Summary
פיתחנו היפוקמפוס פרש במבחנה השומר מערך CA1-CA3 של נוירונים. בשילוב עם מערך מיקרו-אלקטרודה החודרת, פעילות עצבית יכולה להיות במעקב בשתי אוריינטציות אורכי ורוחביות. שיטה זו מספקת יתרונות על פני הכנות פרוסה בהיפוקמפוס כמו ההתפשטות בכל היפוקמפוס ניתן להקליט בו זמנית.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר שיטה להכנה חדשה בהיפוקמפוס ההכנה השטוח מבחנה בשילוב עם מערך מיקרו-במכונה כדי למפות פעילות עצבית בהיפוקמפוס. ההכנה הפרוסה בהיפוקמפוס רוחבית היא הכנת רקמה הנפוצה ביותר ללמוד אלקטרופיזיולוגיה היפוקמפוס. פרוסה בהיפוקמפוס אורך פותח גם כדי לחקור קשרים אורך בהיפוקמפוס. ניתן גם לשמור על ההיפוקמפוס העכבר שלם במבחנה בגלל עוביו מאפשר דיפוזיה חמצן נאותה. עם זאת, שלושת תכשירים אלה אינם מספקים גישה ישירה להתפשטות עצבית שכן חלק מהרקמה חסר או מקופל. ההיפוקמפוס שלם המקופל מספק הן רוחבי וקשרים ארוכי טווח בתצורה שטוחה לגישה ישירה לרקמות לנתח את מלוא היקף התפשטות אות בהיפוקמפוס במבחנה. על מנת לפקח על הפעילות העצבית מt ביעילותהוא שכבת תאים, מנהג עשה חודר מערך מיקרו-אלקטרודה (PMEA) היה מפוברק ופנה להיפוקמפוס פרש. PMEA עם 64 אלקטרודות של 200 מיקרומטר בגובה יכול להקליט פעילות עצבית עמוק בתוך ההיפוקמפוס העכבר. שילוב הייחודי של הכנה בהיפוקמפוס מקופלת וPMEA מספק כלי חוץ הגופייה חדש ללמוד את המהירות וכיוון של התפשטות של פעילות עצבית באזורי CA1-CA3 דו-ממדיים של ההיפוקמפוס עם אות גבוהה יחס רעש.
Introduction
הבנת ההולכה או התפשטות העצבית של אותות עצביים היא קריטית לקביעת המנגנון של תקשורת עצבית בשני התפקוד הנורמלי ומצבים פתולוגיים במוח 1-3. ההיפוקמפוס הוא אחד המבנים הנחקרים ביותר בהרחבה במוח מאז שהיא ממלאת תפקיד בסיסי בכמה תפקודי מוח כגון זיכרון, ומעקב במרחב ובמעורב במספר שינויים פתולוגיים באופן דרמטי את ההשפעה על התנהגות, כמו גם 1,6. אמנם, ההיפוקמפוס מציג ארגון מורכב, האלמנטים השונים של המבנה שלו ניתן לזהות בקלות והגישה בהכנת פרוסה 4-6. בכיוון הרוחבי של ההיפוקמפוס, פעילות עצבית ידועה להפיץ דרך המסלול תלת-סינפטי המרכיב את המשונן gyrus (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. הוא האמין כי שידור סינפטי והולכת axonal לשחק תפקיד מרכזי לcommunicatiבמעגל רוחבי זה 4,6. עם זאת, התפשטות של אות עצבית מתרחשת בשני כיוונים רוחביים ואורך 4,6. משמעות הדבר הוא כי ההיפוקמפוס לא יכול להיחקר באופן מלא על ידי שימוש בהכנות פרוסה המגבילות את התצפית לכיוון מסוים של התפשטות 4. פרוסה האורך פותחה כדי לחקור את מסלולי axonal לאורך ציר אורך 5. חוקרים הבחינו תנודות גמא ותטא התנהגות ספציפית בעיקר לאורך רוחבי וצירה אורך בהתאמה 6. התנהגויות אלו נחקרו בנפרד, אך גישה בו זמנית לשני הכיוונים היא חיונית כדי להבין התנהגויות אלו. אפילו עם הפיתוח של תכשיר ההיפוקמפוס שלם, שקשה לפקח על ההתפשטות בכל רחבי הרקמה בשל מקופל המבנה של ההיפוקמפוס 4. ההיפוקמפוס פרש מספק גישה לתאי העצב ארוזבצורה של 7,8 שכבת תאים דו-ממדי שטוחה.
