Biofilm और पर्यावास विविधता के सह विकास निस्र्पक के लिए तरीके
Summary
Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.
Abstract
Biofilms जटिल संरचना है और महत्वपूर्ण स्थानिक विषमताओं का उत्पादन है कि सतह से जुड़ी सूक्ष्म समुदायों कर रहे हैं। Biofilm विकास दृढ़ता से आसपास के प्रवाह और पोषण वातावरण द्वारा नियंत्रित किया जाता है। Biofilm विकास भी जटिल प्रवाह खेतों और घुला हुआ पदार्थ परिवहन पैटर्न उत्पन्न करके स्थानीय microenvironment की विविधता बढ़ जाती है। Biofilms और उनके स्थानीय माइक्रो-वास के बीच biofilms और बातचीत में विविधता के विकास की जांच करने के लिए, हम Pseudomonas aeruginosa के मोनो प्रजातियों biofilms और पी के दोहरे प्रजातियों biofilms बढ़ी एक microfluidic प्रवाह सेल में पोषक तत्वों की ढ़ाल के तहत aeruginosa और Escherichia कोलाई। हम प्रवाह कोशिका के भीतर पोषक तत्व ढ़ाल बनाने के लिए और बढ़ रही है और इन परिस्थितियों में biofilm विकास दृश्यमान करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम भी ऑप्टिकल तरीकों की एक श्रृंखला के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल वितरित प्रवाह, biofilm संरचना में स्थानिक पैटर्न यों के लिएbutions चारों ओर biofilms, और जन परिवहन के ऊपर और biofilm कालोनियों के भीतर। इन विधियों biofilm और वास विविधता के सह-विकास की व्यापक जांच का समर्थन है।
Introduction
एक बाह्य-मैट्रिक्स बहुलक एक में संलग्न सेल समुच्चय – सूक्ष्मजीवों सतहों और फार्म biofilms को देते हैं। Biofilms सेलुलर चयापचय 2,3 में आंतरिक घुला हुआ पदार्थ परिवहन सीमाओं और स्थानिक विविधताओं का एक संयोजन से उत्पन्न नाटकीय स्थानिक विविधता है क्योंकि biofilms, बहुत अलग ढंग से व्यक्तिगत माइक्रोबियल कोशिकाओं से व्यवहार करते हैं। ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की सांद्रता काफी biofilm और तरल पदार्थ और आगे biofilm 2 में भीतर समाप्त हो पाने के लिए आसपास के बीच इंटरफेस में कमी। Biofilm श्वसन और प्रोटीन संश्लेषण में स्थानिक विविधताओं भी स्थानीयकृत ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की उपलब्धता 2 के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में हो सकता है।
जलीय और मिट्टी के वातावरण में, ज्यादातर बैक्टीरिया biofilms में ध्यान केन्द्रित करना। प्राकृतिक biofilms कार्बन और नाइट्रोजन साइकिल और धातु 4,5 को कम करने सहित महत्वपूर्ण biogeochemical प्रक्रियाओं के लिए बाहर ले। चिकित्सकीय, biofilm गठन respons हैलंबे समय तक फेफड़े और मूत्र संक्रमण 6 के लिए ible। Biofilms में कोशिकाओं को उनके planktonic समकक्षों 6 की तुलना में antimicrobials करने के लिए अत्यंत उच्च प्रतिरोध किया है क्योंकि biofilm से जुड़े संक्रमण अत्यधिक समस्याग्रस्त हैं। Biofilms विविध सेटिंग में महत्वपूर्ण होते हैं, क्योंकि अनुसंधान के एक पर्याप्त राशि biofilm गतिविधियों और biofilms में स्थानिक विविधता और आसपास microenvironment कि नियंत्रण पर्यावरणीय कारकों को समझने पर ध्यान केंद्रित किया गया है।
