Introduction
Estenosis aórtica Clínica (AS) es bien conocido por promover un aumento progresivo en ventricular izquierda (LV) poscarga. Para compensar este aumento de la carga hemodinámica crónica, hipertrofia ventricular izquierda (HVI) se produce como una respuesta adaptativa 1,2. El desarrollo de la HVI se asocia a menudo con alteraciones en la microcirculación coronaria. Se piensa que la disfunción microvascular contribuye a la isquemia crónica en estos pacientes 5. Además de flujo coronario 3,4, la reserva de flujo coronario (CFR) representa el cambio funcional de las arterias coronarias 1,3 y se define como la relación de la velocidad de flujo máxima en la hiperemia de la velocidad de flujo de línea de base o descansando velocidad de flujo 4,6,7. CFR se disminuyó durante LV remodelación 1-3,5-9 y se utiliza como un índice del grado de gravedad de la disfunción funcional coronaria 1,10,17. Se sabe que hay impedimento en muchas formas de miocardiopatía dilatada 10 y también s coronariastenosis 6. CFR es también un marcador pronóstico de pobres resultados clínicos 12.
La remodelación del VI en el contexto de la disfunción cardiaca tales como isquemia o HVI también se acompaña de fibrosis extensa, los cambios en la microcirculación coronaria y engrosamiento de las arterias coronarias 1,2. Como resultado de estos cambios en la fisiología coronaria, es probable remodelación de las arterias coronarias. Esto ayuda a mitigar los efectos de la difusión de oxígeno baja y disfunción diastólica del VI que podría resultar en la susceptibilidad a 1,2,13 isquemia miocárdica.
Ratones genéticamente modificados son ahora una herramienta de investigación muy extendido para imitar las condiciones de enfermedades humanas como la aterosclerosis coronaria 5,7,10,12,17. En particular, el modelo de sobrecarga de presión en ratones ha sido ampliamente estudiado 14,17. El modelo de constricción trans-aórtica (TAC) se ha demostrado que se asocia con fibrosis extensa, y coronary estenosis resultante, en parte, de engrosamiento de la media de las arterias coronarias y con el acompañamiento de los cambios en los patrones de flujo coronario 1,11,17,19 similares a lo que se ve en el contexto de la HVI en los seres humanos. Aunque se sabe que la sobrecarga de presión prolongada conduce a la insuficiencia cardiaca descompensada en alrededor de 4-8 semanas, los efectos sobre la dinámica de flujo y la reserva de flujo coronario en estos modelos, temprano en el proceso de progresión de la enfermedad, y en diferentes etapas después de bandas, son todavía estar claramente delineado.
Numerosas cepas de ratones están disponibles actualmente para su uso en investigación, incluyendo la bien caracterizada LDLR - / - o ApoE - / - ratones 10-12, y estos han impulsado el desarrollo de técnicas sensibles para evaluar la función cardiovascular y la morfología en ratones vivos 11-15. Tales técnicas incluyen MRI, PET, contraste CT, ultrasonidos de alta frecuencia, y tomografía de haz de electrones 2,9,17,19, todos los cuales proporcionan alternativas prometedoras a invasivamétodos tales como cateterismos cardíacos y la angiografía coronaria 12. Sin embargo, en ratones con muy pequeño tamaño de las arterias coronarias y las altas tasas de corazón (HR), imágenes de la circulación coronaria sigue constituyendo un reto técnico para muchas técnicas disponibles en la actualidad 4,12. Curiosamente, se ha producido un aumento exponencial de los avances técnicos en el campo de la ecocardiografía Doppler transtorácica (EDT), incluyendo el desarrollo de alta frecuencia cabezales del escáner matriz con frecuencias centrales de 15 a 50 MHz que permite resoluciones axiales de aproximadamente 30 a 100 micras, a profundidades de 8-40 mm, y velocidades de fotogramas-capturados cuadros / seg mayor que 400. A su vez, las técnicas basadas en TTDE han surgido como una herramienta potencialmente poderosa para obtener imágenes de los vasos más grandes 2 o incluso más pequeños, tales como arterias coronarias 5,12.
