbaixa velocidade de linha de base (1% de isoflurano) velocidade de fluxo diastólica de pico.
- Calcule a razão S / D como a velocidade do fluxo coronário sistólica velocidade do fluxo de pico / pico diastólica coronária. Determinar a proporção na linha de base (isoflurano a 1%) e a hiperemia (2,5% de isoflurano).
- Para os parâmetros padrão da função cardíaca, como a FS, FAC, LVM, consulte os manuais do fabricante para realizar a análise de dados utilizando software proprietário ou consulte JoVE papel de Cheng 2.
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Representative Results
Dos 11 ratos que foram estudados (faixas, n = 8 e sham, n = 3), imagens adequadas e reprodutíveis foram obtidos por um único observador em vários pontos de tempo: na linha de base (D-1), D2, D6 e D13 . Além disso, a velocidade de fluxo no local constritiva foi medida como 2225 ± 110,9 milímetros / s, em comparação com 277,5 ± 10,51 milímetros / s nos ratos sham no dia após a cirurgia (p <0,05). O aumento da velocidade era a verificação do estabelecimento bem sucedido do modelo de sobrecarga de pressão. A velocidade de fluxo SCA, também referido aqui como a velocidade de CF, a CFR, e as relações S / D foram avaliados com êxito na linha de base e durante hiperemia em todos os ratinhos. Mostrado na Figura 3 são as mudanças de FC em ratos sham com menos de 1% e 2,5% de isoflurano. O grupo sham mostrou a velocidade CF diastólica basal de ~ 200 mm / s e hiperemia induzida velocidade CF de> 600 mm / s. O aumento da velocidade CF diastólica e manteve-se 13 dias em todos os ratinhos (n = 3, p> 0,05). Mostradonas Figuras 3E e 3F são as mudanças CF observados nos ratinhos com faixas, a 1% e a 2,5% de isoflurano, respectivamente. Estes murganhos apresentam um padrão semelhante de indução de hiperêmico (2,5%) ao longo da linha de base (1%) CFvelocity. No entanto, neste grupo, a velocidade CF diastólica apresentou um dramático e uma redução sistemática durante o período de avaliação de 14 dias. Especificamente, a velocidade CF diastólica neste grupo foi atenuada entre 600 mm / s (linha de base) para <200 mm / s (Dia 13, pós bandas). A Figura 4B resume a resposta hiperémica como visto em CF mudanças de velocidade, nos dois grupos de ratos, avaliada ao longo de 14 dias.
CFR é calculado como a razão entre a velocidade de fluxo diastólico pico no SCA durante vasodilatação máxima induzida por 2,5% de isoflurano a velocidade de fluxo mínimo de descanso sob isoflurano a 1%. A Figura 4C resume as mudanças observadas em CFR como avaliado no sham e ratos com faixas. Ao contrário do grupo sham, os camundongos com bandas mostraram umaacentuado e contínuo declínio no CFR, a partir de dia 3 após a cirurgia e persistindo até o Dia 13. Esta redução constante CFR foi sugestivo de desregulação coronária progressiva causando uma redução na perfusão miocárdica, presumivelmente induzida pelo aumento da pós-carga devido a bandagem aórtica ( n = 4; p <0,05). Antes de bandas, CFR média para os ratos foi calculada como 2,53 ± 0,47, mas por 13 dias após a bandagem, o CFR no mesmo ratos diminuiu para 0,59 ± 0,27.
O sistólica a relação da velocidade coronária diastólica (relação S / D) representa mais um indicador de disfunção coronária. CF ocorre essencialmente durante a diástole para a sístole comparação. Como tal, a CF em diástole desempenha um papel proeminente na manutenção de 9,15 perfusão miocárdica. Tem sido relatado que distai para o local da estenose coronária, há uma tendência para a igualização de contribuição sistólica e diastólica para CF total de 17. Além disso, uma diferença significativa serrácio tween S / D foi observada entre normais e doentes artérias 18. Um valor de corte da relação S / D como 0,58 foi proposta para distinguir entre lesões significativas e não significativas.
