Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Bir Penetran Mikro-elektrot Array ile bir Kırımsız Hipokampal Hazırlık Sinir Faaliyet Yayılım

Published: March 27, 2015 doi: 10.3791/52601
* These authors contributed equally

Summary

Biz nöronların CA1-CA3 dizi koruyan bir in vitro katlanmamış hipokampus geliştirdik. Nüfuz mikro elektrot dizisi ile birlikte, sinir aktivitesi hem uzunlamasına hem de enine yönlerde izlenebilir. Tüm hipokampta yayılma aynı anda kaydedilebilir Bu yöntem hippocampal slice preparatlarda fazla avantajlar sağlamaktadır.

Abstract

Bu protokol, hipokampus sinir aktivitesi eşleştirmek için bir mikro-talaşlı dizi ile birlikte in vitro düz hipokampus hazırlanmasında yeni hazırlanması için bir yöntem tarif eder. enine hipokampal dilim hazırlık hipokampus elektrofizyoloji çalışma en yaygın doku hazırlıktır. Bir uzunlamasına hipokampal dilim de hipokampus uzunlamasına bağlantıları araştırmak amacıyla geliştirilmiştir. kalınlığı yeterli oksijen difüzyonu sağlar, çünkü dokunulmamış fare hipokampüs, in vitro olarak yapılabilir. Doku bazı eksik ya da katlanmış ya olduğundan Ancak, bu üç hazırlıkları nöral yayılımı doğrudan erişim vermeyin. katlanmamış sağlam hipokampus enine ve in vitro hipokampus sinyal yayılma tam ölçüde analiz dokuya doğrudan erişim için düz bir konfigürasyonda boyuna bağlantıları hem de sağlar. Etkili bir t nöral aktiviteyi izlemek içinO hücre tabakası, özel imal edilmiş mikro-elektrot dizisi (PMEA) nüfuz yaptı ve katlanmamış hipokampus başvurdu. Yüksekliği 200 mikron 64 elektrot ile PMEA derin fare hipokampus içinde nöral aktiviteyi kayıt olabilir. katlanmamış hipokampal hazırlanması ve PMEA benzersiz kombinasyonu gürültü oranı yüksek bir sinyal ile hipokampusun iki boyutlu CA1-CA3 bölgeleri hızı ve sinir aktivitesinin yayılma yönü incelemek için yeni bir in vitro araç sağlar.

Introduction

Nöral sinyallerin sinir iletimi veya ilerlemesini anlamak beyinde 1-3 normal fonksiyon ve patolojik durumlarda hem nöral iletişim mekanizmasının belirlenmesi için çok önemlidir. hipokamp bu bellek, ve mekansal izleme gibi pek çok beyin fonksiyonlarında önemli bir rol oynar ve önemli ölçüde davranışı, 1,6 etki, çeşitli patolojik değişikliklerinin olduğu için beyindeki en yaygın olarak araştırılmış yapılardan biridir. Hipokampus karmaşık bir organizasyon sergiler rağmen, yapısı farklı unsurları kolayca tespit ve dilim hazırlama 4-6 ulaşılabilir. Hipokampusun enine yönde nöral etkinlik kıvrımlarının (AD), CA3, CA1 andsubiculum 4,5 ihtiva tri-sinaptik yolu ile yaymak için bilinmektedir. Bu sinaptik iletim ve aksonal iletim communicati için çok önemli bir rol oynadığı da düşünülmektedirBu enine devresinde 4,6 üzerinde. Ancak, sinir sinyalin yayılma enine ve boyuna yönlerde 4,6 hem de yer alır. Bu hipokampus tamamen yayılma 4 belirli bir yöne gözlem sınırlamak dilim hazırlıkları kullanılarak araştırılmıştır edilemez olduğunu ima eder. uzunlamasına dilim uzunlamasına eksen 5 boyunca aksonal yolları araştırmak için geliştirilmiştir. Araştırmacılar ağırlıklı enine ve boyuna eksenleri sırasıyla 6 boyunca davranış özel gama ve teta salınımlar gözlemledik. Bu davranışlar ayrı ayrı ele alınmıştır, ancak her iki yöne aynı anda erişim bu davranışları anlamak önemlidir. Hatta sağlam hipokampus hazırlık gelişimi ile, bunun nedeni hipokampus 4 katlanmış-yapısına tüm dokusu boyunca yayılmasını izlemek zordur. katlanmamış hipokampus dolu nöronlar erişim sağlardüz iki boyutlu hücre tabakası 7,8 formunda.