Otro avance importante que ha permitido a los investigadores a realizar estudios de diagnóstico por imágenes de la vasculatura en un pequeñonimals es el uso cuidadosamente controlada de anestésicos que mantienen el corazón y el ritmo respiratorio de los animales durante la formación de imágenes 11. Mantenimiento anestesia controlada es particularmente importante para los estudios relacionados con la vasodilatación en ratones, y el efecto de la anestesia también tiene que estudiar más a fondo en este contexto 10,11. En los seres humanos, por otro lado, las mediciones CFR derivados de TTDE se han convertido en una herramienta más comúnmente utilizado para la evaluación de las arterias coronarias epicárdicas estenosis y no obstruido, predominantemente en descendente anterior izquierda (LAD) de la arteria coronaria 5,16. Sin embargo, el papel pronóstico de CFR y cambios en el flujo coronario en pacientes asintomáticos o ratones con preservada la función sistólica del VI en reposo ha sido mucho menos explorado 16. Por lo tanto, el objetivo del estudio fue establecer primero un protocolo claro paso a paso, para evaluar los cambios en el flujo coronario mediante TTDE en un modelo de ratón de la sobrecarga de presión; en segundo lugar, este estudio examinó el signo de pronósticoificance de CFR y cambios en el flujo coronario en respuesta a la presión de sobrecarga de estrés en estos ratones. La hipótesis de que la evaluación basada TTDE de CFR y el flujo coronario puede ser útil en la detección precoz de la disfunción coronaria que puede preceder a la disfunción del VI.
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Protocol
NOTA: Todos los procedimientos se realizaron en ratones de acuerdo con la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (AVMA) directrices y aprobados Institucional Use Comités (IACUC) protocolos y Cuidado de Animales.
1. Diseño del estudio
- Utilice 8-10 semanas de edad macho C57BL / 6 ratones (BW ~ 25 g) en el estudio.
- Selección aleatoria de los ratones (n = 11) en dos grupos, el grupo de estudio seleccionado por constricción aórtica (n = 8), y el grupo de control (n = 3) a someterse a operación simulada a través de toracotomía.
- Preparar el animal para obtener imágenes por eliminar el vello del pecho usando crema depilatoria que es de grado médico.
- Realizar una primera ultrasonido (sección 2) 24 horas antes de la constricción aórtica para determinar los parámetros de línea de base en el Día -1, entre una gama de 1% y 2,5% de isoflurano (mezclado con 100% de O 2 a través de ojiva) inducida por la anestesia.
- Elegir un agente anestésico aprobado médicamente (es decir, isoflurano) y monitorear el grado de anestesia (2.3% a induce, y 1,0% para mantener).
NOTA: la anestesia adecuada es crucial en el mantenimiento de los latidos del corazón a tasas fisiológicas normales (alrededor de 500 latidos / min). - Confirmar la profundidad de la anestesia por pérdida de movimiento del animal en respuesta a un reflejo pedal-retiro. Use ungüento veterinario paralube en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
- Realizar cirugía en el día 0 20,21.
- Para aórtica, ligar la aorta utilizando una sutura de seda 7-0 alrededor de una cónica 26 G aguja que se coloca en el arco.
NOTA: Los detalles relativos al protocolo experimental, incluidos los procedimientos de bandas aórticas quirúrgicos, se han descrito anteriormente 20,21. - Realizar ecografía posterior a la cirugía (sección 2) en el Día (s) 2, 6 y 13.
- La eutanasia a los ratones en el día 14 y la cosecha de los corazones para la evaluación histológica. La eutanasia a los animales mediante una sobredosis de pentobarbital seguido de la eliminación de un órgano vital como el corazón. Arresto los corazones en diastole y fijar con formalina. Utilice el procedimiento de la recolección de corazón que ha sido descrito previamente 22.
- Fijar todos los tejidos del corazón con buffer solución de formalina al 10%. Para tricrómico tinción, incrustar tejidos en parafina antes de seccionar. Utilice los detalles de tricrómico tinción que han sido bien ilustrado anteriormente 14,23.
