Summary
قمنا بتطوير الحصين تكشفت في المختبر الذي يحافظ CA1-CA3 مجموعة من الخلايا العصبية. جنبا إلى جنب مع اختراق مجموعة الكهربائي الصغير، النشاط العصبي يمكن رصدها في كل من التوجهات الطولي والعرضي. يوفر هذا الأسلوب المزايا على الاستعدادات شريحة الحصين كما نشر في قرن آمون كلها يمكن تسجيلها في وقت واحد.
Abstract
يصف هذا البروتوكول وسيلة لإعداد جديدة في المختبر إعداد الحصين شقة جنبا إلى جنب مع مجموعة تشكيله الدقيقة لرسم خريطة النشاط العصبي في قرن آمون. من عرضية إعداد شريحة الحصين هو إعداد الأنسجة الأكثر شيوعا لدراسة الحصين الكهربية. وقد تم تطوير شريحة الحصين طولية أيضا من أجل التحقيق في وصلات طولية في قرن آمون. ويمكن أيضا أن يستمر الحصين الماوس سليمة في المختبر بسبب سمكه يسمح انتشار الأوكسجين الكافي. ومع ذلك، لا هذه التحضيرات ثلاثة لا توفر الوصول المباشر إلى نشر العصبي منذ بعض الأنسجة إما مفقود أو مطوية. يوفر الحصين سليمة تكشفت كل من عرضية وطولية اتصالات في تكوين شقة للوصول المباشر إلى الأنسجة لتحليل المدى الكامل لانتشار الإشارة في قرن آمون في المختبر. من أجل مراقبة النشاط العصبي من ر فعالانه طبقة الخلايا، أدلى مخصص اختراق مجموعة صغيرة القطب (PMEA) كانت ملفقة وتطبيقها على الحصين تكشفت. وPMEA مع أقطاب 64 من 200 ميكرومتر في الطول يمكن تسجيل النشاط العصبي في عمق الحصين الماوس. مزيج فريد من إعداد الحصين تكشفت وPMEA يوفر أداة جديدة في المختبر لدراسة سرعة واتجاه الانتشار من النشاط العصبي في مناطق CA1-CA3 ثنائية الأبعاد من الحصين مع إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء.
Introduction
فهم التوصيل العصبي أو انتشار الإشارات العصبية من الأهمية بمكان لتحديد آلية التواصل العصبي في كل من الوظيفة العادية والحالات المرضية في الدماغ 1-3. الحصين هو واحد من الهياكل الأكثر درس على نطاق واسع في الدماغ لأنه يلعب دورا أساسيا في العديد من وظائف المخ مثل الذاكرة، وتتبع المكاني وتشارك في العديد من التغيرات المرضية التي تؤثر على السلوك بصورة جذرية فضلا 1،6. وعلى الرغم من الحصين يسلك منظمة معقدة، وعناصر مختلفة من هيكلها يمكن التعرف بسهولة والوصول إليها في إعداد شريحة 4-6. في الاتجاه العرضي للقرن آمون، ومن المعروف النشاط العصبي لنشر من خلال مسار ثلاثي متشابك التي تشكل التلفيف المسنن (DG)، CA3، CA1 andsubiculum 4،5. ويعتقد أن انتقال متشابك والتوصيل المحاور تلعب دورا رئيسيا لcommunicatiعلى في هذه الدائرة عرضية 4،6. ومع ذلك، والإكثار من الإشارة العصبية يحدث في كل من عرضية وطولية 4،6 الاتجاهات. وهذا يعني أن الحصين لا يمكن تحقيق كامل عن طريق استخدام مستحضرات شريحة التي تحد من المراقبة لاتجاه معين من نشر 4. تم تطوير شريحة طولية للتحقيق في مسارات محور عصبي على طول المحور الطولي 5. وقد لاحظ الباحثون جاما وثيتا التذبذبات سلوك معين في الغالب على طول عرضية وطولية محاور على التوالي 6. وقد تم دراسة هذه السلوكيات على حدة، حتى الآن الدخول في وقت واحد لكلا الاتجاهين أمر بالغ الأهمية لفهم هذه السلوكيات. حتى مع تطور إعداد الحصين سليمة، فمن الصعب رصد انتشار في جميع أنحاء الأنسجة كامل بسبب هيكل مطوية من الحصين 4. يوفر الحصين تكشفت الوصول إلى الخلايا العصبية معبأةفي شكل طبقة الخلايا ثنائية الأبعاد 7،8 مسطح.
