Abstract
Биопленки поверхностно-прикреплен микробные сообщества, которые имеют сложные структуры и производят значительные пространственные неоднородности. Развитие биопленки активно регулируется окружающей потока и питательной среды. Рост биопленки и повышает неоднородность локального окружения путем генерации сложных полей потока растворенного вещества и транспортным системам. Для исследования развития неоднородности в биопленки и взаимодействия между биопленок и их местных микро-среде обитания, мы выросли моно-видовые биопленки синегнойной палочки и двойного видов биопленки в Р. палочки и кишечной палочки под пищевых градиентов в микрофлюидном ячейку. Мы предоставляем подробные протоколы для создания питательных градиенты в ячейкой, и для выращивания и визуализации развитие биопленки в этих условиях. Мы также представляем протоколы для серии оптических методов количественного пространственных структур в составе биопленки, DISTRI потокаменным биопленок и массового транспорта вокруг и внутри биопленки колонии. Эти методы поддерживают комплексные исследования совместного развития биопленки и среды обитания неоднородности.
Introduction
Микроорганизмы придают поверхности и образуют биопленки - клеточных агрегатов, заключенных в внеклеточного полимерной матрице 1. Биопленки ведут себя очень по-разному от отдельных микробных клеток, потому что биопленки иметь драматические пространственной неоднородности в результате сочетания внутренних ограничений растворенного транспорта и пространственных вариаций в клеточном метаболизме 2,3. Концентрации кислорода и питательных веществ резко уменьшается на границе раздела между биопленки и окружающей жидкости и получить дополнительно обедненного пределах в биопленки 2. Пространственные вариации биопленки дыхания и синтеза белка может происходить в ответ на локализованном кислорода и питательных веществ наличии 2.
В водных и почвенных условиях, большинство бактерий обитает в биопленки. Природные биопленки выполняют важные биохимические процессы, включая велосипедные углерод и азот и снижения металлы 4,5. Клинически, формирование биопленки RESPONSмых для длительного легочной и мочевой инфекции 6. Биопленки-ассоциированной инфекции весьма проблематичным, так как клетки в биопленки имеют чрезвычайно высокую устойчивость к противомикробных препаратов по сравнению с их аналогами планктонных 6. Потому что биопленки играют важную роль в различных условиях, значительное количество исследований было сосредоточено на изучении экологических факторов, которые контролируют биопленки деятельности, а также неоднородность в биопленки и окружающей микросреды.
Предыдущие исследования показали, что развитие биопленки сильно регулируется рядом факторов окружающей среды: биопленки развития различных морфологии в различных условиях потока; кислорода и усвояемость питательных веществ влияние биопленки морфология; и напряжение сдвига гидродинамических влияет на прикрепление планктонных клеток к поверхности и отряду из клеток из биопленок 7-9. Кроме того, внешнее состояние потока влияет на доставку субстратов Intо и в биопленки 10. Рост биопленки также изменяет окружающий физические и химические условия. Например, рост биопленки приводит к локальной истощение кислорода и питательных веществ 2; биопленки накапливаются неорганических и органических соединений из окружающей среды 11; и биопленки кластеры отвлечь потока и увеличение поверхности трения 12,13. Потому что биопленки взаимодействовать с их окружающей средой, в очень сложных отношениях, очень важно, чтобы одновременно получить информацию о свойствах биопленки и условий окружающей среды, и междисциплинарные подходы, должны быть использованы, чтобы всесторонне характеризуют биопленки и окружающей средой.
