Metoder til karakterisering af fælles udvikling af Biofilm og nye levesteder
Summary
Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.
Abstract
Biofilm er overfladeaktive vedhæftet mikrobielle samfund, der har komplekse strukturer og skabe betydelige rumlige heterogeniteter. Biofilm udvikling er stærkt reguleret af det omgivende flow og ernæringsmæssige miljø. Biofilm vækst øger også heterogenitet af den lokale mikromiljø ved at generere komplekse flow felter og stoftransport mønstre. For at undersøge udviklingen af heterogenitet i biofilm og interaktioner mellem biofilm og deres lokale mikro-levesteder, vi voksede mono-arter biofilm af Pseudomonas aeruginosa og dual-arter biofilm af P. aeruginosa og Escherichia coli under ernæringsmæssige gradienter i en mikrofluid strømningscelle. Vi giver detaljerede protokoller for at skabe næringsstoffer gradienter i flowcellen og til dyrkning og visualisere biofilm udvikling under disse betingelser. Vi har også nuværende protokoller for en serie af optiske metoder til at kvantificere rumlige mønstre i biofilm struktur, flow distridrag i biofilm, og masse transport rundt og inden biofilm kolonier. Disse metoder understøtter omfattende undersøgelser af den fælles udvikling af biofilm og levesteder heterogenitet.
Introduction
Mikroorganismer tillægger overflader og danne biofilm – celleaggregater lukkede i en ekstracellulær-polymermatrix 1. Biofilm opfører sig meget anderledes end individuelle mikrobielle celler, fordi biofilm har dramatiske rumlig heterogenitet som følge af en kombination af interne stoftransport begrænsninger og rumlige variationer i cellulær metabolisme 2,3. Ilt og næringsstoffer koncentrationer drastisk falde på grænsefladen mellem biofilm og omgivende væske og få yderligere forarmet inden i biofilmen 2. Rumlige variationer i biofilm respiration og proteinsyntese kan også forekomme som svar på lokaliseret oxygen og næringsstof tilgængelighed 2.
I vand- og jordmiljøer, de fleste bakterier bo i biofilm. Naturlige biofilm udfører vigtige biogeokemiske processer, herunder cykling kulstof og kvælstof og reducere metaller 4,5. Klinisk biofilmdannelse er responsusynligt for langvarig pulmonal og urinvejsinfektioner 6. Biofilm infektioner er yderst problematisk, fordi celler i biofilm har ekstremt høj modstandsdygtighed over for antimikrobielle stoffer i forhold til deres planktoniske modstykker 6. Fordi biofilm er vigtige i forskellige indstillinger, har en betydelig mængde forskning været fokuseret på at forstå de miljømæssige faktorer, der styrer biofilm aktiviteter og den rumlige heterogenitet i biofilm og det omgivende mikromiljø.
Tidligere undersøgelser har vist, at biofilm udvikling er stærkt reguleret af en række miljøfaktorer: biofilm udvikler forskellige morfologier under forskellige strømning; ilt og næringsstoffer tilgængelighed indflydelse biofilm morfologi; og hydrodynamiske shear stress påvirker fastgørelsen af planktoniske celler til overflader og udstationering af celler fra biofilm 7-9. Endvidere ekstern flow tilstand påvirker levering af substrater into og inden biofilm 10. Væksten af biofilm ændrer også omgivende fysiske og kemiske forhold. For eksempel biofilm vækst fører til lokal udtømning af ilt og næringsstoffer 2; biofilm akkumulerer uorganiske og organiske forbindelser fra det omgivende miljø 11; og biofilm klynger aflede strømmen og forøgelse friktion 12,13. Fordi biofilm interagerer med deres omgivende miljø i meget komplekse måder, er det vigtigt at samtidig få oplysninger om biofilm egenskaber og miljømæssige forhold, og tværfaglige tilgange skal bruges til omfattende karakterisere biofilm-miljø interaktioner.
Her præsenterer vi en række integrerede metoder til at karakterisere rumlige mønstre i mikrobiel vækst inden mono-arter og dual-arter biofilm under en pålagt ernæringsmæssig gradient, og til at overholde den deraf ændring af den lokale kemiske og flydende mikromiljø. Vi first beskriver anvendelsen af et nyudviklet dobbelt-indløb microfluidic flow celle at observere biofilm vækst under veldefinerede kemiske gradienter. Vi derefter demonstrere brugen af denne mikrofluid flow celle at observere væksten af to arter af bakterier, Pseudomonas aeruginosa og Escherichia coli, i biofilm under en række af ernæringsmæssige betingelser. Vi viser, hvordan in situ visualisering af fluorescerende sporstof formering i biofilm kolonier kan anvendes til kvantitativt at vurdere mønstre af stoftransport i biofilm. Endelig viser vi, hvordan mikroskala partikel sporing Velocimetri, udføres under konfokal mikroskopi, kan anvendes til at opnå lokal flow felt omkring de voksende biofilm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi viste en suite af metoder til at karakterisere tre vigtige biofilm-miljø interaktioner: biofilm reaktion på kemiske gradienter, effekter af biofilm vækst på det omgivende flow mikromiljø, og biofilm heterogenitet som følge af interne begrænsninger transport.
Vi først viste anvendelsen af en hidtil ukendt microfluidic strømningscelle at pålægge en veldefineret kemisk gradient for biofilm udvikling. For at generere en veldefineret kemisk gradient i flowcellen, er det vigtig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Matt Parsek ved University of Washington (Seattle, WA) til at tilvejebringe P. aeruginosa og E. coli stammer og Roger Nokes på University of Canterbury (New Zealand) til at give adgang til Streams software. Dette arbejde blev støttet af tilskud R01AI081983 fra National Institutes of Health, National Institute of Allergy og infektionssygdomme. Konfokal billeddannelse blev udført ved Northwestern Biologisk Imaging Facility (BIF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 mL TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters- sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