التي تتكشف التلفيف المسنن (DG) (الشكل 1)، وقرن آمون يعتمد شكل بالارض مع تكوين مستطيل فيه كلا عرضية وطولية الاتصالات لا تزال سليمة مع طبقة الخلايا الهرمية مرتبة في ورقة ثنائية الأبعاد تحتوي على كل CA3 وCA1، ترك شقة قطعة من الأنسجة العصبية التي يمكن استخدامها لتحقيق انتشار العصبي (الشكل 2) 8. ويمكن بعد ذلك النشاط العصبي يمكن رصدها مع ماصات الفردية والزجاج، والمصفوفات مسرى مكروي، تحفيز كهربائي، وكذلك الأصباغ الحساسة الجهد (VSD) 3،7،8. وبالإضافة إلى ذلك، المشفرة وراثيا مؤشر الجهد من الفئران المعدلة وراثيا يمكن أن تستخدم لتتبع نمط انتشار 9.
التكوين المسطح من شبكة الحصين المطوية هي مناسبة تماما لتسجيل طريقة البصرية ولكن أيضا لمجموعة ومسرى مكروي. Mهي ملفقة معاهدة الفضاء الخارجي للصفائف المتاحة تجاريا مع أقطاب الملف الشخصي شقة أو منخفضة ويمكن تسجيل النشاط العصبي في كل من شرائح الأنسجة والخلايا العصبية مثقف 10-12. ومع ذلك، فإن نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) تنخفض عندما يتم الحصول على إشارات من لأنسجة سليمة منذ سوما من الخلايا العصبية تقع في عمق الأنسجة. مطلوبة صفائف مسرى مكروي الكهربائي مع الجانب نسب عالية لتحسين SNR.
لهذا الغرض، تم وضع اختراق مجموعة مسرى مكروي (PMEA) في المختبر لدينا، ويوفر القدرة على تحقيق مباشرة في الأنسجة عن طريق إدراج 64 المسامير التي يبلغ قطرها 20 ميكرومتر وارتفاع 200 ميكرون في قرن آمون تكشفت 7،13 . هذه المجموعة مسرى مكروي ديها SNR أعلى بالمقارنة مع الجهد حساسة التصوير صبغ وSNR لا تزال مستقرة خلال تجربة 7،13. مزيج من إعداد الحصين تكشفت وPMEA يوفر طريقة جديدة للاستثمارآي جيت نشر العصبي على طائرة ثنائية الأبعاد. التجارب باستخدام هذه التقنية قد أسفرت بالفعل عن نتائج هامة حول آليات انتشار الإشارة العصبية في الحصين حيث النشاط العصبي يمكن أن تنتشر بشكل مستقل من نقاط الاشتباك العصبي متشابك أو الكهربائية 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم استعراض الحيوان البروتوكولات التجريبية التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في الجامعة: ملاحظة. وتستخدم الفئران CD1 من كلا الجنسين في سن P10 P20 لفي هذه الدراسة.
1. حلول لجراحة وتسجيل التجريبي
- إعداد الطبيعي السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) العازلة التي تحتوي على (مم): كلوريد الصوديوم 124، بوكل 3.75، KH 2 PO4 1.25، MgSO 4 2، NaHCO 3 26، سكر العنب 10، وCaCl 2 2. استخدام هذا ACSF العادي للانتعاش بعد تشريح الأنسجة، وكذلك لغسل النظام في بداية التجربة.
- إعداد ACSF السكروز الذي يتم استخدامه أثناء تشريح الحصين ويحتوي على (مم): 220 السكروز، بوكل 2.95، ناه 2 PO4 1.3، MgSO 4 2، NaHCO 3 26، سكر العنب 10، وCaCl 2 2. من أجل حمل النشاط صرعي في إعداد الأنسجة قرن آمون سليمة، إضافة 4-Aminopyridine (4-AP) لACSF العادي فيتركيز 100 ميكرومتر.
2. إجراء العمليات الجراحية لإعداد الحصين سليمة
- إسقاط الأيزوفلورين (1 مل) في غرفة في الجزء السفلي من وعاء زجاجي مجفف (No.1 في مواد محددة والمعدات) واستخدام منشفة ورقية العادية لتغطية سطح مرحلة القاع حتى الحيوان لا تحصل على اتصال مع السائل. ثم، ضع الماوس CD1 في جرة وإغلاق الغطاء. حفاظ على الحيوانات في جرة مغلقة لمدة 1 دقيقة لمدة 2 دقيقة. عندما تردد التنفس حوالي واحد في الثانية الواحدة، وإزالة الماوس من الجرة.
