طرق للتميز الرئيسين تطوير بيوفيلم والموئل التجانس
Summary
Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.
Abstract
الأغشية الحيوية هي المجتمعات الميكروبية المرفقة السطحية التي لديها هياكل معقدة وإنتاج التغاير المكانية كبيرة. وينظم تطوير بيوفيلم بقوة تدفق المحيطة والبيئة الغذائية. يزيد نمو بيوفيلم أيضا عدم تجانس المكروية المحلية عن طريق توليد حقول تدفق المعقدة وأنماط النقل المذاب. للتحقيق في وضع من عدم التجانس في الأغشية الحيوية والتفاعلات بين الأغشية الحيوية والخاصة المحلية الصغيرة الموائل، ونحن نمت الأغشية الحيوية أحادية أنواع الزائفة الزنجارية والأغشية الحيوية ثنائي الأنواع من P. الزنجارية والقولونية تحت التدرجات الغذائية في خلية تدفق الموائع الدقيقة. ونحن نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لإنشاء التدرجات المواد الغذائية داخل الخلية وتدفق لزراعة وتصور تنمية بيوفيلم في ظل هذه الظروف. نحن أيضا بروتوكولات الحالية لسلسلة من وسائل بصرية لقياس الأنماط المكانية في هيكل بيوفيلم، وتدفق زعتهbutions على الأغشية الحيوية، والنقل الجماعي حول وداخل المستعمرات بيوفيلم. هذه الأساليب تدعم تحقيقات شاملة للشارك في تطوير بيوفيلم والسكن التجانس.
Introduction
الكائنات الحية الدقيقة نعلق على الأسطح والأغشية الحيوية شكل – المجاميع الخلية المغلقة في مصفوفة خارج الخلية البوليمر 1. الأغشية الحيوية تتصرف بشكل مختلف جدا من الخلايا الميكروبية الفردية، لأن الأغشية الحيوية لها التنوع المكاني الدرامي الناتجة عن مزيج من القيود النقل المذاب الداخلية والاختلافات المكانية في الأيض الخلوي 2،3. تركيزات الأكسجين والمواد الغذائية انخفاضا كبيرا في واجهة بين بيوفيلم والمحيطة السائل والحصول على مزيد من ضمن المنضب في بيوفيلم 2. يمكن أن تحدث أيضا تغيرات المكانية في التنفس بيوفيلم وتخليق البروتين كرد فعل على الأكسجين المحلية وتوافر المواد الغذائية 2.
في البيئات المائية والتربة، ومعظم البكتيريا يسكن في الأغشية الحيوية. الأغشية الحيوية الطبيعية تنفذ العمليات البيولوجية الكيميائية الهامة بما في ذلك ركوب الدراجات الكربون والنيتروجين والحد من المعادن 4،5. سريريا، وتشكيل بيوفيلم هو رد والمرئي لفترة طويلة الرئوية والتهابات المسالك البولية 6. العدوى المرتبطة بيوفيلم هي مشكلة كبيرة لأن الخلايا في الأغشية الحيوية لها مقاومة عالية للغاية لمضادات الميكروبات مقارنة مع نظرائهم العوالق 6. لأن الأغشية الحيوية مهمة في إعدادات متنوعة، وقد تركز قدر كبير من البحوث على فهم العوامل البيئية التي تتحكم في أنشطة بيوفيلم وعدم التجانس المكاني في الأغشية الحيوية والمكروية المحيطة بها.
وقد وجدت دراسات سابقة أن التنمية بيوفيلم وينظم بقوة من قبل عدد من العوامل البيئية: الأغشية الحيوية تتطور الأشكال التضاريسية مختلفة تحت ظروف تدفق مختلف. الأكسجين والمغذيات توافر تأثير التشكل بيوفيلم. وإجهاد القص الهيدروديناميكية يؤثر المرفق من خلايا العوالق على الأسطح ومفرزة من الخلايا من الأغشية الحيوية 7-9. وعلاوة على ذلك، حالة التدفق الخارجي يؤثر على تسليم ركائز كثافة العملياتس وداخل الأغشية الحيوية 10. نمو الأغشية الحيوية يغير أيضا الظروف المحيطة الفيزيائية والكيميائية. على سبيل المثال، يؤدي نمو بيوفيلم في استنفاد المحلي من الأوكسجين والمواد المغذية 2. الأغشية الحيوية تتراكم المركبات العضوية وغير العضوية من البيئة المحيطة 11؛ ومجموعات بيوفيلم تحويل تدفق وزيادة سطح الاحتكاك 12،13. لأن الأغشية الحيوية تتفاعل مع بيئتها المحيطة بطرق معقدة جدا، فمن الأهمية بمكان الحصول على المعلومات في وقت واحد على خصائص بيوفيلم والظروف البيئية، ونهج متعدد التخصصات في حاجة لاستخدامها لتوصيف شامل التفاعلات بيوفيلم للبيئة.
هنا نقدم سلسلة من أساليب متكاملة لتوصيف الأنماط المكانية في النمو الميكروبي داخل الأنواع أحادية والأغشية الحيوية ثنائي الأنواع تحت التدرج الغذائية المفروضة، ومراقبة التعديل الناتجة من هذه المادة الكيميائية المحلية والمكروية السوائل. نحن التنوبالحادي ووصف استخدام خلية تدفق ميكروفلويديك مزدوجة مدخل وضعت مؤخرا لمراقبة نمو بيوفيلم تحت التدرجات الكيميائية واضحة المعالم. نحن ثم شرح استخدام هذه الخلية تدفق الموائع الدقيقة لمراقبة نمو نوعين من البكتيريا، الزائفة الزنجارية والقولونية، في الأغشية الحيوية في ظل مجموعة من الظروف الغذائية. وتبين لنا كيف التصور الموقع من نشر التتبع الفلورسنت في المستعمرات بيوفيلم في يمكن استخدامها لتقييم كمي لأنماط النقل المذاب في الأغشية الحيوية. وأخيرا، وتبين لنا كيف الميكروسكيل velocimetry تتبع الجسيمات، وتتم تحت المجهر متحد البؤر، ويمكن استخدامها للحصول على مجال تدفق المحلي حول الأغشية الحيوية المتنامية.
Protocol
Representative Results
Discussion
أثبتنا مجموعة من الطرق لتوصيف الثلاثة المهمة التفاعلات بيوفيلم للبيئة: استجابة بيوفيلم إلى التدرجات الكيميائية، وآثار نمو بيوفيلم على المكروية تدفق المحيطة بها، وعدم التجانس بيوفيلم الناجمة عن القيود النقل الداخلي.
أظهرنا لأو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مات Parsek في جامعة واشنطن (سياتل، WA) لتوفير P. الزنجارية وE. سلالات القولونية وروجر Nokes في جامعة كانتربري (نيوزيلندا) لتوفير الوصول إلى تيارات البرمجيات. وأيد هذا العمل من قبل R01AI081983 منحة من المعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية. تم إجراء التصوير متحد البؤر في مرفق نورث وسترن التصوير البيولوجية (BIF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 mL TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters- sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
