Abstract
Biofilms קהילות חיידקים מצורף משטח שיש לי מבנים מורכבים ולייצר heterogeneities מרחבי משמעותי. פיתוח biofilm מוסדר בחום על ידי הזרימה סביב והסביבה תזונתית. צמיחת biofilm גם מגדילה את ההטרוגניות של מייקרו-הסביבה המקומית על ידי יצירת שדות זרימה מורכבות ודפוסי תחבורה מומסת. כדי לחקור את הפיתוח של ההטרוגניות בbiofilms ואינטראקציות בין biofilms ומיקרו-בית הגידול המקומי שלהם, שגדלנו biofilms מונו-מינים של Pseudomonas aeruginosa וbiofilms כפולים מינים של P. coli aeruginosa וEscherichia תחת הדרגתיים תזונתי בתא זרימת microfluidic. אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים ליצירת שיפועים מזינים בתוך תא הזרימה ולגידול והדמית פיתוח biofilm בתנאים אלה. אנחנו גם פרוטוקולים הנוכחיים לסדרה של שיטות אופטיות לכמת תבניות המרחביות במבנה biofilm, לזרום distributions על biofilms, ותחבורה המונית סביב ובתוך מושבות biofilm. שיטות אלו תומכות חקירות מקיפות של הפיתוח המשותף של ההטרוגניות biofilm ובית גידול.
Introduction
מיקרואורגניזמים לצרף למשטחים וbiofilms טופס - אגרגטים תא סגורים במטריצה תאית-פולימר 1. Biofilms להתנהג בצורה שונה מאוד מתאי חיידקים בודדים, כי יש לי biofilms ההטרוגניות המרחבית דרמטית כתוצאה משילוב של מגבלות תחבורה מומסת הפנימיות ווריאציות מרחבית בחילוף חומרים תאיים 2,3. ריכוזי חמצן וחומרים מזינים להקטין באופן דרסטי בממשק שבין biofilm והסביבה נוזל ומתמעט נוסף בתוך בbiofilm 2. וריאציות מרחבית בנשימת biofilm וסינתזה של חלבון יכולות להתרחש גם כתגובה לחמצן מקומי וזמינות חומרי מזון 2.
בסביבות מימית ואדמה, רוב החיידקים שוכנים בbiofilms. biofilms הטבעי לבצע תהליכים חשובים biogeochemical כולל רכיבה על אופניים פחמן וחנקן והפחתת מתכות 4,5. מבחינה קלינית, היווצרות biofilm היא responsידיהם לריאות ממושכות וזיהומים בדרכי שתן 6. הזיהומים הקשורים biofilm הם בעייתיים מאוד, כי יש לי תאים בbiofilms גבוהה מאוד התנגדות לאנטיביוטיקה בהשוואה לעמיתיהם הפלנקטון 6. בגלל biofilms חשוב בהגדרות שונות, כמות משמעותית של מחקר התמקדה בהבנת הגורמים הסביבתיים השולטים פעילויות biofilm וההטרוגניות המרחבית בbiofilms ומייקרו-הסביבה שמסביב.
מחקרים קודמים מצאו כי פיתוח biofilm מוסדר מאוד על ידי מספר הגורמים סביבתיים: biofilms לפתח מורפולוגיות שונות תחת תנאי זרימה שונים; חמצן וbiofilm השפעת זמינות חומרי מזון מורפולוגיה; ומאמץ גזירה הידרודינמית משפיע על הקובץ המצורף של תאי פלנקטון למשטחים והניתוק של תאים מbiofilms 7-9. יתר על כן, זרימת מצב חיצוני משפיע על המשלוח של int מצעיםo ובתוך biofilms 10. הצמיחה של biofilms גם משנה מקיפה תנאים פיזיים וכימיים. לדוגמא, צמיחת biofilm מובילה לדלדול המקומי של חמצן וחומרים מזינים 2; biofilms לצבור תרכובות אורגניות ואורגניות מהסביבה 11; ואשכולות biofilm להסיט חיכוך זרימה ומשטח עליית 12,13. בגלל biofilms אינטראקציה עם סביבתם סביבה בדרכים מורכבות מאוד, זה קריטי כדי להשיג מידע על מאפייני biofilm ותנאים סביבתיים בו-זמנית, וגישות רב-תחומיות צריכים לשמש כדי לאפיין באופן מקיף אינטראקציות biofilm-סביבה.