Здесь мы представляем серию комплексных методов для характеристики пространственных структур в микробного роста в моно-видов и биопленки двойного видов, находящихся под навязанной градиента питания, и наблюдать за результатом изменения местного химического и микросреды жидкости. Мы ельул описывают использование недавно разработанной двойного всасывания клетки Микрожидкостных потока наблюдать рост биопленки под четко определенные химические градиенты. Затем мы продемонстрировать использование этого микрожидкостных проточной ячейке, чтобы наблюдать рост двух видов бактерий, синегнойной палочки и кишечной палочки, в биопленки при различных условиях питания. Покажем, как в месте визуализации флуоресцентного распространения примеси в биопленки колонии могут быть использованы для количественной оценки моделей растворенного транспорта в биопленки. Наконец, мы покажем, как микромасштабная отслеживания частиц велосиметрия, проводится под конфокальной микроскопии, могут быть использованы для получения локальным полем потока вокруг растущих биопленок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Технологическая схема установки сотовый и Прививка
ПРИМЕЧАНИЕ:. Используйте микрофлюидальный Cell Double-потока на входе, описанную в песне и др, 2014 14 расти биопленки. Эта ячейка поток способен создавать четкие ровные химические градиенты. Конструкция клетки потока показан на рисунке 1 и поток изготовление клеток было описано ранее в песни и др., 2014 14. Здесь мы подробно наши методы с использованием P. палочки и Е. палочка с образованием биопленок, но и другие виды могут быть пригодны также. Мы использовали P. палочки PAO1- GFP, который конструктивно выражает зеленый флуоресцентный белок (GFP), как модельный организм для развития биопленки. Кроме того, мы использовали E. палочка DH5 & сформировать биопленку смешанного вида с P. палочки. П. палочки и Е. Штаммы кишечной палочки были выращены на LB чашках с агаром.
- Подготовьте, используя полидиметилсилоксана проточной ячейки (PDMS), связанного сстекло покровное с помощью кислородной терапии плазмы, как описано в 14. Размеры проточной ячейки камеры на 23 мм × 13 мм × 0,24 мм (длина × ширина × глубина).
- Подготовка изменены ФАБ питательную среду 15. Для наблюдения роста биопленки под питательной градиента в проточную ячейку, вводят модифицированные FAB среднего 15 с 0,6 мкМ глюкозы в одно впускное отверстие и ввести FAB среды без какого-либо источника углерода через другое входное отверстие. Фильтр-стерилизовать (размер пор = 0,2 мкм) глюкозы раствор (60 мм), прежде чем добавлять его в среде FAB. Также в автоклаве среды FAB с циклом 1 (жидкость, 15 мин; 121 ° С, 17 фунтов на квадратный дюйм) перед использованием.
- Стерилизовать систему потока. До прививки, автоклав путь всего потока (средний бутылки, трубы, пузырь ловушки, проточные ячейки) с помощью цикла 1, для пластиковых трехходовых клапанов (одноразовые и предварительно стерилизованные), расположенных выше по течению проточной ячейки, кроме. (Три-Ways клапаны используются для нагнетания ячейки Сulture, флуоресцентный трейсер и микросферы). Чтобы избежать загрязнения во время сборки, охватывают все трубы и соединительные отверстия с алюминиевой фольгой или автоклаве мешки перед автоклавированием.
- Подключите систему потока. Тщательно Собирают компоненты системы проточной ячейки (см видео для сборки системы потока) и обеспечивают питательную среду в камеру потока с помощью перистальтического насоса, который точно регулирует расход.
- Подготовка культуре клеток для прививки путем передачи колонию P. палочки или E. палочка из LB пластин 3 мл LB бульоне и встряхните культура O / N на 225 оборотов в минуту и 37 ° C. Развести O / N клеточных культур в 1 мл стерилизованной воды до конечного OD 600 = 0,01 в качестве посевного материала. (Культура и разбавить бактерии в капюшоне ламинарного потока, чтобы избежать загрязнения.)
- Для экспериментов с биопленки смешанного вида, разбавить две бактериальные культуры в соотношении 1: 1 в 1 мл с эквивалентным OD 600 = 0,01 для каждой бактерии.
- Посев в проточную кювету. Подайте 1 мл инокулята на входе проточной ячейки из трех-ходовым клапаном. После инъекции приостановить поток в течение 1 часа, чтобы позволить бактериальные клетки прикрепляются к защитным стеклом. (Убедитесь, что проточная ячейка находится с покровного стороной вниз, чтобы позволить подвесные клетки оседают на покровное.)
- После 1 часа, возобновить поток и насос ростовой среды к проточной кювете при постоянной скорости 0,03 мл / мин в течение каждого входе в течение 3 дней.
