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Neuroscience

Actividad neural propagación en una preparación del hipocampo Desplegado con un penetrante Micro-electrodo de matriz

Published: March 27, 2015 doi: 10.3791/52601
* These authors contributed equally

Summary

Hemos desarrollado un hipocampo desplegada in vitro que conserva CA1-CA3 variedad de neuronas. En combinación con la matriz de micro-electrodo de penetración, la actividad neural puede ser monitoreado en ambas las orientaciones longitudinales y transversales. Este método proporciona ventajas sobre las preparaciones de cortes de hipocampo como la propagación en todo el hipocampo se pueden grabar simultáneamente.

Abstract

Este protocolo describe un método para preparar un nuevo en preparación hipocampo plana vitro combinado con una matriz de micro-mecanizado para mapear la actividad neuronal en el hipocampo. La preparación de cortes de hipocampo transversal es la preparación del tejido más común para estudiar la electrofisiología hipocampo. Una rebanada del hipocampo longitudinal también se desarrolló con el fin de investigar las conexiones longitudinales en el hipocampo. El hipocampo del ratón intactas también se pueden mantener in vitro debido a su grosor permite la difusión adecuada de oxígeno. Sin embargo, estas tres preparaciones no proporcionan acceso directo a la propagación de los nervios ya que algunos de los tejidos es falta o doblada. El hipocampo intacto desplegada proporciona tanto transversal y conexiones longitudinales en una configuración plana para el acceso directo al tejido para analizar la extensión completa de propagación de la señal en el hipocampo in vitro. Con el fin de controlar con eficacia la actividad neuronal de tque la capa de células, una costumbre hizo penetrar matriz de micro-electrodo (PMEA) se fabricó y se aplica al hipocampo desplegada. El PMEA con 64 electrodos de 200 m de altura podría registrar la actividad neuronal en el interior de el hipocampo del ratón. La combinación única de una preparación del hipocampo desplegada y la PMEA proporciona una nueva herramienta in-vitro para estudiar la velocidad y la dirección de propagación de la actividad neuronal en las dos dimensiones regiones CA1-CA3 del hipocampo con una elevada relación señal a ruido.

Introduction

La comprensión de la conducción neural o la propagación de señales neuronales es crucial para la determinación del mecanismo de la comunicación neural tanto en la función normal y condiciones patológicas en el cerebro 1-3. El hipocampo es una de las estructuras más ampliamente estudiados en el cerebro, ya que juega papel fundamental en varias funciones cerebrales como la memoria, y el seguimiento espacial y participa en varios cambios patológicos que afectan drásticamente el comportamiento, así 1,6. Aunque, el hipocampo exhibe una organización compleja, los diferentes elementos de su estructura se pueden identificar y acceder en la preparación rebanada 4-6 fácilmente. En la dirección transversal del hipocampo, la actividad neural se conoce para propagar a través de la vía de tri-sináptica que comprenden el giro dentado (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. Se cree que la transmisión sináptica y la conducción axonal juegan un papel importante para communicatien este circuito transversal 4,6. Sin embargo, la propagación de la señal neural tiene lugar tanto en direcciones transversal y longitudinal 4,6. Esto implica que el hipocampo no puede ser completamente investigó mediante el uso de preparaciones rebanada que limitan la observación a una dirección de propagación particular 4. El corte longitudinal se desarrolló para investigar las vías axonales lo largo del eje longitudinal 5. Los investigadores han observado gamma y oscilaciones theta-conducta específica predominantemente a lo largo del ejes transversal y longitudinal respectivamente 6. Estos comportamientos se han estudiado por separado, pero el acceso simultáneo a las dos direcciones es crucial para entender estos comportamientos. Incluso con el desarrollo de la preparación hipocampo intacto, es difícil controlar la propagación a lo largo de todo el tejido debido a la estructura plegada de la hipocampo 4. El hipocampo desplegada proporciona acceso a las neuronas envasadosen una forma de un plano de dos dimensiones 7,8 capa de células.

