Neural aktivitet Förökning i ovikt hippocampus Beredning med en Penetrating Micro-elektrod Array

Summary

Vi har utvecklat en in vitro ovikt hippocampus som bevarar CA1-CA3 rad nervceller. Kombinerat med det penetrerande mikroelektroduppsättningen, kan neural aktivitet övervakas i både de längsgående och tvärgående riktningar. Denna metod ger fördelar jämfört hippocampus slice förberedelser som utbredning i hela hippocampus kan spelas in samtidigt.

Abstract

Detta protokoll beskriver en metod för framställning av en ny i platt hippocampus vitro beredning kombineras med en mikrobearbetad array att kart neural aktivitet i hippocampus. Den tvärgående hippocampus slice preparatet är den vanligaste vävnadspreparat för att studera hippocampus elektrofysiologi. En longitudinell hippocampus slice utvecklades också för att undersöka longitudinella anslutningar i hippocampus. De intakta mus hippocampus kan också upprätthållas in vitro eftersom dess tjocklek ger tillräcklig syrediffusion. Men dessa tre preparat som inte ger direkt tillgång till neural förökning eftersom en del av vävnaden saknas eller vikas. Ovikt intakta hippocampus ger både tvärgående och längsgående förbindelser i en platt konfiguration för direkt åtkomst till vävnaden för att analysera den fulla omfattningen av signalutbredning i hippocampus in vitro. För att effektivt övervaka neural aktivitet från tHan cellagret, en skräddarsydd penetrerande mikroelektrod array (PMEA) tillverkades och appliceras ovikt hippocampus. Den PMEA med 64 elektroder av 200 nm i höjd kunde spela in neural aktivitet djupt inne musen hippocampus. Den unika kombinationen av en ovikt hippocampus förberedelser och PMEA ger en ny in-vitro verktyg för att studera hastigheten och utbredningsriktning neural aktivitet i de tvådimensionella CA1-CA3 regioner i hippocampus med en hög signalbrusförhållande.

Introduction

Att förstå de neurala ledning eller förökning av neurala signaler är avgörande för bestämning av mekanismen för neurala kommunikation i både den normala funktionen och patologiska tillstånd i hjärnan ^1-3. Hippocampus är en av de mest omfattande studerade strukturer i hjärnan, eftersom den spelar avgörande roll i flera funktioner i hjärnan såsom minne, och rumslig spårning och är inblandad i flera patologiska förändringar som dramatiskt påverkar beteende samt ^1,6. Även hippocampus uppvisar en komplex organisation, kan de olika delarna av dess struktur lätt identifieras och nås i slice beredningen ^4-6. I tvärriktningen av hippocampus, är neural aktivitet kända för att utbreda sig genom tri-synaptisk bana som innefattar dentate gyrus (DG), CA3, CA1 andsubiculum ^4,5. Man tror att synaptisk transmission och axonal ledning spelar en stor roll för communicatipå i denna tvär kretsen ^4,6. Men förökning av neurala signalen sker i både tvärgående och längsgående riktningar ^4,6. Detta innebär att hippocampus inte kan utredas fullständigt med hjälp slice preparat som begränsar observation till en viss riktning utbrednings ^4. Den longitudinella slice utvecklades för att undersöka axonal vägar längs den längsgående axeln ^5. Forskare har observerat beteendespecifik gamma- och theta svängningar främst längs tvärgående och längsgående axlar respektive ^6. Dessa beteenden har studerats separat, men ändå samtidig tillgång till båda riktningarna är avgörande för att förstå dessa beteenden. Även med utvecklingen av den intakta hippocampus preparat, är det svårt att övervaka utbredningen genom hela vävnaden på grund av den hopvikta strukturen i hippocampus ^4. Ovikt hippocampus ger tillgång till de packade nervcelleri en form av en platt tvådimensionell cellskikt ^7,8.

Genom utspelas gyrus dentatus (GD) (Figur 1), antar hippocampus en tillplattad form med en rektangulär form där både tvärgående och längsgående anslutningar förbli intakt med det pyramidala cellskiktet arrangerade i ett tvådimensionellt ark innehåller både CA3 och CA1, lämnar en platt bit av neural vävnad som kan användas för att undersöka neurala förökning (figur 2) ^8. Neural aktivitet kan sedan följas med individuella glaspipetter, mikroelektrod arrayer, stimulerande elektroder, samt spänningskänsliga färgämnen (VSD) ^3,7,8. Dessutom kan genetiskt kodad spänningsindikator från transgena möss användas för att spåra utbredningsmönster ^9.