2. Характеризуя биопленки развития в ответ на пищевые градиентов с помощью конфокальной микроскопии
ПРИМЕЧАНИЕ: P. палочки могут быть отображены с конструктивно выраженной GFP, но E. палочка в биопленки смешанного вида должны быть отображены на counterstaining.
- Соблюдайте 3-дневные биопленки с помощью конфокальной микроскопии. По мнению представителя результатов следуйте биопленки с помощью конфокальной микроскопии с целью 63X. До визуализации, знакCell Double-входной поток с сеткой на обложке стороне стекла. (Цель этой сетки, чтобы позволить экспериментатор, чтобы найти области, изображений в мобильный блок камеры.)
- Для контрастное, разбавленных 10 мкл красного флуоресцентного красителя клетки проникающий нуклеиновой кислоты, такие как зеленого флуоресцентного красителя нуклеиновых кислот, таких как STYO 62, раствор (1 мМ) в 990 мкл стерилизованной воды, а затем медленно вводить разбавленную пятно с помощью шприца в проточной ячейки камеры от входного трехходового клапана. Держите измерительную ячейку на прежнем уровне и в темноте в течение 30 мин, а затем возобновить поток, чтобы смыть несвязанного пятно в течение 15 мин.
- Выполните конфокальной микроскопии. Активируйте 488 нм аргонового лазера для возбуждения и эмиссии коллекторах для GFP (500-535 нм) и пятно нуклеиновой кислоты (для зеленого флуоресцентного красителя нуклеиновых кислот, 650-750 нм). Отрегулируйте прибыли и коррекции для обоих каналов имеют яркие и чистые изображения. Выберите XYZ и режим одновременного отображения. Используйте ручку г-управления для идентифы низ и верх биопленки в этой области. Установите Z-шаг до 0,5 мкм для получения стека изображений 3-D. (Чтобы обеспечить высокое качество изображения, используйте средней линии четыре для получения изображений.)
- Для отображения пространственных моделей развития биопленки в клетке потока, графические биопленки в три или более продольных (х) расстояния вдоль входе проточной ячейки, и в три поперечных (у) положение относительно наложенного градиента питания, как показано на рисунке 1 ,
3. Характеризуя Внутренняя растворенного вещества Транспорт инъекций Консервативной люминесцентных Tracer
Примечание: консервативная флуоресцентные Tracer, такие как Cy5, могут быть использованы для характеристики растворенного транспортным системам в биопленки.
- Растворить Cy5 (Mono-реактивный NHS сложный эфир) в воде до конечной концентрации 10 мг / мл в качестве основного раствора. Храните Cy5 маточного раствора в -20 ° C морозильнике.
ПРИМЕЧАНИЕ: В Cy5 свет-SENSITIve, магазин, развести и вводить решения Cy5 в темноте. - До инъекции флуоресцентного индикатора, возьмите изображения стек 3-D в 3-дневный биопленки с конфокальной микроскопии (с целью 63X). (Широкие области биопленки колонии идеально подходят для временных рядов наблюдений транспорта красителя). Также надо выбрать плоскость г с хорошо разделенными колоний для визуализации (как показано на рисунке 5А).
- Для каждого эксперимента инъекции Cy5, разбавленные 2 мкл Cy5 маточного раствора в 998 мкл стерилизованной воды с получением инъекционного раствора, имеющего концентрацию Cy5 20 мкг / мл.
- Остановите насос, чтобы приостановить поток и придать решение Cy5 в верховьях проточной ячейки, используя шприц с помощью 3-ходового клапана. (Важно, чтобы предотвратить пузырьки воздуха от входа в канал потока во время инъекции. Bubble ловушки должны быть открыты в течение задней инъекции.)
- После введения раствора Cy5, закройте ловушки пузырь, отрегулируйте 3-ходовой клапан и перезагрузитенасос для доставки введенного раствора Cy5 в проточную кювету.