Desplegando el giro dentado (DG) (Figura 1), el hipocampo adopta una forma aplanada con una configuración rectangular en la que tanto transversal y conexiones longitudinales permanecen intactos con la capa de células piramidales dispuestos en una lámina bidimensional que contiene tanto CA3 y CA1, dejando una pieza plana de tejido neural que se puede utilizar para investigar la propagación neural (Figura 2) 8. La actividad neuronal puede entonces ser monitoreado con pipetas de vidrio individuales, arrays de microelectrodos, electrodos de estimulación, así como colorantes sensibles al voltaje (VSD) 3,7,8. Además, el indicador de tensión codificado genéticamente de ratones transgénicos se puede utilizar para rastrear el patrón de propagación 9.

La configuración plana de la red del hipocampo desplegada es muy adecuado para la grabación método óptico sino también para una matriz de microelectrodos. Ma mayoría de las matrices disponibles en el mercado están fabricados con electrodos perfil plano o baja y puede registrar la actividad neuronal en los dos cortes de tejido y las neuronas cultivadas 10-12. Sin embargo, la relación señal-ruido (SNR) disminuye cuando las señales se obtienen de un tejido intacto desde el soma de las neuronas se encuentra más profunda en el tejido. Se requieren conjuntos de electrodos microelectrodos con altas relaciones de aspecto para mejorar la SNR.

Para este efecto, una matriz de microelectrodos penetrante (PMEA) se ha desarrollado en nuestro laboratorio, y proporciona la capacidad para sondar directamente en el tejido mediante la inserción de espigas 64 con un diámetro de 20 micras y 200 micras de altura en el hipocampo desplegadas 7,13 . Esta matriz de microelectrodos tiene mayor SNR en comparación con la formación de imágenes colorante sensible al voltaje y la SNR se mantiene estable durante un experimento 7,13. La combinación de la preparación del hipocampo desplegada y la PMEA proporciona una nueva manera de invertirIgate la propagación neural sobre un plano de dos dimensiones. Los experimentos utilizando esta técnica ya han dado resultados significativos sobre los mecanismos de propagación de la señal neuronal en el hipocampo mediante el cual la actividad neuronal puede propagarse independientemente de las sinapsis sinápticas o eléctricos 7.

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Protocol

NOTA: Animal protocolos experimentales fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la universidad. Ratones CD1 de cualquier sexo a la edad de P10 a P20 se utilizan en este estudio.

1. Soluciones de Cirugía Experimental y grabación

  1. Preparar tampón normal de líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) que contiene (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH 2 PO 4 1,25, MgSO 4 2, NaHCO3 26, dextrosa 10, y CaCl 2 2. Utilice esta LCRa normal para la recuperación del tejido después de la disección, así como para el sistema de lavado al comienzo del experimento.
  2. Preparar LCRa sacarosa que se utiliza durante la disección hipocampo y contiene (mM): Sacarosa 220, KCl 2,95, NaH 2 PO 4 1,3, MgSO4 2, NaHCO3 26, dextrosa 10, y CaCl 2 2. Con el fin de inducir la actividad epileptiforme en la preparación intacta tejido del hipocampo, añadir 4-aminopiridina (4-AP) a LCRa normal ala concentración de 100 mM.