על ידי התגלגלות gyrus המשונן (DG) (איור 1), ההיפוקמפוס מאמץ צורה שטוחה עם תצורה מלבנית שבשני רוחבי וחיבורי אורך להישאר שלמים עם שכבת תאי הפירמידה מסודרת בגיליון דו-ממדי המכיל את שני CA3 וCA1, משאיר פיסת הרקמה עצבית שיכול לשמש כדי לחקור התפשטות עצבית שטוחה (איור 2) 8. פעילות עצבית אז יכולה להיות במעקב עם טפטפות פרט זכוכית, מערכי microelectrode, אלקטרודות גירוי, כמו גם צבעי מתח רגישים (VSD) 3,7,8. בנוסף, מחוון מתח מקודד גנטי מעכברים הטרנסגניים ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר התפשטות הדפוס 9.
התצורה שטוחה של הרשת בהיפוקמפוס המקופלת היא גם מתאימה להקלטת שיטה אופטית אלא גם למערך microelectrode. Most של המערכים הזמינים המסחרית מיוצר עם אלקטרודות פרופיל שטוח או נמוך והוא יכול להקליט פעילות עצבית בשתי פרוסות רקמה ונוירונים בתרבית 10-12. עם זאת, יחס אות לרעש (SNR) יורד כאשר האותות המתקבלים מרקמה שלמה מאז סומה של תאי העצב ממוקמים עמוקה יותר לתוך הרקמה. מערכי אלקטרודה microelectrode עם יחס רוחב-גובה גבוה נדרשים כדי לשפר את יחס האות לרעש.
ברוח זו, מערך microelectrode חודר (PMEA) פותח במעבדה שלנו, ומספק את היכולת לחקור ישירות לתוך הרקמות על ידי הוספת 64 קוצים בקוטר של 20 מיקרומטר וגובה של 200 מיקרומטר להיפוקמפוס פרש 7,13 . יש מערך microelectrode זה SNR גבוה יותר בהשוואה להדמית הצבע רגישה המתח ויחס האות לרעש נותר יציבה במהלך ניסוי 7,13. השילוב של ההכנה בהיפוקמפוס המקופלת וPMEA מספק דרך חדשה להשקיעIgate ההתפשטות העצבית על מטוס דו-ממדי. ניסויים באמצעות טכניקה זו כבר הניבו תוצאות משמעותיות על המנגנונים של התפשטות אות עצבית בהיפוקמפוס לפי פעילות עצבית יכולה להפיץ באופן עצמאי של סינפסות הסינפטי או חשמלית 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: בעלי חיים פרוטוקולי ניסוי נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטה. עכברי CD1 של שני מינים בגיל P10 P20 למשמשים במחקר זה.
1. פתרונות לכירורגיה והקלטה ניסויית
- הכן חיץ נורמלי מלאכותי נוזל השדרתי (aCSF) המכיל (מ"מ): 124 NaCl, KCl 3.75, 1.25 KH 2 PO 4, 4 MgSO 2, NaHCO 3 26, דקסטרוז 10, וCaCl 2 2. השתמש aCSF הנורמלי הזה לשחזור רקמות לאחר נתיחה, כמו גם עבור מערכת שטיפה בתחילת הניסוי.
- הכן aCSF סוכרוז המשמש במהלך נתיחת ההיפוקמפוס ומכיל (מ"מ): 220 סוכרוז, KCl 2.95, Nah 2 1.3 PO4, 4 MgSO 2, NaHCO 3 26, דקסטרוז 10, וCaCl 2 2. כדי לגרום לפעילות epileptiform בהכנת הרקמה בהיפוקמפוס בשלמות, להוסיף 4-aminopyridine (4-AP) לaCSF הנורמלי בהריכוז של 100 מיקרומטר.
2. נוהל כירורגי לHippocampus הכנת השלמים
- זרוק isoflurane (1 מיליליטר) לתוך התא בתחתית צנצנת זכוכית ייבוש (מס '1 בחומרים ספציפיים וציוד) ולהשתמש במגבת נייר רגילה כדי לכסות את פני השטח של השלב התחתון כל כך החיה לא מקבלת במגע עם הנוזל. לאחר מכן, הנח את עכבר CD1 לתוך הצנצנת ולסגור את המכסה. לשמור על בעלי החיים בצנצנת הסגורה לדקות על 1 עד 2 דקות. כאשר תדירות נשימה היא אחד לשנייה בערך, להסיר את העכבר מהצנצנת.
