Summary
हम न्यूरॉन्स की सीए 1-सीए 3 सरणी को बरकरार रखता है, जो एक में इन विट्रो सामने आया हिप्पोकैम्पस विकसित किया है। मर्मज्ञ सूक्ष्म इलेक्ट्रोड सरणी के साथ संयुक्त, तंत्रिका गतिविधि दोनों अनुदैर्ध्य और अनुप्रस्थ झुकाव में नजर रखी जा सकती है। पूरे हिप्पोकैम्पस में प्रचार एक साथ दर्ज किया जा सकता है के रूप में इस विधि हिप्पोकैम्पस टुकड़ा तैयारी से अधिक लाभ प्रदान करता है।
Abstract
इस प्रोटोकॉल हिप्पोकैम्पस में तंत्रिका गतिविधि नक्शा करने के लिए एक माइक्रो machined सरणी के साथ संयुक्त विट्रो फ्लैट हिप्पोकैम्पस तैयारी में एक नया तैयार करने के लिए एक विधि का वर्णन है। अनुप्रस्थ हिप्पोकैम्पस टुकड़ा तैयारी हिप्पोकैम्पस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन करने के लिए सबसे आम ऊतक तैयारी है। एक अनुदैर्ध्य hippocampal टुकड़ा भी हिप्पोकैम्पस में अनुदैर्ध्य कनेक्शन की जांच करने के क्रम में विकसित किया गया था। इसकी मोटाई पर्याप्त ऑक्सीजन प्रसार की अनुमति देता है क्योंकि बरकरार माउस हिप्पोकैम्पस भी इन विट्रो में बनाए रखा जा सकता है। ऊतक के कुछ गुम या मुड़ा तो है लेकिन, जब से इन तीनों की तैयारी तंत्रिका प्रचार के लिए सीधी पहुँच प्रदान नहीं करते हैं। सामने आया बरकरार हिप्पोकैम्पस अनुप्रस्थ और इन विट्रो में हिप्पोकैम्पस में संकेत प्रसार की पूर्ण सीमा तक विश्लेषण करने के लिए ऊतक के लिए सीधी पहुँच के लिए एक फ्लैट विन्यास में अनुदैर्ध्य कनेक्शन दोनों प्रदान करता है। प्रभावी रूप से टी से तंत्रिका गतिविधि पर नजर रखने के आदेश मेंवह सेल परत, एक कस्टम निर्मित किया गया था सूक्ष्म इलेक्ट्रोड सरणी (PMEA) मर्मज्ञ बनाया है और सामने आया हिप्पोकैम्पस के लिए आवेदन किया। ऊंचाई में 200 माइक्रोन के 64 इलेक्ट्रोड के साथ PMEA गहरी माउस हिप्पोकैम्पस के अंदर तंत्रिका गतिविधि को रिकॉर्ड कर सकता है। एक सामने आया हिप्पोकैम्पस तैयारी और PMEA का अनूठा संयोजन शोर अनुपात करने के लिए एक उच्च संकेत के साथ हिप्पोकैम्पस के दो आयामी सीए 1-सीए 3 क्षेत्रों में गति और तंत्रिका गतिविधि के प्रसार की दिशा में अध्ययन करने के लिए एक नया में इन विट्रो उपकरण प्रदान करता है।
Introduction
तंत्रिका संकेतों के तंत्रिका चालन या प्रचार को समझना मस्तिष्क 1-3 में सामान्य कार्य और रोग की स्थिति में दोनों तंत्रिका संचार के तंत्र का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है। हिप्पोकैम्पस यह ऐसी स्मृति, और स्थानिक ट्रैकिंग के रूप में कई मस्तिष्क कार्यों में मौलिक भूमिका निभाता है और नाटकीय रूप से व्यवहार के रूप में अच्छी तरह से 1,6 प्रभाव है कि कई रोग परिवर्तन में शामिल है के बाद से मस्तिष्क में सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन संरचनाओं में से एक है। हिप्पोकैम्पस एक जटिल संगठन दर्शाती है, इसकी संरचना के विभिन्न तत्वों को आसानी से पहचान की है और टुकड़ा तैयारी 4-6 में पहुँचा जा सकता है। हिप्पोकैम्पस की अनुप्रस्थ दिशा में, तंत्रिका गतिविधि दांतेदार गाइरस (डीजी), सीए 3, सीए 1 andsubiculum 4,5 शामिल है कि सप्ताह में तीन अन्तर्ग्रथनी मार्ग के माध्यम से प्रचार करने के लिए जाना जाता है। यह synaptic प्रसारण और axonal चालन संचार के लिए एक प्रमुख भूमिका निभा माना जाता है किइस अनुप्रस्थ सर्किट 4,6 में पर। हालांकि, तंत्रिका संकेत के प्रचार अनुप्रस्थ और अनुदैर्ध्य दिशाओं 4,6 दोनों में जगह लेता है। इस हिप्पोकैम्पस पूरी तरह से प्रचार 4 के एक विशेष दिशा को अवलोकन की सीमा जो टुकड़ा तैयारी का उपयोग करके जांच नहीं की जा सकती कि निकलता है। अनुदैर्ध्य टुकड़ा अनुदैर्ध्य अक्ष 5 साथ axonal रास्ते जांच करने के लिए विकसित किया गया था। शोधकर्ताओं ने मुख्य रूप से अनुप्रस्थ और अनुदैर्ध्य कुल्हाड़ियों क्रमश: 6 के साथ व्यवहार-विशिष्ट गामा और थीटा दोलनों मनाया है। इन कार्यों को अलग से अध्ययन किया गया है, फिर भी दोनों दिशाओं में एक साथ उपयोग इन कार्यों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां तक बरकरार हिप्पोकैम्पस तैयारी के विकास के साथ, यह कारण हिप्पोकैम्पस 4 की मुड़ा-संरचना करने के लिए पूरे ऊतक भर में प्रचार पर नजर रखने के लिए मुश्किल है। सामने आया हिप्पोकैम्पस पैक न्यूरॉन्स के लिए पहुँच प्रदान करता हैएक फ्लैट दो आयामी सेल परत 7,8 के रूप में।
