Summary
Мы разработали развернутый гиппокамп в пробирке, которая сохраняет CA1-Ca3 массив нейронов. В сочетании с проникающим массива микро-электрода, нейронной активности можно наблюдать как в продольном, так и в поперечном направлениях. Этот способ обеспечивает преимущества по сравнению с гиппокампа препаратов срезов в распространение в целых гиппокампа могут быть записаны одновременно.
Abstract
Этот протокол описывает способ получения нового препарата в пробирке с плоским гиппокампа в сочетании с микро-механической обработке массива для отображения нейронной активности в гиппокампе. Поперечный срез гиппокампа препарат является получение наиболее распространенным ткани гиппокампа для изучения электрофизиологии. Продольная гиппокампа ломтик был разработан для того, чтобы исследовать продольных связей в гиппокампе. В интактных гиппокампа мыши также могут быть сохранены в пробирке, поскольку его толщина позволяет адекватную диффузию кислорода. Тем не менее, эти три препарата не обеспечивают прямой доступ к нейронной распространения, так как некоторые из ткани либо отсутствует, либо сложить. Развернутая нетронутыми гиппокамп обеспечивает как поперечные и продольные связи в плоской конфигурации для прямого доступа к ткани для анализа в полной мере распространения сигнала в гиппокампе в пробирке. Для того, чтобы эффективно контролировать нейронную активность от ТОн клеточный слой, выполненный на заказ проникающего массив микро-электрода (PMEA) был изготовлен и наносили на развернутом гиппокампа. PMEA с 64 электродами 200 мкм в высоту может записывать нейронной активности в глубине гиппокампа мыши. Уникальное сочетание развернутой гиппокампа подготовки и PMEA обеспечивает новый инструмент в пробирке для изучения скорость и направление распространения нейронной активности в двумерных CA1-CA3 регионах гиппокампа с высоким отношением сигнала к шуму.
Introduction
Понимание нервной проводимости или распространение нейронных сигналов имеет решающее значение для определения механизма нейронной связи как в нормальной функции и патологических состояний, в головном мозге 1-3. Гиппокамп является одним из наиболее широко изученных структур в головном мозге, так как он играет фундаментальную роль в различных функций мозга, таких как память и пространственное слежение и участвует в нескольких патологических изменений, которые существенно влияют поведение, а 1,6. Хотя, гиппокамп обладает сложной организацией, различные элементы его конструкции могут быть легко идентифицированы и доступны в подготовке среза 4-6. В поперечном направлении гиппокампе, нейронной активности, как известно, распространяются через три-синаптический пути, которые включают в зубчатой извилине (ГД), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. Считается, что синаптическая передача и аксонов проводимости играют важную роль для communicatiв этой поперечной схеме 4,6. Тем не менее, распространение сигнала нейронной происходит как в поперечном и продольном направлениях 4,6. Это означает, что гиппокамп не может быть полностью исследована с помощью препараты срезов, которые ограничивают наблюдение к определенному направлению распространения 4. Продольный срез был разработан, чтобы исследовать аксонов пути вдоль продольной оси 5. Исследователи наблюдали поведение конкретных гамма и тета-колебаний преимущественно вдоль поперечных и продольных осей соответственно 6. Такое поведение были изучены отдельно, но одновременный доступ к обоим направлениям имеет решающее значение для понимания такого поведения. Даже при развитии интактного препарата гиппокампа, трудно контролировать распространение на протяжении всего ткани за счет сложенного-структуры гиппокампа 4. Развернутая гиппокамп обеспечивает доступ к упакованных нейроновв виде плоской двумерной клеточного слоя 7,8.
По разворачивается зубчатой извилине (DG) (рисунок 1), гиппокамп принимает уплощенную форму с прямоугольной конфигурации, в которой оба поперечных и продольных связей остаются нетронутыми с пирамидальной слоя клеток, расположенных в двумерной листа, содержащего как CA3 и CA1, оставляя плоскую часть нервной ткани, которые могут быть использованы для исследования нейронной распространение (рисунок 2) 8. Нейронной активности может контролироваться с отдельных стеклянных пипеток, микроэлектродов массивов, стимулирующих электродов, а также напряжения чувствительных красителей (VSD) 3,7,8. Кроме того, генетически кодируемых индикатор напряжения от трансгенных мышей могут быть использованы для отслеживания шаблон для размножения 9.
