Abstract
Biofilm er overfladeaktive vedhæftet mikrobielle samfund, der har komplekse strukturer og skabe betydelige rumlige heterogeniteter. Biofilm udvikling er stærkt reguleret af det omgivende flow og ernæringsmæssige miljø. Biofilm vækst øger også heterogenitet af den lokale mikromiljø ved at generere komplekse flow felter og stoftransport mønstre. For at undersøge udviklingen af heterogenitet i biofilm og interaktioner mellem biofilm og deres lokale mikro-levesteder, vi voksede mono-arter biofilm af Pseudomonas aeruginosa og dual-arter biofilm af P. aeruginosa og Escherichia coli under ernæringsmæssige gradienter i en mikrofluid strømningscelle. Vi giver detaljerede protokoller for at skabe næringsstoffer gradienter i flowcellen og til dyrkning og visualisere biofilm udvikling under disse betingelser. Vi har også nuværende protokoller for en serie af optiske metoder til at kvantificere rumlige mønstre i biofilm struktur, flow distridrag i biofilm, og masse transport rundt og inden biofilm kolonier. Disse metoder understøtter omfattende undersøgelser af den fælles udvikling af biofilm og levesteder heterogenitet.
Introduction
Mikroorganismer tillægger overflader og danne biofilm - celleaggregater lukkede i en ekstracellulær-polymermatrix 1. Biofilm opfører sig meget anderledes end individuelle mikrobielle celler, fordi biofilm har dramatiske rumlig heterogenitet som følge af en kombination af interne stoftransport begrænsninger og rumlige variationer i cellulær metabolisme 2,3. Ilt og næringsstoffer koncentrationer drastisk falde på grænsefladen mellem biofilm og omgivende væske og få yderligere forarmet inden i biofilmen 2. Rumlige variationer i biofilm respiration og proteinsyntese kan også forekomme som svar på lokaliseret oxygen og næringsstof tilgængelighed 2.
I vand- og jordmiljøer, de fleste bakterier bo i biofilm. Naturlige biofilm udfører vigtige biogeokemiske processer, herunder cykling kulstof og kvælstof og reducere metaller 4,5. Klinisk biofilmdannelse er responsusynligt for langvarig pulmonal og urinvejsinfektioner 6. Biofilm infektioner er yderst problematisk, fordi celler i biofilm har ekstremt høj modstandsdygtighed over for antimikrobielle stoffer i forhold til deres planktoniske modstykker 6. Fordi biofilm er vigtige i forskellige indstillinger, har en betydelig mængde forskning været fokuseret på at forstå de miljømæssige faktorer, der styrer biofilm aktiviteter og den rumlige heterogenitet i biofilm og det omgivende mikromiljø.
Tidligere undersøgelser har vist, at biofilm udvikling er stærkt reguleret af en række miljøfaktorer: biofilm udvikler forskellige morfologier under forskellige strømning; ilt og næringsstoffer tilgængelighed indflydelse biofilm morfologi; og hydrodynamiske shear stress påvirker fastgørelsen af planktoniske celler til overflader og udstationering af celler fra biofilm 7-9. Endvidere ekstern flow tilstand påvirker levering af substrater into og inden biofilm 10. Væksten af biofilm ændrer også omgivende fysiske og kemiske forhold. For eksempel biofilm vækst fører til lokal udtømning af ilt og næringsstoffer 2; biofilm akkumulerer uorganiske og organiske forbindelser fra det omgivende miljø 11; og biofilm klynger aflede strømmen og forøgelse friktion 12,13. Fordi biofilm interagerer med deres omgivende miljø i meget komplekse måder, er det vigtigt at samtidig få oplysninger om biofilm egenskaber og miljømæssige forhold, og tværfaglige tilgange skal bruges til omfattende karakterisere biofilm-miljø interaktioner.