כאן אנו מציגים סדרה של שיטות משולבות לאפיון דפוסים מרחביים בהתפתחותם של חיידקים בתוך מונו-מינים וbiofilms כפולים מינים תחת שיפוע תזונתי שהוטל, ולצפות בשינוי של כימי המקומית ומייקרו-סביבת נוזל וכתוצאה מכך. אנו אשוחרח 'מתאר את השימוש של זרימת microfluidic תא כניסה כפולה לפותח לאחרונה להתבונן צמיחת biofilm תחת מילויים כימיים מוגדרים היטב. לאחר מכן, אנו מדגימים את השימוש בתא זרימת microfluidic זה להתבונן הצמיחה של שני מינים של חיידקים, Pseudomonas aeruginosa וEscherichia coli, בbiofilms תחת מגוון של תנאים תזונתיים. אנו מראים כיצד בהדמיה באתרו של התפשטות נותב ניאון למושבות biofilm ניתן להשתמש כדי להעריך כמותית דפוסי התחבורה מומסת בbiofilms. לבסוף, אנו מראים כיצד velocimetry מעקב חלקיקים המיקרוסקופי, שבוצע תחת מיקרוסקופ confocal, יכול לשמש כדי לקבל שדה זרימה מקומי סביב biofilms גדל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
התקנת תא 1. זרימה והרכבה
הערה:. השתמש תא זרימת microfluidic כניסה כפולה למתואר בשיר et al, 2014 14 לגדול biofilms. תא זרימה זה מסוגל ליצור מעברי צבע כימיים חלקים מוגדרים היטב. עיצוב תא הזרימה מוצג באיור 1 וזרימת ייצור תאים תוארו בעבר בשיר et al., 2014 14. השיטות שלנו כאן פירוט על ידי שימוש P. aeruginosa וא coli כדי ליצור biofilms, אבל מינים אחרים עשויים להיות מתאימים יותר. אנחנו השתמשנו P. aeruginosa PAO1- GFP, אשר constitutively מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כאורגניזם מודל לפיתוח biofilm. בנוסף, השתמשנו E. coli DH5α כדי ליצור biofilms מעורבים-מינים עם פ aeruginosa. P. aeruginosa וא coli זנים גדלו על צלחות אגר LB.
- הכן את polydimethylsiloxane באמצעות תא זרימה (PDMS) הקשור לcoverslip זכוכית באמצעות טיפול פלזמה חמצן כפי שתואר ב -14. הממדים של חדר תא הזרימה הם 23 מ"מ × 13 מ"מ × 0.24 מ"מ (אורך × רוחב × עומק).
- הכן שונה מדיום גידול FAB 15. להתבונן צמיחת biofilm תחת שיפוע תזונתי בתוך תא הזרימה, להציג שונה FAB בינוני 15 עם גלוקוז 0.6 מיקרומטר בכניסה אחת ולהציג את מדיום FAB ללא כל מקור פחמן דרך פתח האחר. מסנן לעקר (גודל נקבובית = 0.2 מיקרומטר) מניית גלוקוז הפתרון (60 מ"מ) לפני הוספתו למדיום FAB. גם חיטוי בינוני FAB עם מחזור 1 (נוזל, 15 דקות, 121 מעלות צלזיוס, 17 psi) לפני השימוש.
- לעקר את מערכת הזרימה. לפני החיסון, חיטוי את כל נתיב הזרימה (בקבוקים בינוניים, צינורות, מלכודות בועה, תאי זרימה) באמצעות מחזור 1, פרט לשסתומי פלסטיק שלושה-כיווני (חד פעמי ומעוקר מראש) הממוקמים במעלה הזרם של תא הזרימה. (שסתומים שלוש דרכים המשמשים להזרקת התא גulture, נותב וmicrobeads ניאון.) כדי למנוע זיהום בזמן ההרכבה, לכסות את כל פתחי צינורות ומחבר ברדיד אלומיניום או שקיות החיטוי לפני מעוקר.
- חבר את מערכת הזרימה. להרכיב את הרכיבים של מערכת תא זרימה בזהירות (ראה וידאו להרכבת מערכת זרימה) ולספק מדיום גידול לתא הזרימה באמצעות משאבת peristaltic שדווקא שולטת בקצב הזרימה.