- מניחים את העכבר על הבמה הניתוח ולערוף עם מספריים מתאימים. מייד לאחר עריפת הראש, הנח את הראש ל( 3-4 מעלות צלזיוס) קר כקרח, aCSF סוכרוז מחומצן לכ -30 שניות.
- השתמש במספריים עדינים (מס '5 בחומרים וציוד ספציפיים) כדי להסיר את העור בחלקו העליון של הגולגולת ולחתוך את הגולגולת לאורך קו האמצע של הראש, כמו גם בשני קצוות ליד הטמפואונת RAL. מלקחיים שימוש (מס '6 בחומרים וציוד ספציפיים) לקלף את גולגולת החתך כלפי כל צד של הראש כדי לחשוף את המוח.
- הכנס מרית מעבדה מיקרו (מס '8 בחומרים ספציפיים וציוד) לפער בין האונות הקודקודית של המוח והגולגולת לקלף בזהירות את המוח מהחלק התחתון של הגולגולת ולאחר מכן שחרר אותו על גבי מוכן (קר כקרח 3 -4 ° C) שלב כירורגית מכוסים בנייר רטוב מסנן (מס '2 בחומרים ספציפיים וציוד). הסר את המוח הקטן עם להב קרח צונן ולהפריד בין שתי ההמיספרות על ידי חיתוך קו האמצע של המוח. ואז, במקום שתי ההמיספרות מופרדות לכוס מלאה aCSF סוכרוז קר כקרח מבעבע עם 95% O CO 2/5% 2.
- קח מחצית מחצי הכדור ומניחים על הבמה נייר סינון קר כקרח. מניחים מגבות נייר רגילות או נייר סינון סביב המוח למצוץ פתרון הנוסף. השתמש בשני כלים פיפטה זכוכית אש מלוטשת (מס '10 בחומרים וציוד) כדי להפריד את הקליפה משאר חלק במוח המרכזי.
- לאחר היפוקמפוס חשוף מהחלק הפנימי של קליפת המוח ולשים על הבמה קרה כקרח, מקום שתיים או שלוש טיפות של aCSF סוכרוז קר כקרח על הרקמה ולאחר מכן להסיר את פתרון נוסף סביב היפוקמפוס. חותך את הקשרים עם הקליפה בשני קצוות של ההיפוקמפוס. לאחר מכן, לנתח את ההיפוקמפוס מתוך המוח עם כלים מזכוכית מלוטש אש ולהסיר את החלק הנותר של המוח.
- הפרד את כל ההיפוקמפוס עם צד alveus פונה כלפי מעלה ומענית בהיפוקמפוס פונה כלפי מטה. מהירות שחרר שתיים או שלוש טיפות של aCSF סוכרוז קר כקרח על הרקמה שוב ולהסיר את הפתרון הנוסף סביב הרקמות באמצעות פיסת מגבת נייר. השתמש בכלי זכוכית מלוטש אש להתהפך כל ההיפוקמפוס כדי לחשוף את מענית (איור 1 ב, ג).
- תחת מיקרוסקופ אופטי רגיל, להכניס מחט מחוייט זכוכית (מס '11 בMateri ספציפיals וציוד) לקצה אחד של מענית ולחתוך את חיבורי סיבים, מgyrus המשונן (DG) לsubiculum או שדה CA1, לאורך הכיוון של מענית (איור 1 ג). החל להב קר כקרח לקצץ את הקצוות במחיצה ובזמן של ההיפוקמפוס במידת צורך. הכנס לולאה מותאמת אישית עשה חוט מתכת (מס '12 בחומרים ספציפיים וציוד) למענית הקיצוץ ולעצור בצד דרך DG מן הרקמה תוך החזקת סוף subiculum / CA1 של ההיפוקמפוס בכלי זכוכית מלוטשת אש (1D איור) .
- בהמשך להליך התגלגלות לעיל, להוסיף שתיים או שלוש טיפות נוספות של aCSF סוכרוז קר כקרח על הרקמות ולהסיר את הפתרון הנוסף סביב הרקמה. לאחר מכן, חתוך את ההיפוקמפוס פרש עם הלהב קר כקרח בקצוות (איור 1E) ולמקם את ההכנה על ידי מרית לתוך התא מתאושש מלא aCSF הנורמלי ומבעבע עם 95% O 2/5% CO 2 בRT (כ 25 ° C). השאררקמת ההיפוקמפוס פרש להתאושש על 1 שעות לפני הצבתו בתא ההקלטה.