Her præsenterer vi en række integrerede metoder til at karakterisere rumlige mønstre i mikrobiel vækst inden mono-arter og dual-arter biofilm under en pålagt ernæringsmæssig gradient, og til at overholde den deraf ændring af den lokale kemiske og flydende mikromiljø. Vi first beskriver anvendelsen af et nyudviklet dobbelt-indløb microfluidic flow celle at observere biofilm vækst under veldefinerede kemiske gradienter. Vi derefter demonstrere brugen af denne mikrofluid flow celle at observere væksten af to arter af bakterier, Pseudomonas aeruginosa og Escherichia coli, i biofilm under en række af ernæringsmæssige betingelser. Vi viser, hvordan in situ visualisering af fluorescerende sporstof formering i biofilm kolonier kan anvendes til kvantitativt at vurdere mønstre af stoftransport i biofilm. Endelig viser vi, hvordan mikroskala partikel sporing Velocimetri, udføres under konfokal mikroskopi, kan anvendes til at opnå lokal flow felt omkring de voksende biofilm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Flow Cell Setup og Podning
BEMÆRK:. Brug en dobbelt-indløb microfluidic gennemstrømningscelle beskrevet i Song et al, 2014 14 til at vokse biofilm. Dette flow celle er i stand til at skabe veldefinerede glatte kemiske gradienter. Flowcelle design er vist i figur 1 og flowcelle fremstilling er tidligere beskrevet i Song et al. 2014 14. Her detalje vores metoder ved hjælp af P. aeruginosa og E. coli til dannelse af biofilm, men andre arter kan være egnede også. Vi brugte P. aeruginosa PAO1- GFP, som konstitutivt udtrykker et grønt fluorescerende protein (GFP) som en model organisme til biofilm udvikling. Derudover brugte vi E. coli DH5a at danne blandede arter biofilm med P. aeruginosa. P. aeruginosa og E. coli stammer blev dyrket på LB-agarplader.
- Forbered flowcellen hjælp polydimethylsiloxan (PDMS) bundet til endækglas via oxygen plasma behandling som beskrevet i 14. Dimensionerne af flowcellen kammer er 23 mm × 13 mm × 0,24 mm (længde × bredde × dybde).
- Fremstille modificerede FAB vækstmedium 15. At observere biofilm vækst under en ernæringsmæssig gradient i flowcellen, indfører modificeret FAB medium 15 med 0,6 uM glucose i et indløb og indføre FAB medium uden carbonkilde gennem det andet indløb. Filter-sterilisere (porestørrelse = 0,2 um) glucose stamopløsning (60 mM), før du tilføjer den til FAB medium. Også autoklaveres FAB medium med cyklus 1 (væske, 15 min; 121 ° C, 17 psi), før brug.
- Steriliser flow system. Før inokulering autoklavere hele strømningsvej (mellemstore flasker, slanger, bobbelfælder, flow-celler) ved anvendelse af cyklus 1, bortset fra plast trevejsventiler (engangs og forud steriliseret) placeret opstrøms for flowcellen. (Tre-vejs ventiler anvendes til injektion Cell CULTUR, fluorescerende sporstof og mikroperler.) For at undgå kontaminering under samling, dækker alle de slanger og stik åbninger med aluminiumsfolie eller autoklaveposer før autoklavering.
- Tilslut flow system. Saml komponenterne i flowcellen systemet omhyggeligt (se video for strømningssystem samling) og levere vækstmedium til flowcellen via en peristaltisk pumpe, der præcist styrer strømningshastigheden.
- Forbered cellekultur til inokulation ved at overføre en koloni af P. aeruginosa eller E. coli fra LB-plader til 3 ml LB-bouillon og ryste kultur O / N ved 225 rpm og 37 ° C. Fortynd O / N-cellekulturer i 1 ml steriliseret vand til et endeligt OD600 = 0,01 som inokulum. (Kultur og fortynde bakterierne i en laminar strømning hætte for at undgå forurening.)
- Til eksperimenterne med blandede arter biofilm, fortyndes to bakteriekulturer til et forhold på 1: 1 i 1 ml med en tilsvarende OD600 = 0,01 for hver bakterie.
- Podes strømningscellen. Injicer 1 ml inokulum til flowcellen indløbet fra trevejsventilen. Efter injektionen, pause strømmen i 1 time for at tillade bakterieceller at knytte til dækglasset. (Sørg for, at flow-celle placeres med dækglasset nedad for at tillade suspenderede celler til rette på dækglasset.)
- Efter 1 time genoptage strømmen og pumpe vækstmediet til flowcellen ved en konstant hastighed på 0,03 ml / min for hvert indløb i 3 dage.