- הכן תרבית תאי חיסון על ידי העברת מושבה של P. aeruginosa או E. coli מצלחות LB עד 3 מיליליטר של מרק LB ולנער את התרבות O / N ב 225 סל"ד ו -37 מעלות צלזיוס. לדלל את O / תרביות תאי N ב 1 מיליליטר מים המעוקרים לOD סופי 600 = 0.01 כבידוד. (תרבות ולדלל את החיידקים בזרימה למינרית כדי למנוע זיהום.)
- לניסויים עם biofilms מעורבים-מינים, לדלל שתי תרבויות חיידקים ליחס של 1: 1 ב 1 מיליליטר עם OD שווה 600 = 0.01 עבור כל חיידק.
- לחסן תא הזרימה. הזרק 1 מיליליטר של הבידוד לכניסת תא זרימה משסתום שלוש הדרך. לאחר ההזרקה, להשהות את הזרימה עבור שעה 1 כדי לאפשר לתאי חיידקים לצרף את מכסה הזכוכית. (ודא שתא הזרימה ממוקם בצד coverslip למטה כדי לאפשר לתאים מושעים להתיישב על coverslip.)
- אחרי שעה 1, לחדש את הזרימה ולשאוב את מדיום הגידול לתא הזרימה בקצב קבוע של 0.03 מיליליטר / דקה עבור כל כניסה במשך 3 ימים.
2. אפיון Biofilm פיתוח בתגובה לGradients התזונתי באמצעות מיקרוסקופיה confocal
הערה: פ aeruginosa ניתן הדמיה עם GFP constitutively-הביע, אבל E. coli בbiofilms מעורב-מינים חייב להיות צילם על ידי counterstaining.
- שים לב biofilms 3 הימים באמצעות מיקרוסקופ confocal. לקבלת תוצאות הנציג, להתבונן biofilms באמצעות מיקרוסקופ confocal עם מטרת 63X. לפני ההדמיה, סימןתא זרימת כניסה הכפול לעם רשת בצד מכסה הזכוכית. (המטרה של רשת זו היא לאפשר לניסוי כדי לאתר את אזורי ההדמיה בתוך תא תא זרימה.)
- לcounterstain, לדלל 10 μl של כתם תא-permeant אדום ניאון חומצות גרעין, כגון כתם ירוק ניאון גרעין חומצה כגון STYO 62, פתרון מניות (1 מ"מ) ב990 μl מעוקר מים ואז מזריק את הכתם בדילול באמצעות מזרק לתוך לאט תא תא זרימה משלוש דרך השסתום במעלה הזרם. שמור את תא הזרימה קופא על שמריו ובחושך במשך 30 דקות, ולאחר מכן לחדש את הזרימה כדי לשטוף את הכתם מאוגד במשך 15 דקות.
- לבצע הדמיה confocal. הפעל את לייזר 488 ננומטר ארגון לעירור ופליטת איסוף ערוצים לGFP (500-535 ננומטר) וכתם חומצות גרעין (לכתם חומצה ירוק ניאון גרעין, 650-750 ננומטר). התאם רווחים וקיזוז בשני הערוצים יש תמונות בהירות ונקיות. xyz בחר ומצב הדמיה בו זמנית. השתמש בכפתור z-השליטה לIDENתצדיק את התחתית והחלק העליון של biofilm בתחום. הגדר את z-הצעד לרמה של 0.5 מיקרומטר לרכישת מחסנית תמונה 3-D. (כדי להבטיח איכות תמונה גבוהה, להשתמש ממוצע שורה של ארבע לרכישת תמונה.)
- כדי למפות את הדפוסים המרחבי של פיתוח biofilm בתוך תא הזרימה, biofilms תמונה בשלוש או יותר אורך (x) מרחקים לאורך כניסת תא זרימה, ובשלוש רוחבי (y) ממקם יחסית לשיפוע התזונתי שהוטל, כפי שמוצג באיור 1 .
3. אפיון הפנימי מומסת תחבורה על ידי זריקות של הקונסרבטיבי פלורסנט Tracer
הערה: נותב ניאון שמרני, כגון Cy5, ניתן להשתמש בו כדי לאפיין את דפוסי תחבורה מומסת בתוך biofilm.
- לפזר Cy5 (Mono-reactive NHS אסתר) במים לריכוז סופי של 10 מ"ג / מיליליטר כפתרון מניות. אחסן את פתרון מניות Cy5 ב-20 ° C במקפיא.
