Abstract
Biofilms जटिल संरचना है और महत्वपूर्ण स्थानिक विषमताओं का उत्पादन है कि सतह से जुड़ी सूक्ष्म समुदायों कर रहे हैं। Biofilm विकास दृढ़ता से आसपास के प्रवाह और पोषण वातावरण द्वारा नियंत्रित किया जाता है। Biofilm विकास भी जटिल प्रवाह खेतों और घुला हुआ पदार्थ परिवहन पैटर्न उत्पन्न करके स्थानीय microenvironment की विविधता बढ़ जाती है। Biofilms और उनके स्थानीय माइक्रो-वास के बीच biofilms और बातचीत में विविधता के विकास की जांच करने के लिए, हम Pseudomonas aeruginosa के मोनो प्रजातियों biofilms और पी के दोहरे प्रजातियों biofilms बढ़ी एक microfluidic प्रवाह सेल में पोषक तत्वों की ढ़ाल के तहत aeruginosa और Escherichia कोलाई। हम प्रवाह कोशिका के भीतर पोषक तत्व ढ़ाल बनाने के लिए और बढ़ रही है और इन परिस्थितियों में biofilm विकास दृश्यमान करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम भी ऑप्टिकल तरीकों की एक श्रृंखला के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल वितरित प्रवाह, biofilm संरचना में स्थानिक पैटर्न यों के लिएbutions चारों ओर biofilms, और जन परिवहन के ऊपर और biofilm कालोनियों के भीतर। इन विधियों biofilm और वास विविधता के सह-विकास की व्यापक जांच का समर्थन है।
Introduction
एक बाह्य-मैट्रिक्स बहुलक एक में संलग्न सेल समुच्चय - सूक्ष्मजीवों सतहों और फार्म biofilms को देते हैं। Biofilms सेलुलर चयापचय 2,3 में आंतरिक घुला हुआ पदार्थ परिवहन सीमाओं और स्थानिक विविधताओं का एक संयोजन से उत्पन्न नाटकीय स्थानिक विविधता है क्योंकि biofilms, बहुत अलग ढंग से व्यक्तिगत माइक्रोबियल कोशिकाओं से व्यवहार करते हैं। ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की सांद्रता काफी biofilm और तरल पदार्थ और आगे biofilm 2 में भीतर समाप्त हो पाने के लिए आसपास के बीच इंटरफेस में कमी। Biofilm श्वसन और प्रोटीन संश्लेषण में स्थानिक विविधताओं भी स्थानीयकृत ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की उपलब्धता 2 के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में हो सकता है।
जलीय और मिट्टी के वातावरण में, ज्यादातर बैक्टीरिया biofilms में ध्यान केन्द्रित करना। प्राकृतिक biofilms कार्बन और नाइट्रोजन साइकिल और धातु 4,5 को कम करने सहित महत्वपूर्ण biogeochemical प्रक्रियाओं के लिए बाहर ले। चिकित्सकीय, biofilm गठन respons हैलंबे समय तक फेफड़े और मूत्र संक्रमण 6 के लिए ible। Biofilms में कोशिकाओं को उनके planktonic समकक्षों 6 की तुलना में antimicrobials करने के लिए अत्यंत उच्च प्रतिरोध किया है क्योंकि biofilm से जुड़े संक्रमण अत्यधिक समस्याग्रस्त हैं। Biofilms विविध सेटिंग में महत्वपूर्ण होते हैं, क्योंकि अनुसंधान के एक पर्याप्त राशि biofilm गतिविधियों और biofilms में स्थानिक विविधता और आसपास microenvironment कि नियंत्रण पर्यावरणीय कारकों को समझने पर ध्यान केंद्रित किया गया है।
पिछले अध्ययनों biofilm विकास दृढ़ता से पर्यावरणीय कारकों की एक संख्या के द्वारा नियंत्रित किया जाता है कि मिल गया है: biofilms विभिन्न प्रवाह शर्तों के तहत विभिन्न morphologies विकसित करना; ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की उपलब्धता प्रभाव biofilm आकृति विज्ञान; और hydrodynamic कतरनी तनाव सतहों planktonic कोशिकाओं के लगाव और biofilms 7-9 से कोशिकाओं की टुकड़ी को प्रभावित करता है। इसके अलावा, बाह्य प्रवाह हालत substrates के पूर्णांक के वितरण को प्रभावित करती हैओ और biofilms 10 के भीतर। biofilms के विकास में भी भौतिक और रासायनिक परिस्थितियों के आसपास के बदल। उदाहरण के लिए, biofilm विकास ऑक्सीजन और पोषक तत्वों दो की स्थानीय कमी की ओर जाता है; biofilms आसपास के वातावरण में 11 से अकार्बनिक और कार्बनिक यौगिकों जमा; और biofilm समूहों प्रवाह को और बढ़ाने की सतह घर्षण 12,13 हटाने की। Biofilms उनके बहुत जटिल तरीकों से आसपास के वातावरण के साथ बातचीत है, क्योंकि यह एक साथ biofilm गुण और पर्यावरण की स्थिति के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, और बहु अनुशासनिक दृष्टिकोण व्यापक biofilm से पर्यावरण बातचीत चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है।