दांतेदार गाइरस (डीजी) (चित्रा 1) खुलासा करके, हिप्पोकैम्पस, अनुप्रस्थ और अनुदैर्ध्य कनेक्शन दोनों सीए 3 और सीए 1 दोनों से युक्त एक दो आयामी चादर में व्यवस्थित पिरामिड सेल परत के साथ बरकरार रहेगा, जिसमें एक आयताकार विन्यास के साथ एक चपटे आकार को गोद ले तंत्रिका प्रचार जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि तंत्रिका ऊतक के एक फ्लैट टुकड़ा छोड़ने (चित्रा 2) 8। तंत्रिका गतिविधि तो व्यक्ति कांच pipettes, microelectrode सरणियों, उत्तेजक इलेक्ट्रोड, साथ ही वोल्टेज संवेदनशील रंजक (वी एस डी) 3,7,8 के साथ नजर रखी जा सकती है। इसके अलावा, ट्रांसजेनिक चूहों से आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग वोल्टेज सूचक प्रचार पैटर्न 9 ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
सामने आया हिप्पोकैम्पस नेटवर्क के फ्लैट विन्यास ऑप्टिकल विधि रिकॉर्डिंग के लिए, लेकिन यह भी एक microelectrode सरणी के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। एमव्यावसायिक रूप से उपलब्ध सरणियों का कमजोर पक्ष फ्लैट या कम प्रोफ़ाइल इलेक्ट्रोड के साथ निर्मित कर रहे हैं और ऊतक स्लाइस और सभ्य न्यूरॉन्स 10-12 दोनों में तंत्रिका गतिविधि रिकॉर्ड कर सकते हैं। न्यूरॉन्स की सोमा ऊतक में गहरी स्थित हैं के बाद से संकेतों एक अक्षुण्ण ऊतक से प्राप्त कर रहे हैं फिर भी, जब संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR) कम हो जाती है। उच्च पहलू अनुपात के साथ microelectrode इलेक्ट्रोड सरणियों SNR में सुधार के लिए आवश्यक हैं।
इस आशय का एक मर्मज्ञ microelectrode सरणी (PMEA) हमारी प्रयोगशाला में विकसित किया गया है, और सामने आया हिप्पोकैम्पस 7,13 में एक 20 माइक्रोन से व्यास और 200 माइक्रोन की ऊंचाई के साथ 64 के spikes डालने से सीधे ऊतक में जांच करने की क्षमता प्रदान करता है । इस microelectrode सरणी वोल्टेज संवेदनशील डाई इमेजिंग की तुलना में उच्च SNR है और SNR एक प्रयोग 7,13 दौरान स्थिर बनी हुई है। सामने आया हिप्पोकैम्पस तैयारी और PMEA के संयोजन निवेश करने के लिए एक नया तरीका प्रदान करता हैएक दो आयामी विमान पर तंत्रिका प्रचार आईगेट। इस तकनीक का उपयोग प्रयोगों पहले से ही तंत्रिका गतिविधि स्वतंत्र रूप से अन्तर्ग्रथनी या बिजली synapses के 7 का प्रचार कर सकते हैं जिससे हिप्पोकैम्पस में तंत्रिका संकेत प्रसार के तंत्र के बारे में महत्वपूर्ण परिणाम सामने आए है।
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Protocol
नोट: पशु प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की समीक्षा की और विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। P20 के लिए P10 साल की उम्र में या तो सेक्स के CD1 चूहों इस अध्ययन में इस्तेमाल कर रहे हैं।
सर्जरी और प्रायोगिक रिकॉर्डिंग के लिए 1. समाधान
- NaCl 124, KCl 3.75, के.एच. 2 PO4 1.25, MgSO 4 2, 3 NaHCO 26, dextrose 10, और 2 CaCl 2: (मिमी) से युक्त सामान्य कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) बफर तैयार करें। प्रयोग की शुरुआत में कपड़े धोने प्रणाली के लिए और साथ ही, विच्छेदन के बाद ऊतक वसूली के लिए यह सामान्य aCSF का प्रयोग करें।
- हिप्पोकैम्पस विच्छेदन के दौरान इस्तेमाल किया और होता है कि सूक्रोज aCSF तैयार करें (मिमी): सुक्रोज 220, KCl 2.95, नाह दो PO4 1.3, MgSO 4 2, 3 NaHCO 26, dextrose 10, और 2 CaCl 2। अक्षुण्ण हिप्पोकैम्पस ऊतक तैयार करने में epileptiform गतिविधि के लिए प्रेरित करने के लिए, पर सामान्य aCSF से 4 Aminopyridine (4-एपी) जोड़ने100 माइक्रोन की एकाग्रता।