- Analizar los datos utilizando software sin conexión (sección 3).
2. Protocolo Imaging
- Imágenes largas y cortas de los ejes de la arteria coronaria septal (SCA) (Modo B)
- El uso de la sonda MS550D con frecuencia central de 40 MHz conectados al puerto activo, establecer la aplicación preestablecido a "imagen cardiaca".
- Con la supina animal sobre la plataforma calentada, y bajo anestesia controlada a través de cono de la nariz, la posición de la sonda usando el sistema ferroviario para obtener el paraesternal eje largo (PSLAX) (Figura 1A). Asegúrese siempre de que el animal se mantiene caliente en la platfor precalentadom y la temperatura corporal se mantiene a niveles fisiológicos.
- Girar la sonda (con la muesca apuntando caudalmente) en sentido horario tal que el ángulo de la sonda es 15 ° a la línea izquierda paraesternal (eje largo vista) (Figura 1B).
- Ajuste el ángulo de la sonda por la inclinación ligeramente a lo largo del eje y de la sonda para obtener una vista longitudinal de longitud completa de la SCA en el centro de la pantalla (Figura 1B).
- Una vez que los puntos de referencia apropiados (válvula aórtica y la arteria pulmonar) son vistos, tienda de cine la imagen utilizando la más alta frecuencia de imagen posible.
- Mediante el uso de la "xy" ejes micromanipuladores (Figura 1D), ajustar la posición de la sonda para obtener la imagen más clara de la SCA.
- Gire la sonda 90 ° (con la muesca apuntando en dirección caudal) en sentido horario tal que el extremo con muescas de la sonda está a la izquierda de la línea media (eje corto) (Figura 1 C).
- Imágenes largas y cortas de los ejes de SCA (Color-Doppler Mode)
- Una vez que una imagen de modo B es capturado o almacena cine-, haga clic en la tecla Doppler color en el teclado para activar el Doppler color de la ventana acústica (Figura 2).
NOTA: Este ayuda a aislar la arteria coronaria (flecha blanca indica SCA) o bien en el largo (Figura 2A) o en el eje corto (Figura 2C). Color rojo es como se ve en tiempo real y es indicativo de la dirección del flujo (lejos de la válvula aórtica). - Asegúrese de que la profundidad de enfoque (indicado por una punta de flecha amarilla en la derecha de la pantalla de la imagen), se encuentra en el centro de la arteria coronaria.
- Asegúrese de que los datos se graban utilizando la tecla cine-tienda, en la más alta velocidad de cuadro posible (> 100 imágenes / seg).
- Una vez que una imagen de modo B es capturado o almacena cine-, haga clic en la tecla Doppler color en el teclado para activar el Doppler color de la ventana acústica (Figura 2).
- PW Doppler Imaging de SCA (Pulsada-Wave o Modo PW)
- Mientras que en el modo Doppler color, haga clic en la tecla de PW para que aparezca una línea amarilla-indicador de la arteria coronaria (Figura 2, se muestra en rojo).
- Coloque el amarilloLínea de PW en el medio de la arteria coronaria a la vista, en un ángulo que es paralela a la direccionalidad del flujo. Tenga en cuenta que las mediciones de velocidad son altamente dependientes del ángulo de adquisición de imágenes.
- Ajustar el ángulo de flujo (clave ángulo PW) y volumen de la muestra (clave SV) de tal manera que la tecla PW ángulo es de 60 ° o menos y el volumen de muestra fluya captura justo en el centro de la SCA.
- Usar el almacén de cine para capturar las formas de onda que indican la velocidad del flujo coronario en la sístole (S) de pico y la diástole (D) (Figuras 3A y 3B), usando 1% y el 2,5% de isoflurano.
3. Cálculo y Análisis de Datos
- Seleccione el tiempo de la velocidad herramienta integral (VTI) para obtener el pico sistólica y diastólica velocidades de las imágenes mostradas en las Figuras 3A y 3B.