2. karakterisere Biofilm udvikling i Reaktion på næringsstoffer Gradienter Brug konfokalmikroskopi
BEMÆRK: P. aeruginosa kan afbildes med konstitutivt udtrykt GFP, men E. coli i blandede arter biofilm skal afbildes ved modfarvning.
- Overhold 3-dages biofilm ved hjælp af konfokal mikroskopi. For de repræsentative resultater observere biofilm under anvendelse af et konfokalt mikroskop med en 63X objektiv. Før billeddannelse, markdobbelt-indløb flow celle med et gitter på dækglasset side. (Formålet med dette net er at give eksperimentatoren at lokalisere de billeddannende regioner i flowcellen kammeret.)
- Til kontrastfarve, fortyndes 10 pi celle-gennemtrængende røde fluorescerende nucleinsyrefarve, såsom grønt fluorescerende nucleinsyrefarve såsom STYO 62 stamopløsning (1 mM) i 990 pi steriliseret vand og derefter langsomt injicere fortyndede pletten med en sprøjte ind strømningscellen kammer fra den opstrøms trevejsventil. Hold flowcellen stillestående og i mørke i 30 min, derefter genoptage strømmen at udvaske ubundet farve i 15 minutter.
- Udfør konfokal billeddannelse. Aktiver 488 nm Argon laser for excitation og emission indsamle kanaler for GFP (500-535 nm) og nucleinsyrefarve (for grønt fluorescerende nucleinsyrefarve, 650-750 nm). Juster gevinster og forskydninger for begge kanaler til at få lyse og rene billeder. Vælg xyz og samtidig billedbehandlingstype. Brug Z-knappen for at idencere bunden og toppen af biofilm på området. Indstil Z-trin til 0,5 um for at erhverve en 3-D billedstak. (For at sikre høj billedkvalitet, skal du bruge en linje i gennemsnit fire til billedoptagelse.)
- At kortlægge de rumlige mønstre af biofilm udvikling i flowcellen, billed biofilm på tre eller flere i længderetningen (x) afstande langs flowcellen indløbet, og tre tværgående (y) positioner i forhold til den påførte ernæringsmæssige gradient, som vist i figur 1 .
3. karakterisere Intern stoftransport ved Injektioner af konservative Fluorescent Tracer
BEMÆRK: En konservativ fluorescerende sporstof, såsom Cy5, kan anvendes til at karakterisere stoftransport mønstre i biofilmen.
- Opløs Cy5 (Mono-reaktivt NHS ester) i vand til en slutkoncentration på 10 mg / ml som en stamopløsning. Opbevar Cy5 stamopløsning i en -20 ° C fryser.
BEMÆRK: Da Cy5 er lys-SENSITive, butik, fortyndes og injicere Cy5 løsninger i mørke. - Forud for injektioner af det fluorescerende sporstof, tage en 3-D billede stak af 3-dages biofilm med konfokal mikroskopi (med en 63X objektiv). (Brede områder af biofilm kolonier er ideelle til time-serie observationer af farvestof transport.) Også vælge en z-fly med godt adskilte kolonier til billeddannelse (som vist i figur 5A).
- For hvert Cy5 injektion eksperiment, fortyndes 2 pi af Cy5 stamopløsning i 998 pi steriliseret vand til opnåelse af en injektionsopløsning med en Cy5 koncentration på 20 ug / ml.
- Stop pumpen for at stoppe flowet og injicere Cy5 opløsningen i opstrøms for flowcellen ved hjælp af en sprøjte via 3-vejsventilen. (Det er vigtigt at forhindre luftbobler ind strømningsvejen under injektion. Bobbelfælder bør holdes åbne under tilbage injektion.)
- Efter indsprøjtning af Cy5 løsning, lukke boble fælder, justere 3-vejs ventil, og genstartpumpe til at levere den injicerede Cy5 opløsningen i strømningscellen.