यहाँ हम एक लगाया पोषण ढाल के तहत मोनो प्रजातियों और दोहरे प्रजातियों biofilms भीतर माइक्रोबियल विकास में स्थानिक पैटर्न विशेषताएँ, और स्थानीय रासायनिक और तरल पदार्थ microenvironment के परिणामस्वरूप संशोधन निरीक्षण करने के लिए एकीकृत तरीकों की एक श्रृंखला प्रस्तुत करते हैं। हम प्राथमिकीसेंट अच्छी तरह से परिभाषित रासायनिक ढ़ाल के तहत biofilm विकास निरीक्षण करने के लिए एक हाल ही में विकसित डबल इनलेट microfluidic प्रवाह सेल के उपयोग का वर्णन। हम तो पोषक तत्वों की स्थितियों की एक श्रृंखला के तहत biofilms में बैक्टीरिया, Pseudomonas aeruginosa और Escherichia कोलाई, की दो प्रजातियों के विकास का निरीक्षण करने के लिए इस microfluidic प्रवाह सेल के उपयोग के प्रदर्शन। हम biofilm कालोनियों में फ्लोरोसेंट ट्रेसर प्रसार की सीटू दृश्य में मात्रात्मक biofilms में घुला हुआ पदार्थ परिवहन के पैटर्न का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे दिखा। अंत में, हम confocal माइक्रोस्कोपी के तहत प्रदर्शन microscale कण ट्रैकिंग velocimetry, बढ़ रही है, biofilms के आसपास स्थानीय प्रवाह क्षेत्र प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे दिखा।
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Protocol
1. प्रवाह सेल सेटअप और टीका
नोट:। में गाने एट अल वर्णित एक डबल इनलेट microfluidic प्रवाह सेल का प्रयोग करें, 2014 14 biofilms विकसित करने के लिए। इस प्रवाह सेल अच्छी तरह से परिभाषित चिकनी रासायनिक ढ़ाल बनाने में सक्षम है। प्रवाह सेल डिजाइन पहले से गाने में वर्णित किया गया था 1 चित्र में दिखाया गया है और कोशिका निर्माण प्रवाह है एट अल।, 2014 14। यहाँ हम विस्तार हमारे तरीके पी का उपयोग करके aeruginosa और ई कोलाई biofilms फार्म करने के लिए, लेकिन अन्य प्रजातियों को भी उपयुक्त हो सकता है। हम पी इस्तेमाल किया aeruginosa अनिवार्यता से biofilm विकास के लिए एक मॉडल जीव के रूप में, एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करता है जो GFP, PAO1-। इसके अतिरिक्त, हम ई इस्तेमाल किया कोलाई DH5α पी के साथ मिश्रित प्रजातियों biofilms फार्म के लिए aeruginosa पी। aeruginosa और ई कोलाई उपभेदों लेग अगर प्लेटों पर बड़े हो रहे थे।
- एक करने के लिए (PDMS) बाध्य प्रवाह सेल का उपयोग कर polydimethylsiloxane तैयार करें14 में वर्णित के रूप में ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार के माध्यम से गिलास coverslip। प्रवाह सेल चैंबर के आयाम 0.24 मिमी (लंबाई × चौड़ाई × गहराई) × 23 मिमी 13 × मिमी हैं।
- तैयार करें फैब मध्यम विकास 15 संशोधित। प्रवाह सेल के भीतर एक पोषण ढाल के तहत biofilm विकास का निरीक्षण करने के लिए, एक इनलेट में 0.6 माइक्रोन ग्लूकोज के साथ 15 मध्यम फैब संशोधित और अन्य इनलेट माध्यम से किसी भी कार्बन स्रोत के बिना फैब मध्यम परिचय परिचय। फिल्टर बाँझ (ताकना आकार = 0.2 माइक्रोन) फैब मध्यम करने के लिए इसे जोड़ने से पहले ग्लूकोज स्टॉक समाधान (60 मिमी)। इसके अलावा चक्र एक साथ फैब मध्यम आटोक्लेव (तरल, 15 मिनट, 121 डिग्री सेल्सियस, 17 साई) उपयोग करने से पहले।
- प्रवाह प्रणाली जीवाणुरहित। टीका करने से पहले, पूरे प्रवाह पथ (मध्यम बोतलें, ट्यूबिंग, बुलबुला जाल, प्रवाह कोशिकाओं) प्रवाह सेल के ऊपर स्थित (डिस्पोजेबल और पूर्व निष्फल) प्लास्टिक तीन तरह वाल्व के लिए छोड़कर, चक्र 1 का उपयोग आटोक्लेव। (तीन तरीके वाल्व सेल सी इंजेक्शन लगाने के लिए उपयोग किया जाता हैulture, फ्लोरोसेंट ट्रेसर और microbeads।), विधानसभा के दौरान संक्रमण से बचने के एल्यूमीनियम पन्नी या वाष्पदावी पहले आटोक्लेव बैग के साथ सभी ट्यूबिंग और कनेक्टर के उद्घाटन को कवर करने के लिए।
- प्रवाह प्रणाली से कनेक्ट करें। ध्यान से प्रवाह सेल प्रणाली के घटकों को इकट्ठा (प्रवाह प्रणाली विधानसभा के लिए वीडियो देखें) और ठीक प्रवाह की दर को नियंत्रित करता है कि एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के माध्यम से प्रवाह सेल करने के लिए मध्यम विकास उद्धार।