- קח את חצי הכדור האחר במוח ולהשתמש בו כדי לעבור את שלבים 2.5-2.9. בדרך כלל, לוקח על 1 עד 2 דקות כדי לסיים את ההליך כולו להתגלות היפוקמפוס אחת ושחרר aCSF סוכרוז קר כקרח ברציפות כדי לשמור על הרקמה מחומצן והתייבשות.
הגדרת מערכת הניסויית 3.
- דבק PMEA מפוברק מותאם אישית על חבילת מערך רשת סיכה (PGA) ולהשתמש מליטה חוט מיקרו לחיבור כל משטח מmicroelectrode יחיד לכרית של סיכה על האריזה (איור 3). לאחר מכן, הכנס את החבילה לתוך השקע בלוח מעגלים מותאם אישית 13.
- בנפרד להתחבר כל microelectrode למסננים שלה עם תדרים חתוכים לעבור להקה מרץ 1 עד 4 קילוהרץ ומגברים עם רווח של 100 על המנהג עשה המעגלים 13. עבר דיגיטציה היציאה האנלוגית מהמעגלים על ידי / המרה Derting מערכת, ולרכוש ולאחסן את הנתונים במחשב.
- דבק תא הקלטת פלסטיק מחוייט סביב המערך עם כניסה וצינורות לשקע לזרימת הפתרון (איור 4 א). השתמש בלפחות שני בקבוקים כדי לשמור על פתרונות שונים במערכת, ולהצטרף ולשלוט בצינורות הפלט של הבקבוקים על ידי תלת-סתום. חבר את הפלט של תלת-השסתום למערכת צינורות עם תא עירוי המנחה את הפתרון לתא ההקלטה.
- בין שלושה שסתום והכניסה של חדר ההקלטה, להוסיף מחמם חשמלי כדי לחמם את הפתרון לטמפרטורה מבוקרת (35 ° C) לפני הפתרון מודרך לתא ההקלטה. צרף את היציאה של תא ההקלטה לצינור ואקום כדי לאסוף את הפתרון לתוך בקבוק מחובר צינור ואקום. לא ממחזר כל פתרון בכל ניסוי במחקר זה.
4. הצבת Hippocampus מצב הפרישה על PMEA כדי להקליט את הפעילות עצבית
5. הסרתרקמה מPMEA לאחר ניסוי
- לשלוט עוגן הרקמה על ידי micromanipulator ולהרים רקמות מתא ההקלטה בהדרגה. כבה את שניהם כניסה ויציאה להפסקת הזרימה בתא ההקלטה. חדר ההקלטה צריך להיות מלא עם פתרון או להוסיף כמה טיפות של פתרון ללמלא את התא אם תא ההקלטה אינו מלא.
- השתמש במברשת צבע קטנה כדי להרים כל פינה של הרקמה. אם הרקמה לא צף בפתרון, ואז להעסיק את השפופרת הריק לייבוש קאמרי בזהירות עם הרקמה עדיין יושבת על המערך. לאחר מכן, פתח בזהירות את הכניסה כדי למלא בהדרגה את החדר וסגר את הכניסה כדי לעצור את הזרם כאשר תא ההקלטה מלא. החל מברשת הצבע הקטנה כדי להרים כל פינה של הרקמה שוב.