Den plana konfigurationen av det ovikta hippocampus nätverk är väl lämpad för optisk metod inspelning men också för en mikroelektrod array. MOST av de kommersiellt tillgängliga matriser är tillverkade med platt eller låg profil elektroder och kan spela in neural aktivitet i både vävnadsskivor och odlade nervceller ^10-12. Emellertid, signal-till-brusförhållande (SNR) minskar när signalerna erhålles från en intakt vävnad eftersom soma av nervceller finns djupare in i vävnaden. Mikroelektrod elektrod arrayer med höga bildformat krävs för att förbättra SNR.

För detta ändamål har en genomträngande mikroelektrod array (PMEA) utvecklats i vårt laboratorium, och ger möjlighet att direkt söka i vävnaden genom att sätta 64 spikar med en diameter på 20 nm och höjd på 200 nm i ovikt hippocampus ^7,13 . Denna mikroelektrod array har högre SNR jämfört med spänningskänsliga färgämne avbildning och SNR förblir stabil under ett experiment ^7,13. Kombinationen av den ovikta hippocampus preparatet och PMEA ger ett nytt sätt att investeraiGate neurala utbredning över ett tvådimensionellt plan. Experiment som använder denna teknik har redan gett betydande resultat om mekanismerna för neurala signalutbredning i hippocampus vari neural aktivitet kan föröka oberoende av synaptiska eller elektriska synapser ^7.

Protocol

OBS: Animal experimentella protokoll granskades och godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid universitetet. CD1 möss av något kön vid en ålder av P10 till P20 används i denna studie.

1. Lösningar för kirurgi och experimentell inspelning

1. Förbered normal artificiell cerebrospinalvätska (aCSF) buffert innehållande (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH ₂ PO4 1,25, MgSO ₄ 2, NaHCO ₃ 26, dextros 10, och CaCl ₂ 2. Använd denna normal aCSF för vävnads återhämtning efter dissekering, liksom för tvättsystem i början av experimentet.
2. Förbered sackaros aCSF som används under hippocampus dissektion och innehåller (mM): Sackaros 220, KCl 2,95, NaH ₂ PO4 1.3, MgSO ₄ 2, NaHCO ₃ 26, dextros 10 och _CaCl2 2. För att framkalla epileptiform aktivitet i intakta hippocampus vävnad förberedelse, tillsätt 4-Aminopyridin (4-AP) till normal aCSF påkoncentrationen av 100 pM.