- Skift konfokal billedbehandlingstype at xyt. Aktiver Cy5 og GFP kanaler under samtidig billedbehandlingstype. Juster konfokale indstillinger på Cy5 intensitet (laser intensitet, vinde og offset) for at undgå mætning signaler, hvilket er afgørende for kvantificering. (Høj tidsopløsning foretrækkes til visualisering farvestof penetration. Men hurtig scanning falder billedkvaliteten.) Vælg korrekt scanning hastighed og line gennemsnit på balance tidspunktet opløsning på billedbehandling og billedkvaliteten. Til denne protokol bruger en linje gennemsnit på fire og en frame rate på 0,15 Hz.
- Genoptag strømmen til at levere Cy5 i strømningscellen (stadig ved en strømningshastighed på 0,03 ml / min). Samtidig begynder tidsserier konfokal billeddannelse.
- Kvantificere Cy5 gennemtrængning af radialt gennemsnit Cy5 intensitet inden for en 2-D cirkulære biofilm koloni. Til gennemsnit, først identificere kanten af en biofilm klynge, derefter generere en afstand kort for en 2-D del af klyngenOg endelig gennemsnitlige radiale mønstre af Cy5 intensiteter til at generere en penetration kurve (se figur 6).
- Til beregningsmæssigt indser trin 3.8, skal du bruge BioSPA (Biofilm Spatial Pattern Analysis) softwarepakke (ikke offentliggjort, softwarepakke og manuel til rådighed efter anmodning) eller andre billede analyseprogrammer.
- Hvis du vil bruge BioSPA, først importere et billede sat ind BioSPA. Vælg derefter korrekt tærskel for GFP og Cy5-kanaler til at gøre binære billeder. I menuen analysen / beregning, skal du vælge Advanced Analysis og derefter Diffusion Analysis. Brug GFP kanal at definere kanten af en klynge og bruge polygon værktøj til at vælge en klynge som region af interesse (ROI).
- Dobbeltklik på den valgte biofilm klynge til at udføre diffusion analyse. Spar analyseresultater spredningen og kalibrere Cy5 intensitet til Cy5 koncentration på en kalibreringskurve.
- For at generere Cy5 koncentration kalibreringskurven, måle Cy5 intensiteter over en Cy5 koncentration gradient under konfokal mikroskopi. (Cy5 intensitet og koncentration har en lineær sammenhæng.)
4. karakterisere de omkringliggende Flow Field ved at spore fluorescentpartikler
BEMÆRK: Fluorescerende partikler, såsom fluorescerende mikroperler, kan anvendes til at karakterisere strømmen felt omkring biofilm. Flow felt omkring biofilm kan beregnes ud fra tidsserier observationer af partikel positioner ved hjælp af partikel sporing Velocimetri software. De viste resultater blev opnået med den Streams 2,02 softwarepakke 16 (software download og brugervejledning findes på http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ).
- Fortynd de fluorescerende mikrokugler (diameter ~ 1 uM) i steriliseret vand til en endelig faststofkoncentration på 0,2% og et endeligt volumen på 0,5 ml. Vortex for at sikre, at mikroperlerneer godt dispergeret.
- Injicer og levere de fortyndede fluorescerende mikrokugler i flowcellen efter procedurer fra trin 3,3-3,5. For at tillade en nøjagtig sporing af partiklen stien, skal du bruge en forholdsvis lav strømningshastighed (0,01 ml / time for partikel sporing resultater i dette papir).
- Skift konfokale indstillinger for at xyt tilstand for at spore partikel bevægelse på én z-slice og tage tid-serie billeder. (En ramme på 1 Hz blev anvendt til de repræsentative resultater vist i dette dokument.) Gentag partikel injektion og image på forskellige z steder at generere 3-D flow område.
- Pre-proces tidsserier konfokale billeder ved at trække baggrunden fluorescens signal (signalet i første erhvervede billede af billedet sæt) ved hjælp ImageJ (software download og manuel tilgængelig på http://imagej.nih.gov/ij/ ) eller andre programmer.
- I ImageJ Åbn det første billede af et billede sæt og derefter importere billedsættet. Under Process / billede Calculator, trække det første billede fra billedet sæt. Gem forbehandlede billede sæt.
- For at beregne flow vektorer, import tid-serien konfokale billeder i Streams 2.02. Under "Open udsigt proces", vælge og udføre "Identificer partikler". Brug korrekt tærskel til at identificere partikler. Brug 0,5 og 5 um ved mindste og største diameter tærskler for 1 um partikler.