הערה: כCy5 הוא אור-sensitive, חנות, לדלל ולהזריק פתרונות Cy5 בחושך. - לפני הזריקות של נותב הניאון, לקחת ערימת 3-D תמונה של biofilm 3 הימים עם מיקרוסקופיה confocal (עם מטרת 63X). (אזורים רחבים של מושבות biofilm הם אידיאליים עבור תצפיות בזמן סדרה של תחבורת צבע.) כמו כן לבחור z-מטוס עם מושבות מופרדות היטב להדמיה (כפי שמוצג באיור 5 א ').
- עבור כל ניסוי הזרקת Cy5, לדלל 2 μl של פתרון מניות Cy5 ב998 μl מעוקר מים להניב פתרון הזרקה יש ריכוז Cy5 של 20 מיקרוגרם / מיליליטר.
- עצור את המשאבה כדי להשהות את הזרימה ולהזריק את פתרון Cy5 לזרם של תא הזרימה באמצעות מזרק דרך שסתום 3-הדרך. (זה חשוב כדי למנוע בועות אוויר מלהיכנס לנתיב הזרימה תוך הזרקה. צריכה להישמר מלכודות בועה פתוחות במהלך ההזרקה בחזרה.)
- לאחר הזרקת פתרון Cy5, לסגור את מלכודות הבועה, להתאים את שסתום 3-בדרך, והפעל מחדש אתלשאוב כדי לספק את פתרון Cy5 מוזרק לתוך תא הזרימה.
- לעבור למצב הדמיה confocal לxyt. הפעל ערוצי Cy5 וGFP תחת מצב הדמיה בו זמנית. התאם את הגדרות confocal על עוצמת Cy5 (עוצמת לייזר, להרוויח וקיזוז), כדי למנוע להרוות אותות, שהוא קריטי לכימות. (החלטה זמנית גבוהה עדיפה להמחשת חדירת צבע. עם זאת, סריקה מהירה מקטינה את איכות תמונה.) בחר את מהירות סריקה נכונה וממוצע קו כדי לאזן את הזמן ברזולוציה של הדמיה ואיכות התמונה. לפרוטוקול זה משתמש בממוצע שורה של ארבע ומסגרת שיעור של 0.15 הרץ.
- לחדש את הזרימה לספק Cy5 לתוך תא הזרימה (עדיין בקצב זרימה של 0.03 מיליליטר / דקה). במקביל יתחיל הדמיה confocal זמן סדרה.
- לכמת חדירת Cy5 ידי רדיאלית ממוצע עוצמת Cy5 בתוך מושבה biofilm עגולה 2-D. בממוצע, ראשון לזהות את קצה אשכול biofilm, לאחר מכן ליצור מפת מרחק לסעיף 2-D של האשכול, ובסופו דפוסי רדיאלי הממוצע של עוצמות Cy5 כדי ליצור עקומת חדירה (ראה איור 6).
- כדי לממש את המחשוב צעד 3.8, להשתמש BioSPA (ניתוח תבנית Biofilm מרחבי) חבילת תוכנה (, חבילת תוכנה שלא פורסם ומדריך לזמין על פי בקשה) או תוכניות ניתוח תמונה אחרות.
- כדי להשתמש בBioSPA, לייבא ראשון תמונה שנקבעה לBioSPA. לאחר מכן, בחר סף ראוי לערוצי GFP וCy5 כדי להפוך את התמונות בינארי. בתפריט ניתוח / חישוב, בחר מתקדם ניתוח ולאחר מכן ניתוח דיפוזיה. השתמש בערוץ ה- GFP להגדיר את הקצה של אשכול ולהשתמש בכלי המצולע כדי לבחור אשכול אחד כמו האזור של העניין (ROI).
- לחץ לחיצה כפולה על אשכול biofilm נבחר לבצע ניתוח דיפוזיה. שמור את תוצאות ניתוח דיפוזיה ולכייל עוצמת Cy5 לריכוז Cy5 באמצעות עקומת כיול.
- כדי ליצור עקומת כיול ריכוז Cy5, למדוד עוצמות Cy5 על conce Cy5שיפוע ntration תחת מיקרוסקופ confocal. (עוצמת Cy5 וריכוז יש קשר ליניארי.)