- ضع الماوس على مرحلة الجراحة وقطع رأس مع مقص مناسبة. مباشرة بعد قطع الرأس، ووضع الرأس في الجليد الباردة (3-4 ° C)، المؤكسج السكروز ACSF لمدة 30 ثانية.
- استخدام مقص غرامة (NO.5 في مواد محددة والمعدات) لإزالة الجلد في أعلى الجمجمة وقطع الجمجمة على طول خط الوسط من الرأس وكذلك في طرفي بالقرب من وتيرةالفص راؤول. استخدام ملقط (رقم 6 في مواد محددة والمعدات) لقشر الجمجمة قطع نحو كل جانب من الرأس من أجل فضح الدماغ.
- إدراج ملعقة مختبر الدقيقة (رقم 8 في مواد محددة والمعدات) إلى الفجوة بين الفصوص الجدارية من الدماغ والجمجمة لقشر بعناية الدماغ من الجزء السفلي من الجمجمة ثم بإفلاته على الجليد الباردة استعداد (3 -4 درجة مئوية) مرحلة جراحية مغطاة رقة الترشيح الرطب (NO.2 في مواد محددة والمعدات). إزالة المخيخ مع شفرة الجليد المبردة وفصل نصفي الكرة الأرضية عن طريق قطع خط الوسط من الدماغ. ثم، ضع نصفي فصل في كوب مليئة ACSF السكروز الجليد الباردة فقاعات مع 95٪ O 05/02٪ CO 2.
- خذ نصف الكرة الأرضية ومكان على المسرح ورق الترشيح الجليد الباردة. وضع المناشف الورقية العادية أو ورق الترشيح في جميع أنحاء الدماغ لامتصاص حل اضافي. استخدام اثنين من الأدوات الزجاجية ماصة مصقول النار (رقم 10 في المواد والمعدات) لفصل القشرة عن بقية الجزء الأوسط من المخ.
- بعد تعرض الحصين من داخل القشرة وضعت على المسرح المثلج، ضع اثنين أو ثلاث قطرات من الجليد الباردة ACSF السكروز على النسيج ثم قم بإزالة حل إضافية حول الحصين. قطع الاتصالات مع القشرة في طرفي الحصين. ثم، تشريح الحصين من المخ مع الحريق مصقول الأدوات الزجاجية وإزالة الجزء المتبقي من الدماغ.
- فصل الحصين كله مع الجانب شكوة لها تواجه صعودا وقرن آمون تلم أسفل. إسقاط بسرعة مرتين أو ثلاث قطرات من الثلج الباردة السكروز ACSF على النسيج مرة أخرى وإزالة الحل إضافية حول الأنسجة باستخدام قطعة من منشفة ورقية. استخدام النار مصقول أداة الزجاج لتسليم الحصين كله لفضح تلم (الشكل 1B، C).
- تحت المجهر الضوئي العادي، اضافة الى وجود إبرة الزجاج العرف (رقم 11 في الماطري محددةالمرض والمعدات) في واحدة من نهاية التلم وقطع الاتصالات الألياف، من التلفيف المسنن (DG) إلى مرفد أو مجال CA1، على طول اتجاه تلم (الشكل 1C). تطبيق شفرة الجليد الباردة لتقليم نهايات الحاجز والزمانية للالحصين إذا لزم الأمر. اضافة الى وجود العرف الأسلاك المعدنية حلقة (رقم 12 في المواد المحددة والمعدات) في خفض التلم وسحب أكثر من DG بعيدا عن الأنسجة في حين عقد نهاية مرفد / CA1 من الحصين بواسطة أداة النار الزجاج المصقول (1D الشكل) .
- وبعد إجراء تتكشف أعلاه، إضافة اثنين أو ثلاث قطرات آخر من السكروز ACSF الجليد الباردة على الأنسجة وإزالة حل إضافية حول الأنسجة. ثم، وتقليم الحصين تكشفت مع شفرة الجليد الباردة في حواف (الشكل 1E) ووضع بإعداد ملعقة في غرفة يتعافى مليئة ACSF العادي وفقاعات مع 95٪ O 05/02٪ CO 2 في RT (حوالي 25 ° C). تركالأنسجة الحصين كشفها لاسترداد حوالي 1 ساعة قبل وضعه في غرفة تسجيل.