- Переключатель конфокальной режим отображения, чтобы XYT. Активируйте Cy5 и GFP каналов в режиме одновременного отображения. Настройка параметров конфокальной на Cy5 интенсивности (интенсивность лазерного излучения, усиления и смещения), чтобы избежать насыщения сигналов, что особенно важно для количественного определения. (Высоким временным разрешением является предпочтительным для визуализации проникновения красителя. Тем не менее, быстрое сканирование снижает качество изображения.) Выбрать правильную скорость сканирования и линии среднего, чтобы сбалансировать временное разрешение изображения и качество изображения. Для этого протокола использовать средней линии четырех и частоту кадров 0,15 Гц.
- Резюме потока для доставки Су5 в проточную кювету (все еще при скорости потока 0,03 мл / мин). Одновременно начать конфокальной микроскопии временных рядов.
- Количественная проникновение Cy5 радиально среднем интенсивность Cy5 в 2-D круговой колонии биопленки. Для усреднения, сначала определить край биопленки кластера, а затем генерировать на карте расстояния для 2-D части кластера вИ, наконец, средние радиальные модели интенсивности Cy5, чтобы сформировать кривую проникновения (рисунок 6).
- Для вычислений понять, шаг 3,8, используйте BioSPA (биопленки пространственного анализа Pattern) пакет программного обеспечения (неопубликованные, пакет программного обеспечения и руководство по запросу) или другие программы анализа изображений.
- Чтобы использовать BioSPA, сначала импортировать изображение, установленное в BioSPA. Затем выберите правильный порог для GFP и Cy5 каналов, чтобы бинарных изображений. В меню Анализ / Расчет, выберите Advanced анализ, а затем Diffusion анализ. Используйте GFP-канал для определения край кластера и использовать инструмент многоугольник, чтобы выбрать один кластер как области интереса (ROI).
- Дважды щелкните по выбранному биопленки кластер для выполнения анализа диффузии. Сохранение результатов анализа диффузии и калибровки интенсивности Cy5 концентрации Cy5 с использованием калибровочной кривой.
- Для создания Cy5 калибровки концентрация кривой, измерять интенсивность Cy5 над Conce Cy5ntration градиент под конфокальной микроскопии. (Cy5 интенсивность и концентрация в линейной зависимости).
4. Характеризуя окружающий поля течения, отслеживая флуоресцентный частиц
Примечание: Флуоресцентные частицы, такие как флуоресцентные микрошарики, может быть использован, чтобы характеризовать поле потока вокруг биопленки. Поле обтекание биопленок может быть рассчитана из временных рядов наблюдений позиций частиц с использованием отслеживания скорости на частицы программное обеспечение. Результаты, показанные здесь, были получены с потоками 2,02 программный пакет 16 (программное обеспечение для скачивания и гид пользователя в http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ).
- Развести флуоресцентные микрошарики (диаметр ~ 1 мкм) в стерилизованной воде до конечной концентрации твердого вещества 0,2% и в конечном объеме 0,5 мл. Vortex, чтобы убедиться, что микросферыхорошо разошлись.
- Вводят и доставить разбавленные флуоресцентные микрошарики в проточную кювету в соответствии с процедурами из шагов 3,3 до 3,5. Чтобы разрешить точное отслеживание траектории частицы, используют частоту относительно низкого расхода (0,01 мл / ч для отслеживания результатов частиц в этой статье).
- Переключатель конфокальной настройки для режима XYT для отслеживания движения частиц в одном Z-среза и получать изображения временных рядов. (Частота кадров 1 Гц была использована для представительных результатов, показанных в этой статье.) Повторная инъекция частиц и изображение в разных местах г, чтобы создать поле потока 3-D.
- Предварительная обработка временных рядов конфокальной изображения путем вычитания фоновой флуоресценции сигнал (сигнал в первом полученного изображения множества изображений) с помощью ImageJ (скачать программное обеспечение и руководство доступно на http://imagej.nih.gov/ij/ ) или других программ.
- В ImageJ, открыть первый образ множества изображений, а затем импортировать набор изображений. Под процессом / Image Calculator, вычесть первое изображение из набора изображений. Сохраните предварительно обработанных набор изображений.
- Для расчета векторов потока, импорт временных рядов конфокальной изображения в потоках 2,02. В разделе "Open View процесса", выбрать и выполнить "Определить частицы". Используйте соответствующую порог для идентификации частиц. Используйте 0,5 и 5 мкм, как минимальный и максимальный диаметр порогов 1 мкм частиц.