- Calcular el índice de reserva de flujo coronario (CFR) como la relación de hiperémica (2,5% de isoflurano) pico diastólica fbaja velocidad de la línea de base (1% isoflurano) flujo diastólico pico.
- Calcular la relación S / D como la velocidad de flujo coronario sistólica / velocidad de flujo máximo pico diastólica coronaria. Determine la relación al inicio (1% de isoflurano) y en hiperemia (2,5% de isoflurano).
- Para los parámetros estándar de función cardiaca tales como FS, FAC, LVM, consulte los manuales del fabricante para realizar análisis de datos utilizando el software propietario o se refieren a papel JoVe de Cheng 2.
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Representative Results
De los 11 ratones que fueron estudiados (anillados, n = 8 y la falsa, n = 3), se obtuvieron imágenes adecuadas y reproducibles por un solo observador en varios puntos de tiempo: al inicio del estudio (D-1), D2, D6 y D13 . Además, la velocidad de flujo en el sitio constrictiva se midió como 2,225 ± 110,9 mm / s, en comparación con 277,5 ± 10,51 mm / s en los ratones sham en el día después de la cirugía (p <0,05). El aumento en la velocidad era la verificación de la creación exitosa del modelo de sobrecarga de presión. La velocidad de flujo SCA, también denominado aquí como la velocidad de CF, la CFR, y las relaciones S / D se evaluaron con éxito al inicio del estudio y bajo hiperemia en todos los ratones. Se muestra en la Figura 3 son cambios CF en ratones sham menores de 1% y el 2,5% de isoflurano. El grupo de tratamiento simulado mostró la velocidad CF diastólica inicial de ~ 200 mm / s y la hiperemia inducida por la velocidad de CF> 600 mm / s. El aumento en la velocidad CF diastólica y se mantuvo en 13 días en todos los ratones (n = 3, p> 0,05). Mostradoen las Figuras 3E y 3F son los cambios CF observados en los ratones en bandas, a 1% y en 2,5% de isoflurano, respectivamente. Estos ratones muestran un patrón similar de inducción de hiperémica (2,5%) sobre la línea base (1%) CFvelocity. Sin embargo, en este grupo, la velocidad diastólica CF mostró una dramática y una reducción sistemática a lo largo del período de evaluación de 14 días. Específicamente, la velocidad CF diastólica en este grupo fue atenuada de 600 mm / s (línea de base) a <200 mm / seg (Día 13, poste bandas). Figura 4B resume la respuesta hiperémica como se ve en los cambios de velocidad CF, en los dos grupos de ratones, evaluaron más de 14 días.
CFR se calcula como la relación de la velocidad del flujo diastólico pico en el SCA durante la vasodilatación máxima inducida por 2,5% de isoflurano a la velocidad de flujo descansando bajo mínimo 1% de isoflurano. Figura 4C resume los cambios observados en CFR como se evaluó en el farsa y ratones bandas. A diferencia del grupo de simulación, los ratones mostraron una anilladasmarcado y continuo descenso en el CFR, comenzando en el día 3 después de la cirugía y que persiste hasta el día 13. Esta reducción constante CFR era sugestivo de desregulación coronaria progresiva que causa una reducción de la perfusión miocárdica, probablemente inducido por el aumento de la poscarga debido a la constricción aórtica ( n = 4, p <0,05). Antes de anillamiento, CFR media de los ratones se calculó como 2,53 ± 0,47, pero por 13 días después de anillamiento, el CFR en los mismos ratones se redujo a 0,59 ± 0,27.
El sistólica diastólica relación de velocidad coronaria (relación S / D) representa otro indicador de la disfunción coronaria. CF se produce esencialmente durante la diástole en comparación con la sístole. Como tal, CF en diástole juega un papel destacado en el mantenimiento de 9,15 perfusión miocárdica. Se ha informado de que distal al sitio de la estenosis coronaria, hay una tendencia hacia una igualación de la contribución sistólica y diastólica a CF total de 17. Además, una diferencia significativa searelación S / D tween se ha observado entre las arterias normales y enfermos 18. Se propuso un valor de corte de la relación S / D como 0,58 para distinguir entre lesiones significativas y no significativas.