बरकरार हिप्पोकैंपस तैयारी के लिए 2. सर्जिकल प्रक्रिया
- एक desiccator ग्लास जार (विशिष्ट सामग्री और उपकरणों में नंबर 1) के नीचे स्थित चेंबर में isoflurane (1 मिलीलीटर) ड्रॉप और जानवर के साथ संपर्क में नहीं मिलता है तो नीचे चरण की सतह को कवर करने के लिए एक नियमित रूप से कागज तौलिया का उपयोग तरल। फिर, जार में CD1 माउस जगह और ढक्कन बंद कर दें। के बारे में एक मिनट से 2 मिनट के लिए बंद जार में पशु रखें। सांस आवृत्ति के बारे में एक दूसरे के प्रति है, तो जार से माउस को हटा दें।
- सर्जरी के मंच पर माउस प्लेस और एक उपयुक्त कैंची से सिर काटना। इसके तत्काल बाद कत्ल के बाद, के बारे में 30 सेकंड के लिए ठंडा (3-4 डिग्री सेल्सियस) में सिर, ऑक्सीजन सूक्रोज aCSF जगह है।
- खोपड़ी के शीर्ष पर त्वचा को हटाने के लिए और गति के पास दो सिरों पर और साथ ही सिर के मध्य रेखा के साथ खोपड़ी में कटौती के लिए ठीक कैंची (विशिष्ट सामग्री और उपकरणों में संख्या 5) का उपयोग करेंRAL पालि। इस्तेमाल की संदंश (विशिष्ट सामग्री और उपकरणों में नंबर 6) मस्तिष्क को बेनकाब करने के क्रम में सिर के प्रत्येक पक्ष की ओर कटौती खोपड़ी छील करने के लिए।
- ध्यान से खोपड़ी के नीचे से मस्तिष्क छील और फिर पर ड्रॉप करने के लिए मस्तिष्क और खोपड़ी के पार्श्विका लोब के बीच की खाई में एक सूक्ष्म प्रयोगशाला रंग (विशिष्ट सामग्री और उपकरणों में 8 वें नंबर) डालें एक तैयार ठंडा (3 विशिष्ट सामग्री और उपकरण) में गीला फिल्टर पेपर (नं .2 के साथ कवर -4 डिग्री सेल्सियस) शल्य चरण। एक बर्फ ठंडा ब्लेड के साथ सेरिबैलम निकालें और मस्तिष्क के midline काटने से दो गोलार्द्धों अलग। फिर, 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ bubbled ठंडा सूक्रोज aCSF से भरा एक बीकर में दो अलग गोलार्द्धों जगह है।
- बहुत ठंडा फिल्टर पेपर के मंच पर गोलार्द्ध और जगह में से एक आधा ले लो। अतिरिक्त समाधान चूसना करने के लिए मस्तिष्क के आसपास नियमित रूप से कागज तौलिए या फिल्टर पेपर रखें। माल में दो आग पॉलिश कांच पिपेट उपकरण (नं 10 का प्रयोग करें औरउपकरण) मस्तिष्क के मध्य भाग के बाकी हिस्सों से कॉर्टेक्स अलग करने के लिए।
- हिप्पोकैम्पस कॉर्टेक्स के अंदर से अवगत कराया और ठंडा मंच पर डाल दिया है, के बाद ऊतक पर ठंडा सूक्रोज aCSF के दो या तीन बूँदें जगह और फिर हिप्पोकैम्पस के आसपास अतिरिक्त समाधान निकालें। हिप्पोकैम्पस के दोनों सिरों पर कॉर्टेक्स के साथ कनेक्शन काट दिया। फिर, आग पॉलिश कांच उपकरणों के साथ मस्तिष्क के बाहर हिप्पोकैम्पस काटना और मस्तिष्क के शेष भाग को हटा दें।
- इसके alveus पक्ष सामना करना पड़ रहा है और हिप्पोकैम्पस परिखा नीचे का सामना करना पड़ के साथ पूरे हिप्पोकैम्पस अलग करें। जल्दी से फिर ऊतक पर ठंडा सूक्रोज aCSF के दो या तीन बूँदें ड्रॉप और कागज तौलिया का एक टुकड़ा का उपयोग करने के ऊतकों के आसपास अतिरिक्त समाधान निकालें। परिखा (चित्रा 1 बी, सी) को बेनकाब करने के लिए पूरे हिप्पोकैम्पस पर बारी करने के लिए एक आग पॉलिश कांच उपकरण का उपयोग करें।
- एक सामान्य ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत, विशिष्ट materi में एक कस्टम बनाया गिलास सुई (नं 11 डालनेए एल एस और परिखा के एक छोर में उपकरण) और परिखा की दिशा (चित्रा 1C) के साथ, दांतेदार subiculum को गाइरस (डीजी) या सीए 1 क्षेत्र से फाइबर कनेक्शन, काटा। यदि आवश्यक हो तो हिप्पोकैम्पस के सेप्टल और लौकिक सिरों ट्रिम करने के लिए एक बहुत ठंडा ब्लेड लागू करें। कटौती परिखा में (विशिष्ट सामग्री और उपकरणों में नं 12) एक कस्टम बनाया धातु के तार पाश डालें और एक आग पॉलिश कांच उपकरण के द्वारा हिप्पोकैम्पस के subiculum / सीए 1 छोर पकड़े जबकि ऊतक से दूर महानिदेशक ऊपर खींचने (चित्रा -1) ।