2. Procedimiento quirúrgico para la Intacto Preparación Hippocampus

  1. Caiga isoflurano (1 ml) a la cámara en el fondo de un frasco de vidrio desecador (No.1 en Materiales y Equipos Específicos) y use una toalla de papel ordinario para cubrir la superficie de la etapa de fondo para que el animal no se interpone en contacto con el líquido. Luego, coloque el ratón CD1 en el frasco y cierre la tapa. Mantenga el animal en el frasco cerrado durante aproximadamente 1 min a 2 min. Cuando la frecuencia de la respiración es de aproximadamente uno por segundo, quite el ratón de la jarra.
  2. Coloque el ratón en el escenario de la cirugía y decapitar con unas tijeras adecuadas. Inmediatamente después de la decapitación, coloque la cabeza en la enfriado con hielo (3-4 ° C), LCRa sacarosa oxigenada durante aproximadamente 30 seg.
  3. Con unas tijeras finas (No.5 en Materiales y Equipos Específicos) para eliminar la piel en la parte superior del cráneo y de cortar el cráneo a lo largo de la línea media de la cabeza, así como en los dos extremos cercanos al tempolóbulo ral. Use pinzas (No. 6 en Materiales y Equipos Específicos) para pelar el cráneo corte hacia cada lado de la cabeza con el fin de exponer el cerebro.
  4. Inserte una espátula de laboratorio micro (No. 8 en Materiales y Equipos Específicos) en el espacio entre los lóbulos parietales del cerebro y el cráneo de pelar cuidadosamente el cerebro desde la parte inferior del cráneo y luego colóquelo en un helado preparado (3 -4 ° C) fase quirúrgica cubierta con papel filtro húmedo (No.2 en Materiales y equipos específicos). Retire el cerebelo con una hoja enfriada con hielo y separar los dos hemisferios mediante la reducción de la línea media del cerebro. Luego, coloque los dos hemisferios separados en un vaso de precipitados lleno con el LCRa sacarosa enfriado con hielo burbujeado con 95% de O2 / 5% de CO 2.
  5. Tome la mitad del hemisferio y el lugar en el escenario de papel de filtro helada. Coloque toallas de papel normal o papel de filtro alrededor del cerebro para aspirar la solución extra. Utilice dos herramientas de pipeta de vidrio pulido al fuego (No. 10 en Materiales yEquipo) para separar la corteza del resto de la parte central del cerebro.
  6. Después de que el hipocampo se expone desde el interior de la corteza y se puso la etapa de enfriado en hielo, colocar dos o tres gotas de helado sacarosa LCRa sobre el tejido y luego eliminar la solución adicional alrededor del hipocampo. Cortar las conexiones con la corteza en los dos extremos del hipocampo. Entonces, diseccionar el hipocampo de cerebro con las herramientas de vidrio pulidas al fuego y retirar la parte restante del cerebro.
  7. Separe todo el hipocampo con el lado de alveus y surco del hipocampo hacia abajo. Caen rápidamente dos o tres gotas de helado sacarosa LCRa sobre el tejido de nuevo y eliminar la solución adicional alrededor del tejido usando un trozo de toalla de papel. Utilice una herramienta de vidrio pulida al fuego a entregar todo el hipocampo para exponer el surco (Figura 1B, C).
  8. Bajo el microscopio óptico normal, insertar una aguja de vidrio hecho a medida (Nº 11 en específico MateriALS y Equipo) en un extremo del surco y cortar las conexiones de fibra, de giro dentado (DG) para subiculum o el campo CA1, a lo largo de la dirección del surco (Figura 1C). Aplicar una hoja helada para recortar los extremos del tabique y temporales del hipocampo si es necesario. Inserte un asa de alambre de metal por encargo (No. 12 en Materiales y Equipos Específicos) en el surco de corte y tire sobre la DG lejos del tejido mientras sujeta el extremo subiculum / CA1 del hipocampo mediante una herramienta de vidrio pulido fuego (Figura 1D) .
  9. Siguiendo el procedimiento de despliegue anteriormente, añadir otros dos o tres gotas de la sacarosa LCRa enfriado con hielo sobre el tejido y eliminar la solución adicional alrededor del tejido. A continuación, recortar el hipocampo desplegada con la hoja enfriada con hielo en los bordes (Figura 1E) y coloque la preparación por una espátula en la cámara de recuperación de llenado con LCRa normal y burbujeado con 95% de O2 / 5% de CO 2 a RT (alrededor 25 ° C). Dejarel tejido hipocampo desplegada para recuperar aproximadamente 1 hr antes de colocarlo en la cámara de grabación.
  10. Tome el otro hemisferio del cerebro y lo utilizan para ir a través de los pasos 2,5 a 2,9. Por lo general, tomar alrededor de 1 a 2 min para terminar todo el procedimiento para desplegar una sola hipocampo y gota fría con hielo sacarosa LCRa continuamente para mantener el tejido oxigenada e hidratada.