2. Kirurgisk Förfarande för Intact Hippocampus Förberedelse

1. Drop isofluran (1 ml) i kammaren i botten av en exsickator glasburk (No.1 i särskilda material och utrustning) och använda en vanlig pappershandduk för att täcka ytan av den nedre scenen så att djuret inte kommer i kontakt med vätskan. Därefter placerar CD1 musen i burken och stäng locket. Hålla djuret i den slutna burken under ca 1 min till 2 min. När andetag frekvensen är ungefär en per sekund, ta bort musen från burken.
2. Placera musen på operationen scenen och decapitate med en lämplig sax. Omedelbart efter halshuggning, placera huvudet i iskall (3-4 ° C), syresatt sackaros aCSF i ca 30 sek.
3. Använd fin sax (No.5 i särskilda material och utrustning) för att ta bort huden på toppen av skallen och att skära skallen längs mittlinjen av huvudet samt vid två ändar nära tempotral lob. Använd pincett (nr 6 i särskilda material och utrustning) att skala den kapade skallen mot vardera sidan av huvudet, för att exponera hjärnan.
4. Sätt i ett micro lab spatel (nr 8 i särskilda material och utrustning) i springan mellan hjässloberna i hjärnan och skallen att noggrant skala hjärnan från botten av skallen och sedan släppa den på en förberedd iskall (3 -4 ° C) kirurgisk skede täckt med våta filterpapper (No.2 i särskilda material och utrustning). Ta bort lillhjärnan med en is-kyld blad och separera de två hjärnhalvorna genom att skära mittlinjen av hjärnan. Sedan placera de två separerade halvklot i en bägare fylld med iskallt sackaros aCSF bubblade med 95% _O2 / 5% _CO2.
5. Ta hälften av halvklotet och plats på iskall filterpapper skede. Placera regelbundna pappershanddukar eller filterpapper runt hjärnan att suga extra lösningen. Använd två brand polerat glaspipett verktyg (nr 10 inom material ochEquipment) för att separera cortex från resten av den centrala delen av hjärnan.
6. Efter hippocampus exponeras från insidan av hjärnbarken och sätta på den iskalla scenen, placera två eller tre droppar iskall sackaros aCSF på vävnaden och sedan bort extra lösning kring hippocampus. Skär anslutningarna med cortex vid två ändar av hippocampus. Därefter, dissekera hippocampus ut ur hjärnan med brand polerade glas verktyg och avlägsna den återstående delen av hjärnan.
7. Separera hela hippocampus med sin alveus uppåt och hippocampus sulcus nedåt. Snabbt släppa två eller tre droppar iskall sackaros aCSF på vävnaden igen och ta bort den extra lösningen runt vävnaden med en bit hushållspapper. Använd en brand polerat glas verktyg för att vända hela hippocampus att exponera sulcus (Figur 1B, C).
8. Under en normal optiskt mikroskop, sätt in en skräddarsydd glasnål (nr 11 i specifik mateALS och utrustning) i ena änden av sulcus och skär anslutningarna fiber, från gyrus dentatus (DG) för att subiculum eller CA1 fältet, längs riktningen av sulcus (figur 1C). Applicera en iskall blad att trimma septala och temporala ändarna av hippocampus vid behov. Sätt i en skräddarsydd metalltråd slinga (nr 12 i särskilda material och utrustning) i snittet sulcus och dra över GD ifrån vävnaden medan du håller subiculum / CA1 änden av hippocampus av en brand polerat glas verktyg (Figur 1D) .
9. Efter den pågående förfarandet ovan, lägga till ytterligare två eller tre droppar av iskall sackaros aCSF på vävnaden och ta bort den extra lösningen runt vävnaden. Sedan, trimma ovikt hippocampus med iskall blad vid kanterna (Figur 1E) och placera beredningen av en spatel i återvinningskammaren fyllas med normal aCSF och bubblade med 95% _O2 / 5% _CO2 vid RT (om 25 ° C). Lämnaovikt hippocampus vävnad för att återhämta sig ca 1 tim innan du placerar den i inspelningen kammaren.
10. Ta den andra hjärnhalvan och använda den för att gå igenom steg 2,5-2,9. Vanligtvis tar ca 1 till 2 minuter för att avsluta hela proceduren att veckla en enda hippocampus och släppa iskall sackaros aCSF kontinuerligt för att hålla vävnaden syresatt och släckt.

3. Experimentell Systeminstallation

1. Limma en anpassad fabricerade PMEA på ett stift grid array (PGA) paket och använda micro trådbond att ansluta varje dyna från en enda mikroelektrod till dynan i ett stift på förpackningen (figur 3B). Därefter sätter paketet i uttaget på en skräddarsydd kretskort ^13.
2. Individuellt ansluta varje mikroelektrod till sina filter med bandpassgränsfrekvens från 1 Hz till 4 kHz och förstärkare med vinst på 100 på skräddarsydda kretskortet ^13. Digitalisera analoga utsignalen från kretskortet av en A / D-omverting systemet, och förvärva och lagra data på en dator.
3. Limma en skräddarsydd plast inspelning kammare runt arrayen med inlopp och utlopp slangar för vätskeflödet (Figur 4A). Använd minst två flaskor för att hålla olika lösningar i systemet, och gå och kontrollera utgångsslangen av flaskorna med en tri-ventil. Anslut utgången av tri-ventil till ett slangsystem med en IV droppkammare som är vägledande lösningen i inspelningen kammaren.
4. Mellan den tri-ventilen och inloppet av inspelningen kammaren, lägga till en elektrisk varmare för att värma lösningen till en kontrollerad temperatur (35 ° C) innan lösningen styrs till inspelningen kammaren. Fäst utlopp inspelningen kammaren till ett vakuumrör för uppsamling av lösningen i ett vakuumrör anslutet kolv. Inte återvinna någon lösning i något experiment i denna studie.