- חזור על שלב 5.2 עד הרקמה מנותק מהמערך וצף בפתרון. אם הרקמה צף בפתרון, ולאחר מכן להשתמש צינור הוואקום למצוץ את הרקמה משם. t הפתוחהוא זורם בכניסה ולפתוח את הוואקום בשקע. לשטוף את המערכת עם מים מזוקקים ולייבש אותו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הנתונים המוצגים בדמויות כאן נרשמו בהכנת היפוקמפוס פרש עם 4-AP (100 מיקרומטר) aCSF הוסיף במהלך הדגירה של הרקמה בחדר ההקלטה ב RT (25 ° C). בדרך כלל פעילות מתחילה תוך 5 דקות, אבל בכמה רקמות בהיפוקמפוס מבעלי החיים המבוגרים זה עלול לקחת זמן רב יותר. הירי העצבי הנגרם על-4-AP נצפה עם PMEA הוא אותו כפי שדווח בעבר 14,15. מאז יש לי אלקטרודות לגובה של 200 מיקרומטר, הטיפים אלקטרודה נמצאים ממש מתחת לשכבת התאים (איור 3 ג) כי שכבת התאים היא בדרך כלל 250 עד 300 מיקרומטר מעל alveus של ההיפוקמפוס (איור 2), ההקלטות (57 מתוך יש 64 בניסוי המדגם) מערוצים שונים סטייה חיובית בעיקר. עם זאת, חלק מההקלטות החיוביות אלה יכול להציג סטיות שליליות קטנות, כמו גם (איור 5) אם הטיפים אלקטרודה ההקלטה הם קרובים מספיק לשכבת התאים.אם הטיפים אלקטרודה נמצאים ממש ברמה של שכבת תאים, ההקלטה תהיה spiking השלילי חד מאוד עם שינוי חיובי על זה או סתם spiking השלילי (איור 5 ג) 16. במדגם נתונים המוצג כאן, יש לי 5 ערוצים מתוך 57 קלטות spiking שלילי. לאחר שרכש את הנתונים מכל 64 הערוצים, השיטה של נורמליזציה בודדת (איור 6) על מפת ההתפשטות העצבית על מטוס 2-D לאורך הציר של זמן ההקלטה 7. עם שילוב של PMEA וההיפוקמפוס פרש, התפשטות עצבית ממופית ונצפתה ליזום בעיקר בצד אחד של CA3 ולעבור longitudinally בחזית גל אלכסוני, חוצה את האזור כולו של ההיפוקמפוס (איור 6).
איור 1. הליך כירורגי להיפוקמפוס פרש . (א) אחד משני hippocampi הוא גזור מאונה הטמפורלית של מוח עכבר. (ב) במחיצה והפסקות זמניות לאורך ציר האורך. (C) ההיפוקמפוס התהפך עם טפטפת זכוכית מלוטשת אש לחשוף מענית. שני הקצוות של ההיפוקמפוס הם גזומים ומחט זכוכית משמשת לחיתוך הקשרים בין DG וCA1 או subiculum לאורך ציר האורך. (ד) ההיפוקמפוס הוא פרש על ידי חוט מתכת לולאת מחוייט. (E) היפוקמפוס פרש ב subiculum וDG גזוז. הכנת הרקמה הסופית של ההיפוקמפוס פרש (F). עמדה זו מציגה את הנטייה של ההיפוקמפוס כאשר הוא מונח על המערך בניסוי. לפרטים נוספים על האנטומיה היפוקמפוס פרש עיין שיטות ניסיוניות בכתבי יד שפורסם בעבר 7."Target =" g1large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. היסטולוגיה חתך של ההיפוקמפוס פרש. כתם Crystal סגול מראה את המיקום של שכבת התאים פירמידליים CA1-CA3 בתוך ההיפוקמפוס פרש רמה של 250 עד 300 מיקרומטר מעל alveus כך איתור microelectrodes ממש מתחת לשכבת התאים (עיין באיור 3 ג). כדי להשיג את החלקים מוכתמים בסגולים הגביש, הרקמה הייתה קבוע פוסט לאחר ההיפוקמפוס היה מקופל. ההיפוקמפוס פרש הוצב ב 4% N / O PFA. לאחר מכן, הרקמה הועברה והמשיכה בפתרון סוכרוז (30%) במשך 48 שעות, ואחריו הצמד-ההקפאה באיזופנטאן אופנוען מכיל (2-Methylbutane) כדי להתקרר ל-35 מעלות צלזיוס בקרח יבש. סעיף קפוא היו אז לחתוך בcryostat עם20 מיקרומטר חלקים עבים במישור הרוחבי (כפי שמוצג באיור 2) כדי לחשוף את המיקום של שכבת התאים פירמידליים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. היפוקמפוס פרוש על PMEA. מבט לראש PMEA חדש עם microelectrodes ממוקמת בקצו של כל עקבות מתכת זהב (). להוסיף בצד ימין מראה microelectrode אחת תחת מיקרוסקופ אלקטרונים בגובה של 200 מיקרומטר וקוטר של 20 מיקרומטר 7,13. (ב) מערך microelectrode מודבק על חבילת PGA עם תא הקלטת פלסטיק סביב microelectrodes ב מצע זכוכית. להוסיף בצד הימין מראה היפוקמפוס מקופל מונח על עיבוד microelectrodeאיי באמצע. (ג) בצד השמאל, הדמיה אופטית קוהרנטיות טומוגרפיה (אוקטובר) מראה את רקמת פרש ממוקמת על גבי המערך בניסוי שונה. מימין, שתי תמונות פרוסה אורך המתקבלות מהדמית אוקטובר בצד השמאל מראה את הטיפים microelectrode (נקודות לבנות הצביעו על ידי החיצים) להגיע לאזור ממש מתחת לשכבת גוף תא. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .
איור 4. התקנה ניסיונית. () מכסה כיסוי פלסטיק עם ברגים ממוקם מעל המעגלים כדי להגן עליו מפני נזקי מים אפשריים. יש חדר ההקלטה שני צינורות כניסה ויציאה לביצוע זרימת הפתרון. עוגן רקמה בהתאמה אישית דבוק עם רשת סיבי ניילון משמש כדי לאבטח את Tissue במהלך הניסויים. לקחה תמונה (B) מהחלק התחתון של מצע הזכוכית של PMEA מראה את עוגן הרקמה מחזיק פרוסת מדגם במהלך ניסוי. החוטים המעוקלים הם סיבי ניילון מרשת לחיצה על החלק העליון של הרקמה. הנקודות העגולות הן הבסיסים של microelectrodes. חיצים מצביעים על אלקטרודות שניזוקו בעקבות כמה ניסויים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
5. נתונים גולמיים איור נרשמו על ידי PMEA מההיפוקמפוס פרש. עזב את הפנל: 4-AP-induced פעילות epileptiform נרשמה מmicroelectrode יחיד פנל ימני:. גרסת Zoomed-באות מסומנת בחלון הזמן בצד השמאל. סעיף 10 שניות של דוגמא של הפעילות הספונטנית ב()מיוצר על ידי 100 מיקרומטר 4-AP aCSF שהתקבל לאחת מmicroelectrodes ממוקמת באזור דנדריטים הבסיסי המבוסס על הקוטביות של האותות עם יחס אות לרעש של 34.9 dB. (ב) נתונים גולמיים מmicroelectrode אחר הממוקם קרוב יותר לsomata עם SNR של 27.2 dB. (C) דוגמא של הקלטה המתקבלת מהאלקטרודה ממוקמת בתוך השכבה הגופנית. בדוגמא זו, יחס האות לרעש הוא 18.53 הקלטה dB. (ד) התקבלה מאלקטרודה כפופה עדיין מנהלת אך לא חודרת לתוך הרקמה. אלקטרודה הכפופה יש SNR נמוך משמעותי בהשוואה לאלקטרודות אלה ללא פגע (1.5 dB בדוגמא זו). רעש Baseline (E) שנרשם מmicroelectrode. נקודת ההתחלה בדרך כלל יש שיא לשווי שיא 150-200 μV והעכבה של האלקטרודה יחידה הוא סביב 1-2 MΩ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
המרת איור 6. נתונים הקלטה עצביים לתוך מפות התפשטות 2-D. () חלון זמן msec 170 חותך spiking עצבי אחת בכל ערוץ זמם על התמונה של PMEA. הנתונים הגולמיים מסוננים על ידי מסנן מעביר נמוך ב -100 HZ. האותות מאלקטרודות שבורות הם אינטרפולציה עם ההקלטות סביבו. בדוגמא זו, כל הקוצים הם חיוביים. (ב) ספייק עצבי אחת מפיקסל האדום ב (א) הוא מנורמל לבר צבע עם שיטה שפותח מותאמת אישית לנורמליזציה בודדת (עיין בפרסום הקודם לפרטים נוספים על הנורמליזציה 7). (ג) מפות הצבע שנוצרו על ידי הנורמליזציה הפרט מראות כי מהלכי התפשטות על פני כל השטח של ההיפוקמפוס פרש בנקודות זמן שונים."Target =" www.jove.com/files/ftp_upload/52601/52601fig6large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפיתוח של תכשיר היפוקמפוס המקופל, שבו צירי האורך ורוחב של ההיפוקמפוס נשמרים בשילוב עם מערך microelectrode חודר, מספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את קשרי האנטומיה או התפשטות עצבית בהיפוקמפוס 7. הליך התגלגלות גם לגבי ללימוד היפוקמפוס בעכברים בוגרים. מחקרים שנעשה לאחרונה עם הכנה זו הראו כי פעילות epileptiform המושרית-4-AP יכולה להפיץ בחזית גל אלכסונית על פני כל השטח של ההיפוקמפוס המקופל (איור 6) 7,8. מחקרים אלה הראו כי ההיפוקמפוס פרש שלם מספק יתרונות משמעותיים על פני פרוסות או רוחביים או אורכי כאשר ההתפשטות העצבית ברשת עצבית בהיפוקמפוס שטוחה יכולה להיחקר (איור 6).