4. אפיון שדה הזרימה סביב ידי מעקב פלורסנט חלקיקים
הערה: חלקיקי פלורסנט, כגון microbeads פלורסנט, יכול לשמש כדי לאפיין את שדה הזרימה סביב biofilms. שדה זרימה סביב biofilms ניתן לחשב מהתצפיות בזמן שורה של תפקידי חלקיקים באמצעות תוכנת velocimetry מעקב אחר חלקיקים. התוצאות מוצגות כאן התקבלו עם זרמי 2.02 תוכנת חבילת 16 (להורדת תוכנה והמדריך למשתמש זמין בhttp://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml).
- לדלל את microbeads הניאון (קוטר ~ מיקרומטר 1) במים מעוקרים לריכוז סופי מוצק של 0.2% ונפח סופי של 0.5 מיליליטר. מערבולת לוודא כי microbeadsהם התפזרו גם.
- הזרק ולספק את microbeads פלורסנט המדולל לתוך תא הזרימה בעקבות הליכים מצעדים 3.3-3.5. כדי לאפשר מעקב מדויק של מסלול החלקיקים, השתמש קצב זרימה נמוך יחסית (0.01 מיליליטר / שעה לתוצאות מעקב חלקיקים במאמר זה).
- לעבור הגדרות confocal לxyt מצב כדי לעקוב אחר תנועת חלקיקים בz-פרוסה אחת ולקחת תמונות בזמן סדרה. (במסגרת שיעור של 1 הרץ שימש לתוצאות הנציג שמוצגים במאמר זה.) הזרקת חלקיקים חזרו ותמונה במקומות שונים z לייצר תזרים שדה 3-D.
- טרום תהליך בזמן הסדרה תמונות confocal על ידי הפחתת אות הקרינה רקע (אות בתמונה נרכשה הראשונה של סט התמונה) באמצעות ImageJ (להורדת תוכנה ומדריך לנגיש בhttp://imagej.nih.gov/ij/) או תוכניות אחרות.
- בImageJ, לפתוח את התמונה הראשונה של קבוצת תמונה ולאחר מכן לייבא את סט התמונה. במסגרת הליך / תמונה Calculator, לחסר את התמונה הראשונה מסט התמונה. שמור את סט דימוי מעובד מראש.
- כדי לחשב את זרימת וקטורים, תמונות confocal זמן סדרת יבוא בזרמים 2.02. תחת "תצוגת תהליך פתוחה", לבחור ולבצע "זהה את החלקיקים". השתמש סף ראוי לזהות חלקיקים. השתמש 0.5 ו -5 מיקרומטר כספי מינימום וקוטר מרבי ל1 מיקרומטר חלקיקים.
- לאחר מכן, תחת "תצוגת תהליך פתוחה", לבחור ולבצע "צינור ניתוח PTV" כדי ליצור נתיבי חלקיקים. בדקו את נתיבי חלקיקים כדי לראות אם הם מייצגים תנועת חלקיקים. לבסוף, בחר ולבצע "צור שדה מהירות" כדי ליצור מפת זרימת וקטור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תא זרימת כניסה הכפולה לmicrofluidic מאפשר תצפית של צמיחת biofilm תחת שיפוע כימי מוגדר היטב שהוקם על ידי ערבוב של שני פתרונות בתוך תא הזרימה. השיפוע הכימי וכתוצאה מכך נצפה בעבר על ידי הזרקת צבע ומאופיין בפירוט על ידי et al שיר. 14. הדרגתיים ריכוז חלק נוצרו בכיוון הרוחבי, כפי שמוצג באיור 1. פרופיל הריכוז היה תלול ליד הכניסה ויש רגוע במורד הזרם עקב דיפוזיה (איור 1). כדי לצפות בהתפתחות biofilm תחת שיפוע תזונתי, השתמשנו בינוני מוגדרת מינימאלי צמיחה (בינוני FAB) עם גלוקוז רק הוסיף לכניסה אחת כמקור פחמן היחיד. זה הניב שיפוע גלוקוז בתא תא זרימה בעוד כל החומרים המזינים האחרים חולקו בצורה הומוגנית. הצמיחה של פ biofilms aeruginosa PAO1 היה מתואם חזק למשלוח המקומי של גלוקוז (איור 2).כמפל ריכוזי גלוקוז הרוחבי היה תלול ליד הכניסה, ביומסה biofilm הראתה ירידה דרמטית מהאזור גבוה של גלוקוז באזור הנמוך של גלוקוז. ככל ששיפוע גלוקוז הרוחבי רגוע במורד הזרם, ביומסה biofilm הפכה הומוגנית יותר. בנוסף, אנו מדגימים את השימוש בתא זרימה זו כדי לחקור את יחסי הגומלין של פ aeruginosa וא coli בbiofilms תחת שיפוע גלוקוז (איור 3). התוצאות הראו כי שני מינים אלה הראו דפוסים מרחביים שונים ביחסי צמיחה לשיפוע התזונתי, ולכן כבושים נישות אקולוגיות שונות: P. aeruginosa שלט ביומסה biofilm באזורים עם ריכוזים גבוהים של גלוקוז וא coli שלט באזורים עם ריכוזים נמוכים של גלוקוז (איור 3).