Como mostrado na Figura 5, este S / valor D aumentou significativamente no grupo apenas com faixas, tanto na linha de base e no estado hiperêmico. Houve uma redução significativa da velocidade do fluxo coronário diastólica após a bandagem aórtica. Isso em parte contribuiu para a elevação da relação S / D (D0 a D13, 0,45 ± 0,05-0,83 ± 0,02 na linha de base e 0,27 ± 0,02-,27 ± 0,01 no estado de hiperemia). Como um mecanismo compensatório em resposta à diminuição da alimentação de oxigénio e reduzido perfusão do miocárdio, contractilidade LV aumentou, resultando num aumento concomitante da velocidade de fluxo sistólico coronária (D0 a D13, 89,2 ± 3,2-202,5 ± 0,85 mm / seg).
Os dados de eco foram comparados com dados histopatológicos obtered dos corações que foram colhidos no dia 14, a partir de todos os animais. Esta última técnica é o padrão ouro atual para avaliação da função coronariana 11. Os parâmetros hemodinâmicos avaliados no estudo apresentaram boa correlação com as alterações histopatológicas no SCA mouse. Como mostrado na Figura 6, tricromo de Masson sobre as secções de coração revelou um aumento da fibrose do miocárdio e peri-arterial coronária no grupo em faixas (n = 4) em comparação com o grupo sham (n = 2).
Como mostrado na Figura 7, a variabilidade intra e inter-observadores foi avaliada. Para variabilidade intra-observador, 20 formas de ondas aleatórias e imagens para cada rato foram selecionados para medidas repetidas que foram realizadas uma semana de intervalo. Não houve diferenças significativas nas velocidades de pico medidos. Para variabilidade inter-observador, dois observadores experientes avaliaram as gravações de forma de onda de uma maneira cega. Não houve diferen significativaces nos valores obtidos.
Além disso, não se observaram alterações significativas nos parâmetros ecocardiográficos tradicionais usados para avaliar a função LV ou fisiologia cardíaca durante os 14 dias (Figuras 8 e 9).
Tomados em conjunto, os resultados do estudo revelaram alterações significativas na circulação coronariana na SCA em todos os ratos. Também é digno de nota que o ultra-som baseado em mudanças na CF precedida alterações na função LV convencionalmente avaliadas, reflectindo assim a sensibilidade do método. Embora o estudo foi realizado sobre um número muito pequeno de ratinhos, resulta ainda revelou um alto nível de significância entre os dois grupos no que diz respeito a todos os parâmetros pertinentes.
Figura 1:. A avaliação assistida por ultra-som de fluxo coronário A linha vermelha indica the posição da sonda para a obtenção (A) corte paraesternal longitudinal (PSLAX) do coração, e (B) Modificado paraesternal eixo curto (mod-PSALX). O pontilhado como mostra que ao girar a sonda de 15 ° no sentido horário a partir da posição (A), CF podem ser detectados no SCA, perto de seio aórtico e RVOT; (C) view-eixo curto (SAX) facilita a imagem da CF usando a exibição de nível aórtico (D) A direção xy da sonda é indicado.
Figura 2. O fluxo coronariano (CF) de detecção utilizando os mod-PSLAX e SAX pontos de vista. (A) A vista mod-PSLAX demonstra CF no lúmen da SCA paralelo ao longo eixo do coração, e às 10 horas posição ao longo do IVS, perto de AV (B) A ilustração de mod-PSLAX para indicar o locação de SCA e estruturas adjacentes (c) O eixo curto mostra a origem CF de válvula aórtica para 1 horas posição. (D) A ilustração do eixo curto para facilitar a identificação de SCA. Marcos-chave estão na tabela de abreviaturas.
Figura 3: mudança atenuada do fluxo coronário (CF) de velocidade em camundongos com faixas sob hiperemia comparação com Sham (A) A linha amarela destaca o pico CF em sístole (S) e diástole (D). (B) A ilustração indica que o pico sistólico e velocidade de fluxo diastólica. Também são mostradas as mudanças da CF diastólica nos ratos sham, sob (C) e 1% (D) 2,5% de isoflurano, sugerindo uma indução hyperemic da CF na artéria coronária no grupo sham. A CF diastólica basal detectado é ~ 200 mm / seg e eleva-se a> 600 mm / s sob Alterações hiperemia de CF diastólica em ratinhos com faixas em (E) e 1% (F) 2,5% de isoflurano. Como mostrado neste grupo, as mudanças no (E) antes e depois da hiperemia, foram semelhantes aos do grupo sham. Após formação de bandas, no entanto, (F) foi marcadamente atenuada (a partir de 600 m / s a <200 m / s), particularmente sob a hiperemia.