Плоская конфигурация разложенном гиппокампа сети хорошо подходит для оптической записи метода, но и для массива микроэлектродов. MOST из коммерчески доступных массивов изготавливаются с плоскими или низкопрофильных электродов и может записывать активность нейронов в обоих срезов тканей и культивируемых нейронов 10-12. Тем не менее, отношение сигнал-шум (ОСШ) уменьшается, когда сигналы получены из интактного ткани, так как сомы нейронов расположены глубже в ткани. Микроэлектродные электродов массивы с высокими пропорциями требуется, чтобы улучшить SNR.
С этой целью, проникая микроэлектрод массив (PMEA) была разработана в нашей лаборатории, а также предоставляет возможность непосредственно зонда в ткани, вставив 64 шипов с диаметром 20 мкм и высотой 200 мкм в развернутых гиппокампа 7,13 , Этот массив микроэлектродов имеет более высокий SNR по сравнению с изображениями чувствительной красителя напряжения и SNR остается стабильным во время эксперимента 7,13. Сочетание разложенном гиппокампа подготовки и PMEA обеспечивает новый способ инвестироватьIGATE нейронной распространении над двумерной плоскости. Эксперименты, использующие этот метод уже дали значительные результаты о механизмах распространения нервного сигнала в гиппокампе при этом нейронная активность может распространяться независимо от синаптических и электрических синапсов 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Animal экспериментальные протоколы были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию Институциональная животного в университете. CD1 мышей обоего пола в возрасте от P10 до P20 используются в данном исследовании.
1. Решения для хирургии и экспериментальной записи
- Подготовка нормального искусственного спинномозговой жидкости (ACSF) буфера, содержащего (мМ): NaCl 124, KCl 3,75, KH 2 PO4 1,25, MgSO 4 2, NaHCO 3 26, декстроза 10, и CaCl 2 2. Эта нормальной ACSF для восстановления тканей после вскрытия, а также для стирки системы в начале эксперимента.
- Подготовка сахарозы ACSF, который используется во время гиппокампа вскрытия и содержит (мМ): Сахароза 220, KCl 2,95, NaH 2 PO 4 1,3, MgSO 4 2, NaHCO 3 26, декстроза 10, и CaCl 2 2. Для того, чтобы побудить эпилептиформная деятельность в неповрежденном гиппокампе тканевого препарата, добавить 4-аминопиридин (4-AP) к нормальной ACSF наконцентрация 100 мкМ.
2. Хирургические процедуры для неповрежденном гиппокампа подготовки
- Оставьте изофлурана (1 мл) в камере в нижней части сушильной печи стеклянную банку (№ 1 в конкретных материалов и оборудования) и использовать обычную бумажную салфетку, чтобы покрыть поверхность нижней ступени, так животное не войти в контакт с жидкость. Затем поместите CD1 мышь в банку и закройте крышку. Держите животное в закрытом кувшине около 1 мин до 2 мин. Когда частота дыхания составляет около одного в секунду, удалить мышь из банки.
- Наведите на сцене хирургии и обезглавить с подходящим ножницами. Сразу же после обезглавливания, поместите голову в ледяную (3-4 ° С), кислородом сахарозы ACSF около 30 сек.
- Используйте тонких ножниц (№ 5 в конкретных материалов и оборудования), чтобы удалить кожу на верхней части черепа и сократить череп вдоль средней линии головы, а также на двух концах рядом с темпомRAL доле. Используйте пинцет (№ 6 в конкретных материалов и оборудования) для того чтобы слезть вырезать череп к каждой стороне головы, чтобы выставить на мозг.
- Вставьте микро лаборатории шпателем (№ 8 в конкретных материалов и оборудования) в зазор между теменной долей мозга и черепа, чтобы тщательно очистить мозг от нижней части черепа, а затем перетащите его на подготовленный ледяной (3 -4 ° C) Хирургический этап покрыты влажной фильтровальной бумаги (№ 2 в конкретных материалов и оборудования). Удалить мозжечок с охлажденного льдом лезвия и разделить два полушария за счет сокращения средней линии мозга. Затем поместите два разделенных полушарий в стакан, наполненный ледяной сахарозы ACSF продувают 95% O 2/5% CO 2.