- इसके बाद के संस्करण खुलासा प्रक्रिया के बाद, ऊतक पर ठंडा सूक्रोज aCSF के एक और दो या तीन बूँदें जोड़ने और ऊतकों के आसपास अतिरिक्त समाधान निकालें। फिर, किनारों (चित्रा 1E) में बर्फ ठंड ब्लेड के साथ सामने आया हिप्पोकैम्पस ट्रिम और के बारे में (आरटी पर सामान्य aCSF से भरा है और 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ bubbled उबरने के चेंबर में एक रंग से तैयारी जगह 25 डिग्री सेल्सियस)। छुट्टीसामने आया हिप्पोकैम्पस ऊतक रिकॉर्डिंग कक्ष में रखने से पहले के बारे में एक घंटा ठीक करने के लिए।
- अन्य मस्तिष्क गोलार्द्ध लो और 2.5-2.9 कदम के माध्यम से जाने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं। आमतौर पर, एक भी हिप्पोकैम्पस प्रकट करना और ऑक्सीजन और हाइड्रेटेड ऊतक रखने के लिए लगातार बर्फ ठंड सूक्रोज aCSF ड्रॉप करने के लिए पूरी प्रक्रिया को समाप्त करने के बारे में 1 से 2 मिनट ले लो।
3. प्रायोगिक प्रणाली सेटअप
- एक पिन ग्रिड सरणी (पीजीए) पैकेज पर एक कस्टम गढ़े PMEA गोंद और पैकेज (3B चित्रा) पर एक पिन की पैड के लिए एक एकल microelectrode से प्रत्येक पैड से कनेक्ट करने के लिए सूक्ष्म तार संबंध का उपयोग करें। फिर, एक कस्टम बनाया सर्किट बोर्ड पर 13 सॉकेट में पैकेज डालें।
- व्यक्तिगत रूप से कस्टम बनाया सर्किट बोर्ड पर 13 100 की बढ़त के साथ 4 kHz और एम्पलीफायरों के लिए 1 हर्ट्ज से बैंड पास कट ऑफ आवृत्ति के साथ अपने फिल्टर करने के लिए प्रत्येक microelectrode कनेक्ट। एक ए / डी रूपांतरण द्वारा सर्किट बोर्ड से अनुरूप उत्पादन digitizeप्रणाली erting, और एक कंप्यूटर पर डाटा अधिग्रहण और दुकान।
- समाधान प्रवाह (चित्रा -4 ए) के लिए इनलेट और आउटलेट टयूबिंग के साथ सरणी के चारों ओर एक कस्टम निर्मित प्लास्टिक रिकॉर्डिंग कक्ष गोंद। प्रणाली में अलग अलग समाधान रखने के लिए, और शामिल होने और एक सप्ताह में तीन वाल्व द्वारा बोतलों के उत्पादन ट्यूबिंग नियंत्रित करने के लिए कम से कम दो बोतलों का प्रयोग करें। रिकॉर्डिंग कक्ष में समाधान मार्गदर्शक है जो एक चतुर्थ ड्रिप कक्ष के साथ एक ट्यूबिंग व्यवस्था करने के लिए सप्ताह में तीन वाल्व के उत्पादन में कनेक्ट।
- त्रि-वाल्व और रिकार्डिंग कक्ष के इनलेट के बीच, समाधान रिकार्डिंग कक्ष के लिए निर्देशित करने से पहले एक नियंत्रित तापमान (35 डिग्री सेल्सियस) का हल करने के लिए गर्मी एक बिजली के हीटर जोड़ें। एक वैक्यूम ट्यूब जुड़े कुप्पी में समाधान इकट्ठा करने के लिए एक वैक्यूम ट्यूब के लिए रिकार्डिंग कक्ष के आउटलेट संलग्न। इस अध्ययन में किसी भी प्रयोग में कोई हल रीसायकल नहीं है।
4. PMEA पर सामने आया हिप्पोकैंपस रखकर तंत्रिका गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए
5. निकाल रहा हैएक प्रयोग के बाद PMEA से ऊतक
- एक micromanipulator द्वारा ऊतक लंगर को नियंत्रित करने और धीरे-धीरे रिकॉर्डिंग कक्ष से ऊतक उठा। रिकॉर्डिंग कक्ष में प्रवाह को रोकने के लिए इनलेट और आउटलेट दोनों शट डाउन। रिकॉर्डिंग कक्ष समाधान के साथ भरा हो या रिकॉर्डिंग कक्ष पूर्ण नहीं है अगर चैम्बर भरने के लिए समाधान की कुछ बूँदें जोड़ने चाहिए।
- ऊतक के प्रत्येक कोने लिफ्ट करने के लिए एक छोटा सा पेंट ब्रश का प्रयोग करें। ऊतक समाधान में तैर नहीं है, तो ऊतक अभी भी सरणी पर बैठा के साथ सावधानी से चैम्बर सुखाने के लिए वैक्यूम ट्यूब रोजगार। फिर ध्यान से धीरे-धीरे चैम्बर फिर से भरना और रिकार्डिंग कक्ष भरा हुआ है जब प्रवाह को रोकने के लिए प्रवेश बंद करने के लिए इनलेट खुला। फिर ऊतक के प्रत्येक कोने लिफ्ट करने के लिए छोटे पेंट ब्रश लागू करें।
- ऊतक जब तक दोहराएँ कदम 5.2 सरणी से अलग और समाधान में तैर रही है। ऊतक समाधान में तैर रहा है, तो दूर ऊतक चूसना करने के लिए वैक्यूम ट्यूब का उपयोग करें। ओपन टीवह इनलेट में प्रवाह और आउटलेट में वैक्यूम खुला। आसुत जल के साथ प्रणाली धो लें और इसे बाहर सूखी।
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Representative Results