- Тогда в "Open View процесса", выбрать и выполнить "PTV анализа трубопровода" Чтобы создать траекторий частиц. Проверьте траекторий частиц, чтобы увидеть, если они представляют движение частиц. Наконец, выбрать и выполнить "Создать поле скоростей", чтобы создать вектор потока карту.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микрожидкостных клеток дважды на входе потока позволяет наблюдать роста биопленки под четко определенной химической градиента, образованного путем смешивания двух растворов в проточную камеру. В результате химического градиента была ранее наблюдались инъекции красителя и характеризуются подробно Песни и др. 14. Гладкие градиенты концентрации были сформированы в поперечном направлении, как показано на рисунке 1. Профиль концентрации был крутой вблизи входа и получил расслабился вниз по течению за счет диффузии (рис 1). Для наблюдения развитие биопленки под градиентом питательной мы использовали определенную минимальную питательную среду (FAB среды) с глюкозой добавлен только один вход в качестве единственного источника углерода. Это дало градиент глюкозы в клетки поток камере, а все другие питательные вещества были равномерно распределены. Рост P. палочки PAO1 биопленки сильно коррелирует с локальной доставки глюкозы (рис 2).Как поперечная концентрация глюкозы градиент был крутой вблизи входа, биомасса биопленки показали резкое снижение с области высоких глюкозы в область низких глюкозы. Как поперечного градиента глюкозы расслабленной вниз по течению, биомасса биопленки стал более однородным. Кроме того, мы продемонстрировали использование этого потока клетки для изучения взаимодействия P. палочки и Е. палочка в биопленки под градиентом глюкозы (рис 3). Результаты показали, что эти два вида показали различные пространственные структуры в росте по сравнению с градиентом питательной, и, следовательно, занимают различные экологические ниши: П. палочки преобладают биопленки биомассы в регионах с высокой концентрацией глюкозы и Е. палочки преобладают в регионах с низкими концентрациями глюкозы (рисунок 3).
Чтобы понять обратную связь между ростом биопленки и окружающей среды потока, мы охарактеризовали поле течения вокруг растет биофильмы флуоресцентного отслеживания частиц велосиметрии под конфокальной микроскопии. Наблюдается движение вводимых флуоресцентных микросфер показана на фильм 1. Местная информация вектор потока экстрагировали в среднем, по крайней мере, 4200 дискретных измерений скоростей частиц с помощью программного пакета потоков. Трехмерная картография поля течения был получен путем отслеживания частиц в нескольких вертикальных положениях (рисунок 4). Рост биопленки значительно увеличенный расход неоднородность (рисунок 4). Расход около биопленки базы отводится около биопленки кластеров, что приводит к увеличению неоднородности и снижение скорости (рисунок 4). Расход на биопленки верхней имеет более высокую скорость и более однородна (рис 4).
Чтобы понять внутреннюю неоднородность, вызванную ограниченной растворенного транспорта в биопленки, мы наблюдали транспорт Cy5 в пределах биопленки с помощью конфокальной микроскопии. Проникновение Временные рядыиз Cy5 в биопленки кластера показано на Фильм 2. Временные ряды кривые проникновения Cy5 показано в кино 3. эффективного коэффициента диффузии Cy5 в биопленок рассчитывается путем установки 1-D диффузионная модель для профилей концентрации Cy5:
где С радиально-усредненной концентрации Су5 рассчитывается по интенсивности флуоресценции, и это расстояние в биопленки 17. Cy5 показали высокую концентрацию в объеме потока и снижение круто при входе в биопленку (рисунок 5).