- Возьмите одну половину полушария и место на сцене фильтровальной бумаги ледяной. Поместите регулярные Бумажные полотенца или фильтровальной бумаги вокруг мозга, чтобы сосать дополнительную решения. Используйте две пожарные-полированного стекла пипеток инструменты (№ 10 в материалах иОборудование), чтобы отделить кору от остальной части центральной части головного мозга.
- После гиппокамп подвергается изнутри коры и поставить на ледяной сцене, поместите два или три капли ледяной сахарозы ACSF на ткань, а затем удалить лишние раствора вокруг гиппокампа. Разрежьте связи с коры на двух концах гиппокампа. Затем, рассекают гиппокамп из мозга с огнем полированного стекла инструментов и снимите оставшуюся часть мозга.
- Разделить всю гиппокамп с его Alveus стороной вверх и гиппокампа борозда вниз. Быстро падает два или три капли ледяной сахарозы ACSF на ткани снова и удалить лишнюю раствор вокруг ткани использованием кусок бумажным полотенцем. Используйте пожарной полированное стекло инструмент, чтобы перевернуть весь гиппокамп, чтобы разоблачить борозды (рис 1B, C).
- Под нормальной оптического микроскопа, вставьте на заказ стеклянные игольчатые (№ 11 в конкретных материаALS и оборудование) в один конец борозды и сократить соединения волокна, из зубчатой извилины (ГД), чтобы Основание гиппокампа или области СА1, вдоль направления борозды (рис 1С). Нанесите ледяной клинок, чтобы урезать перегородки и временные концы гиппокампе, если это необходимо. Вставьте ковка проволочную петлю (№ 12 в конкретных материалов и оборудования) в вырез борозды и потяните за DG от ткани, держа конец Основание гиппокампа / CA1 гиппокампа в результате пожара полированного стекла инструмента (рис 1D) ,
- После разворачивается процедуру, описанную выше, добавить еще два или три капли ледяной сахарозы ACSF на ткани и удалить лишнюю раствора вокруг ткани. Затем, обрезать развернутый гиппокамп с ледяной лезвия по краям (рис 1E) и поместите подготовку шпателем в восстанавливающейся камере, заполненной нормальной ACSF и ыми с 95% O 2/5% CO 2 при комнатной температуре (около 25 ° С). Оставлятьразвернутая гиппокамп ткани для восстановления около 1 часа до размещения его в записи камеры.
- Возьмите другое полушарие мозга и использовать его, чтобы пройти через этапы от 2,5 до 2,9. Как правило, занимает около 1 до 2 минут, чтобы закончить всю процедуру, чтобы развернуть единую гиппокамп и падение ледяной сахарозы ACSF постоянно держать ткань кислородом и увлажненной.
Настройка 3. Экспериментальная система
- Клей на заказ, изготовленный РМЕА на Pin Grid Array (PGA) пакета и использовать микро проводного соединения для подключения каждого площадку из одного микроэлектродом на площадку штифта на упаковке (рис 3б). Затем вставьте пакет в гнездо на заказ плате 13.
- Индивидуально подключения каждого микроэлектрода его фильтров с полосовой частоты среза от 1 Гц до 4 кГц и усилителей с коэффициентом усиления 100 на заказ сделал плате 13. Оцифровка аналогового выхода из печатной платы с помощью A / D CONVerting систему, а принимать и хранить данные на компьютере.
- Клей на заказ пластиковую камеру для записи вокруг массива с впускным и выпускным шлангом для потока раствора (рис 4а). Использование по меньшей мере, две бутылки, чтобы различные решения в системе, а также участвовать и контролировать выходной трубопровод из бутылок по три-клапана. Подключите выход три-клапан к системе трубопроводов с капельницами камеры, которая направляет решение в записи камеры.