Dentat girus (DG), (Şekil 1) açılma olarak, hipokampus, enine ve uzunlamasına bağlantı hem CA3 ve CA1 her ikisini de içeren iki boyutlu bir tabaka halinde düzenlenmiş, piramidal hücre tabakası ile sağlam kaldığı bir dikdörtgen şekline sahip düzleştirilmiş bir şekli benimser Nöral yayılmasını araştırmak için kullanılabilecek nöral doku düz bir parça bırakarak (Şekil 2) 8. Sinir aktivitesi daha sonra münferit cam pipetler, mikroelektrot dizileri, uyarıcı elektrot ve aynı zamanda gerilim duyarlı boyalar (VSD), 3,7,8 ile izlenebilir. Buna ek olarak, transgenik farelerin genetik olarak kodlanmış gerilim göstergesi yayılım modelini 9 izlemek için kullanılabilir.

katlanmamış hipokampal ağ yapılandırması düz optik yöntem kayıt için değil, aynı zamanda bir mikroelektrot dizisi için uygundur. Mpiyasada mevcut dizilerin ost düz ya da düşük profilli elektrotlar ile imal edilir ve doku dilimleri ve kültürlü nöronlar 10-12 hem nöral aktiviteyi kaydedebilirsiniz. Nöronların soma dokuya daha derin bulunduğu çünkü sinyallerin sağlam bir dokudan elde edilir, ancak bir sinyal-gürültü oranı (SNR) azalır. Yüksek boy oranları ile mikroelektrod elektrot diziler SNR geliştirmek için gereklidir.

Bu amaçla, bir nüfuz mikroelektrot dizi (PMEA), laboratuarda geliştirilmiş ve katlanmamış hipokampus 7,13 bir 20 um çapında ve 200 mm yüksekliğinde 64 sivri sokulmasıyla direkt olarak dokunun araştırmak olanağı sağlar . Bu mikroelektrot dizisi gerilim duyarlı boya görüntüleme kıyasla daha yüksek SNR sahiptir ve SNR bir deney 7,13 sırasında sabit kalır. katlanmamış hipokampal hazırlanması ve PMEA'nın kombinasyonu yatırım için yeni bir yol sağlariki boyutlu düzlem üzerinde nöral yayılmasını Igate. Bu tekniği kullanarak deneyler zaten sinirsel aktivite bağımsız sinaptik veya elektrik sinaps 7 yaymak sayede hipokampus nöral sinyal yayılım mekanizmaları hakkında önemli sonuçlar vermiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Hayvan deneysel protokolleri gözden ve üniversitede Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. P20 P10 çağındaki her iki cinsiyetten CD1 fareleri bu çalışmada kullanılmıştır.

Cerrahi ve Deneysel Kayıt için 1. Çözümler

  1. NaCl 124, KCI 3.75, KH 2 PO4 1.25, MgSO 4 2, NaHCO 3 26, Dekstroz 10, ve CaCl 2 2: (mM) içeren normal bir yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) tampon hazırlayın. Deneyin başlangıcında yıkama sistemi yanı sıra, ayrıldıktan sonra, doku kurtarma için, bu normal aCSF kullanın.
  2. Hipokampus diseksiyon sırasında ve içerir sükroz aCSF hazırlayın (mM olarak): Sakaroz 220, KCI 2.95 NaH 2 PO4 1.3, MgSO 4 2, NaHCO3, 26 Dekstroz 10 ve CaCI2 2. Sağlam hipokampal doku terkibi epileptiform activity uyarılması amacıyla, normal aCSF 4-aminopiridin (4-AP) ekleyin100 uM konsantrasyonu.