כדי להבין את המשוב בין צמיחת biofilm וזרימת הסביבה, אנו אפיינו את שדה הזרימה ביו גדל סביבסרטים של velocimetry מעקב חלקיקי ניאון תחת מיקרוסקופ confocal. התנועה הנצפית של microbeads הניאון המוזרק מוצגת בסרט 1. מידע זרימת וקטור מקומי היה שחולצה מן הממוצע של לפחות 4,200 מדידות של מהירויות חלקיקים באמצעות חבילת תוכנת הזרמים בדידות. מיפוי תלת ממדי של שדה הזרימה הושג על ידי מעקב אחר חלקיקים במספר עמדות אנכיות (איור 4). צמיחת biofilm גדל באופן משמעותי את זרימת ההטרוגניות (איור 4). זרימה ליד בסיס biofilm הסיטה סביב אשכולות biofilm, שמובילה להטרוגניות מוגברת וירידת מהירות (איור 4). זרימה בראש biofilm יש מהירות גבוהה יותר והומוגנית יותר (איור 4).
כדי להבין את ההטרוגניות הפנימית שנגרמה על ידי תחבורה מומסת מוגבלת בתוך biofilms, צפינו התחבורה של Cy5 בתוך biofilms ידי מיקרוסקופ confocal. חדירת זמן סדרהשל Cy5 לאשכול biofilm מוצג בסרט 2. עקומות חדירת זמן סדרת Cy5 מוצג בסרט 3. מקדם הדיפוזיה היעיל של Cy5 בbiofilms חושבה על ידי התאמת מודל דיפוזיה 1-D לפרופילי ריכוז Cy5:
כאשר C הוא ריכוז Cy5 רדיאלית-הממוצע מחושב מעוצמת הקרינה, והוא המרחק לbiofilm 17. Cy5 הראה את הריכוז הגבוה ביותר בזרימת כמויות גדולות וירד בתלילות בכניסה לbiofilm (איור 5).
איור 1. תא זרימת microfluidic כניסה כפולה ל. מילויים גלוקוז חלקים נוצרו בתוך תא הזרימה על ידי החדרת בינונית FAB לשני פתחי הכניסה עם מקור פחמן (גלוקו se) ניתן רק בכניסה אחת. כתוצאה דפוסים של גלוקוז בתוך תא הזרימה מסומן על ידי הצללה. הצללה כהה מייצגת ריכוזי גלוקוז גבוהים יותר. ההדמיה confocal בוצעה בתשעה מקומות בתא הזרימה. תוצאות מוצגות באיורים 2 ו -3 מתייחסים למקומות ממוספרים 1-9 באיור. נתון זה משתנה לאחר אל השיר et. (2014), איור. 1. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. צמיחת PAO1 biofilm תחת הדרגתיים של גלוקוז. Biofilms PAO1 3 ימים היו צילמו במקומות 9 מוצגים באיור 1. ריווח רשת = 18 מיקרומטר לתמונה 1-8 ו -24 מיקרומטר לתמונה 9.g "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. הפיתוח של פ aeruginosa וא biofilms coli כפולים מינים תחת הדרגתיים של גלוקוז. P. aeruginosa constitutively מבטא GFP, וbiofilms גם counterstained על ידי 62 SYTO, אשר הוא כתם חומצת גרעין כללי. תמונות המוצגות כאן הן שכבות של GFP (ירוק) וSYTO 62 ערוצים (אדום). פ aeruginosa אפוא ירוק או צהוב (ירוק + אדום), וא coli נראה אדום. ברים סולם = 47 מיקרומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
שדות איור וקטור מהירות 4. זרימה בz = 4, 10 ו -16 מיקרומטר סביב אשכול biofilm. אורך החץ מייצג את הגודל של המהירות. נמוכה מהירות זרימה מראה בבסיס biofilm (z = 4, חיצים כחולים). הזרימה היא יותר הומוגנית ליד ראש biofilm (z = 16, חיצים אדומים). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. Cy5 חדירה לbiofilms. (א) Confocal מיקרוסקופ בz = 18 מיקרומטר מראה חדירה חלקית של Cy5 לאשכולות biofilm בt = 190 שניות. ברים סולם = 10 מיקרומטר. (ב) כתוצאה דפוסי מפת ריכוז Cy5. (C) פרופיל ריכוז Cy5 באשכול biofilm אחד. "Target =" 602fig5large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. נהלים כדי ליצור פרופיל חדירת Cy5 שמאל:. נבחרים ROI המכיל מקבץ biofilm 2-D. מפת מרחק של אשכול biofilm: התיכון. מימין: פרופיל עצמת Cy5 רדיאלית-בממוצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.