Microelectrode החודר מספק יתרון משמעותי על פני מיל הקייםמערכי croelectrode (MEA) שמורכבים ממספר אנשי קשר ממוקמים מעל משטח שטוח 11,12,17. MEA עם אלקטרודות משטח שטוחות קשה לשימוש עם ההיפוקמפוס פרש מאז שכבת התאים ממוקמת על 250 עד 300 מיקרומטר מהמשטח (איור 2). PMEA המתואר כאן נועד לפתור את הבעיה הזו עם חודר-64 אלקטרודות מתאימות ללימוד ההתפשטות העצבית בגובה של 200 מיקרומטר להגיע עמוק בתוך הרקמה 7,13. בנוסף, PMEA גם ישים בכל הכנת רקמה שטוחה, כגון פרוסות בקליפת המוח, בהיפוקמפוס רוחבי פרוסות וכו '
יתרון נוסף של שימוש PMEA זה SNR המשופר. מחקר אב טיפוס של PMEA זה מראה את יחס SNR של אות עצבית שנרשמה על ידי PMEA זה יש ערך ממוצע של 19.4 ± 3 dB, שהוא גבוה באופן משמעותי ויציב יותר בהשוואה לזה של הקלטת VSD מאז המחקרים הקודמים הצביעו על כך שהרעילות והלבנת תמונה של VSD בבירור לקויה היכולת להקליט נתונים 8. עם פרוטוקול השתפר ניסיוני על ידי שימוש בעוגן הרקמות במחקר זה, יחס האות לרעש של ההקלטה מעליות PMEA למגוון מכ -20 עד 30 dB (איור 5), שבו יש יחס אות לרעש גבוה יותר בהשוואה למערכים לשטח-אלקטרודה אלה עם ערך מ -10 עד 15 dB 11,18. היכולת להתפתח ההיפוקמפוס היא חיונית על מנת להשיג שכבה של תאי עצב (CA1-CA3) שניתן נחקר על ידי מערך הקלטה שטוח.
יתר על כן, מאז מערך סיליקון בנוי על מצע שקוף, טכניקת הדמיה צבע רגיש מתח יכולה להיות משולב במערכת PMEA ללמוד את ההתפשטות של פעילות עצבית בהיפוקמפוס 8. גם עכברים הטרנסגניים עם אינדיקטורים רגישים מתח ניאון יכולים לשמש כדי לחקור את המקור ואת ההתפשטות של האות בתנאים פיסיולוגיים, כמו גם שינויים הנגרם על ידי pharmacologiסוכני cal או רקמות שונה גנטיות ממודלים של בעלי חיים שונים 9.
ישנם מספר צעדים קריטיים כדי להבטיח הקלטה באיכות גבוהה. ראשית, כדי להבטיח את הכדאיות רקמות, ההליך הכירורגי חייב להתבצע במהירות אפשרית. בדרך כלל, זה לוקח בערך 1-2 דקות כדי לעבור את כל השלבים מ2.1) ל2.10). פרקטיקה של הליך התגלגלות על בעלי חיים מסוימים מדגם מומלצת מאוד לפני הניתוח ניסיוני בפועל מתבצע. שנית, צרכי קצב זרימה ללהישמר קבועים, כדי למנוע כל תנודה של רמת נוזל זלוף בחדר ההקלטה. יתר על כן, הרקמה צריכה להיות מעוגנת במורד, כדי למנוע תנועה של הרקמה ביחס למערך.
למרות PMEA המתואר כאן יכול לספק אותות שימושיים במעקב אחר ההתפשטות העצבית בהיפוקמפוס פרש, יש כמה חסרונות ומגבלות למתודולוגיה הקלטה זו.
ראשית, Microelectrodes יכול לשבור עקב הכוח המכני המוטל עליהם (איור 5D, E). במהלך ההליך של מיקום והסרת רקמות, הקשר המקרי בין מברשת הצבע הקטנה והמערך עלול לגרום microelectrodes לכופף או לשבור. כאשר עוגן הרקמה הוא הוריד על ידי micromanipulator, התנועה אופקית של הרקמות בחלק התחתון של החדר יכולה ליצור כוח גזירה שעלולה להוביל לכיפוף או שבירה של האלקטרודות. בעיצוב עתיד, יש עיצב מחדש את microelectrodes עם בסיס עבה מעט כדי להפוך אותם חזקים יותר. בגרסה הנוכחית של PMEA זה, אלקטרודות ההקלטה יש בסיס צר ביחס לקוטרו 13, ובכך להחליש את האלקטרודות (איור 3 א).