- पी के एक कॉलोनी स्थानांतरित द्वारा टीका के लिए सेल संस्कृति को तैयार aeruginosa या ई लेग प्लेटों से तीन लेग शोरबा की मिलीलीटर और 225 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति ओ / एन मिलाने के लिए कोलाई। एक अंतिम 600 आयुध डिपो के लिए पानी निष्फल 1 मिलीलीटर में हे / एन सेल संस्कृतियों पतला = 0.01 inoculum के रूप में। (संस्कृति और प्रदूषण से बचने के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड में बैक्टीरिया पतला।)
- एक बराबर 600 आयुध डिपो के साथ एक मिलीलीटर में 1 = 0.01 प्रत्येक जीवाणु के लिए: मिश्रित प्रजातियों biofilms साथ प्रयोगों के लिए, एक के अनुपात को दो बैक्टीरियल संस्कृतियों पतला।
- प्रवाह सेल टीका लगाना। तीन तरह वाल्व से प्रवाह सेल इनलेट को inoculum के 1 मिलीलीटर इंजेक्षन। इंजेक्शन के बाद, बैक्टीरियल कोशिकाओं गिलास को कवर करने के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति देने के लिए एक घंटे के लिए प्रवाह को रोकते हैं। (प्रवाह सेल निलंबित कोशिकाओं coverslip पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए नीचे coverslip के पक्ष के साथ रखा गया है कि सुनिश्चित करें।)
- 1 घंटे बाद, प्रवाह फिर से शुरू और तीन दिनों के लिए प्रत्येक इनलेट के लिए 0.03 मिलीग्राम / मिनट की एक स्थिर दर पर प्रवाह सेल करने के लिए मध्यम विकास पंप।
Confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग पोषक तत्व अनुपात के जवाब में 2. निस्र्पक Biofilm विकास
नोट: पी aeruginosa अनिवार्यता से व्यक्त GFP के साथ imaged, लेकिन ई किया जा सकता है मिश्रित प्रजातियों biofilms में कोलाई counterstaining ने उतारी जानी चाहिए।
- Confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग 3 दिन biofilms का निरीक्षण करें। प्रतिनिधि परिणामों के लिए, एक 63X उद्देश्य के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग biofilms निरीक्षण करते हैं। इमेजिंग के लिए पहले, निशानकांच कवर पक्ष पर एक ग्रिड के साथ डबल प्रवेश प्रवाह सेल। (इस ग्रिड के उद्देश्य प्रयोगकर्ता प्रवाह सेल कक्ष के भीतर इमेजिंग क्षेत्रों का पता लगाने की अनुमति देने के लिए है।)
- ऐसे STYO 62 के रूप में, 990 μl में शेयर समाधान (1 मिमी) पानी निष्फल और फिर धीरे धीरे एक सिरिंज में उपयोग करते हुए पतला दाग इंजेक्षन ऐसे हरी फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग के रूप में सेल-permeant लाल फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग के 10 μl, पतला, counterstain करने के लिए नदी के ऊपर तीन तरह वाल्व से प्रवाह सेल चैंबर। स्थिर प्रवाह सेल रखें और 30 मिनट के लिए अंधेरे में, फिर 15 मिनट के लिए अपार दाग को धोने के लिए प्रवाह फिर से शुरू।
- Confocal इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं। उत्तेजना के लिए 488 एनएम आर्गन लेजर और GFP (500-535 एनएम) और (हरी फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग के लिए, 650-750 एनएम) न्यूक्लिक एसिड दाग के लिए चैनलों को एकत्रित उत्सर्जन को सक्रिय करें। चमकदार और साफ छवियों है करने के लिए दोनों चैनलों के लिए लाभ और ऑफ़सेट समायोजित करें। चयन करें XYZ और साथ इमेजिंग मोड। IDEN को जेड नियंत्रण घुंडी का प्रयोग करेंक्षेत्र में biofilm के नीचे और ऊपर tify। एक 3 डी छवि ढेर प्राप्त करने के लिए 0.5 माइक्रोन से Z-कदम सेट करें। (छवि अधिग्रहण के लिए चार के एक लाइन औसत का उपयोग, उच्च छवि गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए।)
- तीन या कम स्थानिक प्रवाह सेल के भीतर biofilm विकास के पैटर्न, छवि biofilms मैप में और अधिक अनुदैर्ध्य (एक्स) प्रवाह सेल इनलेट साथ दूरी, और चित्र 1 में दिखाया के रूप में तीन अनुप्रस्थ (y), लगाया पोषण ढाल करने के रिश्तेदार की स्थिति ।
कंजर्वेटिव फ्लोरोसेंट ट्रेसर का इंजेक्शन द्वारा 3. निस्र्पक आंतरिक घुला हुआ पदार्थ परिवहन
नोट: इस तरह के Cy5 के रूप में एक रूढ़िवादी फ्लोरोसेंट ट्रेसर, biofilm भीतर घुला हुआ पदार्थ परिवहन पैटर्न विशेषताएँ इस्तेमाल किया जा सकता है।