Bozulmamış Hippocampus Preparasyon 2. Cerrahi Prosedür

  1. Bir kurutucu cam kavanoz (Belirli Malzeme ve Ekipman No.1) altındaki odasına izofluran (1 ml) Bırak ve hayvan ile temas almaz böylece alt aşamada yüzeyini kapsayacak şekilde düzenli bir kağıt havlu kullanın Sıvı. Ardından, kavanoza CD1 fare koyun ve kapağını kapatın. Yaklaşık 1 dakika ile 2 dakika süre ile, kapalı bir kavanoza hayvan tutun. Nefes sıklığı yaklaşık bir saniyede olduğunda, kavanoz fareyi çıkarın.
  2. Cerrahi sahnede fare koyun ve uygun bir makasla başını kesmek. Hemen konusu hayvanın başı kesildikten sonra, yaklaşık 30 saniye boyunca buz soğukluğunda (3-4 ° C) içine baş, oksijenli sükroz aCSF yerleştirin.
  3. Kafatasının üst deriyi kaldırmak ve tempo yakın iki ucunda yanı sıra baş orta hat boyunca kafatası kesmek için ince makas (Özel Malzeme ve Ekipmanları No.5) kullanınral lob. Kullanım forseps (Özel Malzeme ve Ekipmanları No. 6) beyin ortaya koymak için başın her iki tarafına doğru kesik kafatası soymak için.
  4. Dikkatle kafatasının altından beyin kabuğu ve daha sonra üzerine düşmesi beyin ve kafatası parietal lob arasındaki boşluğa bir mikro laboratuar spatula (Belirli Malzeme ve Ekipmanları No 8) takın hazırlanmış bir buz-soğuk (3 Belirli Malzeme ve Ekipmanları) ıslak filtre kağıdı (No.2 ile kaplı -4 ° C) cerrahi evre. Bir buz-soğuk bıçak ile beyincik çıkarın ve beynin orta hat keserek iki hemisfer ayırın. Daha sonra,% 95 O 05/02% CO2 ile kabarcıklandırılmış buz gibi soğuk sükroz aCSF ile dolu bir beher içine iki ayrılmış hemisferlerin yerleştirin.
  5. Buz gibi soğuk filtre kağıdı sahnede yarımkürede ve yerin yarısını alın. Ekstra çözüm emmek için beynin etrafında normal kağıt havlu veya filtre kağıdı yerleştirin. Malzeme iki yangın parlatılmış cam pipet araçları (No. 10 kullanın veEkipman) beynin orta kısmının geri kalanından ayırmak için korteksi.
  6. Hipokampus korteks içinden maruz kalan ve buz-soğuk sahneye koymak sonra, doku üzerinde buz soğuk sakaroz aCSF iki veya üç damla koyun ve ardından hipokampus etrafında ekstra çözüm kaldırmak. Hipokampus iki ucunda korteks ile bağlantıları kesin. Ardından, yangın cilalı cam araçları ile beynin dışarı hipokampus incelemek ve beynin geri kalan kısmını kaldırın.
  7. Onun alveus tarafı yukarı bakacak ve hipokampal sulkus aşağı bakacak şekilde tüm hipokampus ayırın. Hızla yeniden doku üzerinde buz soğuk sakaroz aCSF iki veya üç damla damla ve kağıt havlu parçası kullanarak doku etrafında ekstra çözüm kaldırmak. Sulkus (Şekil 1B, C) ​​maruz tüm hipokampus üzerinde açmak için bir ateş cilalı cam aracını kullanın.
  8. Normal optik mikroskop altında, Özgül Materi bir ölçüye cam iğne (No. 11 yerleştirinals ve sulcus bir ucunu Ekipmanları) ve sulcus yönünde (Şekil 1C) boyunca, dentat subikulum için gyrus (DG) veya CA1 alanından lif bağlantıları kesmek. Gerekirse hipokampus septal ve zamansal biter süs için bir buz-soğuk bıçak uygulayın. Kesme sulkus içine (Özel Malzeme ve Ekipmanları No. 12), bir özel yapılmış metal tel döngü yerleştirin ve bir yangın parlatılmış cam aracı tarafından hipokampus subikulum / CA1 ucunu tutarak dokudan uzak DG üzerinden çekin (Şekil 1D) .
  9. Yukarıda açılma prosedüre göre, doku üzerine buz gibi soğuk sükroz aCSF bir, iki veya üç damla ve doku çevresinde ilave uzaklaştırın. Daha sonra, kenarları (Şekil 1E) buz gibi soğuk bıçak ile katlanmamış hipokampus Döşeme ve ilgili (oda sıcaklığında, normal aCSF ile doldurulmuş ve% 95 O 05/02% CO2 ile kabarcıklandırılmış geri kazanılması haznesine bir spatula ile hazırlanmasını yer 25 ° C). Ayrılmakkatlanmamış hipokampus doku kayıt odasına yerleştirmeden önce yaklaşık 1 saat kurtarmak için.
  10. Diğer beyin yarımkürede alın ve 2,5-2,9 adım adım gitmek için kullanabilirsiniz. Genellikle, bir tek hipokampus açılmak ve oksijenli ve sulu doku tutmak için sürekli buz gibi soğuk sakaroz aCSF damla tüm prosedürü tamamlamak için yaklaşık 1 ila 2 dakika sürebilir.

3. Deneysel Sistem Kurulumu

  1. Bir pim ızgara dizisi (PGA) paket üzerinde özel bir imal PMEA'nm Tutkal ve ambalajın (Şekil 3B), bir pimin pedi tek bir mikroelektrot her ped bağlamak için mikro tel bağlanmasını kullanır. Ardından, ısmarlama bir devre kartı 13 sokete paketi takın.
  2. Bireysel özel yapılmış devre kartı 13 100 kazanç 4 KHz ve amplifikatörler 1 Hz band geçiren kesme frekansı ile filtreleri her mikroelektrot bağlayın. A / D sohbetler devre kartından analog çıkış Sayısallaştırsistemi Erting ve bir bilgisayardaki verileri kazanmak ve depolamak.
  3. Çözelti akış (Şekil 4A) için giriş ve çıkış boru ile dizi etrafında bir ısmarlama plastik kayıt odasına Tutkal. Sistemdeki farklı çözümler tutmak ve birleştirme ve üç valf ile şişelerin çıkış boru kontrol etmek için en az iki şişe kullanın. Kayıt odasına çözüm rehberlik IV damla odası ile bir boru sistemine tri-vana çıkışını bağlayın.
  4. Tri-valf ve kayıt odasının giriş arasında, çözelti, kayıt odasına yönlendirilir önce kontrollü bir sıcaklıkta (35 ° C) çözelti ısıtmak için bir ısıtıcı ekleyin. Bir vakum tüpü bağlı balona çözüm toplamak için bir vakum tüp kayıt odasının çıkış takın. Bu çalışmada herhangi bir deneyde herhangi bir solüsyon geri verme.