- خذ نصف الكرة المخ الأخرى واستخدامه للذهاب من خلال خطوات 2،5-2،9. عادة، يستغرق حوالي 1 إلى 2 دقيقة لإنهاء الإجراء بأكمله تتكشف في الحصين واحد وإسقاط الجليد الباردة السكروز ACSF باستمرار للحفاظ على الأنسجة بالأكسجين والمائية.
الإعداد 3. نظام التجريبية
- الغراء PMEA مخصصة ملفقة على حزمة مجموعة دبوس شبكة (PGA) واستخدام الربط الأسلاك الصغيرة لتوصيل كل لوحة من مسرى مكروي واحد للوحة دبوس على الحزمة (الشكل 3B). ثم، تضاف حزمة في المقبس على لوحة الدوائر حسب الطلب (13).
- ربط بشكل فردي كل مسرى مكروي لمرشحات مع تمريرة الفرقة قطع تردد من 1 هرتز إلى 4 كيلو هيرتز ومكبرات الصوت مع زيادة 100 على العرف وحة الدوائر (13). رقمنة الناتج التناظرية من لوحات الدوائر الالكترونية من قبل A / D التحويلنظام erting، واكتساب وتخزين البيانات على الكمبيوتر.
- الغراء تسجيل البلاستيك غرفة مصنوعة خصيصا حول مجموعة مع مدخل ومخرج أنابيب لتدفق الحل (الشكل 4A). استخدام اثنين على الأقل زجاجات للحفاظ على حلول مختلفة في النظام، والانضمام إليها والسيطرة على أنابيب انتاج الزجاجات التي كتبها a-صمام ثلاثي. وصل الناتج من صمام ثلاثي إلى نظام الأنابيب مع غرفة بالتنقيط الرابع الذي توجيه الحل في غرفة تسجيل.
- بين صمام ثلاثي ومدخل للغرفة تسجيل، إضافة سخان كهربائي لتسخين حل لدرجات الحرارة للرقابة (35 ° C) قبل ويسترشد الحل إلى غرفة تسجيل. إرفاق منفذ للغرفة تسجيل لأنبوب فراغ لجمع الحل في أنبوب فراغ متصل القارورة. لا تدوير أي حل في أي تجربة في هذه الدراسة.
4. وضع كشف الحصين على PMEA لتسجيل النشاط العصبي
5. إزالةالأنسجة من PMEA بعد تجربة
- السيطرة على مرساة الأنسجة من قبل مياداة مجهرية ورفع تدريجيا الأنسجة من غرفة تسجيل. إيقاف كل من مدخل ومخرج لوقف تدفق في غرفة تسجيل. وينبغي أن تكون غرفة تسجيل كامل مع حل أو إضافة بضع قطرات من محلول لملء الغرفة إذا كانت غرفة تسجيل ليست كاملة.
- استخدام فرشاة الدهان الصغيرة لرفع كل زاوية من الأنسجة. إذا كان النسيج لا يتحرك في الحل، ثم توظيف فراغ أنبوب لتجف الغرفة بعناية مع النسيج لا يزال جالسا على صفيف. ثم فتح بعناية مدخل لإعادة ملء تدريجيا الغرفة وأغلقت مدخل لوقف تدفق عندما غرفة تسجيل ممتلئة. تطبيق فرشاة الدهان الصغيرة لرفع كل زاوية من النسيج مرة أخرى.