- एक शेयर के समाधान के रूप में मिलीलीटर 10 मिलीग्राम / के अंतिम एकाग्रता के लिए पानी में Cy5 (मोनो-रिएक्टिव एनएचएस एस्टर) भंग। एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में Cy5 शेयर समाधान स्टोर।
नोट: Cy5 प्रकाश Sensit है के रूप मेंIve, स्टोर, पतला और अंधेरे में Cy5 समाधान इंजेक्षन। - फ्लोरोसेंट ट्रेसर के इंजेक्शन से पहले, (एक 63X उद्देश्य के साथ) confocal माइक्रोस्कोपी के साथ तीन दिवसीय biofilm की एक 3 डी छवि ढेर ले लो। (Biofilm कालोनियों के वाइड क्षेत्रों डाई परिवहन के समय श्रृंखला टिप्पणियों के लिए आदर्श होते हैं।) (चित्रा 5 ए में दिखाया गया है) इसके अलावा इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अलग कालोनियों के साथ एक Z-विमान का चयन करें।
- प्रत्येक Cy5 इंजेक्शन प्रयोग के लिए, 20 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के एक Cy5 एकाग्रता होने एक इंजेक्शन समाधान उपज के लिए पानी निष्फल 998 μl में Cy5 शेयर समाधान के 2 μl पतला।
- प्रवाह को रोकते हैं और तीन तरह वाल्व के माध्यम से एक सिरिंज का उपयोग प्रवाह सेल के अपस्ट्रीम में Cy5 समाधान इंजेक्षन करने के लिए पंप बंद करो। (यह इंजेक्शन लगाने जबकि प्रवाह पथ में प्रवेश करने से हवाई बुलबुले को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। बुलबुला जाल वापस इंजेक्शन के दौरान खुला रखा जाना चाहिए।)
- Cy5 समाधान इंजेक्शन लगाने के बाद, तीन तरह वाल्व समायोजित, बुलबुला जाल बंद करें, और पुनः आरंभप्रवाह सेल में इंजेक्शन Cy5 समाधान देने के लिए पंप।
- Xyt को confocal इमेजिंग मोड स्विच। साथ इमेजिंग मोड के तहत Cy5 और GFP चैनलों को सक्रिय करें। (, लेजर तीव्रता हासिल करने और ऑफसेट) Cy5 तीव्रता पर confocal सेटिंग्स समायोजित मात्रा का ठहराव के लिए महत्वपूर्ण है जो संकेत है, saturating से बचने के लिए। (उच्च अस्थायी समाधान डाई पैठ दृश्यमान करने के लिए पसंद किया जाता है। हालांकि, तेजी से स्कैनिंग छवि गुणवत्ता घट जाती है।) इमेजिंग के समय संकल्प और छवि गुणवत्ता संतुलन के लिए उचित स्कैनिंग गति और रेखा औसत चुनें। इस प्रोटोकॉल के लिए चार के एक लाइन के औसत और 0.15 हर्ट्ज के एक फ्रेम दर का उपयोग करें।
- (अभी भी 0.03 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर) प्रवाह सेल में Cy5 वितरित करने के लिए प्रवाह फिर से शुरू करें। इसके साथ ही समय-श्रृंखला confocal इमेजिंग शुरू करते हैं।
- त्रिज्यात एक 2-डी परिपत्र biofilm कॉलोनी के भीतर Cy5 तीव्रता औसत से Cy5 पैठ यों। पहले एक biofilm क्लस्टर के किनारे की पहचान, औसत करने के लिए, तो क्लस्टर के एक दो-विकास खंड के लिए एक दूरी नक्शा उत्पन्न, और अंत में Cy5 तीव्रता के औसत रेडियल पैटर्न पैठ वक्र (6 चित्रा देखें) उत्पन्न करने के लिए।
- Computationally 3.8 कदम का एहसास करने के लिए, BioSPA (Biofilm स्थानिक पैटर्न विश्लेषण) सॉफ्टवेयर पैकेज (अप्रकाशित, सॉफ्टवेयर पैकेज और मैनुअल अनुरोध पर उपलब्ध है) या अन्य छवि विश्लेषण कार्यक्रमों का उपयोग करें।
- BioSPA का उपयोग करने के लिए, पहली BioSPA में सेट एक छवि आयात करते हैं। तब द्विआधारी चित्र बनाने के लिए GFP और Cy5 चैनलों के लिए उचित सीमा से चुनें। विश्लेषण / गणना मेनू में, उन्नत विश्लेषण और फिर प्रसार विश्लेषण का चयन करें। एक क्लस्टर की बढ़त को परिभाषित करने और ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र के रूप में एक समूह का चयन करने के लिए बहुभुज उपकरण का उपयोग करने के लिए GFP चैनल का उपयोग करें।
- डबल प्रसार विश्लेषण करने के लिए चयनित biofilm क्लस्टर क्लिक करें। प्रसार विश्लेषण परिणामों को बचाने और एक अंशांकन वक्र का उपयोग Cy5 एकाग्रता के लिए Cy5 तीव्रता जांचना।
- एक Cy5 conce अधिक Cy5 तीव्रता को मापने, Cy5 एकाग्रता अंशांकन वक्र उत्पन्न करने के लिएconfocal माइक्रोस्कोपी के तहत ntration ढाल। (Cy5 तीव्रता और एकाग्रता एक रेखीय रिश्ता है।)
4. ट्रैकिंग फ्लोरोसेंट कणों से आसपास के प्रवाह क्षेत्र निस्र्पक