यहाँ के आंकड़े में दिखाया गया डेटा 4-एपी (100 माइक्रोन) आरटी पर रिकॉर्डिंग कक्ष में ऊतक के ऊष्मायन के दौरान जोड़ा aCSF (25 डिग्री सेल्सियस) के साथ सामने आया हिप्पोकैम्पस तैयारी में दर्ज किए गए। आम तौर पर गतिविधि 5 मिनट के भीतर शुरू होता है, लेकिन बड़े पशुओं से कुछ हिप्पोकैम्पस ऊतकों में यह लंबे समय तक लग सकते हैं। पहले से 14,15 रिपोर्ट के रूप में PMEA के साथ मनाया 4-एपी प्रेरित न्यूरोनल फायरिंग में ही है। इलेक्ट्रोड 200 माइक्रोन की ऊंचाई है, इलेक्ट्रोड सुझावों बस से बाहर सेल परत (चित्रा -3 सी) सेल परत आमतौर पर 250 हिप्पोकैम्पस के alveus से ऊपर 300 मीटर करने के लिए है, क्योंकि (चित्रा 2), रिकॉर्डिंग (57 से नीचे स्थित हैं विभिन्न चैनलों से नमूना प्रयोग) में 64 एक ज्यादातर सकारात्मक विक्षेपन है। हालांकि, इन सकारात्मक रिकॉर्डिंग से कुछ के रूप में अच्छी तरह से (चित्रा 5 ब) रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड सुझावों सेल परत के लिए काफी करीब हैं, तो छोटे नकारात्मक विक्षेपण प्रदर्शित कर सकता है।इलेक्ट्रोड सुझावों सेल परत के स्तर पर सही स्थित हैं, तो रिकॉर्डिंग इस पर सकारात्मक बदलाव के लिए या सिर्फ नकारात्मक spiking (चित्रा 5C) 16 के साथ बहुत तेज नकारात्मक spiking होगा। यहाँ दिखाया गया डेटा नमूने में, 57 रिकॉर्डिंग के बाहर 5 चैनल नकारात्मक spiking है। सभी 64 चैनलों से डेटा प्राप्त करने के बाद, व्यक्ति को सामान्य बनाने की विधि (चित्रा 6B) रिकॉर्डिंग 7 के समय धुरी के साथ एक 2-डी विमान पर तंत्रिका प्रचार नक्शा करने के लिए लागू किया जाता है। PMEA और सामने आया हिप्पोकैम्पस का एक संयोजन के साथ, तंत्रिका प्रचार मैप और चित्रा (6) हिप्पोकैम्पस के पूरे क्षेत्र को पार करने, सीए 3 में से एक पक्ष में ज्यादातर आरंभ और एक विकर्ण लहर सामने अनुलंबीय स्थानांतरित करने के लिए मनाया जाता है।
एक सामने आया हिप्पोकैम्पस के लिए चित्रा 1. सर्जिकल प्रक्रिया । (ए) के दो हिप्पोकाम्पी से एक एक माउस मस्तिष्क के टेम्पोरल लोब से विच्छेदित कर रहा है। (बी) के हिप्पोकैम्पस परिखा का पर्दाफाश करने के लिए एक आग पॉलिश कांच विंदुक के साथ खत्म रूप से फ़्लिप है सेप्टल और अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ लौकिक समाप्त। (सी)। हिप्पोकैम्पस के दोनों सिरों छंटनी कर रहे हैं और एक गिलास सुई महानिदेशक और अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ सीए 1 या subiculum के बीच कनेक्शन कट करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (डी) हिप्पोकैम्पस एक कस्टम निर्मित धातु के तार पाश से सामने आया है। (ई) के साथ सामने आया हिप्पोकैम्पस subiculum और डीजी छंटनी की। (एफ) एक सामने आया हिप्पोकैम्पस के अंतिम ऊतक तैयारी। यह एक प्रयोग में सरणी पर रखा गया है जब इस स्थिति में हिप्पोकैम्पस के उन्मुखीकरण से पता चलता है। सामने आया हिप्पोकैम्पस शरीर रचना विज्ञान के बारे में अतिरिक्त जानकारी के लिए पहले प्रकाशित पांडुलिपियों 7 में प्रयोगात्मक विधियों का उल्लेख कृपया।g1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
सामने आया हिप्पोकैम्पस चित्रा 2. प्रोटोकॉल पार अनुभाग। क्रिस्टल वायलेट दाग जिससे सही सेल परत के नीचे microelectrodes लगाने alveus से ऊपर 250 माइक्रोन 300 के स्तर सामने आया हिप्पोकैम्पस के भीतर सीए 1-सीए 3 पिरामिड सेल परत की स्थिति से पता चलता है (चित्रा -3 सी को देखें)। हिप्पोकैम्पस सामने आया था के बाद क्रिस्टल वायलेट के साथ दाग वर्गों को प्राप्त करने के लिए, ऊतक के बाद तय की गई थी। सामने आया हिप्पोकैम्पस पीएफए 4% ओ / एन में रखा गया था। फिर, ऊतक सूखी बर्फ में डिग्री सेल्सियस -35 को शांत करने के लिए एक बाइकर युक्त isopentane (2-Methylbutane) स्नैप-ठंड से तबादला कर दिया और 48 घंटे के लिए sucrose के समाधान (30%) में रखा है, और पीछा किया गया था। जमे हुए अनुभाग तो एक cryostat साथ में काट रहे थेपिरामिड सेल परत के स्थान प्रकट करने के लिए (चित्रा 2 में दिखाया गया है) अनुप्रस्थ विमान में 20 माइक्रोन मोटी वर्गों। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा PMEA पर 3. सामने आया हिप्पोकैम्पस। (ए) प्रत्येक स्वर्ण धातु का पता लगाने के अंत में स्थित microelectrodes के साथ एक नया PMEA के शीर्ष दृश्य। सही पक्ष पर डालने 200 माइक्रोन की ऊंचाई और 20 माइक्रोन 7,13 के एक व्यास के साथ इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के तहत एक भी microelectrode से पता चलता है। (बी) microelectrode सरणी पर microelectrodes के चारों ओर एक प्लास्टिक की रिकार्डिंग कक्ष के साथ एक पीजीए पैकेज पर चिपके है एक गिलास सब्सट्रेट। सही पर डालने microelectrode आगमन पर रखा एक सामने आया हिप्पोकैम्पस से पता चलता हैप्र बाईं तरफ के मध्य। (सी) में, ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (अक्टूबर) इमेजिंग के लिए एक अलग प्रयोग में सरणी के शीर्ष पर तैनात सामने आया ऊतक से पता चलता है। सही पर, बाईं तरफ अक्टूबर इमेजिंग से प्राप्त दो अनुदैर्ध्य टुकड़ा छवियों सही सेल शरीर परत के नीचे के क्षेत्र में पहुँच (सफेद डॉट्स तीर द्वारा उठाई) microelectrode सुझावों को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
4. प्रायोगिक स्थापना चित्रा। (ए) शिकंजा के साथ एक प्लास्टिक कवर ढक्कन संभव पानी के नुकसान के खिलाफ की रक्षा करने के लिए सर्किट पर रखा गया है। रिकॉर्डिंग कक्ष समाधान प्रवाह ले जाने के लिए इनलेट और आउटलेट ट्यूबों दोनों है। एक नायलॉन फाइबर जाल के साथ चिपके एक कस्टम बनाया ऊतक लंगर Tiss सुरक्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता हैप्रयोगों के दौरान UE। (बी) चित्र एक प्रयोग के दौरान एक नमूना टुकड़ा पकड़े ऊतक लंगर दिखा PMEA का गिलास सब्सट्रेट के नीचे से ले लिया। घुमावदार तारों ऊतक के शीर्ष पर दबाव जाल से नायलॉन फाइबर होते हैं। दौर डॉट्स microelectrodes का आधार हैं। तीर कई प्रयोगों के बाद क्षतिग्रस्त हो गए थे कि इलेक्ट्रोड को इंगित करें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
एक सामने आया हिप्पोकैम्पस से PMEA द्वारा दर्ज चित्रा 5. कच्चे डेटा। पैनल वाम: एक एकल microelectrode से दर्ज epileptiform गतिविधि 4-एपी प्रेरित राइट पैनल:। बाईं तरफ के समय खिड़की में चिह्नित संकेत के तेजी से बढ़ी संस्करण में। (ए) सहज गतिविधि का एक उदाहरण में से 10 सेकंड अनुभाग100 माइक्रोन 4-एपी aCSF द्वारा पेश 34.9 DB के एक SNR के साथ संकेतों के polarity पर आधारित बेसल वृक्ष के समान क्षेत्र में स्थित microelectrodes में से एक के लिए प्राप्त की। (बी) के कच्चे डेटा एक SNR के साथ somata के करीब स्थित एक और microelectrode से दैहिक परत के भीतर तैनात एक इलेक्ट्रोड से प्राप्त रिकॉर्डिंग के 27.2 डीबी। (सी) उदाहरण के। इस उदाहरण में, SNR अभी भी आयोजित करने लेकिन ऊतकों में मर्मज्ञ नहीं एक तुला इलेक्ट्रोड से प्राप्त 18.53 डीबी। (डी) रिकॉर्डिंग है। तुला इलेक्ट्रोड उन बरकरार इलेक्ट्रोड (इस उदाहरण में 1.5 DB) की तुलना में एक महत्वपूर्ण कम SNR है। एक microelectrode से दर्ज (ई) बेसलाइन शोर। आधारभूत आमतौर पर शिखर 150 से 200 μV से मूल्य और एक एकल इलेक्ट्रोड के प्रतिबाधा के लिए एक चोटी है लगभग 1 MΩ 2 करने के लिए है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
2-डी प्रचार नक्शे में तंत्रिका रिकॉर्डिंग डेटा की चित्रा 6 रूपांतरण। (ए) एक 170 मिसे समय खिड़की हर चैनल में एक भी तंत्रिका spiking PMEA की तस्वीर पर प्लॉट truncates। कच्चे डेटा 100 हर्ट्ज पर एक कम पास फिल्टर द्वारा फ़िल्टर किया जाता है। टूटी हुई इलेक्ट्रोड से संकेत यह चारों ओर रिकॉर्डिंग के साथ interpolated हैं। इस उदाहरण में, सभी spikes के सकारात्मक रहे हैं। (बी) (ए) में लाल पिक्सेल से एक भी तंत्रिका कील व्यक्ति को सामान्य बनाने के लिए एक कस्टम विकसित विधि के साथ रंग पट्टी (अधिक जानकारी के लिए पिछले प्रकाशन के लिए कृपया देखें लिए सामान्यीकृत है सामान्य बनाने 7)। (सी) के बारे में अलग-अलग सामान्य बनाने के द्वारा बनाई गई रंग नक्शे अलग समय बिंदुओं पर सामने आया हिप्पोकैम्पस के पूरे क्षेत्र भर में है कि प्रचार चालें दिखा।www.jove.com/files/ftp_upload/52601/52601fig6large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