4. Placera Ovikt Hippocampus på PMEA att Anteckna Neural aktivitet

För att förbereda experimentuppställning, fylla en flaska med normal aCSF och en annan flaska med 4-AP aCSF. I båda flaskor, bubbla 95% _O2 / 5% CO ₂ från början av varje experiment. Använd en tri-ventil-kontakt för att styra vilken lösning kommer att väljas under ett experiment. Anslut ett vakuumrör vid utloppet av kammaren att pumpa lösningen till en dammbehållare. Värm rörledningen innan de levererar den i inspelningen kammaren och hålla lösningen vid en kontrollerad temperaturnivå (35 ° C).

När inlopp och utlopp inspelning kammaren är stängda, använd en skräddarsydd glaspipett dropper att överföra och placera ovikt hippocampus i inspelningen kammaren. Under mikroskopet, placera ovikt hippocampus med en vanlig liten pensel medan vävnaden är flytande i lösningen. Placera ovikt hippocampus med sin alveus sidan nedåt, CA3 området pekar bort, och CA1 fält pekar mot forskaren. Försiktigt suga bort lösningen i kammaren med hjälp av en vakuum pipett från kanten av inspelningen kammaren för att sänka lösningens nivå tills kammaren torkas och vävnaden sänks ner på matrisen. Sedan försiktigt placera en skräddarsydd vävnadsankare (Figur 4) (nr 14 i särskilda material och utrustning) ovanpå vävnaden för att hålla ovikta hippocampus på arrayen. Sätt några droppar lösning i inspelningen kammaren att fylla på den, och gradvis öppna in- och utlopp för att justera flödet till ungefär två droppar per sekund i IV droppkammaren.

Inkubera vävnaden i inspelningen kammaren med normal aCSF för ca 1 min att återhämta sig, växla sedan lösningen försörjningen till 4-AP upplöst aCSF och justera flödet ordentligt. Inkubera vävnaden i 4-AP upplöst aCSF under omkring 5 till 10 min och sedan forskaren skulle kunna starta programmet för att registrera signalen när spontan aktivitet visas.

5. Ta bortVävnad från PMEA Efter ett experiment

1. Styr vävnadsankare genom en mikromanipulator och gradvis lyfta vävnad från inspelningen kammaren. Stäng både inlopp och utlopp för att stoppa flödet i inspelningen kammaren. Inspelningen kammaren bör vara full med lösning eller tillsätt några droppar lösning för att fylla kammaren om inspelningen kammaren inte är full.
2. Använd en liten pensel för att lyfta varje hörn av vävnaden. Om vävnaden inte är flytande i lösningen, då anställa vakuumröret torka kammaren försiktigt med vävnaden fortfarande sitter på rad. Sedan försiktigt öppna inloppet till gradvis fylla kammaren och stänga inloppet att stoppa flödet när inspelningen kammaren är full. Applicera liten pensel för att lyfta varje hörn av vävnaden igen.
3. Upprepa steg 5,2 tills vävnaden lösgörs från arrayen och flyter i lösningen. Om vävnaden är flytande i lösningen, sedan använda vakuumröret att suga vävnaden bort. Öppen than flöde i inloppet och öppna vakuumet i utloppet. Tvätta systemet med destillerat vatten och torka ut.

Representative Results

De data som visas i figurerna här registrerades i ovikt hippocampus beredningen med 4-AP (100 M) aCSF sätts under inkubation av vävnaden i inspelningen kammaren vid RT (25 ° C). Normalt aktivitet börjar inom 5 minuter, men i vissa hippocampus vävnader från de äldre djuren kan det ta längre tid. Den 4-AP-inducerad neuron observerats med PMEA är densamma som tidigare rapporterats ^14,15. Eftersom elektroderna har en höjd av 200 um, är elektrodspetsarna ligger strax nedanför cellskiktet (fig 3C), eftersom cellskiktet är vanligen 250-300 fim ovanför alveus av hippocampus (figur 2), inspelningar (57 ur 64 i provet experimentet) från olika kanaler har en mestadels positiv nedböjning. Emellertid kan en del av dessa positiva inspelningar visa små negativa utböjningar samt (Figur 5B) om inspelningselektrodspetsarna är tillräckligt nära cellskiktet.Om elektrodspetsarna ligger precis i nivå med cellskiktet, kommer inspelningen att ha mycket skarp negativ tillsatta med positiv förskjutning på det eller bara negativ tillsatta (Figur 5C) ^16. I exempeldata som visas här, 5 kanaler av 57 inspelningar har negativa tillsatta. Efter förvärvande av data från alla 64 kanaler, är metoden för individuell normalisering (figur 6B) anbringas för att mappa neurala förökning på en 2-D-plan längs tidsaxeln för inspelningen ^7. Med en kombination av PMEA och ovikt hippocampus, är neurala förökning mappas och observeras att initiera mestadels i en sida av CA3 och röra sig i längsled i en diagonal vågfront, korsar hela området av hippocampus (figur 6).