Configuración 3. Sistema Experimental

  1. Pegue un PMEA fabricado a medida en un paquete de pin grid array (PGA) y utilizar micro unión de cables para conectar cada pad de un solo microelectrodos a la almohadilla de un alfiler en el envase (Figura 3B). Luego, inserte el paquete en la toma de una placa de circuito a medida 13.
  2. Conectar individualmente cada microelectrodo a sus filtros de paso de banda con frecuencia de corte de 1 Hz a 4 KHz y amplificadores con ganancia de 100 en la placa de circuito por encargo 13. Digitalizar la salida analógica de la tarjeta de circuitos por un D conv / Asistema dosificando, y adquirir y almacenar los datos en un ordenador.
  3. Pegar una cámara de registro de plástico o hechos a medida alrededor de la matriz con tubos de entrada y salida para el flujo de la solución (Figura 4A). Use por lo menos dos botellas para mantener diferentes soluciones en el sistema, y ​​unirse a y controlar el tubo de salida de las botellas por una válvula de tri. Conectar la salida de la válvula tri a un sistema de tubos con una cámara de goteo IV que está guiando la solución en la cámara de grabación.
  4. Entre la válvula tri-y la entrada de la cámara de grabación, añadir un calentador eléctrico para calentar la solución a una temperatura controlada (35 ° C) antes de que la solución se guía a la cámara de grabación. Coloque la salida de la cámara de grabación para un tubo de vacío para recoger la solución en un matraz conectado tubo de vacío. No reciclar cualquier solución en cualquier experimento en este estudio.

4. Colocación del Desplegado Hippocampus en el PMEA para registrar la actividad neuronal

  • Para preparar el montaje experimental, llenar una botella con LCRa normal y otra botella con 4-AP LCRa. En las dos botellas, burbuja 95% de O2 / 5% de CO 2 desde el comienzo de cada experimento. Utilice un conector tri-válvula para controlar qué solución será seleccionado durante un experimento. Conectar un tubo de vacío en la salida de la cámara para bombear la solución en un recipiente de polvo. Calentar la tubería antes de entregarlo a la cámara de grabación y mantener la solución a un nivel de temperatura controlada (35 ° C).
  • Cuando la entrada y salida de la cámara de grabación están cerradas, usar un gotero pipeta de vidrio por encargo para transferir y colocar el hipocampo desplegada en la cámara de grabación. Bajo el microscopio, posicionar el hipocampo desplegada con un cepillo pequeño regular de pintura mientras que el tejido está flotando en la solución. Coloque el hipocampo desplegada con el lado de alveus abajo, área CA3 apuntando en dirección opuesta, y el campo CA1 apuntando hacia el investigador. Aspirar con cuidado la solución en la cámara utilizando una pipeta de vacío desde el borde de la cámara de grabación para bajar el nivel de la solución hasta que la cámara se seca y el tejido se hace descender sobre la matriz. Luego, coloque un anclaje de tejidos hecho a medida (Figura 4) (Nº 14 en Materiales y Equipos Específicos) en la parte superior del tejido para mantener el hipocampo desplegada sobre la matriz. Ponga unas gotas de solución en la cámara de registro para volver a llenarlo, y poco a poco abrir la entrada y la salida para ajustar la velocidad de flujo a aproximadamente dos gotas por segundo en la cámara de goteo IV.
  • Incubar el tejido en la cámara de registro con LCRa normal para alrededor de 1 min para recuperar, a continuación, conmutar el suministro de la solución de 4-AP LCRa disuelto y ajustar la velocidad de flujo correctamente. Incubar el tejido en 4-AP disuelto LCRa durante aproximadamente 5 a 10 minutos y luego el investigador podría iniciar el software para grabar la señal cuando aparece la actividad espontánea.
  • 5. Extracción de laEl tejido de la PMEA Después de un experimento

    1. Controlar el anclaje de tejidos por un micromanipulador y levantar gradualmente el tejido de la cámara de registro. Apagar tanto de entrada y salida para detener el flujo en la cámara de grabación. La cámara de registro debe estar llena con solución o añadir unas gotas de solución para llenar la cámara si la cámara de grabación no está lleno.
    2. Utilice un pincel pequeño levantar cada esquina del tejido. Si el tejido no está flotando en la solución, a continuación, emplear el tubo de vacío para secar la cámara cuidadosamente con el tejido todavía sentado en la matriz. A continuación, abra cuidadosamente la entrada para volver a llenar la cámara gradualmente y cerrar la entrada para detener el flujo cuando la cámara de grabación está lleno. Aplicar el pincel pequeño para levantar cada esquina del tejido de nuevo.
    3. Repita el paso 5.2 hasta que el tejido se separa de la matriz y flotando en la solución. Si el tejido está flotando en la solución, a continuación, utilizar el tubo de vacío para aspirar el pañuelo. Abrir tque fluya en la entrada y abrir el vacío en la toma de corriente. Lave el sistema con agua destilada y secarlo.