סרט 1: Motion של חלקיקי ניאון מוזרקים סביב אשכולות biofilm (וידאו confocal).
סרט 2: רביה של Cy5 לאשכולות biofilm (וידאו confocal).
_content "> סרט 3: רביה של Cy5 לאשכולות biofilm (ריכוז פרופילי וידאו).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנחנו הוכיחו חבילה של שיטות כדי לאפיין שלוש אינטראקציות biofilm-סביבה חשובות: תגובת biofilm הדרגתי כימי, השפעות של צמיחת biofilm על זרימת מייקרו-הסביבה שמסביב, וההטרוגניות biofilm כתוצאה ממגבלות תחבורה פנימיות.
אנחנו הראיתי לראשונה את השימוש בזרימת microfluidic תא רומן להטיל שיפוע כימי מוגדר היטב לפיתוח biofilm. כדי ליצור שיפוע כימי מוגדר היטב בתוך תא הזרימה, חשוב לשמור על אותו קצב הזרימה לשני פתחי הכניסה. ודא שמשאבת peristaltic מותאמת גם עבור שני ערוצי הזרימה לספק בינוני לגדול באותו קצב. כמו כן יש לוודא שאין סתימה בנתיב הזרימה במהלך צמיחת biofilm. תצפיות של הצמיחה של biofilms כפולי מינים בתכנית תא זה זרימה שהדרגתית כימי השפיע על צמיחת biofilm ואינטראקציות בין-מינים בתוך biofilms מאוד. מילויים כימיים נפוצים בסביבות שבן biofilms לגדול, בשל שילוב של מגבלות תחבורה, כימי מחייבים ותגובות, וספיגה של חיידקים וחילוף חומרים 18-20. תא זרימת microfluidic זה מאפשר חקירות של פעילויות biofilm מגוונות תחת טווח מוגדר של תנאים כימיים בהתקן יחיד. לדוגמא, תא זרימה זו הודגם להיות שימושי לחקר הרג biofilm תחת שיפוע מיקרוביאלית 14.
לאחר מכן, אנו מדגימים את השימוש בvelocimetry מעקב חלקיקים לצפות בשדה הזרימה סביב אשכולות biofilm. כדי להבטיח מעקב מדויק של חלקיקי ניאון המוזרקים, קצב הזרימה צריך להיות מותאם. בדרך כלל, קצב זרימה נמוך מאפשר התנועה של חלקיקים כדי לנפול בפח בתחום confocal מבט. כמו כן במסגרת שיעור הסריקה צריכה להיות מותאמת לאיזון איכות תמונה ורזולוציה זמן. אם החלקיקים לנוע מהר מדי עבור לכידת התנועה, להשתמש בקו תחתון או ממוצע מסגרת או increמהירות סריקת ASE. אנחנו מיפינו את שדה הזרימה בשלוש עמדות אנכיות מעל אשכול biofilm, ומצאנו כי צמיחת biofilm הגדילה את זרימת ההטרוגניות. המאפיין את שדה הזרימה סביב biofilms מאפשר אינטראקציות זרימת biofilm מפתח כדי להיחקר. לדוגמא, זה יכול לשמש כדי להעריך מנגנונים המווסתים את גרירת נוזל וגזירה מעל biofilm, וכישלון biofilm וכתוצאה מכך וניתוק של תאים מפני השטח 1,21. תהליכים אלה חשובים להבנת שתי ההשפעות של biofilms על זרימת מערכות (לדוגמא, biofouling) ורגולציה של מורפולוגיה biofilm 8. תנאי זרימה סביב biofilms גם לשלוט תחבורה המונית, וזה חשוב למגוון רחב של תהליכי biofilm. לדוגמא, מהירות הנוזל המקומית על פני השטח biofilm משפיעה על האספקה של חומרים מזינים ומצעים לbiofilms באמצעות Advection 22.