- يتم فصل كرر الخطوة 5.2 حتى الأنسجة من مجموعة ويتحرك في الحل. إذا كانت الأنسجة يعوم في الحل، ثم استخدام فراغ أنبوب لامتصاص الأنسجة بعيدا. مفتوحة رانه تتدفق في مدخل وفتح الفراغ في منفذ. يغسل النظام مع الماء المقطر وتجفيف بها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تسجيل البيانات التي تظهر في الأرقام هنا في إعداد الحصين تكشفت مع 4-AP (100 ميكرومتر) ACSF وأضاف خلال حضانة الأنسجة في غرفة تسجيل في RT (25 ° C). عادة يبدأ النشاط خلال 5 دقائق، ولكن في بعض الأنسجة قرن آمون من الحيوانات القديمة قد يستغرق وقتا أطول. إطلاق الخلايا العصبية 4-AP التي يسببها لوحظ مع PMEA هو نفسه كما ذكرت سابقا 14،15. منذ الأقطاب لديها ارتفاع 200 ميكرون، وتقع النصائح القطب أسفل طبقة الخلايا (الشكل 3C) لأن طبقة الخلايا عادة ما بين 250 و 300 ميكرومتر فوق شكوة للقرن آمون (الشكل 2)، وتسجيلات (57 من أصل 64 في التجربة عينة) من قنوات مختلفة لديها انحراف في معظمها إيجابية. ومع ذلك، فإن بعض هذه التسجيلات إيجابية يمكن عرض الانحرافات السلبية الصغيرة وكذلك (الشكل 5B) إذا النصائح تسجيل القطب قريبة بما فيه الكفاية لطبقة الخلايا.إذا توجد نصائح القطب الحق في مستوى طبقة الخلايا، فإن التسجيل يكون ارتفاعه سلبي حاد جدا مع تحول ايجابي عليها أو ارتفاعه السلبي فقط (الشكل 5C) 16. في العينة البيانات الواردة هنا، 5 قنوات من 57 التسجيلات لها ارتفاعه سلبي. بعد الحصول على البيانات من جميع القنوات 64، يتم تطبيق طريقة التطبيع الفردية (الشكل 6B) لتعيين نشر العصبي على متن طائرة 2-D على طول محور الوقت من تسجيل 7. مع مزيج من PMEA والحصين تكشفت، يتم تعيين نشر العصبي، ولاحظ أن يبدأ معظمها في جانب واحد من CA3 والتحرك طوليا في جبهة موجة قطري، عبور المنطقة بأكملها من قرن آمون (الشكل 6).
الشكل 1. إجراء العمليات الجراحية لالحصين تكشفت . (A) واحدة من الحصين اثنين يتم تشريح من الفص الصدغي من الدماغ الماوس. (B) والحاجز إنهاء الزمانية على طول المحور الطولي. (C) وانقلبت والحصين خلال مع ماصة الزجاج المصقول النار لفضح التلم. وقلص طرفي الحصين ويتم استخدام إبرة الزجاج لقطع الاتصالات بين DG وCA1 أو مرفد على طول المحور الطولي. (D) وتكشفت الحصين بواسطة سلك معدني حلقة حسب الطلب. (E) الحصين تكشفت مع مرفد وDG قلصت. (F) إعداد الأنسجة النهائي لالحصين تكشفت. وهذا الموقف يدل على توجه الحصين عندما يتم وضعها على مجموعة في تجربة. للحصول على تفاصيل إضافية حول الحصين تشريح تكشفت يرجى الرجوع إلى الطرق التجريبية في المخطوطات التي تم نشرها مسبقا 7.g1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. علم الأنسجة المقطع العرضي للالحصين تكشفت. كريستال البنفسجي وصمة عار يظهر موقف طبقة الخلايا الهرمية CA1-CA3 داخل الحصين تكشفت مستوى 250 و 300 ميكرومتر فوق شكوة وبالتالي تحديد مكان وجود الميكروية الحق دون طبقة الخلايا (راجع الشكل 3C). للحصول على أقسام ملطخة البنفسجي الكريستال، وكانت الأنسجة بعد الثابتة بعد أن كان الحصين تكشفت. وضعت الحصين تكشفت في PFA 4٪ O / N. ثم تم نقل الأنسجة والاحتفاظ بها في محلول السكروز (30٪) لمدة 48 ساعة، وتليها الإضافية تجميد في راكب الدراجة النارية التي تحتوي على isopentane (2-Methylbutane) ليبرد إلى -35 ° C في الثلج الجاف. ثم تم قطع قسم المجمدة في ناظم البرد مع20 ميكرون أبواب سميكة في الطائرة عرضية (كما هو موضح في الشكل رقم 2) للكشف عن مكان وجود طبقة الخلايا الهرمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الحصين تكشفت على PMEA. (A) أعلى نظرا لPMEA جديد مع الميكروية التي تقع في نهاية كل أثر معدن الذهب. إدراج على الجانب الأيمن يظهر مسرى مكروي واحد تحت المجهر الإلكتروني مع ارتفاع 200 ميكرون ويبلغ قطرها 20 ميكرومتر 7،13. (B) يتم لصقها ومجموعة مسرى مكروي على حزمة PGA مع غرفة تسجيل البلاستيك حول الميكروية على الركيزة الزجاج. إدراج على اليمين يظهر الحصين تكشفت وضعت على آر مسرى مكرويالمنعم يوسف في الوسط. (C) على اليسار، يظهر البصرية بالاتساق التصوير المقطعي (OCT) التصوير الأنسجة المطوية وضعه على رأس مجموعة في تجربة مختلفة. على الحق، وصورتين شريحة طولية تم الحصول عليها من التصوير أكتوبر على اليسار تظهر نصائح مسرى مكروي (بقع بيضاء وأشارت بواسطة الأسهم) تصل إلى منطقة الحق دون طبقة خلايا الجسم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم .
الرقم 4. التجريبية الإعداد. (A) يتم وضع غطاء غطاء من البلاستيك مع مسامير على الدوائر لحمايته من الأضرار الناجمة عن المياه ممكن. غرفة تسجيل على حد سواء مدخل ومخرج أنابيب لحمل تدفق الحل. ويستخدم مرساة الأنسجة العرف لصقها مع شبكة الألياف نايلون لتأمين TISSرق خلال التجارب. (B) صورة مأخوذة من الجزء السفلي من الركيزة الزجاج من PMEA تبين مرساة الأنسجة عقد شريحة عينة خلال التجربة. الأسلاك المنحنية هي ألياف النايلون من شبكة الضغط على الجزء العلوي من الأنسجة. النقاط المستديرة هي أسس الميكروية. وتشير الأسهم للأقطاب التي تضررت بعد عدة تجارب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. البيانات الخام التي سجلتها PMEA من الحصين تكشفت. لوحة اليسار: 4-AP-الناجم عن النشاط صرعي المسجلة من مسرى مكروي واحد لوحة اليمين: النسخة المركزة في إشارة ملحوظ في نافذة الوقت على اليسار. (A) القسم 10 ثانية من مثال على النشاط العفوي فيالتي تنتجها 100 ميكرومتر 4-AP ACSF حصلت لأحد الميكروية تقع في منطقة الشجيرية القاعدية على أساس قطبية الإشارات مع SNR 34.9 ديسيبل. (ب) البيانات الخام من مسرى مكروي آخر يقع أقرب إلى somata مع SNR 27.2 ديسيبل. (C) مثال لتسجيل تم الحصول عليها من إلكترود وضعه داخل طبقة الجسدية. في هذا المثال، SNR هو 18.53 ديسيبل. (D) تسجيل تم الحصول عليها من القطب عازمة زالت تجري ولكن لا اختراق في الأنسجة. القطب عازمة لديه أقل SNR كبير مقارنة مع أولئك الأقطاب الكهربائية سليمة (1.5 ديسيبل في هذا المثال). (E) الضوضاء خط الأساس المسجل من مسرى مكروي. خط الأساس وعادة ما يكون الذروة إلى الذروة قيمة 150-200 μV ومقاومة من قطب واحد هو حول 1-2 MΩ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. التحويل لتسجيل البيانات العصبية في 2-D نشر الخرائط. (A) باقتطاع A 170 مللي ثانية نافذة زمنية لارتفاعه العصبي واحد في كل قناة تآمر على الصورة لPMEA. يتم تصفية البيانات الخام من قبل مرشح الترددات المنخفضة عند 100 هرتز. ومحرف إشارات من الأقطاب الكهربائية المكسورة مع تسجيلات حوله. في هذا المثال، جميع المسامير هي إيجابية. (ب) ارتفاع العصبي واحد من بكسل الأحمر في (A) هو تطبيع إلى شريط اللون مع طريقة نموا مخصصة للتطبيع الفردي (يرجى الرجوع إلى المنشور السابق لمزيد من التفاصيل حول تطبيع 7). (C) وخرائط ملونة أنشأتها تطبيع الأفراد تبين أن التحركات نشر عبر المنطقة بأكملها من الحصين تكشفت في نقاط زمنية مختلفة.www.jove.com/files/ftp_upload/52601/52601fig6large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تطوير إعداد الحصين تكشفت، حيث يتم الاحتفاظ المحاور الطولية والعرضية للقرن آمون في تركيبة مع مجموعة ومسرى مكروي اختراق، يوفر أداة قوية للتحقيق في صلات التشريح أو انتشار العصبية في الحصين 7. هذا الإجراء تتكشف ينطبق على دراسة الحصين في فئران بالغة أيضا. وأظهرت الدراسات التي أجريت مؤخرا مع هذا المستحضر إلى أن نشاط صرعي 4-AP يسببها يمكن أن تنتشر مع جبهة الموجة القطرية عبر المنطقة بأكملها من الحصين تكشفت (الشكل 6) 7،8. وأظهرت هذه الدراسات أن الحصين تكشفت سليمة يوفر مزايا هامة على شرائح إما عرضية أو طولية عندما نشر العصبي في الشبكة العصبية قرن آمون مسطحة يمكن التحقيق (الشكل 6).