Como se muestra en la Figura 5, este valor de S / D aumentó significativamente en el grupo de bandas solamente, tanto en la línea de base y en el estado hiperémico. Hubo una reducción significativa de la velocidad de flujo coronario diastólica después de estrechamiento aórtico con banda. Esto en parte contribuyó a la elevación de la relación S / D (D0 a D13, 0,45 ± 0,05 a 0,83 ± 0,02 en la línea de base y 0,27 ± 0,02 a 0,27 ± 0,01 en el estado hiperémico). Como un mecanismo de compensación en respuesta a la disminución de suministro de oxígeno y la reducción de la perfusión miocárdica, la contractilidad del VI aumentó, lo que resulta en un aumento concomitante de la velocidad de flujo sistólico coronaria (D0 a D13, 89,2 ± 3,2 a 202,5 ± 0,85 mm / seg).
Los datos de eco se comparaban con los datos histopatológicos obtenered de los corazones que fueron cosechados en el día 14, a partir de todos los animales. Esta última técnica es el actual estándar de oro para la evaluación de la función coronaria 11. Los parámetros hemodinámicos evaluados en el estudio correlacionan bien con los cambios histopatológicos en el SCA ratón. Como se muestra en la Figura 6, la tinción de tricrómico de Masson en las secciones de corazón reveló un aumento de la fibrosis miocárdica y arterial peri-coronaria en el grupo de bandas (n = 4) comparado con el grupo de tratamiento simulado (n = 2).
Como se muestra en la Figura 7, se evaluó la variabilidad intra e inter-observador. Para la variabilidad intra-observador, se seleccionaron 20 formas de onda aleatorias e imágenes para cada ratón para mediciones repetidas que se realizaron una semana de diferencia. No hubo diferencias significativas en las velocidades de pico medidos. Para variabilidad entre observadores, dos observadores experimentados evaluaron las grabaciones de forma de onda en una forma ciega. No hubo diferen significativaces en los valores obtenidos.
Además, no se observaron cambios significativos en los parámetros ecocardiográficos tradicionales utilizados para evaluar la función ventricular izquierda o la fisiología del corazón durante los 14 días (Figuras 8 y 9).
Tomados en conjunto, los resultados del estudio revelaron cambios significativos en la circulación coronaria en el SCA en todos los ratones. También es de destacar que los ultrasonidos-cambios basados en la FQ precedidos cambios en la función LV convencionalmente evaluado, lo que refleja la sensibilidad del método. Aunque el estudio se realizó en un número muy pequeño de los ratones, los resultados todavía revelaron un alto nivel de significación entre los dos grupos con respecto a todos los parámetros pertinentes.
Figura 1:. La evaluación basada en ultrasonido del flujo coronario La línea roja indica ªe posición de la sonda para la obtención de (A) del eje largo paraesternal (PSLAX) del corazón, y (B) Modificado paraesternal eje corto (mod-PSALX). El salpicado como muestra que al girar la sonda 15 ° a la derecha de la posición (A), CF se puede detectar en el SCA, cerca de seno aórtico y VSVD; (C) vista de eje corto (SAX) facilita la obtención de imágenes de CF utilizando la vista a nivel de la aorta transversal (D) La dirección xy de la sonda se indica.
Figura 2. El flujo coronario (CF) de detección usando los puntos de vista mod-PSLAX y SAX. (A) La vista mod-PSLAX demuestra CF en el lumen de la SCA paralelo al eje largo del corazón, y en diez posición a lo largo del IVS, cerca de AV (B) La ilustración de mod-PSLAX para indicar la locación de SCA y las estructuras circundantes (C) El eje corto muestra el origen CF de la válvula aórtica hacia 1 en punto. (D) La ilustración de eje corto para facilitar la identificación de SCA. Principales puntos de interés están en la tabla de abreviaturas.