- Så under "Open udsigt proces", vælge og udføre "PTV analyse pipeline" til at generere partikel stier. Kontroller partikel stier for at se, om de repræsenterer partikel bevægelse. Endelig skal du vælge og udføre "Opret felt hastighed" for at generere et flow vektor kort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den dobbelt-indløb mikrofluid flowcelle tillader observation af biofilm vækst under en veldefineret kemisk gradient dannet ved blanding af to opløsninger i strømningskammeret. Den resulterende kemiske gradient blev tidligere observeret af farvestof injektion og karakteriseret i detaljer ved Song et al. 14. Glatte koncentrationsgradienter blev dannet i den tværgående retning, som vist i figur 1. Koncentrationen profil var stejle nær indløbet og fik lempes nedstrøms skyldes diffusion (figur 1). At observere biofilm udvikling under en ernæringsmæssig gradient anvendte vi en defineret minimal vækstmedium (FAB medium) med glucose tilsat til én indgang som den eneste carbonkilde. Dette gav en glucose-gradient i flowcellen kammer mens alle andre næringsstoffer blev homogent fordelt. Væksten af P. aeruginosa PAO1 biofilm var stærkt korreleret til lokal levering af glucose (figur 2).Som tværgående glucose koncentrationsgradient var stejle nær indløbet, biofilmen biomasse viste et dramatisk fald fra høj-glucose region til lav-glucose region. Som tværgående glucose gradient lempes nedstrøms biofilmen biomasse blev mere homogen. Vi demonstrerede anvendelsen af denne strømningscelle for at studere interaktioner af P. yderligere aeruginosa og E. coli i biofilm under en glukose gradient (figur 3). Resultaterne viste, at disse to arter viste særskilte rumlige mønstre i vækst i forhold til de ernæringsmæssige gradient, og derfor besatte forskellige økologiske nicher P. aeruginosa domineret biofilm biomasse i områder med høje glucosekoncentrationer og E. coli dominerede i regioner med lave glucosekoncentrationer (Figur 3).
For at forstå feedback mellem biofilm vækst og det omgivende flow miljø, vi præget strømningsfeltet omkring voksende biofilm af fluorescerende partikel sporing Velocimetri under konfokal mikroskopi. Den observerede bevægelse af det injicerede fluorescerende mikrokugler er vist i film 1. Lokalt flow vektor information blev ekstraheret fra et gennemsnit på mindst 4.200 diskrete målinger af partikelhastigheder anvender Streams softwarepakke. Tredimensionelle kortlægning af strømmen område blev opnået ved at spore partikler på flere lodrette positioner (figur 4). Biofilmvækst signifikant forøget flow heterogenitet (figur 4). Flow nær biofilm basen omdirigeres omkring biofilm klynger, hvilket fører til øget heterogenitet og nedsat hastighed (figur 4). Flow på biofilm toppen har højere hastighed og er mere homogene (figur 4).
For at forstå den interne heterogenitet skyldes begrænset stoftransport inden biofilm, observerede vi transporten af Cy5 inden biofilm ved konfokal mikroskopi. Time-serien penetrationaf Cy5 i en biofilm klynge er vist i Movie 2. tidsserier Cy5 penetration kurver er vist i Movie 3. Den effektive diffusionskoefficient Cy5 i biofilm blev beregnet ved at tilpasse en 1-D diffusion model til Cy5 koncentrationsprofiler:
hvor C er radialt gennemsnit Cy5 koncentration beregnes ud fra fluorescensintensiteten, og er afstanden i biofilmen 17. Cy5 viste den højeste koncentration i bulk flow og faldt stejlt ved ankomsten biofilmen (figur 5).