Figur 1. Kirurgisk procedur för en ovikt hippocampus . (A) En av de två hippocampi dissekeras från temporalloben av en mus hjärna. (B) Septal och temporala avslutningar längs längdaxeln. (C) Hippocampus är välte med en brand polerat glaspipett att exponera sulcus. Båda ändarna av hippocampus trimmas och ett glas nål används för att skära sambanden mellan GD och CA1 eller subiculum längs längdaxeln. (D) Hippocampus är utfälld av en skräddarsydd metalltråd slinga. (E) Ovikt hippocampus med subiculum och GD trimmas. (F) Den slutliga vävnads beredningen av en ovikt hippocampus. Denna position visar orienteringen av hippocampus när den placeras på matrisen i ett experiment. För ytterligare information om ovikt hippocampus anatomi se experimentella metoder i tidigare publicerade manuskript ^7.g1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Histologi tvärsnitt av den ovikta hippocampus. Kristall-violett fläck visar positionen av CA1-CA3 pyramidala cellskiktet inom de ovikta hippocampus en nivå av 250-300 um ovanför alveus därigenom lokalisera mikroelektrodema precis nedanför cellskiktet (se figur 3C). För att erhålla de sektioner färgade med kristallviolett, var vävnaden efterfixerades efter hippocampus var utfälld. Ovikt hippocampus placerades i PFA 4% O / N. Därefter ades vävnaden överförs och hålls i sackaroslösning (30%) för 48 h, och följt av snäpp frysning i en cyklist innehållande isopentan (2-metylbutan) för att kyla ned till -35 ° C i torris. Fryst avsnitt skars sedan i en kryostat med20 nm tjocka sektioner i tvärgående plan (som visas i figur 2) för att avslöja platsen för pyramidala cellskiktet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. ovikt hippocampus på PMEA. (A) Top bild av en ny PMEA med mikroelektroder belägna vid slutet av varje guldmetallspår. Insatsen på höger sida visar en enda mikroelektrod enligt elektronmikroskopi med en höjd på 200 nm och en diameter på 20 pm ^7,13. (B) Den mikroelektrod array limmas på en PGA-paketet med en plast inspelning kammare runt mikroelektrodema på ett glassubstrat. Insatsen till höger visar en ovikt hippocampus placeras på mikroelektrod array i mitten. (C) Till vänster visar optisk koherens tomografi (OCT) imaging ovikt vävnaden placerad ovanpå matrisen i en annan experiment. Till höger, två längsgående skiktbilder som erhållits från ULT avbildning till vänster visar mikroelektroden tips (vita prickar pekade med pilarna) når in i området precis under cellkroppen lagret. Klicka här för att se en större version av denna siffra .