4. PMEA'nın üzerine Kırımsız Hippocampus Yerleştirme Sinir Aktivite kaydedin için

  • Deney düzeneği hazırlamak için, bir normal aCSF ile şişe ve 4-AP aCSF ile bir şişe doldurun. Her iki şişelerde, kabarcık% 95 O, her denemenin başından itibaren 05/02% CO 2. Bir deney sırasında seçilen hangi çözüm denetlemek için bir üç-valf konnektörünü kullanın. Bir kabın içine toz çözüm pompalamak için odasının çıkışında bir vakum tüpü bağlayın. Kayıt odasına teslim etmeden önce boru hattı ısıtın ve kontrollü bir sıcaklık seviyesinde (35 ° C) çözüm tutmak.
  • Odasına kayıt giriş ve çıkış kapalı olduğunda, kayıt odasına katlanmamış hipokampus aktarmak ve yerleştirmek için özel yapılmış cam pipet damlalık kullanabilirsiniz. Mikroskop altında, doku çözeltide yüzen ise düzenli bir küçük boya fırçası kullanarak gelişeceğini hipokampus yerleştirin. Onun alveus tarafı uzak işaret, CA3 alanı aşağı bakacak ve CA1 alan araştırmacı bakacak ile gelişeceğini hipokampus yerleştirin. Dikkatle odası kurutulur ve doku dizi üzerine indirilir kadar çözüm seviyesini düşürmek için kayıt odasının kenarından bir vakum pipet kullanarak odasında çözüm uzak emmek. Sonra, dikkatle dizi üzerine gelişeceğini hipokampus tutmak için doku üstünde bir ölçüye doku çapa (Şekil 4) (Belirli Malzeme ve Ekipmanları No. 14) yerleştirin. IV damla odasında saniyede iki damla akış hızını ayarlamak için giriş ve çıkış yeniden doldurmak ve yavaş yavaş açık kayıt odasına solüsyonu ve bir kaç damla koyun.
  • Kurtarmak için yaklaşık 1 dakika boyunca normal bir ACSF kayıt bölümü içinde doku inkübe, daha sonra 4-AP çözündürüldü aCSF çözüm kaynağı anahtarı ve düzgün bir akış hızını ayarlayın. Yaklaşık 5 ila 10 dakika süreyle aCSF çözülmüş 4-AP doku inkübe ve ardından araştırmacı spontan aktivite göründüğünde sinyali kaydetmek için yazılımını başlatmak olabilir.
  • 5. ÇıkarmaBir Deney sonra PMEA'nın gelen doku

    1. Bir micromanipulator doku çapa Kontrol ve yavaş yavaş kayıt odasından doku kaldırın. Kayıt odasında akışını durdurmak için hem giriş hem çıkış kapatın. Kayıt odası solüsyonu ile dolu veya kayıt odası dolu değilse odasını doldurmak için çözümün bir kaç damla eklemek gerekir.
    2. Doku her köşesine kaldırmak için küçük bir boya fırçası kullanın. Doku solüsyonda yüzen değilse, o zaman doku hala dizi oturan ile dikkatli bir şekilde bölme kuru vakum borusunu kullanır. Sonra dikkatlice yavaş yavaş odasına dolum ve kayıt odası dolduğunda akışını durdurmak için giriş kapatmaya giriş açın. Yine doku her köşesini kaldırın küçük boya fırçası uygulayın.
    3. Dokuya kadar adımı yineleyin 5.2 diziden ayrılmış ve çözelti içinde yüzer. Doku çözeltisi içinde yüzen, o uzak doku emmek için vakum tüpü kullanın. Açık tO girişinde akış ve çıkışına vakum açın. Damıtılmış suyla yıkayın sistemi ve kurur.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Burada, şekillerde gösterilen veriler 4-AP (100 uM) oda sıcaklığında kayıt bölümü içinde, dokunun inkübasyonu boyunca ilave aCSF (25 ° C) katlanmamış hipokampus hazırlanmasında kaydedildi. Normalde etkinlik 5 dakika içinde başlar, ancak daha yaşlı hayvanlarda bazı hipokampal dokularda daha uzun sürebilir. Daha önce 14,15 bildirilen PMEA ile gözlemlenen 4-AP ile uyarılan nöronal ateşleme aynıdır. Elektrotlar 200 um'lik bir yüksekliğe sahip olduğundan, elektrot uçları hemen üzerinden hücre tabakası (Şekil 3C), hücre tabakası, genellikle 250 hipokampusun Alveus üzerinde 300 um olduğu için (Şekil 2), kayıtlar (57 altında yer alır Farklı kanallardan örnek deney) 64 çoğunlukla olumlu sapmayı var. Ancak, bu olumlu kayıtların bazılarını de (Şekil 5B) kayıt elektrot uçları hücre tabakasının yeterince yakın ise küçük negatif sapmaları görüntüleyebilirsiniz.Elektrot uçları hücre tabakasının düzeyinde sağ yer alıyorsa, kayıt üzerinde olumlu vardiya ya da sadece olumsuz çivilenmesi (Şekil 5C) 16 ile çok keskin olumsuz smaç olacaktır. Burada gösterilen veri örneğinde, 57 kayıtları üzerinden 5 kanal negatif smaç var. 64 kanal verileri elde edildikten sonra, tek tek normalizasyon metodu (Şekil 6B) kayıt 7 zaman ekseni boyunca bir 2-B düzleminde sinir yayılma harita uygulanır. PMEA ve katlanmamış hipokampusun bir kombinasyonu ile, sinir yayılma eşleştirilir (Şekil 6), hipokampusun tüm alanı geçen, CA3 bir tarafında çok başlatmak ve diyagonal dalga önünde uzunlamasına bir şekilde hareket ettiği görülmektedir.