- Между три-клапана и входом записи камеры, добавить электрический нагреватель для нагревания раствора до контролируемой температуре (35 ° C) до того, как раствор направляется в камеру записи. Прикрепите выход из записи камеры в вакуумную трубку, чтобы собрать раствор в вакуумной трубки, подключенного колбу. Не заменяю какого-либо решения в любом эксперименте в данном исследовании.
4. Размещение разложенном гиппокампа на PMEA Для записи нейронной активности
5. СнятиеТкань из PMEA после эксперимента
- Управление ткани якорем микроманипулятор и постепенно поднять ткани, из записи камеры. Выключите впускного и выпускного отверстия, чтобы остановить поток в записи камеры. Камера Запись должна быть полной раствором или добавить несколько капель раствора, чтобы заполнить камеру, если камера Запись не является полной.
- Используйте маленькую кисть, чтобы поднять каждый угол ткани. Если ткань не плавает в растворе, а затем использовать вакуумную трубку, чтобы высохнуть камеру осторожно ткани по-прежнему сидит на массиве. Затем осторожно открыть отверстие постепенно пополнить камеру и закрыли отверстие, чтобы остановить поток, когда камера записи заполнена. Нанесите небольшое кисть, чтобы поднять каждый угол ткани снова.
- Повторите шаг 5,2 до ткани отделяется от массива и плавающий в растворе. Если ткань плавает в растворе, а затем использовать вакуумную трубку, чтобы сосать ткани от отеля. Открыть тон течь на входе и открыть вакуум в розетку. Вымойте систему дистиллированной водой и высушить его.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Данные, показанные на чертежах здесь были записаны в разложенном подготовки гиппокампа с 4-AP (100 мкМ), добавленного во ACSF инкубации ткани в записи камеры при комнатной температуре (25 ° C). Обычно деятельность начинается в течение 5 мин, но в некоторых гиппокампа ткани от старых животных это может занять больше времени. 4-АР-индуцированной нейронов обжига наблюдали с PMEA так же, как сообщалось ранее 14,15. Поскольку электроды имеют высоту 200 мкм, электродные наконечники расположены чуть ниже слоя клеток (фиг 3C), так как слой клеток, как правило, от 250 до 300 мкм над Алвойсе гиппокампа (рисунок 2), (57 записей из 64 в образце эксперимента) от различных каналов имеют в основном положительный прогиб. Тем не менее, некоторые из этих положительных записей может отображать небольшие отрицательные отклонения, а также (5В), если регистрирующего электрода советы являются достаточно близко к слою клеток.Если электрод советы расположен на уровне слоя клеток, записи будут иметь очень резкую негативную Подкрепление положительный сдвиг на нем или просто негативного пики (5С) 16. В образце данных, показанной здесь, 5 каналов из 57 записей негативно всплески. После получения данных от всех 64 каналах, метод индивидуального нормализации (фиг.6В) применяется для отображения нейронной распространение на 2-D плоскости вдоль оси времени записи 7. В сочетании с PMEA и разложенном гиппокампа, нейронная распространение отображается, и наблюдали, чтобы инициировать в основном в одну сторону СА3 и перемещать в продольном направлении по диагонали волнового фронта, пересекая всю площадь гиппокампе (фиг.6).