לבסוף, הראינו את השימוש בהזרקת קליעים נותבים ניאון כדי לנתחדפוסי תחבורה מומסת בתוך biofilm. אנחנו השתמשנו Cy5 כאן כנותבתי שמרני, ופלואוריד זה מופיע לעתים קרובות להתנהג באופן שמרני בbiofilms 23. לכן התוצאות צריכה להיות נציג של דפוסי התחבורה של מומסים הלא מגיבים, ניטראליים בbiofilms. התוצאות הראו ירידה חדה של ריכוז Cy5 קרוב לפני שטח biofilm, מניב ריכוז Cy5 בחלק הפנימי של biofilm רק ~ 50% מהריכוז בזרימה בתפזורת. פרופילי ריכוז תלולים כזה עולים בקנה אחד עם מדידות שדווחו בעבר של חמצן, חומרי מזון וantimicrobials בתוך biofilms 2,24. עקומות חדירת Cy5 לספק מידע על דיפוזיה מומסת באשכולות biofilm. עם זאת, השיטה שאנו מציגים כאן היא מוגבלת לנתח תחבורה מומסת 2-D במטוסים אופקיים (XY) בbiofilms. עם יכולת חדשה יותר מהירה הדמיה, למשל מסתובב מיקרוסקופיה confocal דיסק, חדירת צבע יכולה גם להיות דמיין ב3-D בתוך biofilms, WHIch יאפשר חקירה על תהליכי הובלה אנכיים. יתר על כן, נותב וחלקיקי ניאון ניתן להזריק יחד כדי להשיג מידע של תנאי זרימה חיצוניים ותחבורה מומסת פנימית באותו הזמן. מידע כזה הוא שימושי כדי לבדל תחבורה מומסת advective וdiffusive בין זרימה וbiofilms תפזורת ולהעריך את ההשפעה של זרימה חיצונית על התחבורה מומסת פנימית בbiofilms.
בסך הכל, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים של שימוש בתא זרימת microfluidic רומן שמספק מוגדר היטב הדרגתיים כימי לחקר תגובות biofilm לאותות כימיים בסביבה. לאפיין טוב יותר את ההטרוגניות בbiofilms וmicrohabitat סביבם, אנו מציגים כאן שיטות כדי לאפיין את הדפוסים בשני תחום הזרימה סביב biofilms ותחבורה מומסת פנימית בתוך biofilms. כל שיטה מספקת מידע ייחודי על נכסי biofilm ו / או תנאי סביבה. מאז שיטות אלהמשולבים, ניתן להשיג היבטים רבים של מידע בו זמנית. מידע משולב מאפשר לחוקרים לגשת לבעיות מורכבות יותר. לדוגמא, על ידי שימוש בשיטות אלה, נתחנו בהצלחה פיתוח biofilm ואינטראקציות interspecies בbiofilms תחת שיפוע מזין. שיטות אלה גם מספקות יכולת ניסיונית כדי להגדיל את המורכבות בקהילת החיידקים והסביבה הכימית, המאפשרת חקירות בתהליכי biofilm בהקשר מציאותי יותר. יישומים אפשריים של שיטות אלה לכסות היבטים שונים של מחקר biofilm, כוללים מחזור החיים biofilm, biofilms multispecies, ההטרוגניות biofilm, תהליכי הובלה בbiofilms, וbiofilm זרימת גומלין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים למאט Parsek באוניברסיטת וושינגטון (סיאטל, וושינגטון) למתן פ aeruginosa וא זני coli ורוג'ר נוקס באוניברסיטת קנטרברי (ניו זילנד) למתן גישה לתוכנת זרמים. עבודה זו נתמכה על ידי R01AI081983 מענק מהמכון הלאומי לבריאות, המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות. ההדמיה confocal בוצעה במתקן נורת 'ווסטרן הביולוגי ההדמיה (BIF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| Pump Tubing 0.50 mm OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1 L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 ml TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters - sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, Suppl 1. 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