हिप्पोकैम्पस के अनुदैर्ध्य और अनुप्रस्थ कुल्हाड़ियों एक मर्मज्ञ microelectrode सरणी के साथ संयोजन में संरक्षित कर रहे हैं, जहां सामने आया हिप्पोकैम्पस तैयारी, के विकास, हिप्पोकैम्पस 7 में शरीर रचना विज्ञान कनेक्शन या तंत्रिका प्रचार की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। यह खुलासा प्रक्रिया भी वयस्क चूहों में हिप्पोकैम्पस के अध्ययन के लिए लागू है। इस तैयारी के साथ हाल के अध्ययनों से चार-एपी प्रेरित epileptiform गतिविधि सामने आया हिप्पोकैम्पस के पूरे क्षेत्र भर में एक विकर्ण लहर सामने (चित्रा 6) 7,8 के साथ प्रचार कर सकता है कि पता चला है। इन अध्ययनों से एक फ्लैट हिप्पोकैम्पस तंत्रिका नेटवर्क में तंत्रिका प्रसार (चित्रा 6) की जांच की जा सकती है जब बरकरार सामने आया हिप्पोकैम्पस अनुप्रस्थ या अनुदैर्ध्य या तो स्लाइस से अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है कि पता चला है।
मर्मज्ञ microelectrode मौजूदा मील पर एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता हैएक सपाट सतह 11,12,17 पर तैनात एकाधिक संपर्कों से मिलकर जो croelectrode सरणियों (विदेश मंत्रालय)। सेल परत के बारे में 250-300 माइक्रोन दूर सतह (चित्रा 2) से स्थित है के बाद सपाट सतह इलेक्ट्रोड के साथ विदेश मंत्रालय के सामने आया हिप्पोकैम्पस के साथ उपयोग करने के लिए मुश्किल हैं। यहाँ वर्णित PMEA ऊतक 7,13 अंदर गहरे तक पहुंचने के लिए 200 माइक्रोन की ऊंचाई के साथ तंत्रिका प्रसार के अध्ययन के लिए उपयुक्त 64-मर्मज्ञ इलेक्ट्रोड के साथ इस समस्या को हल करने के लिए डिजाइन किया गया था। इसके अलावा, इस तरह के कॉर्टिकल स्लाइस के रूप में, किसी भी फ्लैट ऊतक तैयार करने में PMEA भी लागू हो, हिप्पोकैम्पस अनुप्रस्थ स्लाइस आदि
इस PMEA का उपयोग करने का एक और लाभ में सुधार SNR है। इस PMEA का एक प्रोटोटाइप अध्ययन पिछले अध्ययनों में संकेत के बाद से इस PMEA द्वारा दर्ज तंत्रिका संकेत के SNR के अनुपात VSD रिकॉर्डिंग की तुलना में काफी अधिक है और अधिक स्थिर है, जो 19.4 ± 3 DB, के एक औसत मूल्य है जो दिखाता है कि विषाक्तता औरVSD की तस्वीर विरंजन स्पष्ट रूप से डेटा 8 रिकॉर्ड करने की क्षमता बिगड़ा। साथ उन लोगों को समतल इलेक्ट्रोड सरणियों की तुलना में एक उच्च SNR है जिसके बारे में 20 डीबी से 30 से एक श्रृंखला के लिए, इस अध्ययन में (चित्रा 5) PMEA बढ़ता से रिकॉर्डिंग की SNR के ऊतक लंगर का उपयोग करके एक बेहतर प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के साथ 10 to15 डीबी 11,18 से एक मूल्य। हिप्पोकैम्पस प्रकट करने की क्षमता के क्रम में एक फ्लैट रिकॉर्डिंग सरणी से पूछताछ की जा सकती है कि न्यूरॉन्स (सीए 1-सीए 3) की एक परत प्राप्त आवश्यक है।
सिलिकॉन सरणी एक पारदर्शी सब्सट्रेट पर बनाया गया है, क्योंकि इसके अलावा, वोल्टेज संवेदनशील डाई इमेजिंग तकनीक हिप्पोकैम्पस 8 में तंत्रिका गतिविधि के प्रसार का अध्ययन करने के PMEA प्रणाली में एकीकृत किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट वोल्टेज संवेदनशील संकेतक के साथ ट्रांसजेनिक चूहों भी pharmacologi द्वारा प्रेरित मूल और प्रचार शारीरिक शर्तों के तहत संकेत के रूप में अच्छी तरह के रूप में परिवर्तन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैसीएएल एजेंटों या विभिन्न पशु मॉडल 9 से आनुवंशिक रूप से संशोधित ऊतक।
उच्च गुणवत्ता रिकॉर्डिंग को आश्वस्त करने के क्रम में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सबसे पहले ऊतक व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के रूप में संभव के रूप में जल्दी से बाहर किया जाना चाहिए। आमतौर पर, यह 2.10 के लिए 2.1 से सभी चरण)) के माध्यम से जाने के बारे में 1 से 2 मिनट लगते हैं। वास्तविक प्रयोगात्मक सर्जरी से बाहर किए जाने से पहले कुछ नमूना जानवरों पर खुलासा प्रक्रिया का अभ्यास अत्यधिक सुझाव दिया है। दूसरे, प्रवाह की दर की जरूरत है रिकॉर्डिंग कक्ष में छिड़काव तरल पदार्थ के स्तर के किसी भी उतार-चढ़ाव से बचने के लिए स्थिर रखा जाए। इसके अलावा, ऊतक सरणी के लिए ऊतक रिश्तेदार के आंदोलन से बचने के लिए नीचे लंगर की जानी चाहिए।