    Şekil 1,
    Katlanmamış hipokampus Şekil 1. Cerrahi prosedür . (A) iki Hipokampuslardan biri fare beynin temporal lob disseke edilir. (B) hipokampus sulkus ortaya çıkarmak için bir yangın parlatılmış cam pipet ile devrildiğinde Septal ve uzunlamasına eksen boyunca zamansal sonlandırmaları. (C). Hipokampus iki ucu kesilmiş ve cam iğne DG ve boyuna ekseni boyunca CA1 veya subikulum arasındaki bağlantıları kesmek için kullanılır. (D) hipokampus ısmarlama metal tel döngü ile gelişeceğini edilir. (E) Kırımsız hipokampus subikulum ve DG kesilmiş. (F) katlanmamış hipokampus son doku hazırlanması. Bir deneyde dizisi yerleştirilir, bu pozisyon hipokampusun yönünü gösterir. Katlanmamış hipokampus anatomisi hakkında ek ayrıntılar için önceden yayınlanmış yazıların 7 deneysel yöntemlere başvurun.g1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

    Şekil 2,
    Katlanmamış hipokampusun Şekil 2. Histoloji kesiti. Kristal mor leke ve böylece doğru hücre tabakasının altında Mikroelektronlar yerini Alveus üzerinde 250 ila 300 arasında bir seviyede katlanmamış hipokampus içindeki CA1-CA3 piramidal hücre tabakasmm konumunu göstermektedir (Şekil 3C ye bakınız). Hipokampus katlanmamış oldu sonra kristal viyole ile boyandı bölümleri elde etmek, doku sonrası sabit oldu. katlanmamış hipokamp 4 PFA% O / N yerleştirilmiştir. Daha sonra, doku kuru buzda ° C -35 soğumaya bir bisikletçinin içeren izopentan (2-Metilbütan) kıskaç dondurma ile aktarılır ve 48 saat süre ile sükroz solüsyonu (% 30) içinde tutulur ve takip edildi. Frozen sonra kriostat ile kesildiPiramidal hücre tabakasının yerini ortaya çıkarmak için (Şekil 2'de gösterildiği gibi) enine düzlemde 20 mikron kalınlığında kesitler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 3,
    Şekil PMEA'nın 3. Kırımsız hipokampus. (A) her altın metal iz sonunda bulunan Mikroelektronlar yeni bir PMEA'nın üstten görünümü. Sağ taraftaki uç 200 um'lik bir yüksekliğe ve 20 mm 7,13 arasında bir çapı olan, elektron mikroskobu altında, tek bir mikroelektrot gösterir. (B) mikroelektrot dizi ile mikro elektrod bir plastik kayıt odasına sahip bir PGA paketi üzerine yapıştırılır Bir cam alt-tabaka. Sağdaki ekleme mikroelektrod arr üzerine yerleştirilen bir katlanmamış hipokampus gösteriray Sol tarafta ortada. (C), Optik Koherens Tomografi (OCT) görüntüleme, farklı bir deneyde dizinin üstüne konumlandırılmış gelişeceğini doku gösterir. Sağda, solda Ekim görüntüleme elde edilen iki boyuna dilim görüntüleri sağ hücre gövdesi katmanının altında alana ulaşmak (beyaz noktalar oklarla işaret) mikroelektrot ipuçları gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız .

    Şekil 4,
    4. Deneysel kurulumu Şekil. (A) vidalarla bir plastik kapak kapak olası su hasarına karşı korumak için devreleri üzerine yerleştirilir. Kayıt odası çözelti akışını taşımak için giriş ve çıkış boruları hem sahiptir. Bir naylon filesi ile yapıştırılmış bir ölçüye doku çapa Tiss sabitlemek için kullanılırDeneyler sırasında vi. (B), Şekil bir deney sırasında numune dilim tutma doku çapa gösteren PMEA cam alt-tabakanın altından alınan. kıvrık teller doku üstüne bastırarak örgü naylon elyaflardır. Yuvarlak noktalar Mikroelektronlar bazlar vardır. Oklar çeşitli deneyler sonrasında hasar gören elektrotlar işaret. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 5,
    Katlanmamış hipokampus gelen PMEA'nın tarafından kaydedilen Şekil 5. Ham veriler. Sol panel: Tek bir mikroelektrot kaydedilen epileptiform aktiviteyi 4-AP-kaynaklı Sağ paneli:. Soldaki zaman penceresinde işaretli sinyalin Zoomed-sürüm. (A), spontan bir aktivite örnekte 10 saniye bölümü100 mcM 4-AP aCSF tarafından üretilen 34.9 dB SNR sinyallerin kutuplarına göre bazal dendritik bölgede bulunan Mikroelektronlar biri için elde. (B) Ham veri, bir SNR ile somata yakın bulunan başka bir mikroelektrot gelen somatik tabaka içinde yer alan bir elektrot elde edilen kayıt 27.2 dB olur. (C), Örnek. Bu örnekte, SNR yine iletken ancak doku nüfuz bir bükülmüş elektrot elde edilen 18.53 dB olur. (D) Recording. bükülmüş elektrot bu sağlam elektrotlar (bu örnekte 1.5 dB) ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük SNR vardır. Bir mikroelektrot kaydedilen (E) Temel gürültü. Bazal genellikle tepe 150 200 uV gelen değer ve tek bir elektrot empedansı bir tepe vardır yaklaşık 1 MΩ 2 etmektir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 6,
    2-D yayılım haritaları içine nöral kayıt verilerinin Şekil 6. Dönüşüm. (A) 170 msn zaman penceresi her kanalda bir tek sinir spike PMEA'nın fotoğrafın üstüne çizilen keser. Ham veriler, 100 Hz'de, bir düşük geçiş filtresi ile filtre edilir. kırık elektrotlar gelen sinyaller etrafında kayıtları ile interpolasyon edilir. Bu örnekte, tüm sivri olumlu. (B) (A) kırmızı piksel gelen bir tek sinir başak bireysel normalleşmesi için geliştirilmiş özel bir yöntemle renk çubuğu (Daha fazla bilgi için önceki yayına bakın normalize normalleştirme 7). (C) hakkında bireysel normalleşme tarafından oluşturulan renkli haritalar farklı zaman noktalarında gelişeceğini hipokampus tüm bölge genelinde bu yayılma hamle göstermektedir.www.jove.com/files/ftp_upload/52601/52601fig6large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    hipokampus uzunlamasına ve enine eksen delici mikroelektrot dizisi ile birlikte korunur gelişeceğini hipokampus hazırlama, geliştirme, hipokampus 7 anatomi bağlantıları veya nöral yayılmasını araştırmak için güçlü bir araç sağlar. Bu açılımı prosedür de yetişkin farelerde hipokampus incelemek için geçerlidir. Bu hazırlık Son çalışmalar 4-AP-kaynaklı epileptiform aktivite gelişeceğini hipokampus tüm alanı boyunca bir diyagonal dalga önünde (Şekil 6) 7,8 ile yaymak göstermiştir. Bu çalışmalar düz hipokampal sinir ağı nöral yayılma (Şekil 6) araştırılmalıdır zaman sağlam gelişeceğini hipokampus enine ya da boyuna ya dilimleri üzerinde önemli avantajlar sağladığını gösterdi.

    delici mikroelektrot mevcut mi üzerinde önemli bir avantaj sağlardüz bir yüzeye 11,12,17 üzerinde konumlandırılmış birden fazla kişi oluşmaktadır croelectrode diziler (MEA). Hücre tabakası yaklaşık 250-300 mikron yüzeyden (Şekil 2) mesafededir beri düz bir yüzey elektrotları ile MEA gelişeceğini hipokampus ile kullanmak zordur. Burada anlatılan PMEA dokusu 7,13 derinliklerine ulaşmak için 200mm'lik bir yüksekliğe sahip nöral yayılmasını eğitim için uygun 64-delici elektrotlar ile bu sorunu çözmek için tasarlanmıştır. Buna ek olarak, kortikal dilimleri gibi, herhangi bir düz doku hazırlanmasında PMEA de uygulanabilir hipokampal enine kesitler vb