Figura 4: Comparação da CF velocidade e CFR mudanças na farsa e camundongos em faixas. (A) CF mudança de velocidade em ambos os grupos, sob isoflurano a 1%. A CF foi medida como ~ 200 mm / s em ambos sham e camundongos com faixas, antes da indução da hiperemia. (B) CF mudança de velocidade em camundongos, menos de 2,5% de isoflurano. A velocidade CF foi continuamente reduzida ao longo dos dias seguintes bandagem aórtica. No D13, the CF de farsa e camundongos em faixas mostrou diferença significativa (*: p <0,05). (C) Síntese da mudança no CFR em sham e ratos com faixas. Em comparação com os ratos sham, o CFR de camundongos com bandas diminuiu continuamente, correlacionando-se com a queda na velocidade CF. Esse fenômeno indica aumento de bandas induzida aórtica de pós-carga, o que contribuiu para a disfunção coronária. (N = 8, *: p <0,05). CFR CF = 2,5% / 1,5% CF)
Figura 5: A mudança da relação S / D abaixo de 1% e 2,5% de isoflurano em ratos sham e faixas (A) A mudança da relação S / D em ambos os grupos de não-hiperemia (1% isoflorane).. A relação S / D aumentada, após a cirurgia e foi significativa no D9 e D13, mesmo em repouso (n = 11, *: p <0,05). (B) A mudança da relação S / D em ambos os grupos sob hiperemia (2,5% de isoflurano). A relação S / D também aumentou significativamente após a cirurgia na condição hiperêmico (n = 11, *: p <0,05). Velocidade do fluxo coronário S / D = da velocidade do fluxo sístole / coronariana em diástole.
Figura 6:. Myorcardial e fibrose artéria pericoronary detectado por Masson coloração coloração foi realizada em ratos sham e faixas, duas semanas após a bandagem aórtica. (A) Apenas a fibrose limitada foi observado em meados de cavidade do ventrículo esquerdo em ratos sham (20X). (B) As imagens que apresentaram maior aumento (400X) também mostrou pouca fibrose em torno da área peri-artéria coronária (seta branca indicado fibrose). (C) No coração de rato após bandagem aórtica, o azul área fibrótica aumentou significativamente (20X). Fibrose do miocárdio (D) Peri-coronariana também foi signifvamente aumentada neste grupo (seta) (X400). Os dados histológicos tomados em conjunto correlacionar com a nossa observação baseada eco da disfunção coronária.
Figura 7:. Intra e Inter-observador confiabilidade da medição CF (A) A confiabilidade intra-observador indicaram uma correlação significativa alta (R 2 = 0,92). Confiabilidade (B) A inter-observador também mostrou alta correlação entre diferentes observadores (r 2 = 0,88).
Figura 8:. O coração relação ao peso corporal rácio (HW / BW) e molhado para seco (W / D) relação de peso do pulmão em ratos sham e em faixas (A) HW / BW não foi significativamente diferente entre farsa e faixas camundongos em Dia 15 (n= 11, p> 0,05). (B) A proporção de pulmão W / D foi semelhante nos dois grupos.
Figura 9: A freqüência cardíaca (FC) e parâmetros ecocardiográficos convencionais (A) O HR não se alterou significativamente.. Como mostrado em (B) a fração de ejeção ventricular (FEVE) não foi significativamente reduzida. (C) A fração de encurtamento (FS) foi semelhante nos dois grupos. (D) a massa ventricular esquerda (MVE) não apresentaram diferença significativa entre os dois grupos, em 13 dias de pós-bandas.
| Nome completo | Abreviatura |
| A estenose aórtica | AS |
| Valva aórtica | AV |
| Reserva de fluxo coronariano | CFR |
| A insuficiência cardíaca congestiva | CHF |
| Fração de encurtamento | FS |
| A freqüência cardíaca | HR |
| Coração em relação ao peso corporal | HW / BW |
| Septo interventricular | IVS |
| Átrio esquerdo | LA |
| Descendente anterior | LAD |
| Artéria coronária esquerda | LCA |
| Fração de ejeção ventricular esquerda | FEVE |
| Ventrículo esquerdo | LV |
| A hipertrofia ventricular esquerda | LVH |
| A massa ventricular esquerda | LVM |
| Paraesternal visão de longo eixo | PSLAX |
| Artéria pulmonar | PA |
| Átrio direito | RA |
| Ventrículo direito | RV |
| Vista-eixo curto | SAX |
| Artéria coronária Septal | SCA |
| Sistólica com as taxas de fluxo diastólico | S / D |
| Transthoracic ecoDopplercardiográficos | TTDE |
| Velocidade Tempo Integral | VTI |
| Wet em relação ao peso do pulmão secar | W / D |
Tabela 1: Abreviaturas.
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Discussion
Neste estudo de base de ultra-som, a avaliação não-invasiva da circulação coronária foi reprodutivelmente realizado em tempo real, ao longo de dias, em ratos experimentais vivos; Além disso, o protocolo demonstraram o potencial para detectar a disfunção da artéria coronária que estava presente numa fase precoce e foi associada com deficiência de perfusão miocárdica. Este método poderia finalmente ser aproveitado como uma ferramenta clínica para estratificação de risco cardiovascular e / ou resposta avaliar a intervenção terapêutica.
Em primeiro lugar, um protocolo detalhado é descrito para visualizar as alterações anatômicas e funcionais em artérias coronárias do coração de tamanho pequeno rato, utilizando imagens seqüenciais ao longo do tempo com alta frequência ecocardiograma com Doppler colorido. Com cuidado pré-selecção de um conjunto de janelas acústicas complementares com alta resolução axial, volume da amostra firmemente ajustado e controle de anestesia adequada, qualquer operador (com alguma formação sobre a máquina de ultra-som) pode perform todas as etapas sugeridas do protocolo de imagem, bem como analisa o off-line post-hoc dos dados adquiridos. O método permite a visualização reprodutível de coronária principal esquerda e permite a modulação da função coronariana visualizado. Este protocolo pode ser realizada em pequenos animais, tais como ratinhos ou ratos, com elevadas taxas cardíaca e respiratória. É possível obter dados fiáveis de imagiologia sequencial ao longo de dias ou semanas, o que permite aos investigadores a seguir a função de forma não invasiva e longitudinalmente num determinado modelo experimental.
Em segundo lugar, o estudo procura avaliar pequenos vasos que são críticas para a função cardíaca adequada, através da avaliação das pequenas e início alterações na fisiologia intra-coronária (que ocorrem dentro de minutos), dentro do contexto da situação geral da fisiologia cardíaca (por exemplo, a função do VE). Os passos do protocolo pode ser realizada de um modo não-invasivo, preciso e reprodutível. As medidas obtidas em tempo realpode ser obtido por qualquer operador com alguma formação sobre o funcionamento da máquina e a anatomia básica. Além disso, os índices específicos aqui medidos vasculares, tais como CFR e S / D, podem ser obtidos através de qualquer software de medição off-line, e não só o software proprietário fornecido pelo fabricante do equipamento. Estes índices pode ser adicionalmente aplicado para qualquer modelo animal de interesse, tais como a ApoE - / - ou LDR R - / -, os modelos que podem ser usados para o estudo da aterosclerose. Portanto, o método representa uma ferramenta altamente traduzível para utilização em estudos de uma variedade de fenótipos cardiovasculares.
A novidade do método reside na sua agilidade. Também é facilmente modificável por meio de pequenos ajustes, como mudar colocação da sonda, escolha de freqüência de sonda (maior centro de frequência deve ser escolhido para a avaliação de fluxo de baixa velocidade, tais como estudos de isquemia), amostras de volume (menor rendimento amostras de volume mais preciso avaliação de pico) e correção de ângulo (0 ° a 60 °Ângulo PW, mais próximo de 0 ° é mais preciso), de tal modo que qualquer operador pode ser treinado para obter velocidades absolutas precisas da artéria coronária, de septo ou o principal esquerda, seguindo os marcos anatômicos, tais como PA ou raiz da aorta.
Pequenas e temporais mudanças podem ser geralmente difíceis de medir e pode envolver um alto índice de erros, relacionadas a alterações fisiológicas na respiração ou batimentos cardíacos. Solução de problemas geralmente envolve a identificação de pontos de referência apropriados proximal a origem da artéria e manutenção da frequência cardíaca coronária fisiológico normal. Ao monitorizar a fisiologia animal utilizando uma ferramenta de monitorização do sinal do ECG, que está associado com o aparelho de imagem, o protocolo permite que qualquer operador para monitorizar o efeito de qualquer potencial vasomodulador (vasoconstritor ou dilatador), durante o exame.
Proper escolha, via e dose dos níveis de anestesia podem ser considerados como determinantes críticos adequada estimativa da dinâmica de fluxo. Um limitatino do estudo poderia ser a utilização de isoflurano. É conhecido por causar depressão cardíaca e alterar o diâmetro do lúmen em alguns estudos de um modo dependente da dose 7,10. No entanto, as imagens neste estudo são obtidos em poucos minutos, e por meio de um sistema de anestesia rigidamente controlada, pode-se estimar com precisão CF, CFR e S / D, em qualquer estado de fisiologia do mouse incluindo hipóxia, normoxia, vasodilatação, ou constrição vascular, com efeito mínimo de freqüência cardíaca. Outra limitação é a falta de padrão de ouro na correlação entre a RFC e artéria coronária de diâmetro de lumen in vivo em ratinhos, devido ao volume muito pequeno da amostra que pode ser obtido a partir de ratos. No entanto, como demonstrado em humanos este inconveniente pode ser resolvida pela avaliação histológica da morfologia coronária com ecocardiografia quantitativa para adquirir o diâmetro da artéria coronária 4,24.
Usando todos os passos necessários descritos no protocolo de imagem (Passo 2.1.1-2.3.4), CFR e S/ D valores da relação em camundongos são obtidos em poucos minutos. Imagens de alta qualidade renderizar os dados robusta e com baixa variabilidade intra e inter-observador.
Em resumo, o protocolo de imagem, aqui delineado, fornece uma ferramenta de diagnóstico preciso representando uma alternativa às opções invasivos existentes, tais como cateterismo coronariano, Doppler-wire ou estudos histopatológicos post-mortem.
Tomados em conjunto, os resultados deste estudo demonstram que um método não-invasivo de avaliação funcional coronariana como ferramenta de diagnóstico clínico factível e viável, que pode ser usado em pesquisas com animais pequenos. Tal método não-invasivo poderia ajudar a minimizar substancialmente a exigência do uso de animais, a eutanásia, ou necropsia em modelos experimentais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Depilatory cream | Miltex, Inc. | Surgi-Prep | Apply 24 hours prior to imaging |
| Isoflurane | Baxter International Inc. | NDC 10019-773-40 | 2-3% for induction, and 1-1.5 % for maintenance; heart beats will be maintained at above 500 beats per minute |
| High Frequency Ultrasound | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | Vevo 2100 | |
| High-frequency Mechanical Transducer | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | MS250, MS550D, MS400 |
References
- Yang, F., et al. Coronary artery remodeling in a model of left ventricular pressure overload is influenced by platelets and inflammatory cells. PloS one. 7, e40196 (2012).
- Cheng, H. W., et al. Assessment of right ventricular structure and function in mouse model of pulmonary artery constriction by transthoracic echocardiography. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51041 (2014).
- Meimoun, P., et al. Factors associated with noninvasive coronary flow reserve in severe aortic stenosis. Journal of the American Society of Echocardiography : official publication of the American Society of Echocardiography. 25, 835-841 (2012).
- Bratkovsky, S., et al. Measurement of coronary flow reserve in isolated hearts from mice. Acta physiologica Scandinavica. 181, 167-172 (2004).
- Wu, J., Zhou, Y. Q., Zou, Y., Henkelman, M. Evaluation of bi-ventricular coronary flow patterns using high-frequency ultrasound in mice with transverse aortic constriction. Ultrasound in medicine & biology. 39, 2053-2065 (2013).