Рисунок 1. Дважды входе микрофлюидальный проточную ячейку. Гладкие градиенты глюкозы были созданы в проточную камеру, вводя FAB среды в двух впускных отверстий с источником углерода (глюко SE) предоставляется только в одном входе. В результате образцы глюкозы в клетке потока обозначены штриховкой. Темный затенение представляет более высокие концентрации глюкозы в крови. Конфокальной изображения был выполнен в девяти точках в проточную кювету. Результаты, представленные на фиг.2 и 3 относятся к местам пронумерованы 1-9 на рисунке. Эта цифра изменяется после песни и др. (2014), рис. 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. PAO1 рост биопленки условиях градиента глюкозы. 3-дневные PAO1 биопленки были обследованы на 9 местах, показанных на рисунке 1. Шаг сетки = 18 мкм для имиджа 1-8 и 24 мкм для имиджа 9.г "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Развитие P. палочки и Е. палочки двойного видов биопленки условиях градиента глюкозы. P. палочки конститутивно выражает GFP, и биопленки также контрастно по SYTO 62, который является общим пятно нуклеиновой кислоты. Изображения, показанные здесь накладки GFP (зеленый) и SYTO 62 (красный) каналы. П. поэтому палочки появляется зеленый или желтый (зеленый + красный) и E. палочки появляется красная. Масштабные полоски = 47 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. Поток вектора скорости поля при г = 4, 10 и 16 мкм вокруг биопленки кластера. Длина стрелки представляет величину скорости. Низкая скорость потока показан на биопленки базы (Z = 4, синие стрелки). Поток является более гомогенным рядом биопленки верхней (Z = 16, красные стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5. Cy5 проникновение в биопленки. () Конфокальной микрофотография с Z = 18 мкм, показывая частичное проникновение Cy5 в биопленки кластеров при Т = 190 сек. Масштабные полоски = 10 мкм. (B) В результате модели Cy5 концентрации карте. (C) Cy5 профиль концентрации в одном биопленки кластера. 602fig5large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6. Процедуры создания профиля проникновения Cy5 Слева:. Выбранный ROI, содержащий 2-D биопленки кластера. Средний: Показать на карте расстояния от биопленки кластера. Справа: радиально-среднем профиль Cy5 интенсивность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.
Фильм 1 : Motion инжектированных люминесцентных частиц вокруг биопленки кластеров (конфокальной видео).
Фильм 2 : Распространение Cy5 в биопленки кластеров (конфокальной видео).
_content "> Фильм 3 : Распространение Cy5 в биопленки кластеров (концентрационные профили видео).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы показали, набор методов, чтобы охарактеризовать три важных взаимодействий биопленки среды: биопленки ответ на химических градиентов, эффекты роста биопленки на окружающую микросреду потока, и биопленки неоднородности в результате ограничений внутреннего транспорта.
Мы впервые показали использование новых клеточных Микрожидкостных потока навязать четко определенный химический градиент для развития биопленки. Для создания четко определенный химический градиент в проточной кювете, важно поддерживать ту же самую скорость потока для обоих входных отверстий. Убедитесь, что перистальтический насос хорошо приспособлены для обоих каналов потока для доставки вырастите среду с той же скоростью. Также убедитесь, что нет засорения на пути потока во время роста биопленки. Наблюдения за ростом биопленки двойного видов в этом шоу Проточная ячейка том, что химические градиенты в значительной степени пострадали рост биопленки и взаимодействия между видами в пределах биопленки. Химические градиенты являются общими всреда, в которой биопленки расти, благодаря сочетанию транспортных ограничений, химическое связывание и реакции, и микробного поглощения и метаболизма 18-20. Это Микрожидкостных проточная ячейка позволяет исследования различных видов деятельности биопленки под определенного диапазона химических условий в одном устройстве. Например, этот поток клеток была продемонстрирована, чтобы быть полезным для изучения биопленки убийства под антимикробного градиентом 14.