पिछले अध्ययनों biofilm विकास दृढ़ता से पर्यावरणीय कारकों की एक संख्या के द्वारा नियंत्रित किया जाता है कि मिल गया है: biofilms विभिन्न प्रवाह शर्तों के तहत विभिन्न morphologies विकसित करना; ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की उपलब्धता प्रभाव biofilm आकृति विज्ञान; और hydrodynamic कतरनी तनाव सतहों planktonic कोशिकाओं के लगाव और biofilms 7-9 से कोशिकाओं की टुकड़ी को प्रभावित करता है। इसके अलावा, बाह्य प्रवाह हालत substrates के पूर्णांक के वितरण को प्रभावित करती हैओ और biofilms 10 के भीतर। biofilms के विकास में भी भौतिक और रासायनिक परिस्थितियों के आसपास के बदल। उदाहरण के लिए, biofilm विकास ऑक्सीजन और पोषक तत्वों दो की स्थानीय कमी की ओर जाता है; biofilms आसपास के वातावरण में 11 से अकार्बनिक और कार्बनिक यौगिकों जमा; और biofilm समूहों प्रवाह को और बढ़ाने की सतह घर्षण 12,13 हटाने की। Biofilms उनके बहुत जटिल तरीकों से आसपास के वातावरण के साथ बातचीत है, क्योंकि यह एक साथ biofilm गुण और पर्यावरण की स्थिति के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, और बहु अनुशासनिक दृष्टिकोण व्यापक biofilm से पर्यावरण बातचीत चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है।
यहाँ हम एक लगाया पोषण ढाल के तहत मोनो प्रजातियों और दोहरे प्रजातियों biofilms भीतर माइक्रोबियल विकास में स्थानिक पैटर्न विशेषताएँ, और स्थानीय रासायनिक और तरल पदार्थ microenvironment के परिणामस्वरूप संशोधन निरीक्षण करने के लिए एकीकृत तरीकों की एक श्रृंखला प्रस्तुत करते हैं। हम प्राथमिकीसेंट अच्छी तरह से परिभाषित रासायनिक ढ़ाल के तहत biofilm विकास निरीक्षण करने के लिए एक हाल ही में विकसित डबल इनलेट microfluidic प्रवाह सेल के उपयोग का वर्णन। हम तो पोषक तत्वों की स्थितियों की एक श्रृंखला के तहत biofilms में बैक्टीरिया, Pseudomonas aeruginosa और Escherichia कोलाई, की दो प्रजातियों के विकास का निरीक्षण करने के लिए इस microfluidic प्रवाह सेल के उपयोग के प्रदर्शन। हम biofilm कालोनियों में फ्लोरोसेंट ट्रेसर प्रसार की सीटू दृश्य में मात्रात्मक biofilms में घुला हुआ पदार्थ परिवहन के पैटर्न का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे दिखा। अंत में, हम confocal माइक्रोस्कोपी के तहत प्रदर्शन microscale कण ट्रैकिंग velocimetry, बढ़ रही है, biofilms के आसपास स्थानीय प्रवाह क्षेत्र प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे दिखा।
Protocol
Representative Results
Discussion
Biofilm रासायनिक ढ़ाल के जवाब, आसपास के प्रवाह microenvironment पर biofilm विकास, और आंतरिक परिवहन सीमाओं से उत्पन्न biofilm विविधता का प्रभाव: हम तीन महत्वपूर्ण biofilm से पर्यावरण बातचीत चिह्नित करने के तरीकों में से एक कमरे का प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पी प्रदान करने के लिए वाशिंगटन विश्वविद्यालय (सिएटल, वाशिंगटन) पर मैट Parsek धन्यवाद aeruginosa और ई धाराओं सॉफ्टवेयर तक पहुँच प्रदान करने के लिए कैंटरबरी (न्यूजीलैंड) विश्वविद्यालय में कोलाई उपभेदों और रोजर Nokes। इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी और संक्रामक रोगों से अनुदान R01AI081983 द्वारा समर्थित किया गया। Confocal इमेजिंग पश्चिमोत्तर जैविक इमेजिंग सुविधा (BIF) पर प्रदर्शन किया गया था।
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 mL TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters- sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
References
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