Figur 4. Experimentell setup. (A) En plastkåpa lock med skruvar placeras över kretsarna för att skydda den mot möjlig vattenskador. Inspelningen kammaren har både in- och utloppsrören att bära vätskeflödet. En skräddarsydd vävnadsankare limmas med en nylonfibernät används för att säkra tissue under experimenten. (B) Bild tagen från botten av glassubstrat av PMEA visar vävnadsankare håller en provskiva under ett experiment. De böjda trådarna är nylonfibrerna från mask pressning på toppen av vävnaden. De runda prickar är grunderna för mikroelektrodema. Pilarna pekar på elektroder som skadats efter flera försök. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Rådata som registrerats av PMEA från en ovikt hippocampus. Vänster panel: 4-AP-inducerad epileptiform aktivitet registreras från en enda mikroelektrod Höger panel:. Inzoomad version av signalen markerade i tidsfönstret till vänster. (A) 10 sek sektion av ett exempel på den spontana aktiviteten iproduceras vid 100 pM 4-AP aCSF som erhållits för en av de mikroelektroder som ligger i den basala dendritiska regionen baserat på polariteten av signalerna med en SNR på 34,9 dB. (B) Rådata från en annan mikroelektrod belägen närmare somata med en SNR av 27,2 dB. (C) Exempel på registrering erhålls från en elektrod placeras inom den somatiska lagret. I detta exempel är SNR 18.53 dB. (D) Inspelning erhållen från en böjd elektrod fortfarande ledande men inte tränger in i vävnaden. Den böjda elektroden har en signifikant lägre SNR jämfört med de intakta elektroder (1,5 dB i detta exempel). (E) Baslinje buller spelats in från en mikroelektrod. Baslinjen har vanligtvis en topp till toppvärde 150-200 μV och impedansen av en enda elektrod är omkring 1 till 2 MQ. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6. Konvertering av neurala inspelningsdata i 2-D förökning kartor. (A) En 170 ms tidsfönster trunkerar en enda neural tillsatta i varje kanal ritas på fotot av PMEA. Den rådata filtreras av ett lågpassfilter på 100 HZ. Signalerna från de brutna elektrodinterpoleras med inspelningarna runt den. I det här exemplet, alla spikar är positiva. (B) En enda neural spik från röda pixel i (A) är normaliserad till färgfältet med en anpassad utvecklad metod för individuell normalisering (Se föregående publicering för mer information om normalisering ^7). (C) de färgkartor som skapats av den individuella normalisering visar att utbrednings rör sig över hela arean av den ovikta hippocampus vid olika tidpunkter.www.jove.com/files/ftp_upload/52601/52601fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Utvecklingen av den ovikta hippocampus förberedelser, där de längsgående och tvärgående axlar hippocampus bevaras i kombination med en genomträngande mikroelektrod array, ger ett kraftfullt verktyg för att undersöka vilka samband anatomi eller neural förökning i hippocampus ^7. Detta utspelas procedur gäller även för att studera hippocampus hos vuxna möss. Nyligen genomförda studier med detta preparat visade att 4-AP-inducerad epileptiform aktivitet skulle propagera med en diagonal vågfront över hela området av ovikta hippocampus (Figur 6) ^7,8. Dessa studier visade att den intakta ovikta hippocampus ger betydande fördelar jämfört med antingen tvär eller längsgående skivor när neurala utbredning i ett platt hippocampus neuralt nätverk kan undersökas (Figur 6).

Den penetrerande mikroelektrod ger en betydande fördel över befintliga microelectrode arrayer (MEA) som består av flera kontakter placerade över en plan yta ^11,12,17. MEA med platta ytelektroder är svåra att använda med den ovikta hippocampus sedan cellskiktet ligger omkring 250 till 300 pm bort från ytan (figur 2). Den PMEA beskrivs här var utformad för att lösa detta problem med 64-penetrerande elektroder lämpliga för att studera nerv utbredning med en höjd på 200 nm för att nå djupt inne i vävnaden ^7,13. Dessutom PMEA även tillämplig i alla plana vävnadspreparat, såsom kortikala skivor, hippocampus tvär skivor etc.

En annan fördel med att använda denna PMEA är den förbättrade SNR. En prototyp studie av detta PMEA visar SNR förhållandet mellan neurala signal registreras av denna PMEA har ett genomsnittligt värde av 19,4 ± 3 dB, vilket är betydligt högre och mer stabil jämfört med den för VSD inspelning eftersom tidigare studier visade att toxicitet ochfoto blekning av VSD nedsatt tydligt möjligheten att spela in data ^8. Med en förbättrad experimentellt protokoll med hjälp av vävnads ankare i denna studie, SNR av inspelningen från PMEA ökar till ett intervall från ca 20 till 30 dB (Figur 5), som har en högre SNR jämfört med de platta-elektrod arrayer med ett värde från 10 till 15 dB ^11,18. Förmågan att veckla hippocampus är väsentlig för få ett lager av nervceller (CA1-CA3) som kan förhöras av en platt inspelnings array.

Vidare, eftersom kisel arrayen är byggt på ett transparent substrat, spänningskänsligt färgämne avbildningsteknik kan integreras i PMEA systemet studerar fortplantning av neural aktivitet i hippocampus ^8. Transgena möss med fluorescerande spänningskänsliga indikatorer kan också användas för att undersöka ursprunget och förökning av signalen under fysiologiska betingelser, liksom förändringar som induceras av pharmacological agenter eller genetisk modifierade vävnad från olika djurmodeller ^9.