Figur 1. Dobbelt-indløb mikrofluid flowcelle. Glatte glucose gradienter blev skabt i strømningskammeret ved at indføre FAB medium til de to indløb med en carbonkilde (gluco SE) kun leveres i et indløb. Resulterende mønstre af glucose i strømningscellen er angivet med skravering. Mørk skygge repræsenterer højere koncentrationer glucose. Konfokal billeddannelse blev udført ved ni steder i strømningscellen. Resultaterne præsenteret i figur 2 og 3 henviser til de steder nummereret 1-9 i figuren. Dette tal er ændret efter Song et al. (2014), Fig. 1.. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. PAO1 biofilmvækst under glucose gradienter. 3-dages PAO1 biofilm blev afbildet på de 9 steder, der vises i figur 1. Gitterafstanden = 18 um til billedbehandling 1-8 og 24 um for billedet 9.g "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Udviklingen af P. aeruginosa og E. coli dual-arter biofilm under glucose gradienter. P. aeruginosa konstitutivt udtrykker GFP, og biofilm blev også modfarvet ved SYTO 62, som er en generel nucleinsyrefarve. Billeder, der er vist her, er overlejringer af GFP (grøn) og SYTO 62 (rød) kanaler. P. aeruginosa synes derfor grøn eller gul (grøn + rød), og E. coli synes rødt. Scale barer = 47 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Flow hastighedsvektor felter ved z = 4, 10 og 16 um omkring en biofilm klynge. Længden af pilen repræsenterer størrelsen af hastigheden. Lav strømningshastighed viser på biofilm base (z = 4, blå pile). Flow er mere homogen nær biofilm top (z = 16, røde pile). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Cy5 indtrængen i biofilm. (A) Konfokal mikrografi ved z = 18 um viser delvis indtrængning af Cy5 i biofilm klynger ved t = 190 sek. Scale barer = 10 um. (B) Resulterende mønstre af Cy5 koncentration kort. (C) Cy5 koncentrationsprofil i en biofilm klynge. 602fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6. Procedurer til at generere en Cy5 penetration profil Venstre:. Valgt ROI indeholder en 2-D biofilm klynge. Middle: Afstand kort over biofilmen klynge. Til højre: radialt gennemsnit Cy5 intensitet profil. Klik her for at se en større udgave af figuren.
Movie 1 : Motion af injicerede fluorescerende partikler omkring biofilm klynger (konfokal video).
Movie 2 : Spredning af Cy5 i biofilm klynger (konfokal video).
_content "> Movie 3 : Formering af Cy5 i biofilm klynger (koncentration profiler video).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi viste en suite af metoder til at karakterisere tre vigtige biofilm-miljø interaktioner: biofilm reaktion på kemiske gradienter, effekter af biofilm vækst på det omgivende flow mikromiljø, og biofilm heterogenitet som følge af interne begrænsninger transport.
Vi først viste anvendelsen af en hidtil ukendt microfluidic strømningscelle at pålægge en veldefineret kemisk gradient for biofilm udvikling. For at generere en veldefineret kemisk gradient i flowcellen, er det vigtigt at opretholde den samme strømningshastighed for begge indløb. Sørg for, at den peristaltiske pumpe er godt tilpasset til både flow kanaler til at levere vokse medium i samme tempo. Sørg også for at der ikke er nogen tilstopning i strømningsvejen under biofilm vækst. Observationer af væksten af dual-arter biofilm i denne flow-celle viser, at kemiske gradienter i høj grad påvirket biofilm vækst og mellem arterne interaktioner inden biofilm. Kemiske gradienter er almindelige imiljøer, hvor biofilm vokser som følge af en kombination af transport begrænsninger, kemisk binding og reaktioner samt mikrobiel optagelse og metabolisme 18-20. Denne mikrofluid flow celle muliggør undersøgelser af forskellige biofilm aktiviteter under en defineret række kemiske forhold i en enkelt enhed. For eksempel har denne strømningscelle blevet påvist at være nyttige til undersøgelse af biofilm drab under et antimikrobielt gradient 14.