- Hartley, C. J., et al. Effects of isoflurane on coronary blood flow velocity in young, old and ApoE(-/-) mice measured by Doppler ultrasound. Ultrasound in medicine & biology. 33, 512-521 (2007).
- Hartley, C. J., et al. Doppler estimation of reduced coronary flow reserve in mice with pressure overload cardiac hypertrophy. Ultrasound in medicine & biology. 34, 892-901 (2008).
- Saraste, A., et al. Coronary flow reserve and heart failure in experimental coxsackievirus myocarditis. A transthoracic Doppler echocardiography study. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H871-H875 (2006).
- Scherrer-Crosbie, M., Thibault, H. B. Echocardiography in translational research: of mice and men. Journal of the American Society of Echocardiography : official publication of the American Society of Echocardiography. 21, 1083-1092 (2008).
- Caiati, C., Montaldo, C., Zedda, N., Bina, A., Iliceto, S. New noninvasive method for coronary flow reserve assessment: contrast-enhanced transthoracic second harmonic echo Doppler. Circulation. 99, 771-778 (1999).
- Barrick, C. J., Rojas, M., Schoonhoven, R., Smyth, S. S., Threadgill, D. W. Cardiac response to pressure overload in 129S1/SvImJ and C57BL/6J mice: temporal- and background-dependent development of concentric left ventricular hypertrophy. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 292, H2119-H2130 (2007).
- Wikstrom, J., Gronros, J., Gan, L. M. Adenosine induces dilation of epicardial coronary arteries in mice: relationship between coronary flow velocity reserve and coronary flow reserve in vivo using transthoracic echocardiography. Ultrasound in medicine & biology. 34, 1053-1062 (2008).
- Snoer, M., et al. Coronary flow reserve as a link between diastolic and systolic function and exercise capacity in heart failure. European heart journal cardiovascular Imaging. 14, 677-683 (2013).
- Gan, L. M., Wikstrom, J., Fritsche-Danielson, R. Coronary flow reserve from mouse to man--from mechanistic understanding to future interventions. Journal of cardiovascular translational research. 6, 715-728 (2013).
- Mahfouz, R. A. Relation of coronary flow reserve and diastolic function to fractional pulse pressure in hypertensive patients. Echocardiography (Mount Kisco, N.Y). 30, 1084-1090 (2013).
- Kawata, T., et al. Prognostic value of coronary flow reserve assessed by transthoracic Doppler echocardiography on long-term outcome in asymptomatic patients with type 2 diabetes without overt coronary artery disease). Cardiovascular diabetology. 12, 121 (2013).
- Miller, D. D., Donohue, T. J., Wolford, T. L., Kern, M. J., Bergmann, S. R. Assessment of blood flow distal to coronary artery stenoses. Correlations between myocardial positron emission tomography and poststenotic intracoronary Doppler flow reserve. Circulation. 94, 2447-2454 (1996).
- Wada, T., et al. Coronary flow velocity reserve in three major coronary arteries by transthoracic echocardiography for the functional assessment of coronary artery disease: a comparison with fractional flow reserve. European heart journal cardiovascular Imaging. 15, 399-408 (2014).
- Hartley, C. J., et al. Doppler velocity measurements from large and small arteries of mice. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 301, H269-H278 (2011).
- Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. Journal of visualized experiments : JoVE. , 1729 (2010).
- Rockman, H. A., Wachhorst, S. P., Mao, L., Ross, J. ANG II receptor blockade prevents ventricular hypertrophy and ANF gene expression with pressure overload in mice. American Journal of Physiology. , H2468-H2475 (1994).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of visualized experiments : JoVE. , 2581 (2011).
- Niu, X., et al. beta3-adrenoreceptor stimulation protects against myocardial infarction injury via eNOS and nNOS activation. PloS one. 9, e98713 (2014).
- Ross, J. J., Ren, J. F., Land, W., Chandrasekaran, K., Mintz, G. S. Transthoracic high frequency (7.5 MHz) echocardiographic assessment of coronary vascular reserve and its relation to left ventricular mass. Journal of the American College of Cardiology. 16, 1393-1397 (1990).