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    Representative Results

    Los datos mostrados en las figuras aquí se registraron en la preparación hipocampo desplegada con 4-AP (100 mM) LCRa añadido durante la incubación del tejido en la cámara de registro a TA (25 ° C). Normalmente la actividad comienza a los 5 minutos, pero en algunos tejidos del hipocampo de los animales de más edad puede tomar más tiempo. El disparo neuronal inducida por 4-AP observada con el PMEA es el mismo que se informó anteriormente 14,15. Dado que los electrodos tienen una altura de 200 m, las puntas de los electrodos están situadas justo debajo de la capa de células (Figura 3C), porque la capa de células es generalmente de 250 a 300 micras por encima de la alveus del hipocampo (Figura 2), las grabaciones (57 de 64 en el experimento de la muestra) de diferentes canales tienen una desviación en su mayoría positivas. Sin embargo, algunas de estas grabaciones positiva podría mostrar pequeñas deflexiones negativas así (Figura 5B), si las puntas de los electrodos de grabación son lo suficientemente cerca de la capa de células.Si las puntas de los electrodos se encuentran justo a la altura de la capa de células, la grabación tendrá clavar negativo muy fuerte con cambio positivo en ella o simplemente clavar negativo (Figura 5C) 16. En la muestra de datos que se muestra aquí, 5 canales de cada 57 grabaciones tienen clavar negativo. Después de la adquisición de los datos de todos los canales 64, se aplica el método de normalización individual (Figura 6B) para mapear la propagación neural en un plano 2-D a lo largo del eje de tiempo de la grabación 7. Con una combinación de la PMEA y el hipocampo desplegada, la propagación neural se asigna y se observó para iniciar su mayor parte en un lado de CA3 y mover longitudinalmente en un frente de onda diagonal, cruzando toda el área del hipocampo (Figura 6).

    Figura 1
    Figura 1. Procedimiento quirúrgico para un hipocampo desplegada . (A) Uno de los dos hipocampos se diseca de lóbulo temporal del cerebro de un ratón. (B) septal y terminaciones temporales a lo largo del eje longitudinal. (C) El hipocampo se volcó con una pipeta de vidrio pulido de fuego para exponer el surco. Ambos extremos del hipocampo se recortan y una aguja de vidrio se utiliza para cortar las conexiones entre DG y CA1 o subiculum lo largo del eje longitudinal. (D) El hipocampo se desdobla por un bucle de alambre de metal a medida. (E) hipocampo desdobla con subiculum y DG recortados. (F) La preparación final de tejido de un hipocampo desplegada. Esta posición se muestra la orientación del hipocampo cuando se coloca en la matriz en un experimento. Para obtener detalles adicionales sobre la anatomía hipocampo desplegada por favor refiérase a los métodos experimentales en los manuscritos publicados previamente 7.g1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 2
    Figura sección transversal 2. Histología del hipocampo desplegada. Mancha Crystal-violeta muestra la posición de la capa de células piramidales CA1-CA3 del hipocampo dentro de los desplegadas un nivel de 250 a 300 micras por encima de la alveus localización de ese modo los microelectrodos justo debajo de la capa de células (consulte la Figura 3C). Para obtener las secciones teñidas con cristal violeta, el tejido era post fijo después de que el hipocampo fue desplegada. El hipocampo desplegada fue colocado en PFA 4% O / N. Entonces, el tejido fue transferido y mantenido en solución de sacarosa (30%) durante 48 horas, y seguido por snap-congelación en un motorista que contiene isopentano (2-Metilbutano) enfriar a -35 ° C en hielo seco. Sección de congelados se cortaron en un criostato con20 micras de espesor secciones en el plano transversal (como se muestra en la Figura 2) para revelar la ubicación de la capa de células piramidales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 3
    Figura 3. hipocampo desdobladas en la PMEA. (A) Vista superior de una nueva PMEA con los microelectrodos ubicadas al final de cada traza de metal de oro. El inserto en el lado derecho muestra una sola microelectrodo bajo microscopía de electrones con una altura de 200 micras y un diámetro de 20 micras 7,13. (B) La matriz de microelectrodos se pega en un paquete de PGA con una cámara de registro de plástico alrededor de los microelectrodos sobre un sustrato de vidrio. El inserto de la derecha muestra un hipocampo desplegada colocado en el arr microelectrodosay en el medio. (C) A la izquierda, Tomografía de Coherencia Óptica (OCT) de formación de imágenes muestra el tejido desplegada posicionado en la parte superior de la matriz en un experimento diferente. A la derecha, dos imágenes de corte longitudinales obtenidos a partir de la proyección de imagen octubre de la izquierda muestra la punta de microelectrodos (puntos blancos señalaron por las flechas) llegar a la zona justo debajo de la capa de cuerpo celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .

    Figura 4
    Figura 4. Montaje experimental. (A) una tapa de cubierta de plástico con tornillos se coloca sobre los circuitos para proteger contra posibles daños por agua. La cámara de grabación tiene ambos tubos de entrada y de salida para llevar el flujo de la solución. Un ancla para tejido hecho a medida pegada con una malla de fibra de nylon se utiliza para asegurar el TISSue durante los experimentos. (B) Imagen tomada desde la parte inferior del sustrato de vidrio de la PMEA que muestra el anclaje de tejidos celebración de una rebanada de la muestra durante un experimento. Los alambres curvados son las fibras de nylon de la malla presionando en la parte superior del tejido. Los puntos redondos son las bases de microelectrodos. Las flechas apuntan a electrodos que fueron dañados después de varios experimentos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 5
    Figura 5. Los datos brutos registrados por el PMEA de un hipocampo desplegada. Panel izquierdo: 4-AP-inducida por la actividad epileptiforme grabado de una sola microelectrodo panel de la derecha:. Zoom en la versión de la señal de marcado en la ventana de tiempo de la izquierda. (A) sección 10 seg de un ejemplo de la actividad espontánea enproducida por 100 mM 4-AP LCRa obtenido para uno de los microelectrodos ubicados en la región basal dendríticas sobre la base de la polaridad de las señales con una SNR de 34,9 dB. (B) Los datos brutos de otro microelectrodo situado más cerca de la somata con una SNR de 27,2 dB. (C) Ejemplo de grabación obtenida de un electrodo situado dentro de la capa somática. En este ejemplo, el SNR es 18,53 dB. (D) de grabación obtenido a partir de un electrodo de doblado todavía la realización, pero no penetrar en el tejido. El electrodo doblada tiene una SNR significativamente menor en comparación con los electrodos intactos (1.5 dB en este ejemplo). (E) de ruido de línea de base registrada de un microelectrodo. La línea de base por lo general tiene un valor pico a pico de 150 a 200 mV y la impedancia de un solo electrodo será de 1 a 2Mohms. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 6
    Figura 6. La conversión de datos de grabación neuronales en los mapas de propagación 2-D. (A) Una ventana de tiempo ms 170 trunca un solo clavar neural en cada canal representa en la foto de la PMEA. Los datos en bruto se filtra por un filtro de paso bajo a 100 Hz. Las señales de los electrodos rotos se interpolan con las grabaciones a su alrededor. En este ejemplo, todos los puntos son positivos. (B) Un solo punto neural del píxel rojo en (A) se normaliza a la barra de color con un método personalizado desarrollado para la normalización individual (Por favor refiérase a la publicación anterior para obtener más detalles sobre la normalización 7). (C) Los mapas de color creados por la normalización individuales muestran que la propagación mueve a través de toda el área del hipocampo desplegada en diferentes puntos temporales.www.jove.com/files/ftp_upload/52601/52601fig6large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Discussion