नोट: इस तरह के फ्लोरोसेंट microbeads के रूप में फ्लोरोसेंट कणों, biofilms आसपास के प्रवाह क्षेत्र चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Biofilms आसपास के प्रवाह क्षेत्र कण ट्रैकिंग velocimetry सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कण पदों की समय-श्रृंखला टिप्पणियों से गणना की जा सकती है। यहाँ दिखाए गए परिणामों धाराओं 2.02 सॉफ्टवेयर पैकेज 16 (सॉफ्टवेयर डाउनलोड और कम से उपलब्ध उपयोगकर्ता गाइड के साथ प्राप्त किया गया http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml )।
- 0.2% की एक अंतिम ठोस एकाग्रता और 0.5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए निष्फल पानी में फ्लोरोसेंट microbeads (व्यास ~ 1 माइक्रोन) पतला। भंवर microbeads के लिए सुनिश्चित करें किअच्छी तरह बिखरे हैं।
- इंजेक्षन और कदम 3.3-3.5 से प्रक्रियाओं का पालन प्रवाह सेल में पतला फ्लोरोसेंट microbeads के उद्धार। कण पथ के एक सटीक ट्रैकिंग, (इस पत्र में कण ट्रैकिंग परिणामों के लिए 0.01 मिलीग्राम / घंटा) एक अपेक्षाकृत कम प्रवाह दर का उपयोग की अनुमति है।
- एक Z-टुकड़ा पर कण आंदोलन को ट्रैक और समय श्रृंखला चित्र लेने के लिए मोड xyt को confocal सेटिंग्स स्विच। (1 हर्ट्ज की एक फ्रेम दर इस पत्र में दिखाया प्रतिनिधि परिणामों के लिए इस्तेमाल किया गया था।) दोहराएँ कण इंजेक्शन और छवि अलग Z स्थानों पर 3-डी प्रवाह क्षेत्र उत्पन्न करने के लिए।
- प्री-प्रक्रिया में समय-सीरीज (पर उपलब्ध सॉफ्टवेयर डाउनलोड और मैनुअल ImageJ का उपयोग पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संकेत (छवि सेट के पहले अधिग्रहीत छवि में संकेत) को घटाकर की confocal छवियों http://imagej.nih.gov/ij/ ) या अन्य कार्यक्रमों के।
- ImageJ में, एक छवि सेट की पहली छवि को खोलने के लिए और फिर छवि सेट आयात करते हैं। प्रक्रिया के तहत / छवि सीएlculator, छवि सेट से पहले छवि घटाना। पूर्व प्रसंस्कृत छवि सेट बचाओ।
- धाराओं 2.02 में प्रवाह वैक्टर, आयात समय श्रृंखला confocal छवियों की गणना करने के लिए। "ओपन प्रक्रिया दृश्य" के तहत, का चयन करें और "कणों को पहचानें" निष्पादित। कणों की पहचान करने के लिए उचित दहलीज का प्रयोग करें। 1 माइक्रोन कणों के लिए न्यूनतम और अधिकतम व्यास थ्रेसहोल्ड के रूप में 0.5 और 5 माइक्रोन का प्रयोग करें।
- फिर "ओपन प्रक्रिया को देखने" के अंतर्गत, चयन और कण रास्तों उत्पन्न करने के लिए "पीटीवी विश्लेषण पाइपलाइन" निष्पादित। वे कण आंदोलन का प्रतिनिधित्व करते हैं देखने के लिए अगर कण रास्तों की जाँच करें। अंत में, का चयन करें और एक प्रवाह वेक्टर नक्शा उत्पन्न करने के लिए "वेग क्षेत्र बनाएँ" निष्पादित।
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Representative Results
डबल इनलेट microfluidic प्रवाह सेल प्रवाह कक्ष के भीतर दो समाधान का मिश्रण द्वारा गठित एक अच्छी तरह से परिभाषित रासायनिक ढाल के तहत biofilm विकास के अवलोकन की अनुमति देता है। जिसके परिणामस्वरूप रासायनिक ढाल पूर्व डाई इंजेक्शन द्वारा मनाया और सांग एट अल। 14 से विस्तार में विशेषता थी। चित्र 1 में दिखाया के रूप में चिकनी एकाग्रता ढ़ाल, अनुप्रस्थ दिशा में गठन किया गया। एकाग्रता प्रोफाइल इनलेट के पास खड़ी थी और कारण प्रसार (चित्रा 1) करने के लिए नीचे की ओर आराम से हो गया। एक पोषण ढाल के तहत biofilm विकास का निरीक्षण करने के लिए, हम केवल एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में एक इनलेट में जोड़ा ग्लूकोज के साथ एक परिभाषित कम से कम मध्यम विकास (फैब माध्यम) का इस्तेमाल किया। अन्य सभी पोषक तत्वों समान वितरित किए गए, जबकि इस प्रवाह सेल कक्ष में एक ग्लूकोज ढाल झुकेंगे। पी की वृद्धि aeruginosa PAO1 biofilms दृढ़ता से ग्लूकोज की स्थानीय वितरण (चित्रा 2) के लिए सहसंबद्ध किया गया था।अनुप्रस्थ ग्लूकोज एकाग्रता ढाल इनलेट के पास खड़ी थी, biofilm बायोमास कम ग्लूकोज क्षेत्र के लिए उच्च ग्लूकोज क्षेत्र से एक नाटकीय कमी देखी गई। नीचे की ओर ढील अनुप्रस्थ ग्लूकोज ढाल के रूप में, biofilm बायोमास अधिक सजातीय बन गया। हम आगे पी की बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस प्रवाह सेल के उपयोग का प्रदर्शन aeruginosa और ई एक ग्लूकोज ढाल के तहत biofilms में कोली (चित्रा 3)। परिणाम इन दो प्रजातियों के पोषण की ढाल के सापेक्ष वृद्धि में अलग स्थानिक पैटर्न से पता चला है, और इसलिए अलग पारिस्थितिक आलों पर कब्जा कर लिया है कि दिखाया: पी aeruginosa उच्च ग्लूकोज सांद्रता और ई के साथ क्षेत्रों में biofilm बायोमास का बोलबाला कोलाई कम ग्लूकोज सांद्रता (चित्रा 3) के साथ क्षेत्रों में बोलबाला है।