Затем мы продемонстрировали использование отслеживания частиц велосиметрии наблюдать поле потока вокруг биопленки кластеров. Для обеспечения точного отслеживания вводимых флуоресцентных частиц, скорость потока должна быть оптимизирована. Как правило, низкого расхода позволяет движение частиц, которые будут захвачены в конфокальной поле зрения. Также частота кадров сканирования должен быть оптимизирован, чтобы сбалансировать качество изображения и разрешение по времени. Если частицы движутся слишком быстро для захвата движения, использовать нижний строки или кадра среднем или растет в ценеазы скорость сканирования. Мы нанесли на карту поля течения в трех вертикальных положениях над биопленки кластера, и обнаружили, что рост биопленки увеличилось неоднородность потока. Характеризуя поле потока вокруг биопленок позволяет ключевым потока биопленки взаимодействия следует изучить. Например, это может быть использовано для оценки механизмов, регулирующих сопротивление жидкости и сдвига по биопленки, и в результате недостаточности биопленки и отделение клеток от поверхности 1,21. Эти процессы имеют важное значение для понимания как последствий биопленок на проточных системах (например, биообрастание) и регулирования биопленки морфологии 8. Условия обтекания биопленок также управлять массоперенос, что очень важно для широкого круга биопленки процессов. Например, локальная скорость жидкости на поверхности биопленки влияет на доставку питательных веществ и субстратов на основе биопленки адвекцией 22.
Наконец, мы показали использование инъекционного люминесцентные индикаторов для анализарастворенного транспортные структуры внутри биопленки. Мы использовали Су5 здесь в качестве консервативной примеси, и это плавиковый по-видимому, часто ведут себя консервативно в биопленки 23. Поэтому результаты должны быть репрезентативными для транспортных моделей нереакционноспособных, нейтральных растворах в биопленки. Результаты показали резкое снижение концентрации Cy5 вблизи поверхности биопленки, получая концентрацию Cy5 в интерьере биопленки только ~ 50% от концентрации в потоке сыпучих. Такие крутые концентрационные профили согласуются с ранее описанными измерений кислорода, питательных веществ и противомикробных препаратов в рамках биопленок 2,24. Кривые проникновения Cy5 предоставить информацию о растворенном диффузии в биопленки кластеров. Тем не менее, метод, который мы приводим здесь ограничивается анализа 2-D растворенного транспорта в горизонтальном (XY) плоскостей в биопленки. С новой возможностью быстрого изображения, например вращающийся диск конфокальной микроскопии, проникновение красителя может также быть визуализированы в 3-D в пределах биопленки, бееч позволит расследование по вертикали транспортных процессов. Кроме того, флуоресцентный Tracer и частицы могут быть введены вместе, чтобы получить информацию из внешних условий потока и внутренней растворенного транспорта одновременно. Такая информация является полезной для дифференциации адвективный и диффузионного растворенного перевозок между объемного потока и биопленок и оценить влияние внешнего потока на внутренней растворенного транспорта в биопленки.
В целом, мы приводим подробные протоколы с использованием нового микрожидкостных проточную кювету, что обеспечивает четко определенный химические градиенты для изучения биопленки ответов на химические сигналы в окружающей среде. Чтобы лучше характеризуют неоднородность в биопленки и окружающей их микросреды, мы приведем здесь методы характеристики моделей как в поле течения окружающей биопленки и внутренней растворенного транспорт в биопленки. Каждый метод обеспечивает отличительную информацию о свойствах биопленки и / или условий окружающей среды. Поскольку эти методыинтегрированы, несколько аспектов информации может быть получено одновременно. В сочетании информация позволяет исследователям приблизиться к более сложные задачи. Например, с помощью этих методов, мы успешно проанализированы развитие биопленки и межвидовые взаимодействия в биопленки под питательных веществ градиента. Эти методы также обеспечить экспериментальную возможность увеличить сложность в микробного сообщества и химической среды, которая позволяет исследования по биопленки процессов в более реалистичном контексте. Потенциальные области применения этих методов включают в себя различные аспекты биопленки исследований, в том числе биопленки жизненного цикла, многовидовых биопленок, биопленки неоднородности, транспортных процессов в биопленки и биопленки потока взаимодействия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим Мэтт Парсек в университете Вашингтона (Сиэтл, Вашингтон) для обеспечения P. палочки и Е. штаммы кишечной палочки и Роджер Нокс из Университета Кентербери (Новая Зеландия) для обеспечения доступа к потокам программного обеспечения. Эта работа была поддержана грантом R01AI081983 из Национальных институтов здравоохранения, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний. Конфокальной изображения была выполнена в Северо-Западном Биологическая изображениями фонда (БИФ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| Pump Tubing 0.50 mm OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1 L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 ml TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters - sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, Suppl 1. 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