Figura 3: cambio atenuada de flujo coronario (CF) de velocidad en ratones bandas bajo hiperemia en comparación con Sham (A) La línea amarilla destaca el pico CF en sístole (S) y diástole (D). (B) La ilustración indica la sistólica máxima y la velocidad del flujo diastólico. También se muestran los cambios de CF diastólica en los ratones sham, bajo (C) 1% y (D) 2,5% isoflurano que sugieren una inducción de hiperemia de la FQ en la arteria coronaria en el grupo de tratamiento simulado. El CF diastólica inicial detectada es de ~ 200 mm / seg y se eleva a> 600 mm / seg bajo hiperemia Cambios de CF diastólica en ratones bandas bajo (E) 1% y (F) 2,5% de isoflurano. Como se muestra en este grupo, los cambios en (E) antes y después de la hiperemia, fueron similares con el grupo simulado. Después de bandas, sin embargo, (F) se atenuó marcadamente (de 600 m / seg a <200 m / seg), en particular bajo hiperemia.
Figura 4: Comparación de los CF de velocidad y CFR cambios en farsa y ratones bandas. Cambio de velocidad (A) CF en ambos grupos, menos del 1% de isoflurano. El CF se midió como ~ 200 mm / s tanto en farsa y ratones en bandas, antes de la inducción de hiperemia. (B) cambio de velocidad CF en ratones, por debajo de 2,5% isoflurano. La velocidad de CF se redujo continuamente durante días siguientes aórtica. En D13, THe CF de farsa y ratones bandas mostró diferencias significativas (*: p <0,05). (C) Resumen del cambio de CFR en farsa y ratones bandas. En comparación con los ratones farsa, el CFR de ratones bandas disminuyó continuamente, en correlación con la caída en la velocidad CF. Este fenómeno indica inducida bandas aumento de la poscarga aórtica y esto contribuyó a la disfunción coronaria. (N = 8, *: p <0,05). CFR = 2,5% CF / CF 1,5%)
Figura 5: El cambio de la relación S / D por debajo del 1% y el 2,5% de isoflurano en farsa y ratones bandas (A) El cambio de relación S / D en ambos grupos a no hiperemia (1% isoflorane).. La relación S / D se incrementó después de la cirugía y fue significativa en D9 y D13, incluso en reposo (n = 11, *: p <0,05). (B) El cambio de la relación S / D en ambos grupos de bajo hiperemia (2,5% de isoflurano). La relación S / D también aumentó significativamente después de la cirugía en la condición hiperémica (n = 11, *: p <0,05). Velocidad de flujo coronario S / D = velocidad de flujo en sístole / diástole coronaria en.
Figura 6:. Myorcardial y fibrosis arteria pericoronario detectado por Masson Trichrome tinción La tinción se realizó en ratones sham y bandas, dos semanas después de estrechamiento aórtico con banda. (A) Sólo fibrosis limitada se observó a mediados de la cavidad del VI en ratones sham (20X). (B) Las imágenes bajo un aumento mayor (400X) también mostraron escasa fibrosis alrededor de la zona peri-arteria coronaria (flecha blanca indica fibrosis). (C) En el corazón de ratón siguiente aórtica, la zona fibrótica azul aumentó significativamente (20X). Fibrosis arteria (D) Peri-coronaria también era signifcativamente aumentada en este grupo (punta de flecha) (X400). Los datos histológicos toman juntos correlacionan con nuestra observación basada en el eco de la disfunción coronaria.
Figura 7:. Intra e inter-observador fiabilidad de la medición CF (A) La fiabilidad intraobservador indicaron alta una correlación significativa (R 2 = 0,92). Fiabilidad (B) La inter-observador también mostró una alta correlación entre diferentes observadores (R 2 = 0,88).
Figura 8:. La relación de corazón a la relación peso corporal (HW / BW) y húmedo a seco (W / D) peso del pulmón en farsa y ratones bandas (A) HW / BW no fue significativamente diferente entre los ratones sham y bandas en el Día 15 (n= 11, p> 0,05). (B) La relación de pulmón W / D fue similar en ambos grupos.