גם הליך הניקוי יש לשפר כדי להסיר את רקמת השייר וסיבים שיכולים לצרף למערך כראוי. לאחר כל ניסוי, חתיכות קטנותרקמה יכולה להישאר מחובר לmicroelectrodes ורקמת שארית זו שנשארה על האלקטרודות יש להסיר. אם רקמות שייר אלה לא יוסרו, העכבה של אלקטרודות ויחס האות לרעש של ההקלטות יכולות להיות מושפעת. השטיפה של המערכת עם מים מזוקקים הוא הציע כפי שצוין בחלק 5 של סעיף הפרוטוקול. משתמשים מומלץ גם לרוקן את המערכת עם כמה תמיסה חומצית חלשה שיכול להמס הרקמה מבלי לפגוע במערכת
חסרון נוסף של פרוטוקול זה הוא כי במהלך הליך התגלגלות, נתיב perforant בהיפוקמפוס פרש זה הוא לחתוך, מניעת חקירה של האותות העצביים האפשריים להפצת מDG לשכבות האחרות של ההיפוקמפוס.
לסיכום, יש לנו תארנו כאן מתודולוגיה חדשנית כדי לחקור את ההתפשטות של פעילות עצבית בתוך ההיפוקמפוס על ידי שילוב של מערך microelectrode היחס גבוה היבט עם tissu היפוקמפוס פרשדואר. השיטה עשתה להוביל להבנה טובה יותר של איך עצבי פעילות יכול להפיץ בשני כיווני האורך ורוחב. טכניקה זו גם יכולה להיות מיושמת על רקמת קליפת המוח ממוקמת בצורה דומה בחלק העליון של המערך. יתר על כן, שילוב של טכניקת הקלטה אופטית עם הכנה זה אפשרי מאז המערך הוא שקוף ויכול גם להוביל לכמה ממצאים חשובים לגבי התפשטות אותות ברקמה עצבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
| A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
| Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
| Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
| Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
| Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
| small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
| Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
| Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
| Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
| Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
References
- Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. Control of traveling waves in the Mammalian cortex. Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).
- Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity in neonatal intact limbic structures in vitro. Eur J Neurosci. 12 (8), 2757-2768 (2000).
- Grinvald, A., Manker, A., Segal, M. Visualization of the spread of electrical activity in rat hippocampal slices by voltage-sensitive optical probes. J Physiol. 333, 269-291 (1982).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
- Albani, S. H., McHail, D. G., Dumas, T. C. Developmental studies of the hippocampus and hippocampal-dependent behaviors: insights from interdisciplinary studies and tips for new investigators. Neurosci Biobehav Rev. 43, 183-190 (2014).
- Zhang, M., et al. Propagation of Epileptiform Activity Can Be Independent of Synaptic Transmission, Gap Junctions, or Diffusion and Is Consistent with Electrical Field Transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
- Kibler, A. B., Durand, D. M. Orthogonal wave propagation of epileptiform activity in the planar mouse hippocampus in vitro. Epilepsia. 52 (9), 1590-1600 (2011).
- Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108 (11), 3147-3160 (2012).
- Wingenfeld, K., Wolf, O. T. Stress , memory, the hippocampus. Front Neurol Neurosci. 34, 109-121 (2014).
- Liu, J. S., et al. Spatiotemporal dynamics of high-K+-induced epileptiform discharges in hippocampal slice and the effects of valproate. Neurosci Bull. 29 (1), 28-36 (2013).
- Oka, H., Shimono, K., Ogawa, R., Sugihara, H., Taketani, M. A new planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice. J Neurosci Methods. 93, 61-68 (1999).
- Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
- Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. J Pharmacol Exp Ther. 282 (1), 262-270 (1997).
- Perreault, P., Avoli, M. 4-aminopyridine-induced epileptiform activity and a GABA-mediated long-lasting depolarization in the rat hippocampus. J Neurosci. 12 (1), 104-115 (1992).
- Chesnut, T. J., Swann, J. W. Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus. Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings. Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. Hippocampal neuron firing and local field potentials in the in vitro 4-aminopyridine epilepsy model. J Neurophysiol. 108 (9), 2568-2580 (2012).