    El desarrollo de la preparación hipocampo desplegada, donde los ejes longitudinales y transversales del hipocampo se conservan en combinación con una matriz de microelectrodos penetrante, proporciona una poderosa herramienta para investigar las conexiones anatomía o propagación neuronal en el hipocampo 7. Este procedimiento de despliegue es también aplicable para el estudio de hipocampo en ratones adultos. Estudios recientes con esta preparación mostraron que la actividad epileptiforme inducida-4-AP podría propagar con un frente de onda diagonal a través de toda el área del hipocampo desplegada (Figura 6) 7,8. Estos estudios mostraron que el hipocampo desplegada intacto ofrece ventajas significativas sobre rodajas transversales o longitudinales, ya sea cuando la propagación neural en una red neuronal del hipocampo plana puede ser investigado (Figura 6).

    El microelectrodo de penetración proporciona una ventaja significativa sobre mi existentearrays croelectrode (MEA) que se componen de varios contactos colocados sobre una superficie plana 11,12,17. MEA con electrodos de superficie planas son difíciles de utilizar con el hipocampo desplegada desde la capa de células se encuentra a unos 250 a 300 m de distancia de la superficie (Figura 2). La PMEA se describe aquí fue diseñado para resolver este problema con 64 electrodos de penetración adecuados para el estudio de la propagación neural con una altura de 200 m para llegar profunda dentro del tejido 7,13. Además, el PMEA también aplicable en cualquier preparación de tejido plana, como rodajas corticales, del hipocampo transversal rebanadas etc.

    Otra ventaja de utilizar este PMEA es la mejora de la SNR. Un estudio prototipo de esta PMEA muestra la relación SNR de la señal neural registrada por este PMEA tiene un valor promedio de 19.4 ± 3 dB, que es significativamente mayor y más estable en comparación con la de la grabación VSD ya que los estudios anteriores indicaron que la toxicidad yfoto blanqueo de VSD claramente afectada la capacidad de grabar datos 8. Con un protocolo experimental mejorado mediante el anclaje de tejidos en este estudio, la SNR de la grabación de los PMEA aumenta a un intervalo de aproximadamente 20 a 30 dB (Figura 5), que tiene un SNR superior en comparación con las matrices de electrodos con aplanar- un valor de 10 a 15 dB 11,18. La capacidad para desplegar el hipocampo es esencial para obtener una capa de neuronas (CA1-CA3) que pueden ser interrogados por una matriz de grabación plana.

    Además, dado que la matriz de silicio está construido sobre un sustrato transparente, técnica de imagen colorante sensible tensión se puede integrar en el sistema de PMEA para estudiar la propagación de la actividad neuronal en el hipocampo 8. Los ratones transgénicos con indicadores sensibles al voltaje fluorescente también pueden ser utilizados para investigar el origen y la propagación de la señal en condiciones fisiológicas, así como los cambios inducidos por pharmacologiagentes Cal o tejido modificado genético de diversos modelos animales 9.

    Hay varios pasos críticos para asegurar la alta calidad de grabación. En primer lugar para asegurar la viabilidad del tejido, el procedimiento quirúrgico debe llevarse a cabo tan rápidamente como sea posible. Por lo general, se tarda alrededor de 1 a 2 minutos para ir a través de todos los pasos de 2,1) a 2.10). La práctica del procedimiento que se desarrolla en algunos animales de la muestra es muy recomendable antes de la cirugía experimental real se lleva a cabo. En segundo lugar, las necesidades de caudal que se le mantenga constante para evitar cualquier fluctuación del nivel del líquido de perfusión en la cámara de grabación. Además, el tejido debe ser anclado hacia abajo para evitar el movimiento del tejido en relación con la matriz.

    Aunque la PMEA descrito aquí puede proporcionar señales útiles en el seguimiento de la propagación neuronal en el hipocampo desplegada, hay algunos inconvenientes y limitaciones a esta metodología de grabación.