Biofilm विकास और आसपास के प्रवाह के माहौल के बीच प्रतिक्रिया को समझने के लिए, हम चारों ओर से बढ़ जैव प्रवाह क्षेत्र की विशेषताconfocal माइक्रोस्कोपी के तहत फ्लोरोसेंट कण ट्रैकिंग velocimetry द्वारा फिल्मों। इंजेक्ट फ्लोरोसेंट microbeads की मनाया आंदोलन 1. स्थानीय प्रवाह वेक्टर जानकारी धाराओं सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कण वेग के कम से कम 4200 असतत माप की एक औसत से निकाला गया था फिल्म में दिखाया गया है। प्रवाह क्षेत्र के तीन आयामी मानचित्रण कई ऊर्ध्वाधर पदों (चित्रा 4) पर कणों पर नज़र रखने से प्राप्त हुई थी। Biofilm विकास में काफी वृद्धि हुई प्रवाह विविधता (चित्रा 4)। Biofilm बेस के निकट प्रवाह बढ़ विविधता के लिए अग्रणी biofilm समूहों के चारों ओर मोड़ा और वेग (चित्रा 4) की कमी हुई। Biofilm शीर्ष पर फ्लो उच्च वेग है और (चित्रा 4) अधिक सजातीय है।
Biofilms भीतर सीमित घुला हुआ पदार्थ परिवहन की वजह से आंतरिक विविधता को समझने के लिए, हम confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा biofilms भीतर Cy5 के परिवहन मनाया। समय श्रृंखला पैठCy5 की एक biofilm क्लस्टर में Cy5 एकाग्रता प्रोफाइल करने के लिए एक 1-डी प्रसार मॉडल फिटिंग द्वारा गणना की गई मूवी 3. biofilms में Cy5 के प्रभावी प्रसार गुणांक में दिखाया गया है मूवी 2. समय श्रृंखला Cy5 पैठ घटता में दिखाया गया है:
जहां सी प्रतिदीप्ति तीव्रता से गणना की त्रिज्यात-औसतन Cy5 एकाग्रता है, और biofilm 17 में दूरी है। Cy5 थोक प्रवाह में सर्वोच्च एकाग्रता से पता चला है और biofilm (चित्रा 5) में प्रवेश करने पर तेजी से कमी आई है।
1. डबल इनलेट microfluidic प्रवाह सेल चित्रा। चिकना ग्लूकोज ढ़ाल ग्लूको (एक कार्बन स्रोत के साथ दो inlets के लिए फैब मध्यम शुरू करने से प्रवाह कक्ष के भीतर बनाया गया एसई) एक इनलेट में ही प्रदान की है। छायांकन द्वारा संकेत कर रहे हैं प्रवाह सेल के भीतर ग्लूकोज के पैटर्न जिसके परिणामस्वरूप। डार्क छायांकन उच्च ग्लूकोज सांद्रता का प्रतिनिधित्व करता है। Confocal इमेजिंग प्रवाह सेल में नौ स्थानों पर प्रदर्शन किया गया था। 2 और 3 स्थानों का उल्लेख करने के आंकड़े में प्रस्तुत परिणाम चित्रा में 1-9 गिने। यह आंकड़ा गाने एट अल के बाद संशोधित किया गया है। (2014), अंजीर। 1। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
ग्लूकोज ढ़ाल के तहत चित्रा 2. PAO1 biofilm विकास। 3 दिन PAO1 biofilms चित्र 1 में दिखाया 9 स्थानों पर imaged थे। ग्रिड रिक्ति = छवि 1-8 के लिए 18 माइक्रोन और छवि 9 के लिए 24 माइक्रोन।जी "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. पी के विकास aeruginosa और ई ग्लूकोज ढ़ाल के तहत कोलाई दोहरे प्रजातियों biofilms पी। aeruginosa अनिवार्यता से GFP व्यक्त, और biofilms भी एक सामान्य न्यूक्लिक एसिड दाग है जो SYTO 62, द्वारा counterstained थे। यहाँ दिखाया छवियाँ GFP (हरा) और SYTO 62 (लाल) चैनलों की ओवरले हैं। पी aeruginosa इसलिए हरे या पीले रंग (ग्रीन + लाल), और ई प्रकट होता है कोलाई लाल दिखाई देता है। स्केल सलाखों 47 माइक्रोन =। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. प्रवाह वेग सदिश क्षेत्रों Z पर = 4, 10 और एक biofilm क्लस्टर लगभग 16 माइक्रोन। तीर की लंबाई वेग की भयावहता का प्रतिनिधित्व करता है। कम प्रवाह वेग biofilm आधार (जेड = 4, नीले तीर) में दिखाता है। फ्लो biofilm शीर्ष (जेड = 16, लाल तीर) के पास अधिक सजातीय है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Biofilms में चित्रा 5. Cy5 पैठ। टी = 190 सेकंड में biofilm समूहों में Cy5 की आंशिक पैठ दिखा Z = 18 माइक्रोन से कम (ए) Confocal माइक्रोग्राफ। स्केल सलाखों 10 माइक्रोन =। (बी) Cy5 एकाग्रता मानचित्र के पैटर्न जिसके परिणामस्वरूप। (सी) Cy5 एकाग्रता प्रोफाइल एक biofilm क्लस्टर में। 602fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