Vi demonstrerede derefter anvendelse af partikel sporing Velocimetri at observere strømningen felt omkring biofilm klynger. For at sikre en nøjagtig sporing af de injicerede fluorescerende partikler, skal optimeres strømningshastigheden. Normalt giver lav strømningshastighed bevægelsen af partikler, der skal fanget i konfokalt synsfelt. Også scanning frame rate skal optimeres for at afbalancere billedkvalitet og tidsopløsning. Hvis partiklerne bevæge sig for hurtigt til at opfange bevægelsen, brug lavere linje eller ramme gennemsnittet eller støase scanningshastighed. Vi har kortlagt flow felt ved tre lodrette positioner over en biofilm klynge, og fandt, at biofilmvækst øget flow heterogenitet. Karakterisere de flow felt omkring biofilm giver vigtige flow-biofilm interaktioner at blive udforsket. For eksempel kan dette anvendes til at vurdere mekanismer, der regulerer fluid træk og forskydning over biofilmen, og den resulterende biofilm svigt og frigørelse af cellerne fra overfladen 1,21. Disse processer er vigtige for forståelsen både virkningerne af biofilm på flow-systemer (fx biologisk forurening) og regulering af biofilm morfologi 8. Flow forhold omkring biofilm også styre massetransport, som er vigtig for en bred vifte af biofilm processer. For eksempel den lokale væskehastighed på biofilmen overflade påvirker levering af næringsstoffer og substrater til biofilm gennem advektion 22.
Endelig vi viste brugen af intravenøs fluorescerende sporstoffer til at analyseresolut transportmønstre i biofilmen. Vi brugte Cy5 her som en konservativ sporstof, og dette fluor tilsyneladende ofte opfører sig konservativt i biofilm 23. Derfor skal resultaterne være repræsentativ for transportmønstre af ikke-reaktive, neutrale opløste stoffer i biofilm. Resultaterne viste en stejl fald i Cy5 koncentration nær biofilm overflade, hvilket giver en Cy5 koncentration i det indre af biofilmen kun ~ 50% af koncentrationen i bulk flow. Sådanne stejle koncentrationsprofiler er i overensstemmelse med tidligere rapporterede målinger af ilt, næringsstoffer og antimikrobielle inden biofilm 2,24. Cy5 penetration kurver give oplysninger om opløst stof diffusion i biofilm klynger. Imidlertid er fremgangsmåden vi præsenterer her begrænset til at analysere 2-D stoftransport i vandrette (XY) fly i biofilm. Med nyere hurtigt imaging kapacitet, for eksempel spinning disk konfokal mikroskopi, dye penetration kan også visualiseres i 3-D i biofilm, which vil tillade en undersøgelse på lodrette transportprocesser. Endvidere kan fluorescerende sporstof og partikler injiceres sammen for at opnå information af eksterne strømningsforhold og intern transport solut på samme tid. Sådanne oplysninger er nyttig til at skelne advektiv og diffusive stoftransport blandt bulk-flow og biofilm og vurdere effekten af ekstern strøm på intern transport opløst stof i biofilm.
Samlet set præsenterer vi detaljerede protokoller ved at bruge en roman microfluidic flow celle, der giver veldefinerede kemiske gradienter for studiet af biofilm reaktioner på kemiske signaler i miljøet. For bedre at karakterisere heterogenitet i biofilm og deres omgivende microhabitat præsenterer vi her metoder til at karakterisere mønstre i både strømningsfeltet omgivende biofilm og intern stoftransport i biofilm. Hver metode giver markante information om biofilm egenskaber og / eller miljøforhold. Eftersom disse metoderer integreret, kan flere aspekter af information indhentes samtidig. Kombineret information gør det muligt for forskerne at nærme mere komplekse problemer. For eksempel ved hjælp af disse metoder, vi med succes analyseret biofilm udvikling og interspecies interaktioner i biofilm under et næringsstof gradient. Disse metoder giver også eksperimentel evne til at øge kompleksiteten i det mikrobielle samfund og det kemiske miljø, som gør det muligt undersøgelser af biofilm processer på en mere realistisk kontekst. Potentielle anvendelser af disse metoder dækker forskellige aspekter af biofilm forskning, herunder biofilm livscyklus, flere arter biofilm, biofilm heterogenitet, transportprocesser i biofilm, og biofilm-flow samspil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Matt Parsek ved University of Washington (Seattle, WA) til at tilvejebringe P. aeruginosa og E. coli stammer og Roger Nokes på University of Canterbury (New Zealand) til at give adgang til Streams software. Dette arbejde blev støttet af tilskud R01AI081983 fra National Institutes of Health, National Institute of Allergy og infektionssygdomme. Konfokal billeddannelse blev udført ved Northwestern Biologisk Imaging Facility (BIF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| Pump Tubing 0.50 mm OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1 L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 ml TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters - sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, Suppl 1. 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