    Primeramente, Los microelectrodos pueden romperse debido a la fuerza mecánica colocado en ellos (Figura 5D, E). Durante el procedimiento de colocación de los tejidos y la eliminación, el contacto accidental entre el pincel pequeño y la matriz podría causar que los microelectrodos se doblen o se rompan. Cuando el ancla para tejido se baja por el micromanipulador, el movimiento horizontal del tejido a lo largo de la parte inferior de la cámara podría crear una fuerza de cizallamiento que podría conducir a la flexión o la rotura de los electrodos. En un diseño de futuro, los microelectrodos deben ser reformados con una base algo más gruesa para hacerlos más fuertes. En la versión actual de este PMEA, los electrodos de registro tienen una base estrecha en comparación con su diámetro 13, debilitando así los electrodos (Figura 3A).

    El procedimiento de limpieza también debe mejorarse para eliminar adecuadamente el tejido residual y fibras que podría unir a la matriz. Después de cada experimento, cachitosde tejido podría permanecer unidos a los microelectrodos y este tejido residual que queda en los electrodos debe ser eliminado. Si no se eliminan estos tejidos residuales, la impedancia de los electrodos y la SNR de las grabaciones podrían verse afectados. Flushing del sistema con agua destilada, se sugiere que se indican en la parte 5 de la sección Protocolo. Los usuarios también se les recomienda lavar el sistema con algún débil solución ácida que puede disolver el tejido sin dañar el sistema

    Otro inconveniente de este protocolo es que durante el procedimiento de despliegue, la vía perforante en este hipocampo desplegada se corta, evitando investigación de las posibles señales neurales de propagación de la DG a las otras capas del hipocampo.

    En conclusión, hemos descrito aquí una metodología novedosa para investigar la propagación de la actividad neural dentro del hipocampo mediante la combinación de una alta relación de aspecto array de microelectrodos con tissu hipocampo desplegadae. El método condujo a una mejor comprensión de cómo la actividad neuronal puede propagarse en ambas direcciones longitudinal y transversal. Esta técnica también se podría aplicar a tejido cortical colocado de una manera similar en la parte superior de la matriz. Por otra parte, la combinación de la técnica de grabación óptica con esta preparación es posible ya que la matriz es transparente y también podría conducir a algunos hallazgos importantes sobre propagación de la señal en el tejido neural.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    desiccator jar LABRECYCLERS Inc. 5410 Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. 
    A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus N/A N/A A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. 
    Custom made tissue recovery chamber N/A N/A Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF.
    Straight Operating Scissors Fisher Scientific S17336B                                            Medco Instruments No.:81995  This scissors is used to   decapitate the mice.
    Integra Miltex Goldman-Fox Scissors Fisher Scientific 12-460-517                        MILTEX INC                           No.:5-SC-320 This scissors is used to cut the skull of the mice. 
    Miltex
    Hysterectomy Forceps
    Claflin Medical equipment CESS-722033-00001 This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain
    Micro Spatula Cardinal Health This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. 
    Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula Cardinal Health this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber.
    small paint brush Lowe's tem #: 105657                  Model #: 90219 The one with the smallest size in a normal paint brush package
    Fire polished glass help tool N/A N/A This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
    Custom made glass needle N/A N/A This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
    Custom made glass tool with a metal wire loop N/A N/A This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop.
    Custom made glass solution dropper N/A N/A This tool was  made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end.
    Custom made tissue anchor N/A N/A Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. 
    Custom fabricated microelectrode array N/A N/A More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011. 
    Custom made filter and amplifiers circuits for the array N/A N/A More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011. 
    Data acquisition processor 3400a Microstar Laboratories N/A This is a complete data acquisition system with A/D converter.

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    References

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    Neurociencia Número 97 Penetrar microelectrodos array (PMEA) desplegó hipocampo intacto propagación actividad neuronal la cartografía de la señal neuronal capa celular piramidal plana colocación hipocampo desplegada
    Actividad neural propagación en una preparación del hipocampo Desplegado con un penetrante Micro-electrodo de matriz
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    Zhang, M., Kibler, A. B.,More

    Zhang, M., Kibler, A. B., Gonzales-Reyes, L. E., Durand, D. M. Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array. J. Vis. Exp. (97), e52601, doi:10.3791/52601 (2015).

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