6. प्रक्रियाएं चित्रा एक Cy5 पैठ प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए वाम:। एक 2-डी biofilm क्लस्टर युक्त आरओआई चयनित। मध्य: biofilm क्लस्टर की दूरी नक्शा। अधिकार: त्रिज्यात-औसतन Cy5 तीव्रता प्रोफ़ाइल। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
मूवी 1 : biofilm समूहों के आसपास इंजेक्ट फ्लोरोसेंट कणों की गति (confocal वीडियो)।
फिल्म 2 : biofilm समूहों में Cy5 का प्रचार (confocal वीडियो)।
_content "> मूवी 3 : biofilm समूहों में Cy5 का प्रचार (एकाग्रता वीडियो प्रोफाइल)।Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biofilm रासायनिक ढ़ाल के जवाब, आसपास के प्रवाह microenvironment पर biofilm विकास, और आंतरिक परिवहन सीमाओं से उत्पन्न biofilm विविधता का प्रभाव: हम तीन महत्वपूर्ण biofilm से पर्यावरण बातचीत चिह्नित करने के तरीकों में से एक कमरे का प्रदर्शन किया।
हम पहले biofilm विकास के लिए एक अच्छी तरह से परिभाषित रासायनिक ढाल लागू करने के लिए एक उपन्यास microfluidic प्रवाह सेल के उपयोग के दिखाया। प्रवाह सेल के भीतर एक अच्छी तरह से परिभाषित रासायनिक ढाल उत्पन्न करने के लिए, यह दोनों inlets के लिए एक ही प्रवाह की दर बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप अच्छी तरह से एक ही दर से बढ़ने मध्यम देने के लिए दोनों प्रवाह चैनलों के लिए निकाला जाता है कि सुनिश्चित करें। इसके अलावा biofilm विकास के दौरान प्रवाह पथ में कोई clogging नहीं है सुनिश्चित करें। रासायनिक ढ़ाल बहुत biofilms भीतर biofilm विकास और अंतर-प्रजाति बातचीत प्रभावित है कि इस प्रवाह सेल शो में दोहरे प्रजातियों biofilms के विकास की टिप्पणियों। रासायनिक ढ़ाल में आम हैंपरिवहन सीमाओं, रासायनिक बंधन और प्रतिक्रियाओं, और माइक्रोबियल तेज और चयापचय 18-20 का एक संयोजन के कारण biofilms बढ़ने जहां वातावरण। इस microfluidic प्रवाह सेल एक ही उपकरण के भीतर रासायनिक स्थितियों की एक परिभाषित सीमा के तहत विविध biofilm की गतिविधियों की जांच के लिए सक्षम बनाता है। उदाहरण के लिए, इस प्रवाह सेल एक रोगाणुरोधी ढाल 14 के तहत biofilm हत्या के अध्ययन के लिए उपयोगी होने के लिए प्रदर्शन किया गया है।
हम तो biofilm समूहों के आसपास प्रवाह क्षेत्र का निरीक्षण करने के कण ट्रैकिंग velocimetry के उपयोग का प्रदर्शन किया। इंजेक्ट फ्लोरोसेंट कणों की एक सटीक ट्रैकिंग सुनिश्चित करने के लिए प्रवाह दर अनुकूलित किया जाना चाहिए। आमतौर पर, कम प्रवाह दर कणों की गति को देखने के confocal क्षेत्र में कब्जा किए जाने की अनुमति देता है। इसके अलावा स्कैनिंग फ्रेम दर छवि गुणवत्ता और समय संकल्प संतुलन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। कणों आंदोलन पर कब्जा करने के लिए भी तेजी से ले जाते हैं, कम लाइन या फ्रेम औसत या incre के उपयोगएएसई स्कैनिंग गति। हम एक biofilm क्लस्टर पर तीन खड़ी पदों पर प्रवाह क्षेत्र मैप किया है, और biofilm विकास प्रवाह विविधता बढ़ पाया। Biofilms आसपास के प्रवाह क्षेत्र निस्र्पक कुंजी प्रवाह biofilm बातचीत का पता लगाया जा करने के लिए अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, इस सतह 1,21 से कोशिकाओं के तरल पदार्थ खींचें और कतरनी biofilm से अधिक है, और जिसके परिणामस्वरूप biofilm विफलता और टुकड़ी को विनियमित तंत्र है कि मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इन प्रक्रियाओं को समझने के दोनों प्रवाह प्रणाली (जैसे, जैव अवरोध) और biofilm आकृति विज्ञान 8 के नियमन पर biofilms के प्रभाव के लिए महत्वपूर्ण हैं। Biofilms आसपास के प्रवाह की स्थिति भी biofilm प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए महत्वपूर्ण है जो जन परिवहन, नियंत्रित करते हैं। उदाहरण के लिए, biofilm सतह पर स्थानीय द्रव वेग advection 22 के माध्यम से biofilms के लिए पोषक तत्वों और substrates के वितरण को प्रभावित करती है।