Рисунок 1. Хирургическая процедура для развернутого гиппокампе . () Один из двух гиппокампе рассекают от височной доли головного мозга мыши. (B) перегородки и временные окончаний вдоль продольной оси. (C) гиппокамп перевернулся с огнем полированного стекла пипеткой, чтобы разоблачить борозды. Оба конца гиппокампа обрезается и стекло игла используется для резки связи между ГД и СА1 или Основание гиппокампа вдоль продольной оси. (D) гиппокамп развернул на заказ металл проволочной петлей. (E) Развернутая гиппокамп с Основание гиппокампа и DG обрезать. (F) заключительная подготовка ткани развернутой гиппокампа. Это положение показывает ориентацию гиппокампа, когда он находится в массиве в эксперименте. Для получения дополнительной информации о развернутом гиппокампа анатомии, пожалуйста, обратитесь к экспериментальным методам в ранее опубликованных рукописей 7.g1large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Гистологический разрез разложенном гиппокампа. Кристалл-фиолетовый краситель показывает положение пирамидальной клетки слоя СА1-СА3 течение развернутых гиппокампа уровень 250 до 300 мкм над Алвойсе таким размещения микроэлектродов непосредственно под слоем клеток (см 3С). Для получения срезах, окрашенных с кристаллическим фиолетовым, ткань фиксировали после гиппокамп был развернут. Развернутая гиппокамп был помещен в PFA 4% O / N. Затем ткань переносили и выдерживают в растворе сахарозы (30%) в течение 48 ч, а затем оснастки замораживание в велосипедиста, содержащий изопентан (2-метилбутан) остыть до -35 ° C в сухом льду. Замороженные разделе были затем вырезать в криостат с20 мкм срезы толщиной в поперечной плоскости (как показано на рисунке 2), чтобы показать расположение пирамидальных слоя клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Развернутые гиппокамп на PMEA. (А) вид сверху на новый PMEA с микроэлектродов, расположенных на конце каждого металлического золота следа. Вставка на правой стороне показан один микроэлектрода под электронным микроскопом с высотой 200 мкм и диаметром 20 мкм 7,13. (B) Массив микроэлектрода приклеен на PGA пакет с пластиковой записи камеры вокруг микроэлектродов на стеклянная подложка. Вставка справа показывает развернутую гиппокамп, размещенный на микроэлектродов обрай в середине. (С) слева, оптической когерентной томографии (ОКТ) изображений показывает развернутую ткань, расположенную на верхней части массива в другой эксперимента. Справа две продольные изображения срезов, полученных из ОКТ изображений слева показывает советы Микроэлектродные (белые точки указал стрелками) достигают в области прямо под слоем тела клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры ,
Рисунок 4. Настройка экспериментальный характер. () Пластиковая крышка крышка с винтами находится над схемами, чтобы защитить его от возможного повреждения водой. Камера Запись имеет как впускные и выпускные трубы, чтобы перевезти поток раствора. Заказ ткани якорь склеены волокна сетки нейлона используется, чтобы обеспечить TissUE в ходе экспериментов. (В) Фото сделано из нижней части стеклянной подложки на PMEA, показывающий ткани якорь держит образец кусок во время эксперимента. Изогнутые провода волокна нейлона из сетки давит на верхнюю часть ткани. Круглые точки являются основаниями микроэлектродов. Стрелки указывают на электроды, которые были повреждены после нескольких экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5. Исходные данные, записанные с помощью PMEA от развернутой гиппокампа. Левая панель: 4-AP-индуцированной эпилептиформная, зарегистрированное с одного микроэлектродом правой панели:. В масштабе в версии сигнала отмечены в окне слева времени. (А) 10 с сечение примера спонтанной активности вобразуемых 100 мкМ 4-AP ACSF получены по одному из микроэлектродов, расположенных в базальном дендритной области на основе полярности сигналов с ОСШ 34,9 дБ. (В) необработанные данные из другого микроэлектрода, расположенной ближе к somata с ОСШ 27,2 дБ. (С) Пример записи, полученной от электрода, расположенного в соматической слоя. В этом примере ОСШ 18,53 дБ. (D), полученный из записи изогнутого электрода все еще проводящей но не проникающего в ткани. Изогнутая электрод имеет значительную нижнюю SNR по сравнению с теми интактных электродов (1,5 дБ в данном примере). (Е) Baseline шума, записанного с микроэлектрода. Базовый обычно имеет от пика до пика значение от 150 до 200 мкВ и импеданса одного электрода около 1 до 2 МОм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6. Преобразование нейронных записи данных в 2-D карты распространения. () 170 мсек окно обрезает одного нейронная пики в каждом канале построены на фото в PMEA. Необработанные данные фильтруют с помощью фильтра нижних частот в 100 Гц. Сигналы от разбитых электродов интерполируются с записями вокруг него. В этом примере все шипы являются положительными. (B) одного нейронная шип из красного пикселя в (А) нормирована на панели цвета с пользовательским разработанный метод для индивидуального нормализации (пожалуйста, обратитесь к предыдущей публикации для более подробной информации о нормализации 7). (с) цветные карты, созданные с помощью отдельного нормализации показывают, что распространение движения по всей площади разложенном гиппокампа в различные моменты времени.www.jove.com/files/ftp_upload/52601/52601fig6large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Развитие разложенном подготовки гиппокампе, где продольные и поперечные оси гиппокампа сохраняются в комбинации с проникающим массива микроэлектродов, представляет собой мощный инструмент для исследования соединений анатомии или нервных распространение в гиппокампе 7. Это разворачивается процедура также применима для изучения гиппокампа у взрослых мышей. Недавние исследования с этим препаратом показал, что 4-AP-индуцированной эпилептиформная активность может распространяться с диагональю волнового фронта по всей площади разложенном гиппокампа (рис 6) 7,8. Эти исследования показали, что нетронутыми развернулась гиппокамп обеспечивает значительные преимущества по сравнению с любой поперечных или продольных срезов, когда нервная распространение в плоском гиппокампа нейронной сети могут быть исследованы (рисунок 6).