Figura 9: La frecuencia cardíaca (FC) y los parámetros ecocardiográficos convencionales (A) La HR no varió significativamente.. Como se muestra en (B) la fracción de eyección ventricular izquierda (FEVI) no se redujo significativamente. (C) el acortamiento fraccional (FS) fue similar en los dos grupos. (D) de la masa ventricular izquierda (MVI) no mostraron diferencias significativas en los dos grupos, a los 13 días después de la Franja.
| Nombre completo | Abreviatura |
| La estenosis aórtica | COMO |
| Válvula aórtica | AV |
| Reserva de flujo coronario | CFR |
| Insuficiencia cardíaca congestiva | CHF |
| Fracción de acortamiento | FS |
| La frecuencia cardíaca | HR |
| Corazón relación de peso corporal para | HW / BW |
| Septum interventricular | IVS |
| Aurícula izquierda | Los Ángeles |
| Descendente anterior izquierda | LAD |
| Arteria coronaria izquierda | LCA |
| Fracción de eyección ventricular izquierda | FEVI |
| Ventrículo izquierdo | LV |
| La hipertrofia ventricular izquierda | HVI |
| La masa del ventrículo izquierdo | LVM |
| Paraesternal eje largo | PSLAX |
| Arteria pulmonar | Pensilvania |
| Aurícula derecha | RA |
| El ventrículo derecho | RV |
| Vista de eje corto | SAX |
| Arteria coronaria septal | SCA |
| Sistólica para relaciones de flujo diastólica | S / D |
| Transtorácica Doppler ecocardiográfico | TTDE |
| Velocidad Tiempo Integral | VTI |
| Wet relación peso seco de pulmón | W / D |
Tabla 1: Las abreviaturas.
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Discussion
En este estudio basado en la ecografía, la evaluación no invasiva del flujo coronario se realizó de forma reproducible en tiempo real, durante días, en ratones experimentales en vivo; Además, el protocolo demostró el potencial para detectar la disfunción de la arteria coronaria que estaba presente en una etapa temprana y se asoció con deficiencia en la perfusión miocárdica. Este método, en última instancia podría ser aprovechada como herramienta clínica para la estratificación del riesgo cardiovascular y / o evaluación de la respuesta a la intervención terapéutica.
En primer lugar, un protocolo detallado se describe para la visualización de los cambios anatómicos y funcionales en la arteria coronaria del corazón de tamaño pequeño ratón, usando imágenes secuenciales en el tiempo con alta frecuencia ecocardiografía Doppler color. Por cuidado pre-selección de un conjunto de ventanas acústicas complementarias con resolución de alta axial, volumen de muestra firmemente ajustado, y un control adecuado de anestesia, cualquier operador (con algún tipo de formación en la máquina de ultrasonido) puede perform todos los pasos sugeridos del protocolo de imagen, así como la línea post-hoc de análisis de los datos adquiridos. El método permite la visualización reproducible de la izquierda principal coronaria y permite la modulación de la función coronaria visualizado. Este protocolo se puede realizar en animales pequeños, tales como ratones o ratas, con altas tasas de corazón y la respiración. Es posible obtener datos fiables de imágenes secuenciales durante días o semanas, que permite a los investigadores a seguir a la función de forma no invasiva y longitudinalmente en un modelo experimental dado.
En segundo lugar, el estudio intenta evaluar pequeños vasos que son críticos para la función cardíaca adecuada, mediante la evaluación de los pequeños y los primeros cambios en la fisiología intra-coronaria (que ocurren dentro de minutos) en el contexto de la situación general de la fisiología cardiaca (por ejemplo, la función LV). Las etapas del protocolo se pueden realizar de una manera no invasiva, precisa y reproducible. Las mediciones obtenidas en tiempo realse puede obtener por cualquier operador con algún tipo de formación en funcionamiento de la máquina y la anatomía básica. Además, los índices vasculares específicos medidos en el presente documento, tales como CFR y S / D, se pueden obtener usando cualquier software de medición fuera de línea, y no sólo el software propietario proporcionado por el fabricante de la máquina. Estos índices pueden aplicarse, además, a cualquier modelo animal de interés, tales como la ApoE - / - o LDR R - / -, los modelos que se pueden utilizar para estudiar la aterosclerosis. Por lo tanto, el método representa una herramienta muy traducible para su uso en estudios de una variedad de fenotipos cardiovasculares.