अंत में, हम का विश्लेषण करने के लिए फ्लोरोसेंट ट्रेसर इंजेक्शन लगाने के उपयोग से पता चलाbiofilm भीतर घुला हुआ पदार्थ परिवहन पैटर्न। हम एक रूढ़िवादी अनुरेखक के रूप में यहाँ Cy5 प्रयोग किया जाता है, और इस स्त्राव अक्सर biofilms 23 में परंपरागत ढंग से व्यवहार करने के लिए प्रकट होता है। इसलिए परिणाम biofilms में गैर प्रतिक्रियाशील, तटस्थ विलेय के परिवहन के पैटर्न के प्रतिनिधि होना चाहिए। परिणाम biofilm थोक प्रवाह में एकाग्रता का केवल ~ 50% के भीतरी इलाकों में एक Cy5 एकाग्रता से बेदखल, biofilm सतह के पास Cy5 एकाग्रता की एक खड़ी कमी देखी गई। इस तरह खड़ी एकाग्रता प्रोफाइल के biofilms 2,24 भीतर ऑक्सीजन, पोषक तत्वों और antimicrobials की पहले से सूचना दी माप के साथ संगत कर रहे हैं। Cy5 पैठ घटता biofilm समूहों में घुला हुआ पदार्थ प्रसार के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। हालांकि, हम यहां पेश विधि biofilms में क्षैतिज (XY) विमानों में 2-डी घुला हुआ पदार्थ परिवहन का विश्लेषण करने के लिए सीमित है। नए तेज इमेजिंग क्षमता के साथ, कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी उदाहरण के लिए, डाई पैठ भी biofilms भीतर 3-डी में देखे जा सकते हैं, whiचर्चा कार्यक्षेत्र परिवहन की प्रक्रिया पर एक जांच की अनुमति देगा। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट ट्रेसर और कणों बाह्य प्रवाह की स्थिति और एक ही समय में आंतरिक घुला हुआ पदार्थ परिवहन की जानकारी प्राप्त करने के लिए एक साथ इंजेक्शन जा सकता है। इस तरह की सूचना थोक प्रवाह और biofilms के बीच advective और वाचाल घुला हुआ पदार्थ परिवहन अंतर करने के लिए और biofilms में आंतरिक घुला हुआ पदार्थ परिवहन पर बाह्य प्रवाह के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोगी है।
कुल मिलाकर, हम पर्यावरण में रासायनिक संकेतों को biofilm प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए रासायनिक ढ़ाल अच्छी तरह से परिभाषित प्रदान करता है एक उपन्यास microfluidic प्रवाह सेल का उपयोग करने की विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। बेहतर biofilms और उनके आसपास के microhabitat में विविधता को चिह्नित करने के लिए, हम biofilms और biofilms के भीतर आंतरिक घुला हुआ पदार्थ परिवहन आसपास के प्रवाह क्षेत्र में दोनों पैटर्न विशेषताएँ यहाँ विधियों प्रस्तुत करते हैं। प्रत्येक विधि biofilm गुण और / या पर्यावरण की स्थिति पर विशिष्ट जानकारी प्रदान करता है। इन तरीकों के बादएकीकृत कर रहे हैं, सूचना के कई पहलुओं को एक साथ प्राप्त किया जा सकता है। संयुक्त जानकारी अधिक जटिल समस्याओं का दृष्टिकोण करने के लिए शोधकर्ताओं सक्षम बनाता है। उदाहरण के लिए, इन तरीकों का उपयोग करके, हम सफलतापूर्वक एक पोषक तत्व ढाल के तहत biofilms में biofilm विकास और interspecies बातचीत का विश्लेषण किया। इन तरीकों में भी एक और अधिक यथार्थवादी संदर्भ में biofilm प्रक्रियाओं पर जांच की अनुमति देता है जो माइक्रोबियल समुदाय और रासायनिक वातावरण में जटिलता को बढ़ाने के लिए प्रयोगात्मक क्षमता प्रदान करते हैं। इन तरीकों के संभावित अनुप्रयोगों biofilm जीवन चक्र, multispecies biofilms, biofilm विविधता, biofilms में परिवहन प्रक्रियाओं, और biofilm प्रवाह परस्पर क्रिया सहित biofilm अनुसंधान के विविध पहलुओं को कवर किया।
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Acknowledgments
हम पी प्रदान करने के लिए वाशिंगटन विश्वविद्यालय (सिएटल, वाशिंगटन) पर मैट Parsek धन्यवाद aeruginosa और ई धाराओं सॉफ्टवेयर तक पहुँच प्रदान करने के लिए कैंटरबरी (न्यूजीलैंड) विश्वविद्यालय में कोलाई उपभेदों और रोजर Nokes। इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी और संक्रामक रोगों से अनुदान R01AI081983 द्वारा समर्थित किया गया। Confocal इमेजिंग पश्चिमोत्तर जैविक इमेजिंग सुविधा (BIF) पर प्रदर्शन किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| Pump Tubing 0.50 mm OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1 L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 ml TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters - sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
References
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