यहाँ वर्णित PMEA सामने आया हिप्पोकैम्पस में तंत्रिका प्रसार की निगरानी में उपयोगी संकेत प्रदान कर सकते हैं, इस रिकॉर्डिंग कार्यप्रणाली के लिए कुछ कमियां और सीमाएं हैं।
सबसे पहले, Microelectrodes (चित्रा 5D, ई) उन पर रखा यांत्रिक बल की वजह से टूट सकती है। ऊतक नियुक्ति और हटाने की प्रक्रिया के दौरान, छोटे पेंट ब्रश और सरणी के बीच आकस्मिक संपर्क microelectrodes मोड़ या तोड़ने के लिए पैदा कर सकता है। ऊतक लंगर micromanipulator के द्वारा नीचे उतारा जाता है, चैम्बर के नीचे के साथ ऊतक की क्षैतिज आंदोलन झुकने या इलेक्ट्रोड का टूटना करने के लिए ले जा सकता है कि एक कतरनी बल बना सकते हैं। एक भविष्य डिजाइन में, microelectrodes उन्हें मजबूत बनाने के लिए कुछ हद तक एक मोटा आधार के साथ reshaped किया जाना चाहिए। इस PMEA के वर्तमान संस्करण में, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड एक संकीर्ण आधार जिससे इलेक्ट्रोड (चित्रा 3A) कमजोर, इसका व्यास 13 की तुलना में है।
सफाई की प्रक्रिया भी पर्याप्त रूप से सरणी के लिए देते हैं सकता है कि अवशिष्ट ऊतक और तंतुओं को दूर करने के लिए सुधार किया जाना चाहिए। एक प्रयोग के बाद, छोटे टुकड़ोंऊतक के microelectrodes से जुड़ी रह सकता है और इलेक्ट्रोड पर छोड़ दिया इस अवशिष्ट ऊतक हटा दिया जाना चाहिए। इन अवशिष्ट ऊतकों हटाया नहीं कर रहे हैं, इलेक्ट्रोड के प्रतिबाधा और रिकॉर्डिंग के SNR को प्रभावित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल अनुभाग का हिस्सा 5 में संकेत के रूप में आसुत जल के साथ प्रणाली की निस्तब्धता सुझाव दिया है। उपयोगकर्ताओं को भी इस प्रणाली को नुकसान पहुँचाए बिना ऊतक भंग कर सकते हैं जो कुछ कमजोर अम्लीय समाधान के साथ सिस्टम फ्लश करने के लिए सलाह दी जाती है
इस प्रोटोकॉल का एक और दोष खुलासा प्रक्रिया के दौरान, इस सामने आया हिप्पोकैम्पस में पर्फोरेंट पथ महानिदेशक से हिप्पोकैम्पस के अन्य परतों को प्रचार संभव तंत्रिका संकेतों की जांच को रोकने में कटौती कर रहा है।
अंत में, हम सामने आया हिप्पोकैम्पस Tissu के साथ एक उच्च पहलू अनुपात microelectrode सरणी के संयोजन से हिप्पोकैम्पस के भीतर तंत्रिका गतिविधि के प्रचार-प्रसार की जांच करने के लिए यहां एक उपन्यास पद्धति का वर्णन किया हैई। विधि दोनों अनुदैर्ध्य और अनुप्रस्थ दिशाओं में प्रचार कर सकते हैं कि कैसे neuronal गतिविधि का एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व किया था। इस तकनीक को भी सरणी के शीर्ष पर एक समान तरीके से रखा cortical ऊतक को लागू किया जा सकता है। सरणी पारदर्शी है और यह भी तंत्रिका ऊतक में संकेत प्रसार के बारे में कुछ महत्वपूर्ण निष्कर्ष करने के लिए ले जा सकता है, क्योंकि इसके अलावा, इस तैयारी के साथ ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग तकनीक के संयोजन संभव है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
| A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
| Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
| Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
| Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
| Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
| small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
| Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
| Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
| Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
| Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
References
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