Проникая микроэлектрод обеспечивает значительное преимущество над существующей миcroelectrode массивы (МЭС), которые состоят из нескольких контактов, расположенных над плоской поверхностью 11,12,17. МЭА с плоскими поверхностными электродами трудно использовать с развернутой гиппокампе, так как клеточный слой расположен около 250 до 300 мкм от поверхности (рисунок 2). PMEA описано здесь был разработан, чтобы решить эту проблему с 64-проникающей электродов, предназначенных для изучения нейронной распространение с высоты 200 мкм проникают глубоко внутри ткани 7,13. Кроме того, РМЕА также применимо в любой плоской препарата ткани, такие как корковых ломтики, гиппокампа поперечных срезов и т.д.
Еще одним преимуществом использования этого РМЕА является улучшение ОСШ. Прототип изучение этого PMEA показывает соотношение SNR нейронной сигнала, записанного на этом PMEA имеет среднее значение 19,4 ± 3 дБ, что значительно выше, и более стабильным по сравнению с записью VSD, поскольку предыдущие исследования показали, что токсичность ифото отбеливание ВСД четко ослабили способность записывать данные 8. С улучшенной экспериментального протокола с помощью ткани якорь в этом исследовании, ОСШ записи из РМЕА увеличивается в диапазоне от 20 до 30 дБ (рис 5), который имеет более высокую SNR по сравнению с теми сгладить электродных массивов с значение от 10 до 15 дБ 11,18. Возможность разворачиваться гиппокамп имеет важное значение для получения слоя нейронов (CA1-CA3), которые могут быть опрошены плоской решетки записи.
Кроме того, поскольку массив кремния построен на прозрачной подложке, метод визуализации чувствительной краситель напряжение может быть интегрирован в систему РМЕА для изучения распространения нейронной активности в гиппокампе 8. Трансгенные мыши с флуоресцентными напряжения чувствительных индикаторов также может быть использован для исследования происхождения и распространения сигнала в физиологических условиях, а также изменения, вызванные pharmacologiческие агенты или генетически модифицированных тканей из различных животных моделях 9.
Есть несколько важных шагов для того, чтобы обеспечить высокое качество записи. Во-первых, чтобы обеспечить жизнеспособность тканей, хирургическая процедура должна быть выполнена как можно быстрее. Как правило, она занимает около 1 до 2 минут, чтобы пройти через все шаги, начиная 2.1) 2.10). Практика разворачивающейся процедуры на нескольких пробных животных настоятельно рекомендуется до фактического экспериментальной хирургии осуществляется. Во-вторых, потребности расхода, чтобы оставаться постоянной, чтобы избежать каких-либо колебания уровня перфузионной жидкости в камере записи. Кроме того, ткань должна быть закреплена, чтобы избежать движение ткани по отношению к массиву.
Хотя PMEA описано здесь может обеспечить полезные сигналы в мониторинге нейронной распространение в разложенном гиппокампе, есть некоторые недостатки и ограничения этой методологии записи.
Во-первых, Микроэлектродов может сломать из-за механической силы размещенной на них (рис 5D, E). Во время процедуры размещения тканей и удаления, случайный контакт между малым кистью и массива может привести к микроэлектродов согнуть или сломать. Когда ткань якорь опускается вниз с помощью микроманипулятора, горизонтальное движение ткани вдоль нижней части камеры может создать силу сдвига, которые могли бы привести к изгиб или поломка электродов. В будущем дизайна, микроэлектродов следует перестроить с несколько более толстым основанием, чтобы сделать их сильнее. В текущей версии этого PMEA, записывающие электроды имеют узкая база по сравнению с его диаметром 13, тем самым ослабляя электроды (рис 3а).
Процедура очистки должна также быть улучшена, чтобы адекватно удалить остаточную ткань и волокна, которые могли бы прикрепить к массиву. После каждого эксперимента, маленькие кусочкиткани может оставаться прикрепленным к микроэлектродов, и это остаточное ткани слева на электроды должны быть удалены. Если эти остаточные ткани не будут удалены, импеданс электродов и ОСШ из записей могут быть затронуты. Промывка системы с дистиллированной водой предлагается, как указано в части 5 раздела протокола. Люди также рекомендуется промыть систему с некоторым слабым кислотным раствором, который может растворить ткань, не повреждая систему
Еще один недостаток этого протокола в том, что во время разворачивания процедуры, проводящие пути в этом развернутом гиппокампа разрезают, предотвращая исследование возможных нейронных сигналов, распространяющихся от DG в других слоях гиппокампа.
В заключение, мы описали здесь новый методологии при исследовании распространения нейронной активности в гиппокампе путем объединения с высоким соотношением микроэлектродного массив с развернутой гиппокампа Tissuе. Метод сделал привести к лучшему пониманию того, как нейронная активность может распространяться как в продольном, и в поперечном направлениях. Этот метод может быть также применен к кортикальной ткани, помещенной в Аналогичным образом в верхней части массива. Кроме того, сочетая технику оптической записи с этого препарата возможно, так как массив является прозрачным, а также может привести к некоторым важным выводам о распространении сигнала в нервной ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
| A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
| Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
| Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
| Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
| Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
| small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
| Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
| Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
| Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
| Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
References
- Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. Control of traveling waves in the Mammalian cortex. Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).
- Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity in neonatal intact limbic structures in vitro. Eur J Neurosci. 12 (8), 2757-2768 (2000).
- Grinvald, A., Manker, A., Segal, M. Visualization of the spread of electrical activity in rat hippocampal slices by voltage-sensitive optical probes. J Physiol. 333, 269-291 (1982).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
- Albani, S. H., McHail, D. G., Dumas, T. C. Developmental studies of the hippocampus and hippocampal-dependent behaviors: insights from interdisciplinary studies and tips for new investigators. Neurosci Biobehav Rev. 43, 183-190 (2014).
- Zhang, M., et al. Propagation of Epileptiform Activity Can Be Independent of Synaptic Transmission, Gap Junctions, or Diffusion and Is Consistent with Electrical Field Transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
- Kibler, A. B., Durand, D. M. Orthogonal wave propagation of epileptiform activity in the planar mouse hippocampus in vitro. Epilepsia. 52 (9), 1590-1600 (2011).
- Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108 (11), 3147-3160 (2012).
- Wingenfeld, K., Wolf, O. T. Stress , memory, the hippocampus. Front Neurol Neurosci. 34, 109-121 (2014).
- Liu, J. S., et al. Spatiotemporal dynamics of high-K+-induced epileptiform discharges in hippocampal slice and the effects of valproate. Neurosci Bull. 29 (1), 28-36 (2013).
- Oka, H., Shimono, K., Ogawa, R., Sugihara, H., Taketani, M. A new planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice. J Neurosci Methods. 93, 61-68 (1999).
- Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
- Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. J Pharmacol Exp Ther. 282 (1), 262-270 (1997).
- Perreault, P., Avoli, M. 4-aminopyridine-induced epileptiform activity and a GABA-mediated long-lasting depolarization in the rat hippocampus. J Neurosci. 12 (1), 104-115 (1992).
- Chesnut, T. J., Swann, J. W. Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus. Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings. Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. Hippocampal neuron firing and local field potentials in the in vitro 4-aminopyridine epilepsy model. J Neurophysiol. 108 (9), 2568-2580 (2012).