    Bu PMEA'nm kullanmanın bir diğer avantajı, geliştirilmiş SNR. Bu PMEA'nın bir prototip çalışması önceki çalışmalar belirtilen beri bu PMEA'nın tarafından kaydedilen nöral sinyalin SNR oranı VSD kayıt kıyasla daha yüksek ve daha istikrarlı 19.4 ± 3 dB, ortalama değere sahiptir gösteriyor ki toksisite veVSD fotoğraf beyazlatma açıkça verileri 8 kayıt yeteneği engelli. Olanlar dümdüz elektrot dizileri ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir SNR sahip, yaklaşık 20 dB ila 30 arasında değişen bir aralıkta, bu çalışmada (Şekil 5) PMEA artar kayıt SNR doku çapa kullanılarak geliştirilmiş bir deney protokolü ile, 10 ila 15 dB 11,18 arasında bir değer. hipokampus açılmak yeteneği için düz bir kayıt dizisi tarafından sorguya olabilir nöronların (CA1-CA3) bir tabaka elde esastır.

    Silikon dizi saydam alt-tabaka üzerine kuruludur Bundan başka, voltaj duyarlı boya görüntüleme tekniği hipokamp 8 nöral faaliyet yayılmasını çalışma PMEA sistemine entegre edilebilir. Floresan gerilim hassas göstergeleri ile transgenik fareler de pharmacologi neden kaynağını ve yayılma, fizyolojik koşullar altında sinyalin yanı sıra değişiklikleri araştırmak için kullanılabilircal ajanlar veya çeşitli hayvan modellerinde 9 genetik modifiye doku.

    Yüksek kaliteli kayıt sağlamak için birkaç kritik adımlar vardır. Öncelikle doku canlılığını sağlamak için, cerrahi prosedür mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. Genellikle, bu 2.10 2.1 tüm adımlar)) geçmesi için yaklaşık 1 ila 2 dakika sürer. Gerçek deneysel cerrahi yapılmadan önce bazı örnek hayvanlar üzerinde açılımı prosedürün Uygulaması son derece ileri sürülmektedir. İkinci olarak, akış hızı ihtiyaçları kayıt bölümü içinde perfüzyon sıvısı seviyesi herhangi bir dalgalanmasını önlemek için sabit tutulması için. Ayrıca, doku dizisine doku göre hareketini önlemek için aşağı demirlemiş edilmelidir.

    Burada anlatılan PMEA katlanmamış hipokampus nöral yayılımını takip yararlı sinyaller sağlayabilir rağmen, bu kayıt metodolojisi bazı dezavantajları ve sınırlamalar vardır.

    Önce, Mikroelektronlar (Şekil 5D, E) üzerlerine yerleştirilen mekanik kuvvet nedeniyle zarar verebilir. Doku yerleştirme ve kaldırma işlemi sırasında, küçük boya fırçası ve dizi arasındaki kazara temas Mikroelektronlar viraj veya kırılmasına neden olabilir. Doku çapa mikromanipülatör aşağı indirdi zaman, odanın alt kısmındaki doku yatay hareket bükme veya elektrotların kırılması yol açabilecek bir kesme kuvveti yaratabilir. Gelecekteki tasarımında, Mikroelektronlar onları daha güçlü hale getirmek için biraz daha kalın tabanı ile yeniden şekillenen olmalıdır. Bu PMEA'nın geçerli sürümünde, kayıt elektrotları dar taban böylece elektrotlar (Şekil 3A) zayıflaması, kendi çapına göre 13 var.

    Temizleme işlemi de yeterince diziye eklemek olabilir kalan doku ve liflerin kaldırmak için geliştirilmesi gerekmektedir. Her deneyden sonra, küçük parçalardoku Mikroelektronlar bağlı kalır olabilir ve elektrotlar üzerinde kalan bu kalıntı doku çıkarılmalıdır. Bu kalıntı dokular çıkarılmazsa, elektrotların ve direnç kayıtları SNR etkilenebilir. Protokol bölümün bir parçası 5'de gösterildiği gibi damıtılmış su ile sistemin temizleme önerilmektedir. Kullanıcılar ayrıca sisteme zarar vermeden doku erimesi bazı zayıf asidik çözelti sistemi temizlemek için tavsiye edilir

    Bu protokolün bir başka dezavantajı, açılma işlemi sırasında, bu katlanmamış hipokampus delici yol DG Hipokampüsün diğer tabakaların yayılmasını mümkün sinir sinyallerin incelenmesi önlenmesi, kesilmiş olmasıdır.