يوفر مسرى مكروي اختراق تفوقا كبيرا على ميل القائمةصفائف croelectrode (MEA) والتي تتكون من عدة جهات اتصال وضعه فوق سطح مستو 11،12،17. MEA مع أقطاب سطح مسطحة يصعب استخدامها مع الحصين تكشفت منذ طبقة الخلايا تقع على بعد حوالي 250 و 300 ميكرون بعيدا عن السطحية (الشكل 2). تم تصميم PMEA الموصوفة هنا إلى حل هذه المشكلة مع اختراق 64 الأقطاب الكهربائية مناسبة لدراسة انتشار العصبي مع ارتفاع 200 ميكرون للوصول إلى عمق الأنسجة 7،13. بالإضافة إلى ذلك، PMEA ينطبق أيضا في أي تحضير الأنسجة مسطح، مثل شرائح القشرية، قرن آمون شرائح عرضية الخ
ميزة أخرى لاستخدام هذا PMEA هي تحسين SNR. وتظهر دراسة النموذج الأولي من هذا PMEA نسبة SNR الإشارة العصبية التي سجلتها هذه PMEA لديها متوسط قيمة 19.4 ± 3 ديسيبل، وهو أعلى بكثير وأكثر استقرارا مقارنة بما كان عليه من تسجيل VSD منذ أشارت دراسات سابقة إلى أن سمية والصورة تبييض VSD ضعف واضح في القدرة على تسجيل البيانات 8. مع تحسين بروتوكول تجريبي باستخدام مرساة الأنسجة في هذه الدراسة، وSNR للتسجيل من الزيادات PMEA إلى مجموعة من حوالي 20 إلى 30 ديسيبل (الشكل 5)، والتي لديها SNR أعلى مقارنة بتلك صفائف تتسطح القطب مع قيمة من 10 to15 ديسيبل 11،18. القدرة على تتكشف الحصين أمر ضروري من أجل الحصول على طبقة من الخلايا العصبية (CA1-CA3) التي يمكن استجوابه من قبل مجموعة تسجيل مسطحة.
وعلاوة على ذلك، منذ تم بناء مجموعة السيليكون على ركيزة شفافة، والجهد صبغة حساسة تقنية التصوير يمكن أن تكون متكاملة في النظام PMEA لدراسة انتشار النشاط العصبي في الحصين 8. ويمكن أيضا أن الفئران المعدلة وراثيا مع مؤشرات حساسة الجهد فلوري أن تستخدم للتحقيق في أصل وانتشار إشارة في ظل الظروف الفسيولوجية وكذلك التغيرات الناجمة عن pharmacologiوكلاء كال أو أنسجة معدلة وراثية من مختلف النماذج الحيوانية 9.
هناك العديد من الخطوات الهامة من أجل ضمان تسجيل عالية الجودة. أولا لضمان بقاء الأنسجة، ويجب أن تتم العملية الجراحية خارج في أسرع وقت ممكن. عادة، فإنه يأخذ حوالي 1 إلى 2 دقيقة للذهاب من خلال جميع الخطوات من 2.1) إلى 2.10). واقترح للغاية ممارسة الإجراء تتكشف على بعض الحيوانات عينة قبل تنفيذ الجراحة التجريبية الفعلية بها. ثانيا، واحتياجات معدل التدفق إلى أن تبقى ثابتة لتجنب أي تذبذب مستوى السائل نضح في غرفة تسجيل. وعلاوة على ذلك، ينبغي الراسية الأنسجة أسفل لتجنب حركة الأنسجة المتعلقة صفيف.
على الرغم من أن PMEA الموصوفة هنا يمكن أن توفر إشارات مفيدة في رصد انتشار العصبية في الحصين تكشفت، هناك بعض السلبيات والقيود المفروضة على هذه المنهجية تسجيل.
أولا، يمكن للالميكروية كسر بسبب قوة ميكانيكية المفروضة عليهم (الشكل 5D، E). أثناء إجراء التنسيب الأنسجة وإزالة، يمكن أن الاتصال العرضي بين فرشاة الدهان الصغيرة ومجموعة تتسبب في الميكروية لثني أو كسر. عندما يخفض مرساة الأنسجة أسفل من قبل مياداة مجهرية، يمكن أن الحركة الأفقية للأنسجة على طول الجزء السفلي من الغرفة خلق قوة القص التي يمكن أن تؤدي إلى الانحناء أو الكسر من الأقطاب الكهربائية. في تصميم المستقبل، ينبغي إعادة تشكيل الميكروية ذات قاعدة سميكة نوعا ما لجعلها أقوى. في الإصدار الحالي من هذا PMEA، وأقطاب تسجيل لديها قاعدة ضيقة مقارنة قطرها 13، وبالتالي إضعاف أقطاب (الشكل 3A).
وينبغي أيضا تحسين إجراءات التنظيف لإزالة كاف الأنسجة المتبقية والألياف التي يمكن أن نعلق على صفيف. بعد كل تجربة، وقطع صغيرةمن الأنسجة يمكن أن تظل تعلق على الميكروية ويجب إزالة هذه الأنسجة المتبقية اليسار على الأقطاب الكهربائية. إذا لم يتم إزالة هذه الأنسجة المتبقية، يمكن أن تتأثر مقاومة من الأقطاب وSNR من التسجيلات. ويقترح فلاشينغ النظام مع الماء المقطر كما هو مبين في الجزء 5 من قسم البروتوكول. وينصح المستخدمون أيضا لطرد النظام مع بعض الضعيف المحاليل الحمضية التي يمكن إذابة الأنسجة دون الإضرار النظام
عيب آخر من هذا البروتوكول هو أنه خلال إجراء تتكشف، هو قطع الطريق الثاقب في هذا الحصين تكشفت، ومنع التحقيق في الإشارات العصبية الممكنة نشر من DG إلى طبقات أخرى من الحصين.
في الختام، التي وصفناها هنا منهجية جديدة للتحقيق في انتشار النشاط العصبي داخل الحصين عن طريق الجمع بين الجانب ارتفاع نسبة مجموعة مسرى مكروي مع تكشفت الحصين TISSUه. لم طريقة تؤدي إلى فهم أفضل لكيفية نشاط الخلايا العصبية يمكن نشر في كل من الاتجاهين الطولي والعرضي. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية إلى الأنسجة القشرية وضعت بطريقة مشابهة على رأس مجموعة. وعلاوة على ذلك، والجمع بين تقنية التسجيل البصري مع هذا المستحضر من الممكن منذ صفيف شفافة، ويمكن أن تؤدي أيضا إلى بعض النتائج الهامة حول انتشار الإشارة في الأنسجة العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
| A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
| Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
| Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
| Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
| Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
| small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
| Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
| Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
| Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
| Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
References
- Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. Control of traveling waves in the Mammalian cortex. Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).
- Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity in neonatal intact limbic structures in vitro. Eur J Neurosci. 12 (8), 2757-2768 (2000).
- Grinvald, A., Manker, A., Segal, M. Visualization of the spread of electrical activity in rat hippocampal slices by voltage-sensitive optical probes. J Physiol. 333, 269-291 (1982).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
- Albani, S. H., McHail, D. G., Dumas, T. C. Developmental studies of the hippocampus and hippocampal-dependent behaviors: insights from interdisciplinary studies and tips for new investigators. Neurosci Biobehav Rev. 43, 183-190 (2014).
- Zhang, M., et al. Propagation of Epileptiform Activity Can Be Independent of Synaptic Transmission, Gap Junctions, or Diffusion and Is Consistent with Electrical Field Transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
- Kibler, A. B., Durand, D. M. Orthogonal wave propagation of epileptiform activity in the planar mouse hippocampus in vitro. Epilepsia. 52 (9), 1590-1600 (2011).
- Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108 (11), 3147-3160 (2012).
- Wingenfeld, K., Wolf, O. T. Stress , memory, the hippocampus. Front Neurol Neurosci. 34, 109-121 (2014).
- Liu, J. S., et al. Spatiotemporal dynamics of high-K+-induced epileptiform discharges in hippocampal slice and the effects of valproate. Neurosci Bull. 29 (1), 28-36 (2013).
- Oka, H., Shimono, K., Ogawa, R., Sugihara, H., Taketani, M. A new planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice. J Neurosci Methods. 93, 61-68 (1999).
- Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
- Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. J Pharmacol Exp Ther. 282 (1), 262-270 (1997).
- Perreault, P., Avoli, M. 4-aminopyridine-induced epileptiform activity and a GABA-mediated long-lasting depolarization in the rat hippocampus. J Neurosci. 12 (1), 104-115 (1992).
- Chesnut, T. J., Swann, J. W. Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus. Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings. Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. Hippocampal neuron firing and local field potentials in the in vitro 4-aminopyridine epilepsy model. J Neurophysiol. 108 (9), 2568-2580 (2012).