La novedad de la metodología reside en su agilidad. También es fácilmente modificable por medio de pequeños ajustes, como cambiar la colocación de la sonda, la elección de la frecuencia de la sonda (la más alta frecuencia central debe ser recogido para la evaluación del flujo de baja velocidad, tales como estudios de isquemia), muestra de volumen (rendimiento menor muestra de volumen más precisos evaluación de pico) y la corrección del ángulo (0 ° a 60 °Ángulo PW, más cerca de 0 ° es más precisa), de tal manera que cualquier operador puede ser entrenado para obtener velocidades absolutas precisas de la arteria coronaria, septal o la principal izquierda siguiendo los puntos de referencia anatómicos tales como PA o de la raíz aórtica.
Pequeños cambios y temporales pueden ser generalmente difícil de medir y pueden implicar una alta tasa de error, relacionada con los cambios fisiológicos en la respiración o del ritmo cardíaco. Solución de problemas por lo general implica la identificación de puntos de referencia apropiados proximal al origen de la arteria y el mantenimiento de la frecuencia cardíaca coronaria fisiológica normal. Mediante el control de la fisiología animal usando una herramienta de monitorización de la señal ECG, que se asocia con el aparato de formación de imágenes, el protocolo permite que cualquier operador para controlar el efecto de cualquier vasomodulador potencial (vasoconstrictor o dilatador), durante la exploración.
La elección adecuada, vía y dosis de los niveles de anestesia pueden considerarse como determinantes críticos correcta estimación de la dinámica de flujo. Uno limitatien el estudio podría ser el uso de isoflurano. Se sabe que causa depresión cardíaca y cambiar diámetro de la luz en algunos estudios de una manera dependiente de la dosis 7,10. Sin embargo, las imágenes de este estudio se obtienen en cuestión de minutos, y mediante el uso de un sistema de anestesia estrechamente controlada, se puede estimar con precisión CF, CFR y S / D en cualquier estado de la fisiología del ratón incluyendo hipoxia, normoxia, vasodilatación, o constricción vascular, con efecto mínimo de la frecuencia cardiaca. Otra limitación es la falta de estándar de oro en correlación entre CFR y la arteria coronaria diámetro de la luz in vivo en ratones, debido al volumen de muestra muy pequeño que se puede obtener a partir de ratones. Sin embargo, como se muestra en los seres humanos este inconveniente se puede superar potencialmente por la evaluación histológica de la morfología coronaria cuantitativa con ecocardiografía para procurar diámetro de la arteria coronaria 4,24.
Mediante el uso de todos los pasos necesarios descritos en el protocolo de imagen (Step 2.1.1-2.3.4), CFR y S/ D valores de la relación en ratones se pueden obtener en cuestión de minutos. Imágenes de alta calidad hacen que los datos robusta y con una baja variabilidad intra e inter-observador.
En resumen, el protocolo de formación de imágenes, delineado en el presente documento, proporciona una herramienta de diagnóstico precisa que representa una alternativa a las opciones invasivas existentes, tales como cateterismo coronario, Doppler-alambre o estudios histopatológicos post-mortem.
Tomado en conjunto, los resultados de este estudio demuestran que un método no invasivo de evaluación funcional coronaria como una herramienta de diagnóstico clínico factible y viable que se puede utilizar en la investigación de pequeños animales. Dicho método no invasivo podría ayudar a minimizar sustancialmente el requisito del uso de animales, la eutanasia o la necropsia en modelos experimentales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Depilatory cream | Miltex, Inc. | Surgi-Prep | Apply 24 hours prior to imaging |
| Isoflurane | Baxter International Inc. | NDC 10019-773-40 | 2-3% for induction, and 1-1.5 % for maintenance; heart beats will be maintained at above 500 beats per minute |
| High Frequency Ultrasound | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | Vevo 2100 | |
| High-frequency Mechanical Transducer | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | MS250, MS550D, MS400 |
References
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