Det finns flera viktiga steg för att säkerställa högkvalitativ inspelning. För det första för att säkerställa vävnadsviabilitet, måste den kirurgiska proceduren ska utföras så snabbt som möjligt. Vanligtvis tar det ca 1 till 2 minuter att gå igenom alla steg från 2,1) till 2,10). Öva på den pågående procedur på några prov djur är mycket föreslås innan själva experimentell kirurgi utförs. För det andra, att de flödeshastighetsbehov hållas konstant för att undvika fluktuationer av nivån på organgenomströmningsfluiden i inspelningen kammaren. Vidare bör vävnaden förankras ner för att undvika förflyttning av vävnaden i förhållande till matrisen.

Även om PMEA beskrivs här kan ge användbara signaler i övervakningen neurala utbredning i ovikt hippocampus, det finns vissa nackdelar och begränsningar till denna inspelning metod.

För det förstaKan mikroelektrod bryta grund av den mekaniska kraft som ställs på dem (Figur 5D, E). Under förfarandet för vävnads placering och avlägsnande skulle oavsiktlig kontakt mellan den lilla pensel och array orsaka mikroelektroder för att böjas eller brytas. När vävnaden ankaret sänks ned av mikromanipulator, kunde den horisontella rörelsen av vävnaden längs bottnen av kammaren skapar en skjuvkraft som kan leda till böjning eller brott på elektroderna. I en framtida utformning bör microelectrodes omformas med en något tjockare bas för att göra dem starkare. I den nuvarande versionen av denna PMEA, inspelnings elektroder har en smal bas jämfört med dess diameter ^13, vilket försvagar elektrod (Figur 3A).

Rengöringsförfarandet bör också förbättras för att på lämpligt sätt ta bort den kvarvarande vävnad och fibrer som kan fästa på arrayen. Efter varje experiment, små bitarav vävnad kan sitta kvar på mikroelektroder och denna restvävnad kvar på elektrod måste tas bort. Om dessa rest vävnader inte tas bort, kan impedansen hos elektrod och SNR av inspelningarna påverkas. Spolning av systemet med destillerat vatten föreslås som anges i del 5 i protokollet sektionen. Användare uppmanas också att spola systemet med några svaga sur lösning som kan lösa upp vävnaden utan att skada systemet

En annan nackdel med detta protokoll är att under den pågående förfarandet, är det perforanta väg i denna ovikt hippocampus skära, förhindrar undersökning av eventuella neurala signaler som utbreder från GD till övriga skikten i hippocampus.

Sammanfattningsvis har vi beskrivit här en ny metod för att undersöka utbredningen av neural aktivitet inom hippocampus genom att kombinera en högt sidförhållande mikroelektrod array med ovikt hippocampus Tissue. Metoden gjorde leda till en bättre förståelse för hur nervaktivitet kan fortplanta sig i både längs- och tvärgående riktningar. Denna teknik kan även tillämpas på kortikal vävnad placerades på liknande sätt ovanpå matrisen. Dessutom kombinerar optisk inspelningsteknik med detta preparat är möjligt eftersom matrisen är transparent och kan också leda till några viktiga iakttagelser om signalutbredning i nervvävnad.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
desiccator jar	LABRECYCLERS Inc.	5410	Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use.
A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus	N/A	N/A	A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it.
Custom made tissue recovery chamber	N/A	N/A	Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF.
Straight Operating Scissors	Fisher Scientific	S17336B                                            Medco Instruments No.:81995	This scissors is used to   decapitate the mice.
Integra Miltex Goldman-Fox Scissors	Fisher Scientific	12-460-517                        MILTEX INC                           No.:5-SC-320	This scissors is used to cut the skull of the mice.
Miltex Hysterectomy Forceps	Claflin Medical equipment	CESS-722033-00001	This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain
Micro Spatula	Cardinal Health		This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber.
Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula	Cardinal Health		this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber.
small paint brush	Lowe's	tem #: 105657                  Model #: 90219	The one with the smallest size in a normal paint brush package
Fire polished glass help tool	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass needle	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass tool with a metal wire loop	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop.
Custom made glass solution dropper	N/A	N/A	This tool was  made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end.
Custom made tissue anchor	N/A	N/A	Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator.
Custom fabricated microelectrode array	N/A	N/A	More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011.
Custom made filter and amplifiers circuits for the array	N/A	N/A	More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011.
Data acquisition processor 3400a	Microstar Laboratories	N/A	This is a complete data acquisition system with A/D converter.