    Sonuç olarak, biz katlanmamış hipokampal Tissu'nun ile yüksek boy oranı mikroelektrod dizi birleştirerek hipokampus içinde nöral aktivitenin yayılmasını araştırmak için burada yeni bir metodoloji tarif varör. yöntem hem uzunlamasına ve enine yönde yaymak nasıl nöronal aktivitenin daha iyi anlaşılmasına yol vermedi. Bu teknik aynı zamanda dizinin üstünde de benzer bir şekilde yerleştirilir kortikal dokuya uygulanabilir. Dizi şeffaf ve aynı zamanda nöral dokuda sinyal yayılımı ile ilgili bazı önemli bulgulara neden olabilir Dahası, bu hazırlık optik kayıt tekniği birleştirerek mümkündür.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    desiccator jar LABRECYCLERS Inc. 5410 Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. 
    A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus N/A N/A A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. 
    Custom made tissue recovery chamber N/A N/A Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF.
    Straight Operating Scissors Fisher Scientific S17336B                                            Medco Instruments No.:81995  This scissors is used to   decapitate the mice.
    Integra Miltex Goldman-Fox Scissors Fisher Scientific 12-460-517                        MILTEX INC                           No.:5-SC-320 This scissors is used to cut the skull of the mice. 
    Miltex
    Hysterectomy Forceps
    Claflin Medical equipment CESS-722033-00001 This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain
    Micro Spatula Cardinal Health This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. 
    Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula Cardinal Health this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber.
    small paint brush Lowe's tem #: 105657                  Model #: 90219 The one with the smallest size in a normal paint brush package
    Fire polished glass help tool N/A N/A This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
    Custom made glass needle N/A N/A This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
    Custom made glass tool with a metal wire loop N/A N/A This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop.
    Custom made glass solution dropper N/A N/A This tool was  made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end.
    Custom made tissue anchor N/A N/A Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. 
    Custom fabricated microelectrode array N/A N/A More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011. 
    Custom made filter and amplifiers circuits for the array N/A N/A More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011. 
    Data acquisition processor 3400a Microstar Laboratories N/A This is a complete data acquisition system with A/D converter.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. Control of traveling waves in the Mammalian cortex. Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).
    2. Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity in neonatal intact limbic structures in vitro. Eur J Neurosci. 12 (8), 2757-2768 (2000).
    3. Grinvald, A., Manker, A., Segal, M. Visualization of the spread of electrical activity in rat hippocampal slices by voltage-sensitive optical probes. J Physiol. 333, 269-291 (1982).
    4. Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13295-13300 (2005).
    5. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
    6. Albani, S. H., McHail, D. G., Dumas, T. C. Developmental studies of the hippocampus and hippocampal-dependent behaviors: insights from interdisciplinary studies and tips for new investigators. Neurosci Biobehav Rev. 43, 183-190 (2014).
    7. Zhang, M., et al. Propagation of Epileptiform Activity Can Be Independent of Synaptic Transmission, Gap Junctions, or Diffusion and Is Consistent with Electrical Field Transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
    8. Kibler, A. B., Durand, D. M. Orthogonal wave propagation of epileptiform activity in the planar mouse hippocampus in vitro. Epilepsia. 52 (9), 1590-1600 (2011).
    9. Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108 (11), 3147-3160 (2012).
    10. Wingenfeld, K., Wolf, O. T. Stress , memory, the hippocampus. Front Neurol Neurosci. 34, 109-121 (2014).
    11. Liu, J. S., et al. Spatiotemporal dynamics of high-K+-induced epileptiform discharges in hippocampal slice and the effects of valproate. Neurosci Bull. 29 (1), 28-36 (2013).
    12. Oka, H., Shimono, K., Ogawa, R., Sugihara, H., Taketani, M. A new planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice. J Neurosci Methods. 93, 61-68 (1999).
    13. Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
    14. Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. J Pharmacol Exp Ther. 282 (1), 262-270 (1997).
    15. Perreault, P., Avoli, M. 4-aminopyridine-induced epileptiform activity and a GABA-mediated long-lasting depolarization in the rat hippocampus. J Neurosci. 12 (1), 104-115 (1992).
    16. Chesnut, T. J., Swann, J. W. Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus. Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).
    17. Nam, Y., Wheeler, B. C. In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings. Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).
    18. Gonzalez-Sulser, A., et al. Hippocampal neuron firing and local field potentials in the in vitro 4-aminopyridine epilepsy model. J Neurophysiol. 108 (9), 2568-2580 (2012).

    Tags

    Nörobilim Sayı 97 Penetran mikro-elektrot dizisi (PMEA) sağlam hipokampus sinirsel aktivite yayılımı nöral sinyal haritalama düz piramidal hücre tabakasını katlanmamış hipokampus yerleştirme gelişeceğini
    Bir Penetran Mikro-elektrot Array ile bir Kırımsız Hipokampal Hazırlık Sinir Faaliyet Yayılım
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Zhang, M., Kibler, A. B.,More

    Zhang, M., Kibler, A. B., Gonzales-Reyes, L. E., Durand, D. M. Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array. J. Vis. Exp. (97), e52601, doi:10.3791/52601 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter